Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на биологические свойства микроорганизмов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат биологических наук Галиуллина, Ленара Фаилевна

• Галиуллина, Ленара Фаилевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Галиуллина, Ленара Фаилевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Антимикробные пептиды: краткая история вопроса

2.2 Естественное распределение катионных антимикробных пептидов в природе и их структурные особенности

2.3 Антимикробные свойства катионных антимикробных пептидов

2.4 Характеристика и свойства тромбоцитарного катионного белка

2.5 Перспективы практического применения антимикробных пептидов

III СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1Материалы и методы исследований

3.2 ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА АНТИБИОТИКОЧУВСТВИ-ТЕЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

3.3 ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНЫМ ВЕЩЕСТВАМ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ

3.4 ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА АНТИЛИЗОЦИМНУЮ АКТИВНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВА-

НИЙ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ПРИЛОЖЕНИЯ

Список сокращений

АЛА - антилизоцимная активность

АМП - антимикробные пептиды

КАМП - катионные антимикробные пептиды

КОЕ - колониеобразующая единица

МПК - минимальная подавляющая концентрация

ОП - оптическая плотность

ТД - тромбодефенсины

ТКБ - тромбоцитарный катионный белок

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ЦПМ - цитоплазматическая мембрана

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на биологические свойства микроорганизмов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Антимикробные пептиды, синтезируемые организмами различного уровня организации (от губок до человека), являются одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета, которая обеспечивает первую линию защиты от инфекций человека и животных и без которой невозможно выживание в среде, изобилующей потенциально патогенными микроорганизмами (Кокряков В.Н., 2006). Ранее были изучены антимикробные пептиды, выделенные из нейтрофилов человека, кролика и мыши (Бухарин О.В. с соавт., 2000); а также из лейкоцитов русского осетра (Шамова О.В. с соавт., 2006).

Особое внимание исследователи уделяют низкомолекулярным катион-ным белкам из тромбоцитов человека и животных - тромбодефенсинам (Бухарин О.В. с оавт., 2000; Jenssen Н. et al., 2006), поскольку тромбоциты адге-зируются на патогенных микроорганизмах, при взаимодействии с ними in vitro высвобождают низкомолекулярные бактерицидные белки, обладают противогрибковым и антипротозойным действием (Jenssen Н. et al., 2005).

Широко изучаются тромбоцитарные катионные белки (ТКБ), выделенные из тромбоцитов человека (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977; Сулейма-нов К.Г. с соавт., 1979, 1983; Сулейманов К.Г., 1990, 1998; Boman Н., 1996), установлено, что ТКБ уменьшает адгезию бактерий на соматических клетках и изменяет персистентные характеристики стафилококков и эшерихий (Бухарин О.В. с соавт., 2000); ингибирует биопленкообразование S. aureus (Жур-лов О.С. с соавт., 2012). Литературные данные указывают на наличие тром-бодефенсинов в сыворотке крови многих видов животных: крыс, кроликов, лошадей, коров, морских свинок, голубей, овец, уток, индеек, белых мышей, свиней и других (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977; Горюхина O.A., Тка-ченко A.A., 1978; Сулейманов К.Г. с соавт., 1979; Pettersson А., 1935; Donaldson D.M., Marcus S., 1958). Обнаружены антимикробные пептиды в тромбоцитах кур, изучена антимикробная активность тромбодефенсинов лошадей,

крупного рогатого скота, коз, свиней, собак, кур и их антиперсистентное действие (Сычева М.В. с соавт., 2009, 2010, 2011).

Формирование антибиотикорезистентных форм микроорганизмов диктует необходимость поиска новых средств терапии инфекционных заболеваний (Яковлев В.П., Яковлев С.В., 2008). Альтернативой антибиотикам, к большинству которых бактерии приобрели устойчивость, могут стать тром-бодефенсины (Jenssen Н. et al., 2006).

В связи с вышеизложенным, интерес представляет изучение биологических свойств и поиск наиболее эффективных антимикробных белков из тромбоцитов сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния антимикробных пептидов из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить влияние тромбодефенсинов, полученных из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры), на чувствительность к антимикробным средствам грамположительных, грамотрицательных бактерий, а также грибов рода Candida.

2. Изучить антагонистическую активность нормальной микрофлоры кишечника животных (микроорганизмы рода Lactobacillus, E.coli, Е. faecium) в отношении условно-патогенных микроорганизмов после их соинкубиро-вания с тромбодефенсинами сельскохозяйственных животных.

3. Оценить влияние тромбодефенсинов на антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов.

Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки).

Научная новизна исследований.

Изучено влияние тромбодефенсинов (ТД), полученных от сельскохозяйственных животных, на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов.

При изучении влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры) на антибиотикочувствитель-ность грамположительных, грамотрицательных бактерий, а также грибов рода Candida установлено преимущественное повышение чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антимикробным средствам. При этом наибольший эффект оказывают ТД кур и лошадей.

Достоверное повышение чувствительности к антибиотикам отмечено у E.coli и Е. faecalis после соинкубирования с ТД кур в минимальной подавляющей концентрации (МПК); у S. aureus с ТД крупного рогатого скота и лошадей в МПК; К. pneumoniae - с ТД лошадей и кур в 1А МПК; С. albicans - с ТД кур в МПК и ТД лошадей в V* МПК. Установлено, что выраженность данного признака зависит от механизма действия антимикробного средства, к которому определяли чувствительность.

Показано, что у условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) под влиянием тромбодефенсинов повышается чувствительность к антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных. Максимальное повышение чувствительности УПМ к антагонистическому действию штаммов Е. coli и Е. faecium, выделенных из пробиотиков, зарегистрировано, преимущественно, в результате соинкубирования УПМ с тромбодефен-синами кур и лошадей, а к антагонистическому действию лактобацилл - после их соинкубирования с ТД крупного рогатого скота.

Установлено, что тромбодефенсины, выделенные из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры), однонаправлено снижают антилизоцимную активность условно-патогенных бактерий, а также С. albicans. Максимальное подавление способности микро-

организмов инакгивировать лизоцим выявлено после их соинкубирования с тромбодефенсинами лошадей в % МГЖ.

Практическая значимость работы.

Полученные знания о том, что тромбодефенсины с одной стороны, повышают чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антибиотикам, антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных, а с другой, ингибируют их антилизоцимную активность, способствующую персистенции микроорганизмов, позволяет расширить арсенал пептидов в перспективе пригодных для лечения и профилактики инфекцион-но-воспалительных заболеваний животных. Проведенный сравнительный анализ влияния ТД разных видов сельскохозяйственных животных на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов показал, что наибольшую активность проявляют ТД кур и лошадей.

Результаты исследований используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» при преподавании дисциплин «Иммунология» и «Антибиотики» студентам специальности «Микробиология» и «Ветеринарная микробиология и иммунология», «Ветеринария».

Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках темы открытого плана НИР ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет» «Функциональные свойства антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных» (№ государственной регистрации 0120.1252048).

Апробация работы. Результаты научных исследований доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в условиях становления инновационной экономики» (Оренбург, 2011); Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию со дня рождения профессора Ю. В. Храмова «Энтузиазм и творчество молодых учёных, студентов в развитии ветеринарной меди-

цины» (Оренбург, 2011); Первой молодежной научной школе - конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 21 века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011); Международной научно-практической интернет-конференции, посвященной 65-летию кафедры паразитологии Ставропольского ГАУ (Ставрополь, 2012); II региональном молодежном инновационном конвенте Оренбургской области (Оренбург, 2012).

Итоги проведенных исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» (протокол № 9 от 22 января 2013 года).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Тромбодефенсины сельскохозяйственных животных модифицируют биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов - повышают их чувствительность к антимикробным средствам, антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных, ингибируют способность к инактивировать лизоцим.

2. Выраженность действия тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных в отношении биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов определяется видом животного, являющегося источником тромбодефенсинов, при этом наибольшую активность проявляют ТД кур и лошадей.

Публикация результатов исследований. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в семи печатных работах, из них шесть - в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования РФ.

Материалы диссертации представлены на областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2011» (Оренбург, 2011) и отмечены сертификатом победителя. Работа удостоена диплома Всероссийского конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области

биологических наук на Всероссийском фестивале науки (Ульяновск, 2011) и гранта Оренбургского ГАУ по результатам конкурса научно-технических и инновационных проектов «Прорыв» (Оренбург, 2011).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста; включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения результатов исследований, выводы, практические предложения и библиографический список, приложение. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками. Библиографический список включает 206 источников, в том числе - 143 иностранных авторов.

За содействие и помощь в освоении методик, а также проведении цикла экспериментов по теме диссертации, выражаем благодарность заведующей кафедрой микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет», кандидату биологических наук М.В. Сычевой.

и

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2Л Антимикробные пептиды: краткая история вопроса

История изучения клеточно-молекулярных механизмов резистентности человека и животных к инфекции восходит к работам Л. Пастера, который обосновал микробную теорию инфекционных заболеваний (Омелянский В. Л., 1917), И. И. Мечникова, описавшего явление фагоцитоза микробов, проникших через повреждённый эпителий, подвижными клетками, и выдвинувшего фагоцитарную теорию иммунитета. Им же была сформулирована концепция о цигазах — бактерицидных соединениях лейкоцитарного происхождения, обеспечивающих инактивацию и переваривание фагоцитированных микроорганизмов.

Антибиотические пептиды впервые были обнаружены в азурофильных гранулах нейтрофилов морской свинки (Zhang L. et al., 2001), тогда их обозначили как группу лизосомных катионных белков, позднее они были секве-нированы и названы дефенсинами (англ. defence-защита) (Nikawa Н. et al., 2004).

Изучение молекулярных основ врождённого иммунитета у насекомых привело к открытию в гемолимфе куколок Hyalophora cecropia (гигантского шелкопряда) катионных антимикробных пептидов (КАМП), которым позднее было дано название цекропинов (Friedrich С. L. et al., 2001).

Дефенсин-подобные молекулы были найдены у насекомых: в 1989 году французские исследователи выделили из гемолимфы личинки падальной мухи Phormia terranovae два антимикробных пептида (АМП) - формицины А и В, которые имели частичное структурное сходство с дефенсином NP-1 из альвеолярных макрофагов кролика (Bachere Е. et al., 2004). Дальнейшие исследования подтвердили, что АМП широко распространены в природе и присутствуют практически у всех изученных видов организмов, включая бактерий, простейших, грибы, растения, кишечно-полостных, моллюсков, иглокожих, оболочечников, ракообразных, насекомых, амфибий, птиц и млекопитающих.

При этом в одном организме может содержаться от одного до нескольких десятков (38 у крупного рогатого скота) различных антимикробных пептидов, принадлежащих как к разным структурным классам, так и являющихся вариациями одной структуры (Hancock R.E.W., Lehrer R.I., 1998).

В 1987 году М. Zasloff выделил из кожи лягушки Xenopus laevis магей-нины, которые активны in vitro против грамположительных, грам-отрицательных бактерий, грибов и простейших (Zasloff М., 1987).

В 1990 году из лейкоцитов свиньи были выделены протегрины (PG-1,2,3). Они состоят всего из 16-18 аминокислотных остатков, с двумя внутримолекулярными дисульфидными мостиками (Кокряков В.Н., 1990). В условиях in vitro протегрины проявляют активность против широкого спектра микроорганизмов. В начале 90-х годов было открыто семейство каталециди-нов. Ключевым моментом в истории их открытия послужило клонирование кДНК Вас5 (пептида, ранее выделенного из нейтрофилов быка). Причем вместе с кДНК для этого пептида амплифицировались другие кДНК последовательности, каждая из которых содержала одинаковый консервативный участок, кодирующий N-конец пептида и вариабельный участок соответствующий ранее описанным бычьим АМП. В дальнейшем, с помощью метода RACE (быстрой амплификации концов кДНК) множество подобных пептидов было обнаружено у разных видов млекопитающих. Очевидно, что все эти пептиды эволюционно родственны, несмотря на огромное разнообразие эф-фекторных доменов. Консервативный участок оказался на 70% гомологичен белку из лейкоцитов свиньи «кателину», ингибитору катепсина L. Для обозначения этого семейства АМП был введён термин кателицидины (Yamasaki К., Galo R.L., 2008).

В 1997 году в лаборатории Р. Лерера (США) были выделены цекро-пин-подобные пептиды стиелины из гемоцитов асцидии Styela clava (Lee I.H. et al., 1997).

Дана характеристика более 1000 АМП (Bowdish D. М. et al., 2005) (и эта цифра постоянно увеличивается), выделенных из различных видов позво-

ночных и беспозвоночных животных, растений, простейших и даже бактерий (хотя в последнем случае они содержат в своём составе много неканонических и модифицированных аминокислот). Следует отметить, что более 50% известных антимикробных пептидов описаны у насекомых и около 40% антимикробных пептидов у млекопитающих. Данные по другим группам животных имеют несистематический характер.

Информация об антимикробных пептидах животного происхождения в настоящее время стремительно пополняется, однако большинство известных пептидов являются ещё малоизученными.

2.2 Естественное распределение катионных антимикробных пептидов в природе и их структурные особенности

Катионные антимикробные пептиды (КАМП) представляют собой важнейшее звено в системе врождённого иммунитета, обеспечивающее ведущую линию защиты живых организмов от патогенов (Nibbering P. H. et al., 2001; Mikloska Z., Cunningham A. L., 2001; Lehrer R.I., Ganz T., 2002; Ni-kawa H. et al., 2004; Alberola J. et al., 2004; Bowdish D. M. et al., 2005).

КАМП задействованы в системе врожденного иммунитета у большого числа живых организмов, включая организм насекомых и других беспозвоночных, пресмыкающихся, амфибий (земноводных), птиц, рыб, млекопитающих, человека (Кокряков В.Н., 1990, 1999; Marcus S.J., 1968; Chang T. L. et al., 2005).

Все КАМП объединены в одну группу благодаря одинаковому строению: имеют вид короткоцепочечных аминокислотных последовательностей, заряженных положительно, в состав которых могут входить от 12 до 100 аминокислот. КАМП в своей структуре, наряду с основными аминокислотами, содержат значительное число остатков аминокислот, несущих гидрофобные боковые группы (валин, лейцин, изолейцин, пролин, метионин, фенила-ланин, триптофан) (Дьяченко C.B., 2010; Walton Е., 1976).

Единой общепринятой классификации антимикробных пептидов на данный момент не существует, так как, несмотря на всё возрастающее число открываемых пептидов, фактический материал ещё далеко недостаточен.

Слишком мал список изученных в этом отношении видов живых организмов, чтобы делать обобщения, касающиеся больших систематических групп. Необходимо изучение специфичности действия антимикробных пептидов в отношении микробов, контактирующих с данным видом организма в естественных условиях (Hancock R.E.W., Chappie D. S., 1999; Hancock R.E.W., Scott M.G., 2000).

В 1996 году Боман предложил классификацию, основанную на третичной структуре, в которой большое значение придавалось наличию и количеству дисульфидных связей в молекуле пептида. В соответствии с ней выделялось пять структурных классов:

- пептиды, формирующие амфипатические ct-спирали. В данный класс включено большинство известных на сегодняшний день пептидов.

- Пептиды, образующие антипараллельные р-слои (имеют молекулы, содержащие от двух и более внутримолекулярных дисульфидных связей). К данному классу относят петид андроктонин.

- Пептиды с тремя дисульфидными связями (дефенсины).

- Пептиды, обладающие альфа-спиральной структурой. Это молекулы, не содержащие цистеин; домены некоторых из них отличаются высоким содержанием глицина; одна или две из имеющихся аминокислот (Pro-Arg, Тгр-His) обладают повышенной экспрессией. К данной группе относятся пептиды PR-39, индолицидин и гистатин.

- Петлевидные пептиды, имеющие одну дисульфидную связь и петлеобразную структуру с одним или двумя хвостами (бычьи додекапептиды и пептиды лягушки - бревенин и эскулетин).

Существуют также другие классификации КАМП. Так, исследования структуры антибиотических пептидов в растворах методом ядерного магнитного резонанса, выполненные В.Н. Кокряковым (2006), позволили идентифи-

цировать среди КАМП несколько основных классов: a-спиральные (LL37, магейнины, цекропины, буфорин), цистинсодержащие ß-складчатые (a-, ß-, 0-дефенсины, дефенсины насекомых, дрозомицин, протегрины, тахиплезины, лактоферрицин В), пептиды с невыраженной вторичной структурой (PR39, бактенецины, гистатины, индолицидин).

Впервые КАМП были обнаружены и охарактеризованы у бактерий. Однако, антимикробные пептиды бактерий не защищают от инфекции в классическом смысле, они способствуют выживанию отдельных бактериальных клеток, уничтожая другие бактерии, которые могли бы конкурировать за питательные вещества в той же самой среде (Mattick A.T.R., Hirsch А., 1947; Matsuyama К., Natori S., 1988; Klaenhammer T.R., 1988; Riley M.A., 1998; Parente E., Ricciardi A., 1999). В инфекционной защите растений антимикробные пептиды играют фундаментальную роль (Lay F.Т., Anderson М.А., 2005; Scott M.G., Hancock R.E., 2000). Большинство антимикробных пептидов были выделены из семян растений: идентифицированы две большие группы растительных антимикробных пептидов, обладающих ß-глобулярной структурой - фионины и дефенсины. В исследованиях in vitro показана антибактериальная и антимикотическая активности данных пептидов (Yasin В. et al., 2000; Jenssen H. et al., 2005).

Данные о присутствии антибиотических пептидов у простейших единичны. Единственные КАМП были выделены из клеток амебы Entameaba histoytica. Данные пептиды, впоследствии названные амебопорами, обладали выраженной цитотоксической активностью (Lustig F. et al., 1996; Panyutich A. et al., 1997).

Большинство антимикробных пептидов, найденных у беспозвоночных, относятся к дефенсинам (Steine H. et al., 1981; Bachere E. et al., 2004).

Первые дефенсины насекомых были обнаружены в культуральной среде клеток NIH Sape-4, которые представляют собой поддерживаемую in vitro линию эмбриональных клеток серой мясной мухи Sarcophaga peregrine. Эти пептиды получили название сапецины (HultmarkD. et al., 1980; Matsuyama

К., Natori S., 1988). Необходимо отметить, что в состав врождённой имунной системы беспозвоночных также входят, так называемые, прототипические пептиды, такие как альфа-цепочечные цекропины (в гемолимфе насекомых), меллитин (пчелиный яд), ß-шпилечные пептиды подковообразного краба (та-хиплезин и полифемузин). Из вышеперечисленных прототипических пептидов особое внимание исследователей привлекают цекропины. Данная группа белков обладает антимикробной активностью против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (Boman H.G., 1987; Hancock R.E.W., 2001).

Интересным является тот факт, что в эквимолярных концентрациях цекропины проявляют большую антимикробную активность в отношении Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobac-ter caloaceticus (Boman H. G. et al., 1993; Boman H.G., 1994), нежели известный антибиотик тетрациклин. Подобная антимикробная активность стала предпосылкой для проведения исследований по разработке химически синтезированных гомологов цекропина, которые в будущем могут найти применение в медицинской и ветеринарной практике.

Современные литературные данные свидетельствуют о том, что антимикробные пептиды обнаружены у всех позвоночных животных (Selsted М.Е., Ouellette A.J., 2005).

Наибольшая концентрация KAMQ зарегистрирована в гранулах фагоцитарных клеток и криптах тонкой кишки, а также в тканях, которые характеризуются высокой элиминирующей и выделительной способностью (Муг-vik Q.N., Weiser R.S., 1956; Martin Е. et al., 1995; Bulet P. et al., 2004).

Наиболее обширной и наиболее изученной группой антимикробных КАМП позвоночных являются дефенсины. Дефенсины как физиологически активные вещества отличает высокая микробицидность, что и послужило основанием для их всестороннего физико-химического изучения. Дефенсины млекопитающих представлены тремя типами: а-дефенсины, ß-дефенсины и

0-дефенсины, которые экспрессируются либо в гемопоэтичных, либо в эпителиальных клетках (Tang Yi-Quan et al., 2002).

Отличие а- и ß-дефенсинов заключается в конфигурации остатков цис-теинов и в расположении дисульфидных связей (Ganz Т. et al.,1986; Lehrer R.I. et al., 1990; Lehrer R. et al., 1993). Третья группа дефенсинов - 9-дефенсины, продуцируемые посредством посттрансляционного связывания двух остатков усеченных а-дефенсинов, обнаружена только у приматов (Tang Yi-Quan et al., 2002).

Первыми были изучены дефенсины кролика (Zeya Н., Spitznagel J., 1966, 1968; Ranadive N.S., Cochrane C.G., 1968; Weksler B.B., Nachman R.L., 1971; Patterson-Delafield J. et al., 1980). Отличительным признаком молекул дефенсинов кролика является высокое (от 5 до 10 остатков) содержание в их составе аминокислоты аргинина, что в значительной степени определяет их положительный заряд, высокую изоэлектрическую точку и как следствие, опережающую остальные кислоторастворимые белки нейтрофилов электро-форетическую подвижность в направлении к катоду (Dathe М., Wieprecht Т., 1999).

В настоящее время расшифрованы первичные структуры дефенсинов из нейтрофилов морской свинки, крысы и хомячка, молекулы которых построены по единому структурному принципу, что позволяет отнести все рассмотренные полипептиды к единому классу веществ (Scott M.G., Hancock R.E., 2000).

Доказано присутствие дефенсинов (HD 5,6) в клетках эпителия тонкой кишки человека, NP-1 в нейтрофилах кролика, HNP-1 в нейтрофилах человека, BNBD-1 в нейтрофилах и эпителии трахеи крупного рогатого скота, Gal-1 в гетерофилах кур (Кудряшов Б. А. с соавт., 1989; Кокряков В.Н., 1990; Кок-ряков В.Н. с соавт., 1997; Lehrer R.I., Ganz Т., 2002).

В нейтрофилах человека дефенсины составляют 5-7% клеточного белка. Эти полипептиды локализованы, преимущественно, в азурофильных гранулах нейтрофилов человека и кролика (Jenssen Н. et al., 2006). К настояще-

му моменту установлено, что кроме выраженной антимикробной активности, которая подробно будет рассмотрена в следующем разделе, дефенсины также способны обеспечивать эффективность завершающей стадии фагоцитоза (Ра-nyutich А. et al., 1997). Также в очаге воспаления дефенсины могут выступать в качестве молекул с прокоагулирующей активностью за счёт связывания и нейтрализации гепарина крови (Кудряшов Б.А. с соавт., 1989) и ингибирова-ния фибринолиза, запускаемого активатором плазминогена тканевого типа (Higazi A.A. et al., 1996; Dathe M., Wieprecht Т., 1999).

Т. Tominaga с соавт. (1990) установили, что дефенсины альвеолярных макрофагов подавляют in vitro индуцированную адренокортикотропным гормоном продукцию глюкокортикоидов клетками коркового слоя надпочечников крысы.

Другая большая группа антибактериальных пептидов, обнаруженных у млекопитающих, - каталецидины. Около 30 каталецидинов найдены у свиней, кроликов, коров, овец, мышей и других животных, при этом к настоящему времени только один каталецидин, получивший название hCAP18, найден в организме человека. Белок hCAP18 в наибольшей концентрации обнаружен в гранулах зрелых нейтрофилов. Помимо нейтрофилов hCAP18 выявлен в лимфоцитах и моноцитах, в сквамозном эпителии рта, языка, пищевода, шейки матки и влагалища, эпителии легочной ткани, в кератиноцитах при воспалительных заболеваниях и эпидидимите (Zannetti М. et al., 1995; Dorschner R. A. et al., 2001). Было показано, что каталецидин hCAP18 или LL-37, состоящий из 37 аминокислот и устойчивый к протеолитическому разрушению, цитотоксичен по отношению к клеткам млекопитающих (Murakami М. et al., 2002; Koczulla R. et al., 2003; Nagaoka I. et al., 2005), проявляет антимикробную активность, как в отношении грамотрицательных, так и грампо-ложительных бактерий, грибов, некоторых вирусов и простейших (Hancock R.E.W., Lehrer R.I., 1998; Tang Yi-Quan et al., 2002).

Антимикробные пептиды в большом количестве также сосредоточены в коже земноводных. В ходе исследований, проведенных М. Zasloff (1987)

антимикробные пептиды, получившие название магейнины, были обнаружены в коже шпорцевой лягушки. Впоследствии были химически синтезированы различные производные магейнинов с повышенной антимикробной активностью, среди которых наиболее известен пептид MSI-78. Подробному изучению антимикробных пептидов, выделенных из кожи шпорцевой лягушки, посвящены работы H.H. Haukland et al. (2001), Y. Park et al. (2004).

Установлено, что, будучи эффективными антимикробными агентами, пептиды земноводных не лизируют эритроциты и лимфоциты, однако к ли-тическому действию оказались повышенно чувствительны трансформированные (опухолевые) клетки (Li C.Y., Song Y.L., 2010).

Кроме магейнинов из кожи лягушки Xenopus laevis выделены антимикробные пептиды PCLa, девять фрагментов предшественников церулеина, фрагмент предшественника ксенопсина. Необходимо отметить, что часть этих пептидов была обнаружена также в эпителии желудка шпорцевой лягушки (Zasloff М., 1987; Soravia Е. et al., 1988).

Литературные данные свидетельствуют о широком естественном распределении антимикробных пептидов, при этом необходимо отметить, что база данных об антимикробных пептидах стремительно пополняется и некоторые аспекты рассматриваемого вопроса на сегодняшний день остаются еще малоизученными.

Таким образом, антимикробные пептиды во всем своем структурном многообразии широко представлены как в организме растений, насекомых, так и в организме млекопитающих. Все существующие на сегодняшний день классификации основаны на структурных особенностях антимикробных пептидов. Однако общепринятой классификации рассматриваемой группы пептидов на данный момент нет. Отсутствие единого подхода к решению данного вопроса свидетельствует, скорее всего, об отсутствии достаточного количества информации о структурных характеристиках антимикробных пептидов, либо о неполноценной систематизации уже имеющихся данных.

2.3 Антимикробные свойства катионных антимикробных пептидов Важнейшим функциональным свойством низкомолекулярных катионных белков является антимикробная активность. Установлено, что КАМП обладают выраженной антивирусной, антибактериальной, антимикотической и антипротозойной активностями (Myrvik Q.N., Leake E.S., 1960; Zeya Н., Spitznagel J., 1968; Ganz T. et al., 1986; Bach A.C. et al., 1987; Tang Y.Q. et al., 1999; Ayabe T. et al., 2000; Moerman L. et al., 2002; Roch P. et al., 2004; Stein-straesser L. et al., 2005).

Литературные данные свидетельствуют о наличии противовирусной активности у всех известных групп катионных пептидов. Они обладают широким спектром действия в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов (Hancock R.E.W., Lehrer R.I., 1998; Bastian А., Schafer Н., 2001; De Clercq E., 2004; Pietrantoni A. et al., 2006), за исключением безоболочечных аденовирусов (Boman Н., 1996; Jenssen Н. et al., 2004), калицивируса кошек и эховируса 6 (Мс. Сапп К. В. et al., 2003).

Проявление антивирусной активности, главным образом, связывают со вторичной структурой пептидов. К примеру, а-цепочечные пептиды, такие как, цекропины, клаванины и каталицидины LL-37 не способны к инактивации вируса герпеса (Bowdish D. М. et al., 2004). Между тем, а-цепочечные маганины, дермосептины и мелиттины обладают активностью в отношении вируса герпеса. Известно, что у отдельных субклассов пептидов антивирусная активность может существенно варьировать (Daher К.А. et al., 1986; Yasin В. et al., 2000; Lee D. G. et al., 2004; Chang Т. L. et al., 2005; Hörne W. S. et al., 2005; Steinstraesser L. et al., 2005). Например, показано, что у аналогов про-тегринов, у которых отсутствуют дисульфидные связи, активность в отношении вируса герпеса может варьировать от высокой до ее полного отсутствия (Aboudy Y. et al., 1994; Ge Y. et al., 1999).

Согласно литературным данным, существует несколько механизмов антивирусного действия катионных антимикробных пептидов. Один из меха-

низмов основан на блокировании вирусного проникновения посредством взаимодействия с гепарин сульфатом, который входит в состав протеоглика-на, находящегося во всех типах тканей (Klaenhammer T.R.,1988) в секретах внутриклеточных гранул, межклеточном матриксе (Moayeri М. et al., 2008).

Также инактивация вирусов достигается путем блокирования межклеточного распространения (MikloskaZ., Cunningham A. L., 2001; Sinha S. et al., 2003; Jenssen H. et al., 2005), блокирования проникновения вирусов посредством связывания со специфическими вирусными рецепторами (Tamamura Н. et al., 1996; Murakami Т. et al., 1997; Cole A. M. et al., 2002; Barth H. et al.,

2003), путем прямого взаимодействия с капсидом, а также инактивации вируса посредством соединения с вирусным гликопротеином (Tamamura Н. et al., 1996; Yasin В. et al., 2004; Wang Z., Wang G., 2004).

Необходимо отметить, что активность антимикробных пептидов в отношении различных вирусов неодинакова. Например, дефенсины, тахипле-зины, протегрины и лактоферрицин обладают высокой антивирусной активностью в отношении вируса герпеса (Не К. et al., 1996; Yasin В. et al., 2000; Sinha S., 2003; Jenssen H. et al., 2004; Krajewski K. et al., 2004; Yasin B. et al.,

2004), менее активны цекропины, клаванины и кателицидины (Ourth D.D. et al., 1994; Lee I. et al., 1997; Benincasa M. et al., 2003), в то время как магейнин, дермасептин и мелиттин не активны (Albiol Matanic V. С., Castilla V., 2004; BechingerB., 2010).

Наиболее хорошо изучена антибактериальная активность КАМП, которая характерна для большинства известных катионных антимикробных пептидов.

В ранних работах по изучению антибактериальных пептидов было показано, что единственным механизмом антимикробного действия является нарушение структуры бактериальной мембраны. В основе такого механизма лежит положительный заряд и амфифильность молекул пептидов. Благодаря этим свойствам антибиотические пептиды вступают в электростатическое и

гидрофобное взаимодействия с анионными фосфолипидами и липополисаха-ридами мембран микроорганизмов, которые приводят сначала к их адсорбции на поверхности мембран микробных клеток-мишеней, а потом к внедрению в двойной липидный слой, что нарушает организацию и целостность оболочечных структур микроорганизмов (Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф., 1993; Bashford Kini C.L. et al„ 1986; Hill C.P. et al., 1991; Boman H. G. et al., 1993; Skerlavaj B. et al., 1996; Zhang L. et al., 2001). Следствием подобного воздействия АМП на цитоплазматическую мембрану являются необратимые повреждения ее структуры и нарушения разнообразных функций, результирующим действием которых является гибель клеток - мишеней (Zannetti М. et al., 1995).

Важной особенностью антимикробной активности КАМП является избирательность действия на мембраны микроорганизмов, что обеспечивается молекулярно-клеточными механизмами: компартментализация дефенсинов в лизосомоподобных гранулах лейкоцитов и клеток Панета, где они связаны с кислыми мукополисахаридами, которые обеспечивают нейтрализацию цито-токсических молекул (Walton Е., 1976, 1978; Faber С. et al., 2005; Brown K.L., Hancock R.E., 2006; Moayeri M. et al., 2008).

Также установлено, что многие КАМП упакованы в гранулы в форме пропептидов, освобождение которых происходит только в случае активации нейтрофильных гранулоцитов в процессе фагоцитоза. Существенно важными фактороми, обеспечивающими избирательность КАПМ, являются отрицательный заряд поверхности микробных клеток и особенности строения поверхностных структур оболочечных вирусов, бактерий, низших грибов и в меньшей степени паразитов. Установлено, что КАМП проявляют повышенное сродство к следующим компонентам бактериальной клетки: кислые фосфолипиды, липополисахарид, пептидогликан, тейхоевые кислоты. Еще одним немаловажным фактором, обеспечивающим избирательность антимикробного действия, является высокий трансмембранный электрический потенциал (Lehrer R. I., Ganz Т., 1993, 1996).

Однако нарушение структуры бактериальной мембраны не является единственным механизмом антибактериального действия катионных пепти дов. Согласно К. A. Brogden (2005), некоторые катионные антимикробные пептиды могут проникать через бактериальную мембрану и при этом, не нарушая их структуры, накапливаться внутри бактериальных клеток и нарушать различные клеточные процессы. Так, антимикробный пептид буфорин II, выделенный из организма лягушки, проникает через бактериальную мембрану, не нарушая ее структуры, и затем связывается с ДНК клетки.

Подобный механизм антибактериального действия характерен также и для дермосептина, выделенного из кожи лягушек. Данный катионный пептид ингибирует синтез ДНК и РНК, не дестабилизируя мембрану E.coli. К ингибированию синтеза нуклеиновых кислот способны человеческий дефен-син - HNP1 и бычий индолицидин (Friedrich С. L. et al., 2001). Известны антимикробные пептиды, ингибирующие синтез ферментов у бактерий (Sub-balakshmi С., Sitaram N., 1998; Patrzykat A. et al., 2002). Установлено также, что некоторые пептиды оказывают эффективное антибактериальное действие путем нарушения синтеза клеточной стенки на определенном этапе. Например, лантибиотики мерзацидин и низин нарушают синтез клеточной стенки на этапе трансглюкозилирования липида II (Kruszewska D. et al., 2004).

Некоторые исследователи предполагают, что в борьбе с бактериальной инфекцией антимикробные пептиды могут использовать мультицелевой механизм, одновременно нарушая и мембранную структуру, и внутриклеточные процессы бактерий (Steinberg А. et al., 1997; Sinha S. et al., 2003; Hsu С. H. et al., 2005).

В последние годы существенно расширились сведения об антигрибковой активности КАМП. Ряд авторов предполагает, что антимикотическое действие пептидов, главным образом, связано с нарушением процесса синтеза их клеточной стенки (Yeaman М. R. et al., 1993; Lustig F. et al., 1996; Moer-man L. et al., 2002; Nikawa H. et al., 2004). Работы других авторов свидетельствуют в пользу иных механизмов антимикотического действия пептидов

(De Lucca A. J., Walsh T. J., 1999; Kim D. H. et al., 2001). Так, некоторые исследователи считают, что решающим в основе механизма фунгицидного действия катионных пептидов является формирование реактивного кислорода. Е. J. Heimerhost с соавт. (1999, 2001) и K.Kavanagh, S.Dowd (2004) в серии работ по изучению антимикробного действия гистатина-5 выявили энергетически зависимый механизм фунгицидного действия. Они установили, что гистатин-5, выделенный из слюнной жидкости приматов, проникая через клеточную мембрану, в цитоплазме нарушает функционирование митохондрий.

Противогрибковая активность зарегистрирована у индолицидина ( Ni-kawa H., 2004), цекропина, дефенсинов растений (Barbault F. et al., 2005), протегрина свиньи (Cho Y. et al., 1998). Вместе с тем установлено, что на-тивные пептиды обладают более слабой противогрибковой активностью, нежели их синтетические аналоги. Так, путем присоединения пальмитиновой и ундекановой кислот к маганину был получен аналог, обладающий мощной активностью против дрожжей и возбудителей оппортунистических грибковых инфекций (Hirsch J.W. et al., 1960).

D.G. Lee (2004) в своей работе сообщают о том, что был создан гибридный пептид PI8 путем соединения участков двух пептидов маганина 2 и цекропина, обладающий мощной активностью в отношении Candida albicans, Trichosporon beige Iii, Aspergillus flavus, Fusarium oxysporum.

Антипротозойная активность КАМП была выявлена лишь у некоторых пептидов. Впервые эта активность была обнаружена у маганина 2 в отношении Paramecium caudatum (Zannetti M. et al., 1995). Позже в серии работ J. Alberola с соавт. (2004) по изучению антипротозойного действия синтетического пептида Oct-CA(l-7)-M(2-9) была установлена его эффективность при лечении лейшманиоза. Такой же эффект был выявлен в ходе исследований Е. Guerrero с соавт. (2004) у маганина 2. У каталецидина, выделенного из организма свиньи, установлена антинематодная активность, причем он проявляет антипротозойную активность либо нарушая мембранную структуру, ли-

бо прямо взаимодействуя с двойным липидным слоем мембраны. Отмечено, что некоторые антимикробные пептиды, наряду с антипротозойной активностью, также характеризуются наличием антибактериального эффекта. Например, у аналогов дефенсинов мидий, наряду с антибактериальным действием, также обнаружена активность в отношении Leishmania major и Trypanosoma brucei (Roch P. et al., 2004).

2.4 Характеристика и свойства тромбоцитарного катионного бежа

Среди всех КАМП современные исследователи особое внимание уделяют дефенсинам из тромбоцитов млекопитающих (тромбодефенсины), ранее известным, как бета-лизины.

Тромбоцитарный бактерицидный катионный белок (ТКБ) был обнаружен J.Fodor (1887), G.Nuttal (1888) и Е. Behring (1889), которые продемонстрировали в опытах in vitro и in vivo наличие в сыворотке крови некоторых видов животных термостабильного фактора, обладающего бактерицидной активностью в отношении грамположительных спорообразующих бактерий (Сулейманов, К.Г., 1990). Впервые систематическое исследование бета-лизинов как самостоятельной системы, было предпринято A. Petterson (1935), которому удалось установить комплексную природу бета-лизина: оказалось, что литическое действие этого фактора в отношении аэробных спорообразующих бацилл определяется двумя компонентами - собственно бета-лизином и активирующей его субстанцией. Значительно позже, независимо от работ A. Petterson, бета-лизин был повторно описан как «бактерицидин».

Тромбоцитарное происхождение бета-лизина было показано D.M. Donaldson с соавт. (1958), которые определили низкую молекулярную массу и катионные свойства бета-лизинов.

Впервые попытку выделения бета - лизина предприняли W. Bloom и F. Blake в 1948 году (Donaldson D.M., Matheson С., 1964). Разработкой метода очистки бета-лизина занимались также Q. Myrvik, Е. Leake (1960), которые

предложили метод, основанный на преципитации сыворотки крови этанолом, что приводило к осаждению бета-лизина.

D. Donaldson, С. Matheson (1964) для очистки ТКБ из сыворотки и тромбоцитов крови человека предложили метод ионообменной хроматографии, которая включала адсорбцию бежа на асбестовом фильтре в процессе фильтрации сыворотки, отмывание балластных веществ, абсорбированных на фильтре, элюцию бактерицидина с фильтров, диализ и хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе.

Получение высокоочшценных препаратов стало возможным лишь после разработки S. Marcus (1968) схемы очистки бета-лизина из сыворотки крови кролика. В основе данной схемы - способность бета-лизина адсорбироваться на асбестовом фильтре и ограниченная его растворимость в растворах с низкой ионной силой.

С использованием вышеописанной методики L. Shultz и М.Wilder (1971) выделили антимикробный пептид из сыворотки крови кролика, который был активным в отношении L. monocytogenes и В. subtilis.

Однако в работах по выделению и очистке бета-лизинов отсутствуют данные по характеристике его физико-химических свойств. В связи с этим интерес представляют исследования К.Г. Сулейманова (1998), разработавшего способы выделения тромбоцитарного катионного белка. В процессе разработки собственной схемы получения гомогенного препарата ТКБ он установил, что наилучшая степень очистки антимикробного белка из тромбоцитов достигается гель-фильтрацией на сефадексах Г-10, Г-50, Г-75, Г-100 по руководству JI.M. Гинодман (1964). В настоящее время имеются немногочисленные сведения о физико-химических характеристиках тромбодефенси-нов. Известно, что тромбодефенсины стабильны: при температуре схра-няются 1-2 недели в рефрижераторе, их активность подавляется ионами Mg

| л j о | л j о |

, Fe , Fe , Ba , но активируются ионами Ca

Литературные данные указывают на наличие тромбодефенсинов в сыворотке крови многих видов животных. ТКБ был обнаружен у крысы, кро-

лика, лошади, коровы, морской свинки, голубя, овцы, утки, индейки, белой мыши, свиньи и других видов животных, а также у человека (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977; Горюхина О.А., Ткаченко А.А., 1978; Сулейманов К.Г. с соавт., 1979; Pettersson А., 1935; Donaldson D.M., Marcus S., 1958).

Установлено, что концентрация тромбодефенсинов у разных видов млекопитающих варьирует. При этом оказалось, что наиболее богаты тром-бодефенсинами сыворотки крови кролика и крысы, затем в убывающем порядке следуют человек и некоторые виды птиц. При этом различно содержание тромбодефенсинов и у отдельных пород животных одного и того же вида (Бритвина Е.И., 1976).

Так, Н.В. Курцев (1975), исследуя сывороточные бета-лизины у телок и коров различных пород (абердин-ангусская, герефордская, казахская белоголовая, шортгорнская), выявил, что уровень бета-литической активности у животных разных пород не одинаков. Также установлено, что содержание бета-лизинов варьирует в тканях и отдельных клеточных элементах у различных видов животных. В исследовании по изучению распределения бета-лизинов в тканях некоторых видов животных Е.И. Бритвина (1976) выявила тромбодефенсины практически во всех исследованных экстрактах тканей, но в разных количествах.

Сравнение данных по уровням тканевого распределения бета-лизина, позволяет сделать вывод, что антимикробные пептиды в наибольшей концентрации сосредоточены в тканях, которые характеризуются высоким содержанием и активностью фагоцитирующих клеток и тромбоцитов.

Изучены биологические характеристики бета-лизина (Бухарин О.В. Васильев Н.В., 1977; Martin Е. et al., 1995; Bowdish D. M. et al., 2005), в частности, его антимикробная активность.

Ранние работы, посвященные изучению антимикробного действия ТКБ человека, выявили высокую активность белков в отношении микроорганизмов грамположительной группы (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Staphy-

lococcus aureus). При этом наиболее чувствительными к бета-лизину были В. subtilis и В. megaterium (Matheson A.R., Donaldson D.M., 1970).

L. Shultz и M. Wilder (1971) обнаружили листерицидный эффект кроличьей сыворотки и идентифицировали этот фактор как бета-лизин.

Последующие работы существенно расширили представления об антибактериальном эффекте ТКБ. В работе К.Г. Сулейманова (1998) показано, что тромбоцитарный катионный белок крови человека обладает бактерицидной активностью против спорообразующих грамположительных бактерий, стафилококков, стрептококков, энтерококков, микрококков.

Yi-Quan Tang с сотрудниками (2002), изучая антибактериальные характеристики очищенного человеческого тромбодефенсина, установили, что данная группа белков, наряду с выраженной активностью в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Escherichia coli, также подавляет Candida albicans и Cryptococcus neoformans, причем наименее чувствительной к очищенному препарату среди всех изученных микроорганизмов оказалась С. albicans.

Таким образом, тромбоцитарный катионный белок характеризуется широким спектром бактерицидной активности. Чувствительность микроорганизмов определяется, в основном, их родовым и видовым происхождением (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977).

Попытку изучения механизма бактерицидного действия ТКБ впервые предпринял К.Г Сулейманов (1990), которому удалось установить, что бактерицидный эффект ТКБ прежде всего, связан с мембранотропностью, определяемой его катионными свойствами. Данное свойство обуславливает контакт тромбоцитарного белка с поверхностью бактериальной клетки. Такое взаимодействие не является неспецифическим, определяемым лишь электростатическим воздействием, но обуславливается лиганд-рецепторным характером связывания ТКБ и фосфолипидных компонентов мембран. В последующем аллостерические эффекты и непосредственное влияние ТКБ вызывают ингибицию гемсодержащих ферментов пероксидазы и катал азы. Подав-

ление активности ферментов нарушает равновесие в сторону усиления про-оксидантных реакций, то есть приводит к накоплению в клетке (мембранах) активных форм кислорода, которые инициируют перекисный распад липидов мембран и гибель клетки.

Между тем, известно, что многие микроорганизмы способны противостоять действию тромбодефенсинов (Журлов О.С., Иванов Ю.Б., 2005). Среди всех изученных микроорганизмов бактерии кишечно-сальмоннелезной группы оказались наиболее устойчивыми к ТКБ (Salzman N. Н. et al., 2003).

Исследования, проведенные группой американских и австралийских ученых, показали, что наличие гена qacA у S. aureus обеспечивает резистентность не только ко многим антибиотикам, но и к действию тромбоцитарного катионного бежа кролика (Kupferwasser L.I. et al., 1999). Способность к инактивации ТКБ широко представлена среди копроизолятов анаэробных микроорганизмов различных таксонов (Елагина H.H., 2000).

Устойчивость микроорганизмов к ТКБ продемонстрирована в работах американских исследователей. Так, в исследованиях по изучению роли тромбоцитарного катионного белка в борьбе с инфекционным эндокардитом было показано, что Streptococcus viridans, являющийся возбудителем данного заболевания, характеризуется более значительной устойчивостью к действию тромбоцитарного катионного белка, чем Streptococcus viridans, выделенный из ротовой полости здоровых людей (Dankert J. et al., 2001).

Необходимо отметить, что гораздо меньшее внимание современных исследователей сосредоточено на изучении антимикробных свойств тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных. Обширная работа по изучению антимикробных свойств этой группы белков проделана сотрудниками Оренбургского ГАУ. Результаты данных исследований свидетельствуют о наличии антимикробной активности у тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных в отношении широкого спектра грамположительных, грамотрица-тельных форм бактерий и Candida albicans (Шейда Е.В., 2010).

При этом исследователи отмечают, что наибольшую активность проявлял тромбоцитарный катионный белок кур и лошадей, меньшую - ТКБ крупного рогатого скота. Также важно отметить, что в вышеуказанных работах впервые показано наличие низкомолекулярных катионных белков в тромбоцитах кур (Сычева М.В. с соавт., 2009). В процессе изучения регуляции пер-систентных характеристик микроорганизмов тромбодефенсинами, установлено, что они влияют на факторы персистенции микроорганизмов, снижая антилактоферриновую активность у Е. coli и Е. faecalis, С. albicans, а также оказывают модифицирующее влияние на биопленкообразование, снижая его у грибов и усиливая у бактерий (Сычева М.В. с соавт., 2010, 2011).

Необходимо акцентировать внимание также на важной роли ТКБ в иммунном и общем гомеостазе макроорганизма.

Ещё в 1977 году D.M. Donaldson и J.G. Tew показали, что обработка бактерий бета-лизином приводит к «утечке» из цитоплазмы веществ с максимумом поглощения при 280 нм. В дальнейшем К.Г. Сулейманов (1998) в работе по определению влияния ТКБ на проницаемость мембран соматических клеток установил, что ТКБ способен их стабилизировать в экстремальных условиях.

Интерес представляют данные по влиянию ТКБ на активность некоторых гемсодержащих ферментов. Оказалось, что ТКБ оказывает ингибирую-щее влияние на пероксидазную и каталазную активности, а также способен снижать активность миелопероксидазы. Опыты по изучению влияния ТКБ на активность ферментов антиокислительной защиты позволили выявить уменьшение тромбодефенсинами глютатионпероксидазной активности фермента (Бухарин О.В., Сулейманов К.Г, 1997).

В настоящее время установлена цитолитическая активность тромбоде-фенсинов. Наглядно такое свойство ТКБ было продемонстрировано в отношении лимфоцитарных клеток крови, полученных от животных больных лейкозом. Важная роль ТКБ в общем иммунном гомеостазе позволяет отнести ТКБ к белкам, способным осуществлять надзор и выявлять патологиче-

ски изменённые клетки (Сулейманов К.Г. с соавт., 1983; Бухарин О.В. с со-авт., 2000; Мс Keown S.T., 2006).

Таким образом, тромбоцитарный катионный белок представляет огромный интерес для современной медицины и ветеринарии, он характеризуется мощным микробицидным действием в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также грибов, вирусов и простейших.

При этом представленные данные свидетельствуют о важной роли ТКБ в общем и иммунном гомеостазе макроорганизма, где он выступает в качестве регулятора некоторых ферментов и выполняет функцию «надзора», путем выявления в организме патологически измененных клеток.

Несмотря на многочисленные исследования тромбоцитарного катион-ного белка, необходимо отметить, что данные относительно биологических характеристик антимикробных белков из тромбоцитов сельскохозяйственных животных весьма скудны, между тем, наличие у ТКБ, наряду с мощным микробицидным эффектом, также и гомеостазирующей активности открывает широкую перспективу для дальнейшего изучения данной группы белков с целью поиска новых более рациональных подходов в профилактике и лечении инфекционных заболеваний.

2.5 Перспективы практического применения антимикробных пептидов Прикладное значение антимикробных пептидов на современном этапе научных исследований, прежде всего, необходимо рассматривать в контексте поиска новых подходов в лечении инфекционных заболеваний. До самого последнего времени лечение и профилактика бактериальных инфекций заключались в предотвращении или подавлении размножения микроорганизмов в организме антибиотиками, в тяжелых случаях использовались также различные методы модуляции иммунного ответа с помощью кортикостеро-идных гормонов. Однако в случаях тяжелых инфекций часто классические способы не дают терапевтического эффекта в силу множественной антибиотической устойчивости микроорганизмов (Ganz Т. et al., 1985; Yamasaki К.,

Gallo R.L., 2008). В данных условиях в качестве важного арсенала совершенствования существующих терапевтических подходов выступают антимикробные пептиды. На сегодняшний день прикладные разработки в области применения КАМП для лечения инфекционных заболеваний развиваются по трем важным направлениям. Первое направление связано с разработкой антимикробных препаратов на основе пептидов, характеризующихся мощной микробицидной активностью. Такие антимикробные препараты, по мнению экспертов, в ближайшем будущем заменят ряд существующих на сегодняшний день антибиотиков (Zhang L. et al., 2005; Zhang L., Falla T.J., 2006). Преимуществами антимикробных пептидов перед традиционными антибиотиками являются: быстрое микробицидное действие; мультицелевой механизм антимикробного действия, что значительно снижает вероятность появления устойчивости среди инфекционных агентов. Также необходимо отметить, что ряд АМП, наряду с антибактериальным действием обладает противовирусной и противогрибковой активностями (Lehrer R. I. et al., 1990; Benincasa M., 2003; Kavanagh К., Dowd S., 2004; Yamasaki K„ Gallo R.L., 2008).

Результатом серии работ в данном направлении стало получение антимикробных пептидов, некоторые из которых уже успешно прошли клинические испытания и используются в медицинской практике. Среди таких пептидов наибольшую популярность на сегодняшний день имеют два производных индолцидина - MBI-226 и MX-594AN. В серии клинических испытаний, проводимых компанией Magenix (Канада), было показано, что пептид MBI-226 эффективен при лечении катетер-ассоциированных инфекций, приводя к 40%-сокращению колонизации катетера. Пептид MX-594AN характеризовался высокой эффективностью при лечении акне (Nibbering Р. Н. et al., 2001; Zhang L., Falla T.J., 2006).

Компания BioMedix разрабатывает серию гексапептидов, которые, как предполагают, будут эффективными в условиях организма при лечении различных дерматологических заболеваний (Jenssen Н. et al., 2006), так как они характеризуются мощным бактерицидным и противогрибковым действием.

Фармацевтическая фирма по разработке новых антибиотических препаратов на основе магейнина (Magainin Pharmaceutic alslnc.) создала пептид MSI-78, который проходит клинические испытания на пациентах, больных диабетом с инфицированными язвами стопы. Этот пептид оказался эффективным против устойчивых к метициллину S. aureus и S. epidermidis, а также гентамицин устойчивого штамма P. aeruginosa. В испытаниях in vitro с использованием S. aureus в качестве тест-штамма, у бактерий не выявлено формирования резистентности к пептиду MSI-78, что делает его перспективным для наружного применения при кожных заболеваниях (Zasloff М., 1987).

Эффективность антимикробного пептида плектазина из гриба Pseudo-plectania nigrella, полученного рекомбинантным путем компанией No-vozymes, показана на таких моделях бактериальных инфекций, как перитонит и пневмония. Наряду с высокой антибактериальной эффективностью, плек-тазин проявлял низкую токсичность (Kokryakov V. et al., 1993).

В США проходит испытание пептид из нейтрофилов свиньи, который предполагается использовать для лечения язв ротовой полости у онкологических больных после радио- и химиотерапии (В от an H.G., 1987), а также применять в форме аэрозоля при тяжелых формах пневмоний, требующих искусственной вентиляции легких.

Следующим, не менее перспективным направлением применения антимикробных пептидов, является разработка иммуномодулирующих препаратов, поскольку известно, что КАМП, наряду с мощным микробицидным эффектом, проявляют также иммуномодулирующие свойства (Bowdish D. М. et. al., 2005). Известна способность антимикробных пептидов вызывать высвобождение провосполительных цитокинов, тем самым привлекая нейтро-филы, моноциты, макрофаги, Т-лимфоциты к очагу инфекции (11, 20 овечий дефенсин). Согласно данным, полученным R.E.W. Hancock (2001), существует возможность заживлять с помощью антимикробных пептидов открытые

раны, привлекая к месту поражения фибробласты, которые являются важной составлющей процесса регенерации эпителиальной ткани.

В основу третьего важного направления исследований по практическому использованию КАМП в борьбе с инфекционными заболеваниями положено явление синергизма, которое присуще большинству известных в настоящее время антимикробных пептидов.

Установлено, что наряду с антимикробным эффектом вещества данной группы обладают синергизмом с другими соединениями, включая антибиотики (Skerlavaj В. et al., 1996; Hancock R.E.W., Scott M.G., 2000, De Clercq E., 2004). Эти знания были положены в основу разработки комплексной терапии с использованием антимикробных пептидов. Так, в исследованиях in vitro было показано, что низин, продуцируемый Lactococcus lactis и ранолексин, выделенный из кожи лягушки Ranacates beiana, вызывали деградацию бактериальной клеточной мембраны, тем самым облегчая доступ антистафилококкового антибиотика - амоксациллина. Весьма показательными в рамках изучения синергизма КАМП с другими веществами стали исследования M.G. Scott с соавт. (2000), которые продемонстрировали значительное усиление антимикробной активности лактоферрина при совместном действии индоли-цидина с протегрином.

Несмотря на многообещающие перспективы применения КАМП в биологии есть несколько проблем, которые на сегодняшний день предстоит еще решить. Во-первых, в условиях организма КАМП чрезвычайно восприимчивы к протеолитическому действию ферментов (Hilpert К. et al., 2004).

Во-вторых, недостаточно информации о потенциальной токсичности длинноцепочечных и высокозаряженных пептидов. Кроме того, у большинства природных пептидов наряду с антимикробной активностью также выявлено гемолитическое действие. В будущем, вышеуказанные проблемы планируется решить путем создания искусственных аналогов природных соединений, обладающих антимикробной активностью (Zasloff М. et al., 1988;

ве У. & а1., 1999; Ра^ука! А. а1., 2002; НаИоск К. I а1., 2003; Krajewski К. е1 а1., 2004; БсиШего О. е1 а1., 2010).

Необходимо отметить, что антимикробные пептиды представляют интерес не только в контексте борьбы с инфекционными заболеваниями.

Особое внимание исследователи уделяют противоопухолевому действию катионных антимикробных пептидов. Показано, что опухолевые клетки более чувствительны к действию АМП, так получены обнадёживающие результаты по лечению меланомы, рака яичников и лимфомы, но пока только у подопытных животных (Сипайлова О.Ю., Корнеев Г.И., 2009).

Таким образом, изучение биологических свойств антимикробных пептидов представляет несомненный интерес. В условиях стремительного роста инфекционных заболеваний, а также увеличения антибиотикорезистентных штаммов, изучение механизмов антибиотикорезистентности, наряду с углубленным исследованием роли антимикробных пептидов во врожденном иммунитете, станет основанием для разработки антимикробных препаратов нового поколения. Но следует отметить, что в настоящее время в отечественной и зарубежной литературе недостаточно информации об антимикробной активности тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных, их биологических свойствах. Изучение этих вопросов и явилось целью настоящего исследования, задачи которого изложены во введении.

III СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Материалы и методы исследований

В исследование были включены клинически здоровые животные, хорошей упитанности: лошади - 5 голов, трех-четырех летнего возраста; крупный рогатый скот - 5 голов, 5-7 летнего возраста; куры-бройлеры на заключительном этапе откорма в количестве 2000 голов.

Кровь у клинически здоровых лошадей и крупного рогатого скота отбирали при убое животных на скотобойнях, а также на базе частных фермерских хозяйств Беляевского и Переволоцкого районов Оренбургской области, у кур - при массовом убое на ЗАО птицефабрика «Оренбургская» Оренбургского района Оренбургской области.

Убой и взятие крови проводили с соблюдением санитарно-гигиенических правил в чистую пластиковую посуду. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия из расчета 1:10.

При убое крупных животных (лошади, крупный рогатый скот) кровь отбирали в количестве 7-9 литров от одного животного, у кур - сборную кровь в количестве 3-5 литров.

Автотранспортировку и выделение тромбоцитарной массы проводили в течение шести часов после получения крови.

Кислоторастворимые белки тромбоцитов сельскохозяйственных животных (лошади, куры, крупный рогатый скот) выделяли методом кислотной экстракции.

Для этого обогащенную тромбоцитами плазму центрифугировали при 250 g в течение 30 минут. Супернатант вновь центрифугировали при 1000 g 30 минут. Осаждённые тромбоциты отмывали трижды средой 199 (с добавлением 3,8% цитрата натрия в соотношении 1:10). Тромбоцитарную массу ресуспендировали в 10%-ной уксусной кислоте в соотношении 1:10, трижды замораживали при -15°С. После дефростации полученный экстракт центрифугировали при 1000 g в течение 40 минут.

Содержание белка в полученных кислотных экстрактах определяли по методу М.М. Брэдфорда (1976) с использованием красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 («SIGMA», Германия). В лунки 96-луночного планшета вносили по 150 микролитров стандартных разведений бычьего сывороточного альбумина («SIGMA», Германия), разведенного в 10% уксусной кислоте в концентрациях, соответствующих 1, 2, 4 и 5 мг/мл и кислотные экстракты тромбоцитарного катионного белка лошадей, крупного рогатого скота и кур.

В качестве контроля использовали 10% уксусную кислоту. В каждую лунку планшета добавляли по 75 мкл реагента Coomassie и встряхивали 20 секунд на шейкере, после чего инкубировали при комнатной температуре 5 минут. Значения оптической плотности определяли на спектрофотометре STAT FAX 2100 при длине волны 595 нм. На основании полученных значений оптической плотности при измерении стандартных разведений, строили стандартную калибровочную кривую и с ее помощью рассчитывали концентрацию белка в образцах.

Исследования по определению влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на биологические свойства микроорганизмов проводили в период с 2010 по 2013 гг. на базе кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет».

Изучение влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на антибиотикочувствительность микроорганизмов осуществляли на клонах музейных культур Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Candida albicans, выделенных от сельскохозяйственных животных больных инфекционными заболеваниями, штаммы культур получены нами из коллекции лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистентных свойств бактерий ИКВС УрО РАН.

Получение клонов исследуемых микроорганизмов проводили путем рассева суточной культуры на плотную питательную среду в соответствии с

указаниями Дж. Миллера (1976), затем отбирали клоны с наиболее высокими показателями изучаемого признака.

С целью определения влияния ТД на микроорганизмы взвесь суточных агаровых культур с оптической плотностью 0,270 при 650 нм, разведенную 1:1000 стерильным физиологическим раствором с БСА, соинкубировали с кислотными экстрактами из тромбоцитов в концентрациях, соответствовавших 1 МПК и 1:4 МПК, установленных ранее (Сычева М.В. с соавт., 2010).

Перед работой рН кислотных экстрактов доводили 0,1% раствором аммиака до 5,5-5,8 и инкубировали с микроорганизмами в течение 1 часа при

после чего высевали по 0,2 мл на питательный агар и инкубировали 24 часа при 37°С. В качестве контроля использовали те же культуры микроорганизмов, которые инкубировали с 10%-ным раствором ацетата, нейтрализованного до рН 5,5-5,8.

Антибиотикочувствительность микроорганизмов определяли с помощью диско-диффузионного метода (Методические указания МУК 4.2.189004, 2004).

В эксперимент по изучению влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам представителей нормальной микрофлоры экспериментально отобрали антагонистически активные штаммы бактерий рода Lactobacillus (L 364 и L 370) среди штаммов, выделенных из толстого кишечника крупного рогатого скота, а также использовали штаммы E.coli, выделенные из пробиотиков «Микроцикол» и «Бификол» и E.faecium, выделенные из пробиотика «Оралин 35G».

Для выделения штаммов Е. coli, готовили ряд серийных разведений (Ю-1, 10"3, 10'5)

из пробиотиков «Микроцикол», «Бификол» в стерильном физиологическом растворе хлорида натрия, высевали в объеме 1 мл на поверхность среды Эндо, инкубировали в течение 24 часов при

37°С. Выделенные микроорганизмы идентифицировали по морфологическим, тинкто-риальным, культуральным и биохимическим свойствам.

С целью выделения пробиотического штамма Е. faecium из препарата «Оралин 35G», полученные разведения высевали в объеме 1 мл на поверхность Enterococcosel-Agar, инкубировали и идентифицировали по морфологическим тинкториальным, культуральным биохимическим свойствам.

При выделении лактобацилл исследуемый материал засевали на среду MRS, культивировали в течение 2 суток в микроаэрофильных условиях (в эксикаторе). Идентификацию проводили на основании морфологических, культуральных и биохимических свойств.

Штаммы условно-патогенных микроорганизмов (S. aureus, Е. coli (гем+), К. pneumoniae, С. albicans) получены из коллекции лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистентных свойств бактерий ИКВС УрО РАН.

Выделение клонов осуществляли путем рассева суточной бульонной культуры на плотную питательную среду в соответствии с указаниями Дж. Миллера (1976).

Взвесь суточных культур условно-патогенных микроорганизмов с оптической плотностью 0,270 при 650 нм, разведенную 1:1000 стерильным физиологическим раствором с бычьим сывороточным альбумином, соинкуби-ровали с тромбодефенсинами в минимальной подавляющей концентрации и % МПК в течение 1 часа при 37°С, после чего высевали по 0,2 мл на питательный агар и инкубировали 24 часа при 37°С.

Чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам представителей нормальной микрофлоры определяли с помощью чашечного метода (принцип отсроченного антагонизма) (Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966).

Для этого суточные культуры антагонистически активных микроорганизмов засевали уколом на плотную среду, культивировали при 37°С в течение 24 часов, обрабатывали парами хлороформа в течение одного часа, после чего чашки высушивали в течение 20 минут на воздухе.

Параллельно готовили взвесь бактерий: Е. coli (гем+), К. pneumoniae, S. aureus, С. albicans в концентрации 1 миллиард микробных клеток в 1 мл, смешивали с 4 мл расплавленного и остуженного до 45°С 0,7% мясопептон-ного агара и заливали тонким слоем поверхность среды с антагонистически активными микроорганизмами. Чашки культивировали 24 часа в термостате при температуре 37°С, после чего измеряли зоны задержки роста испытуемых культур с помощью штанген-циркуля.

Степень чувствительности к антагонистическим факторам представителей нормальной микрофлоры выражали с помощью коэффициента, который рассчитывали как отношение диаметра зоны задержки роста условно-патогенного микроорганизма к диаметру зоны роста представителей нормальной микрофлоры. Диаметры зон задержки роста условно-патогенных микроорганизмов до и после соинкубирования с тромбодефенсинами показаны на рисунке 1.

а б

Рисунок 1. Зоны задержки роста S. aureus до (а) и после (б) соинкубирования с тромбодефенсинами кур в МПК

Определение антилизоцимной активности (AJ1A) микроорганизмов осуществляли с помощью фотометрического метода (Бухарин О.В., 1999).

Для проведения эксперимента по влиянию тромбодефенсинов на АЛА условно-патогенных микроорганизмов предварительно был осуществлен подбор штаммов микроорганизмов с высоким уровнем антилизоцимной активности и получены клоны с данным признаком (Е. coli, S. aureus, С. albicans, К. pneumoniae). Суточные культуры условно-патогенных микроорганизмов соинкубировали с кислотными экстрактами из тромбоцитов в концентрациях, соответствовавших 1 МПК и % МПК. В качестве контроля использовали те же культуры микроорганизмов, которые инкубировали с 10%-ным раствором ацетата, нейтрализованного до рН 5,5-5,8. Из биомассы исследуемых культур готовили миллиардную взвесь по стандарту мутности БАК 10 в стерильном питательном бульоне объемом 2,9 мл. Полученные взвеси микроорганизмов культивировали в термостате при 37°С в течение 24 часов. В качестве тест-штамма использовали культуру Micrococcus luteus, который засевали газоном на поверхность 1,5 % питательного агара и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. На следующий день взвеси исследуемых микроорганизмов центрифугировали при 3000 g 20 мин.

Культуру М. luteus обрабатывали парами хлороформа, после чего несколько раз смывали стерильным физиологическим раствором хлорида натрия и полученную взвесь доводили до плотности рЮ,3 при длине волны 650 нм. В качестве контроля использовали стерильный питательный бульон.

Супернатанты исследуемых микроорганизмов вносили в лунки микропланшета в объеме 50 мкл, после чего в каждую лунку добавляли по 200 мкл взвеси М. luteus. Спустя 30 сек и 150 сек после внесения М. luteus проводили замер оптической плотности при длине волны 650 нм. Антилизоцимную активность рассчитывали по формуле:

АЛА =

-АО

. ДК

х 2,2,

где АЛА - антилизоцимная активность;

ДО - разница оптической плотности между первым и вторым замерами;

ДК - среднее арифметическое разниц оптических плотностей парных контролей после первого и второго замеров.

Антилизоцимную активность выражали в мкг/мл.

Полученные значения антилизоцимной активности испытуемых культур, соинкубированных с тромбодефенсинами, сравнивали с контролем, в качестве которого выступали те же культуры микроорганизмов, которые инкубировали с 10%-ным раствором ацетата, нейтрализованного до рН 5,5-5,8.

Полученные численные материалы были обработаны статистически с определением средних значений, среднего квадратического отклонения и ошибки средней. Достоверность различий сравниваемых показателей оценивалась по ^критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 (Лакин В.Г., 1990).

3.2 ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Антибиотикорезистентность представляет собой свойство, которое присуще большинству известных на сегодняшний день патогенных и условно-патогенных бактерий, возникшее в результате неконтролируемого применения антимикробных препаратов. Решение проблемы преодоления анти-биотикорезистентности в настоящее время, главным образом, направлено на поиск новых путей терапии инфекционных заболеваний (Spellberg В., 2008).

В рамках преодоления антибиотикорезистентности микроорганизмов, интересным подходом является разработка препаратов нового поколения на основе антимикробных пептидов, в том числе тромбодефенсинов животного происхождения.

Для этого нами было изучено влияние ТД, выделенных от сельскохозяйственных животных, на чувствительность (устойчивость) микроорганизмов разных видов к антибиотикам. Основой для выбора соответствующих антибактериальных препаратов явились данные о природной чувствительности к ним использованных в данном исследовании видов микроорганизмов.

Вначале мы определили влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных в минимальной подавляющей концентрации (МПК) и % МПК на чувствительность клонов Е. coli к левомицетину, канамицину, ло-мефлоксацину.

В результате проведенных исследований были получены следующие результаты: антимикробные пептиды из тромбоцитов крупного рогатого скота в МПК увеличивали зоны задержки роста клонов Е. coli к левомицетину до 20,7±1,2 мм (контроль составлял 19,2±0,8 мм), в 'Л МПК до 19,8±1,4 мм.

При соинкубировании с ТД кур в МПК зарегистрировано повышение чувствительности к левомицетину (зоны задержки роста микроорганизмов составили 20,5±0,9 мм) и отсутствие изменений по сравнению с контролем

при влиянии тромбодефенсинов в 1А МПК - 19,0±0,63 мм. Чувствительность клонов Е. coli к левомицетину под влиянием тромбодефенсинов лошади в МПК незначительно повышалась: зоны задержки роста составляли 20,3±0,8 мм и не изменялись при воздействии Vi МПК, составляя в среднем 19,3±0,9 мм.

Максимальная зона задержки роста кишечной палочки отмечена после ее соинкубирования с кислотным экстрактом из тромбоцитов кур в минимальной подавляющей концентрации под действием ломефлоксацина, средняя зона задержки роста клонов составила 24,7±1,5 мм против 20,7±0,8 мм в контроле (р<0,05) (табл.1).

Подверженной влиянию всех изученных ТД оказалась также чувствительность клонов Е. coli к канамицину. Максимальное изменение данного признака под воздействием кислотного экстракта из тромбоцитов установлено при соинкубировании кишечной палочки с тромбодефенсинами лошади и крупного рогатого скота в МПК, при этом зона задержки роста Е. coli составила 18,8±1,2 мм и 19,0±1,8 мм соответственно, против 15,2±2,5 мм в контроле. При соинкубировании кишечной палочки с ТД крупного рогатого скота и лошадей в Ул МПК изменения зон задержки роста микроорганизма были менее выраженными и составляли 16,0±2,0мм и 16,5±1,6 мм. Напротив, тромбодефенсины кур в МПК не оказывали влияния на чувствительность клонов Е. coli к данному антибиотику (15,2±0,5 мм), а в % МПК зоны задержки роста микроорганизмов составляли в среднем 17,2±1,7 мм.

Тромбодефенсины кур в Ул МПК также повышали чувствительность Е. coli к ломефлоксацину, при этом средние значения зон задержки роста микроорганизмов равнялись 23,7±1,4 мм. Тромбодефенсины лошади незначительно повышали чувствительность клонов Е. coli к данному антибиотику как в МПК, так и в Ул МПК (21,7±1,20 и 22,3±0,6 мм, соответственно). Аналогичные значения были получены и при изучении влияния тромбодефенсинов крупного рогатого скота на чувствительность к ломефлоксацину клонов Е. coli, при этом зоны задержки роста микроорганизмов были практически

Заключение диссертации по теме «Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов», Галиуллина, Ленара Фаилевна

ВЫВОДЫ

1. Тромбодефенсины крови сельскохозяйственных животных повышают чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антимикробным средствам. Степень выраженности данного признака зависит от механизма действия антибиотика, в отношении которого определяли чувствительность. Наиболее выраженный эффект оказывают ТД лошадей и кур.

2. Экспериментально в условиях in vitro выявлено, что антимикробные пептиды из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных модифицируют биологические свойства микроорганизмов, определяющие их взаимоотношения с другими участниками микробной популяции.

3. Установлено, что тромбодефенсины сельскохозяйственных животных преимущественно, повышают чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к факторам межмикробного воздействия нормальной микрофлоры макроорганизма, при этом чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистическому действию штаммов лактобацилл максимально повышалась после их предварительного соинкубирования с ТД крупного рогатого скота, а к антагонистическому действию штаммов Е. coli и Е. faecium - после соинкубирования с тромбодефенсинами кур и лошадей.

4. При изучении влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов установлено их ингибирующее действие на способность микроорганизмов к инактивации лизоцима. Отмечен выраженный подавляющий АЛА бактерий эффект у ТД лошадей в Ул МПК.

5. Проведенными исследованиями установлено, что наибольший подавляющий эффект в отношении изученных биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов проявляли ТД кур и лошадей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Тромбодефенсины, повышающие чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к факторам межмикробного воздействия нормальной микрофлоры макроорганизма, антимикробным средствам и подавляющие антилизоцимную активность УПМ, могут быть использованы для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний животных и являться альтернативой существующим антимикробным препаратам: антибиотикам, пробиотикам.

2. Полученные результаты могут быть использованы при составлении научной и информационной литературы, в учебном процессе, при проведении лекционных и лабораторно-практических занятий по микробиологии, иммунологии, фармакологии, а также при проведении научных исследований по изучению тромбодефенсинов на кафедрах высших учебных заведений или лабораториях научно-исследовательских институтов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Галиуллина, Ленара Фаилевна, 2013 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Антибактериальный спектр тромбодефенсинов некоторых видов животных / М.В. Сычева, Е.В. Шейда, А.П. Жуков, О.Л.Карташова // Аграрный вестник Урала. - 2010. - №7. - С. 50-51.

2. Андрющенко, C.B. Генетические детерминанты специфических секретируемых ингибиторов лизоцима в антилизоцимной активности энтеробактерий / C.B. Андрющенко // Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. -Оренбург, 2012. - 22 с.

3. Антимикробная активность тромбодефенсинов разных видов животных / М.В. Сычева, Е.В. Шейда, А.П. Жуков, О.Л.Карташова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2009 .- №4. - С. 177-179.

4. Ассоциативный симбиоз / О.В. Бухарин, Е.С. Лобакова, Н.В. Немцева, C.B. Черкасов - Екатеринбург: УрО РАН. - 2007. - 264с.

5. Афиногенов, Г.Е., Антимикробные полимеры / Г.Е. Афиногенов, Е.Ф. Панарин. - СПб, 1993. - 264 с.

6. Бритвина, Е.И. Факторы естественного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: бета-лизины и лизоцим в секретах и тканях организма человека / Е.И. Бритвина. - Омск, 1976. В.4. - С. 92-93.

7. Бурмистрова, А. Л. Антибиотики и антибиотикорезистентность. Проблемы и пути решения / А.Л. Бурмистрова. - Челябинск: ФГУП «Челябинский дом печати». - 2004. - 176 с.

8. Бухарин, О.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине: монография / О.В. Бухарин, Н.В. Васильев. -Томск: ТГУ, 1977. - 174 с.

9. Бухарин, О.В. Антилизоцимный тест как маркер персистенции микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов // Теоретическая и прикладная иммунология: Тез. докл. I Всесоюз. конф. - М., 1982. - С. 87-88.

10. Бухарин, O.B. Лизоцим микроорганизмов / O.B. Бухарин, H.B. Васильев, Б.Я. Усвяцов. - Томск: Изд-во Томского университета. - 1985. - 212 с.

11. Бухарин, О.В. Биологические характеристики тромбоцитарного ка-тионного бежа - бета-лизина / О.В. Бухарин, К.Г. Сулейманов // Вопросы мед. химии. - 1997. - № 3. - С. 45-47.

12. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий / О.В. Бухарин. -М.: Медицина. - 1999. - 368 с.

13. Бухарин, О.В. Антимикробный белок тромбоцитов: монография / О.В. Бухарин, В.А. Черепшев, К.Г. Сулейманов. - Екатеринбург, 2000. - 200 с.

14. Бухарин, О.В., Биология и экология энтерококков / О.В. Бухарин, A.B. Валышев. - Екатеринбург: УрО РАН. - 2012. - 222 с.

15. Влияние препаратов стероидных гормонов на персистентные и ростовые характеристики стафилококков / Ю.Б. Иванов, С.В.Черкасов, М.Д. Кузьмин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1997. - № 4. - С. 92-96.

16. Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на антилактоферриновую активность микроорганизмов / М.В. Сычева, Е.В. Шейда, А.П. Жуков, О.Л.Карташова // Материалы международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства»: Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Баумана. -Казань, 2010. - С. 256-259.

17. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к образованию биопленок / М.В. Сычева, Е.В. Шейда, О.Л. Карташова и др. // Известия КрасГАУ. - 2011. - №1. - С. 130-132.

18. Влияние антимикробных пептидов тромбоцитов человека на биопленкообразование Staphylococcus aureus / О.С. Журлов, Н.Б.Перунова, Е.В. Иванова и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2012. -

№ 4. - С. 66-70.

19. Влияние фитосубстанций, обладающих антиоксидантной активностью, на персистентные свойства микроорганизмов / В.А. Куркин, A.B. Жестков, Т.М.Уткина, О.Л.Карташова // Антибиотики и химиотерапия. -2009.-№9-10.-С. 16-18.

20. Влияние лекарственных растений на антилизоцимную активность микроорганизмов / О.В. Бухарин, O.E. Челпаченко, Б.Я. Усвяцов и др.// Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - № 5. - С. 11-14.

21. Горюхина, O.A. Выделение катионных белков из тромбоцитов крови кроликов и изучение их бактериостатической активности / O.A. Горюхина, A.A. Ткаченко // Вопросы мед. химии. - 1978. - № 1.- С. 17-22.

22. Гинодман, Л.М. Хромотография белков на ионообменниках и фракционирование смесей, содержащих белки, на колонках с сефадексом / Л.М. Гинодман //В кн.: Современные методы в биохимии. Под ред. В. Н. Ореховича: М., 1964. - С. 37-73.

23. Доронин, А.Ф., Функциональное питание / А.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров. - М.: Грангь, 2002. - 295 с.

24. Дьяченко, СВ. Фармакоэпидемиологические основы антибактериальной терапии распространенных заболеваний / С.В. Дьяченко. - Хабаровск: Изд. центр ГОУ ВПО ДВГМУ, 2010. - 402 с.

25. Егоров, Н.С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение / Н.С. Егоров, И.П. Баранова // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - Т.44. -№6,- С. 33-40.

26. Елагина, H.H. Факторы персистенции неспорообразующей анаэробной микрофлоры кишечника человека / H.H. Елагина // Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Оренбург, 2000. - 18 с.

27. Журлов, О.С. Способность анаэробной фекальной микрофлоры к инактивации антимикробного белка тромбоцитов / О.С. Журлов, Ю.Б. Иванов //Вестник ОГУ. - 2005. - №6. - С. 135-136.

28. Забирова, Т.М. Биологические свойства лактобацилл биотопов человека в норме и при дисбиозах / Т.М. Забирова // Автореф. дисс...канд. мед. наук. - Оренбург, 2001. - 18 с.

29. Зыкова, Л.С. Этиологическая характеристика пиелонефрита и ее значение для экспериментально-клинического обоснования антибактериальной терапии /Л.С. Зыкова // Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Челябинск, 1986. - 20 с.

30. Кокряков, В.Н. Катионные белки лизосом нейтрофильных гранулоцитов при фагоцитозе и воспалении / В.Н. Кокряков // Вопросы мед. химии. - 1990. - Т. 36. - №6. - С. 13-16.

31. Кокряков В.Н. Дефенсины и родственные им антибиотические пептиды в эволюции защитных систем животных /В.Н.Кокряков, В.Е.Стефанов, Г.М. Алешина и др. // Журн. эволюционной биохимии и физиологии. - 1997. - №1. - Т. 33. - С. 109-123.

32. Кокряков, В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения: монография / В.Н. Кокряков. - СПб.: Наука, 1999. -162 с.

33. Кокряков, В.Н. Очерки о врождённом иммунитете: монография / В.Н. Кокряков. - СПб.: Наука. - 2006. - 261 с.

34. Кудлай, Д. Г. Бактериоциногения / Д.Г. Кудлай, В.Г. Лиходед. -М.: Медицина. - 1966. - 203 с.

35. Курцев, Н.В. Некоторые физиологические показатели мясного скота на фоне сезонных факторов / Н.В. Курцев // Труды Всесоюзного НИИ мясного скотоводства,- 1975.-Вып. 18. - С. 149-153.

36. Кудряшов, Б.А. Катионные белки из нейтрофилов как ингибиторы неферментативной фибринолитической и антикоагулянтной активности плазмы крови / Б.А. Кудряшов, Л.А.Ляпина, В.Н. Кокряков // Вопросы мед. химии. - 1989. - № 3. - С. 103-108.

37. Кудряшов, Б.А. Эффект многократного внутримышечного введения дефенсина на противосвёртывающую систему и ангиоархитектонику

скелетной мышцы / Б.А. Кудряшов, М.В. Кондашевская, JI.A. Ляпина // Докл. АН СССР, 1989. - 304 (2). - С. 494-498.

38. Лакин, В.Г. Биометрия / В.Г. Лакин. - М.: Высшая школа. - 1990. -

228 с.

39. Ленцнер, A.A. О способности лактобацилл микрофлоры человека продуцировать лизоцим / A.A. Ленцнер // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол,- 1975. - № 8. - С.77-81.

40. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, А.П. Малышкин, Н.В. Немцева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1984. - №2,- С.27-28.

41. Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», 2004.

42. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Пер. с анг. / Дж. Миллер. - М.: Мир.- 1976. - 172 с.

43. Омелянский, В.Л. И.И. Мечников, его жизнь и труды / В.Л. Омелянский // Журнал микробиологии. -1917. -№1-2,- Т. IV. - С. 1-46.

44. Первушина, Л.А. Антилизоцимный признак микроорганизмов в бактериологической диагностике и лечении воспалительных заболеваний внутренних женских половых органов / Л.А. Первушина // Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Челябинск, 1990. - 20 с.

45 Петровская, В.Г., Ранние этапы инфекционного процесса (достижения и проблемы) / В.Г.Петровская, Б.И. Маракуша // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1987. - №10. - С. 107-116.

46. Поспелова, В.В. Биологическая характеристика некоторых производственных и свежевыделенных штаммов лактобацилл /В.В. Поспелова, М.А. Шабанская, Н.В. Морозова // Медицинские аспекты микробной экологии. - 1992. - Вып. 6. - С. 54-57.

47. Сафронов, A.A. Антилизоцимная активность и биологические свойства стафилококков при гнойно-септических заболеваниях / A.A. Сафронов,

В.И. Желтова // Персистенция бактерий. Под ред. О.В. Бухарина. - Куйбышев. -1987. - С. 19-22.

48. Сафронов, A.A. Значение антилизоцимной активности микроорганизмов в диагностике осложнений открытых переломов / A.A. Сафронов, В.И. Желтова // Персистенция бактерий. Под ред. О.В. Бухарина. Куйбышев. - 1987.-С. 58-61.

49. Семенов, A.B. Способ повышения антагонистической активности бактерий / A.B. Семенов // Вестник ОГУ. - 2007. - №6. - С. 100-103.

50. Сипайлова, О.Ю., Исследование противоопухолевой активности тромбодефенсинов in vivo / О.Ю. Сипайлова, Г.И. Корнеев // Вестник ОГУ. -2009. - № 6. - С. 344-347.

51. Соколов, В.Ю. Механизм антилизоцимной активности бактерий / В.Ю. Соколов // Автореф. дисс. ... канд.мед. наук. - Челябинск, 1990. - 22 с.

52. Сулейманов, К.Г. Свойства и иммунорегулятивная роль катионного белка (бета - лизина) из сыворотки крови человека: тез. докл. V Всесоюзн. симпоз. «Взаимодействие нервной и иммунной систем» / К.Г. Сулейманов. -Оренбург, 1990. - С. 185-186.

53. Сулейманов, К.Г. Роль бактерицидного тромбоцитарного катионного белка (ТКБ) в инфекционной патологии и гомеостазе / К.Г. Сулейманов // Автреф дисс... докт. мед. наук. - Челябинск, 1998. - 43 с.

54. Сулейманов, К.Г. Бета - лизин из сыворотки крови человека: тез. докл. IV Всесоюзн. биохим. съезда / К.Г. Сулейманов, О.В. Бухарин, Г.Т. Сухих. - Ленинград, 1979,- Т. 3,- С. 143.

55. Сулейманов, К.Г. Использование лизоцимного и бета - лизинового тестов для диагностики маститов у коров: тез. докл. IV Всесоюзн. симпоз. по машинному доению с.-х. животных / К.Г. Сулейманов, О.В. Бухарин, О.Л. Карташова. - Таллин, 1983. - С. 113-114.

56. Сычева, М.В. Антимикробные свойства тромбодефенсинов крупного рогатого скота / М.В. Сычева, Е.В. Шейда, О.Л. Карташова // Вестник ВНИИМС. - 2011.-№1.-С.43-49.

57. Тюрин, М.В. К механизму антагонистической активности лактобацилл / М.В. Тюрин, Б.А. Шендеров, Н.Г. Рахимова // Журнал микробиол., иммунобиол. и эпидемиол. - 1989. - №5. - С. 3-7.

58. Филиппов, В.А. Роль бактериоциногении в регуляции динамики полости рта/ В.А. Филиппов //Антибиотики. -1981. - №1. - С. 33-37.

59. Чернова, О.Л. Особенности микрофлоры и содержание лизоцима в молоке при разных формах мастита у коров / О.Л. Чернова, Н.К. Комарова // Ветеринария. - 2001. - № 4. - С. 32-34.

60. Шамова, О.В. Антимикробные пептиды из лейкоцитов русского осетра / О.В. Шамова, Д.С. Орлов, Т.В. Овчинникова // Фундаментальные исследования. - 2006. - №1. - С. 10-13.

61. Яковлев, В.П. Рациональная антимикробная фармакотерапия / В.П. Яковлев, С.В. Яковлев. - М.: Мир. - 2008. - 101с.

62. Шейда Е.В. Антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка сельскохозяйственных животных / Е.В. Шейда // Автреф.

дисс. ... канд. биол. наук. - Уфа, 2010. - 22 с.

63. Шендеров, Б.А. Пробиотики, пребиотики и синбиотики. Общие и избранные разделы проблемы / Б.А. Шендеров // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. - 2005. - №2. - С. 23-26.

64. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alpha-defensins / Y.Q. Tang, J. Yuan, G. Osapay et al. // Science. -1999. - Vol. 286. - P. 498-502.

65. Activity of two synthetic amphiphilic peptides and magainin-2 against herpes simplex virus types 1 and 2 / Y. Aboudy, E. Mendelson, I. Shalit et al. // Int. J. Pept. Protein Res. - 1994. - Vol. 43. - P. 573-582.

66. Albiol Matanic, V.C. Antiviral activity of antimicrobial cationic peptides against Junin virus and herpes simplex virus / V.C. Albiol Matanic, V. Castilla // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2004. - Vol. 23. - P. 382-389.

67. Alternative splicing determines the binding of platelet-derived growth factor (PDGF-AA) to glycosaminoglycans / F. Lustig , J. Hoebeke, G. Ostergren-Lunden et al. //Biochemistry. - 1996. - Vol. 35. - P. 12077-12085.

68. An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18 / R. Koczulla, G. vonDegenfeld, C. Kupatt et al. // J. Clin. Investig. - 2003. - Vol. 111. - P. 1665-1672.

69. Anti-HSV activity of lactoferricin analogues is only partly related to their affinity for heparan sulfate / H. Jenssen, J. H. Andersen, L. Uhlin-Hansen et al. // Antiviral Res. - 2004. - Vol. 61. - P. 101-109.

70. Antibacterial and antifungal properties of alpha-helical, cationic peptides in the venom of scorpions from southern Africa / L. Moerman, S. Bosteels, W. Noppe et al. // J. Eur. Biochem. - 2002. - Vol. 269. - P. 4799-4810.

71. Antimicrobial peptide therapeutics for cystic fibrosis / L. Zhang, J. Párente, S. M. Harris et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2005. - Vol. 49. - P. 2921-2927.

72. Antinematodal effect of antimicrobial peptide, PMAP-23, isolated from porcine myeloid against Caenorhabditis elegans / Y. Park, S. H. Jang, D. G. Lee et al. // J. Pept. Sci. - 2004. - Vol. 10. - P. 304-11.

73. Antiviral cyclic d,l-alpha-peptides: targeting a general biochemical pathway in virus infections / W. S. Home, C. M. Wiethoff, C. Cui et al. // Bioorg. Med. Chem. - 2005. - Vol. 13. - P. 5145-5153.

74. A small molecule CXCR4 inhibitor that blocks T cell line-tropic HIV-1 infection / T. Murakami, T. Nakajima, Y. Koyanagi et al. // J. Exp. Med. - 1997,-Vol. 186. - P. 1389-1393.

75. A wide range of medium-sized, highly cationic, alpha-helical peptides show antiviral activity against herpes simplex virus / H. Jenssen, J. H. Andersen, D. Mantzilas et al. // Antiviral Res. - 2004. - Vol. 64. - P. 119-126.

76. Augmentation of the bactericidal activities of human cathelicidin CAP18/LL-37-derived antimicrobial peptides by amino acid substitutions / I.

Nagaoka, K. Kuwahara-Arai, H. Tamamura et al. // Inflamm. Res. - 2005. - Vol. 54.-P. 66-73.

77. Bastian, A. Human alpha-defensin 1 (HNP-1) inhibits adenoviral infection in vitro / A. Bastian, H. Schafer // Regul. Pept. - 2001. - Vol. 101. - P. 157-161.

78. Bechinger, B. Membrane association and pore formation by alpha-helical peptides / B. Bechinger // Adv Exp Med Biol. - 2010. - Vol. 677. - P. 24-30.

79. Biological characterization of two novel cathelicidin-derived peptides and identification of structural requirements for their antimicrobial and cell lytic activities / B. Skerlavaj, R. Gennaro, L. Bagella et al. // J. Biol. Chem. - 1996. -Vol. 271.-P. 28375-28381.

80. Boman, H.G. Cell-free immunity in insects / H.G. Bom an // Annu. Rev. Microbiol. - 1987. - Vol. 41. - P. 103-126.

81. Boman, H. G. Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin PI and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine / H. G. Boman, B. Agerberth, A. Boman // Infect, hnmun. - 1993. - Vol. 61,— P. 2978-2984.

82. Boman, H.G. Cecropin: antibacterial peptides from insects and pigs / H.G. Boman // Phylogenetic Perspectives in Immunity: The Insect Host Defense. Austin. - 1994. - Vol. 8 - P. 24-37.

83. Boman, H. Peptide antibiotics: Holy or Heretic Grails of Innate Immunity II Scand / H. Boman // J. Immunol. - 1996. - Vol. 43. - P. 475-482.

84. Bovine lactoferrin peptidic fragments involved in inhibition of Echo virus 6 in vitro infection / A. Pietrantoni, M. G. Ammendolia, A. Tinari et al. // Antiviral Res. - 2006. - Vol. 69. - P. 98-106.

85. Bowdish, D. M. A revaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity / D. M. Bowdish, D. J. Davidson, R. E. Hancock // Curr. Protein Pept. Sci. - 2005. - Vol. 6. - P. 35-51.

86. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. - 1976. - № 72. - P. 248-254.

87. Brogden, K. A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria / K. A. Brogden // A Nat. Rev. Microbiol. - 2005. - Vol. 63.-P. 238-250.

88. Brown, K.L. Cationic host defense (antimicrobial) peptides / K.L. Brown, R.E. Hancock // Curr. Opin. Immunol. - 2006. - Vol. 18. - P. 24-30.

89. Bulet, P. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates II Immunological Reviews / P. Bulet, R. Stocklin, L. Menin . - 2004. - Vol. 198. - P. 169-184.

90. Cathelicidin anti-microbial peptide expression in sweat, an innate defense system for the skin / M. Murakami, T. Ohtake, R. A. Dorschner et al. // J. Investig. Dermatol. - 2002. - Vol. 119. - P. 1090-1095.

91. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate / H. Barth, C. Schafer, F. Adah et al. // J. Biol. Chem. -2003. - Vol. 278. - P. 41003 - 41012.

92. Cho, Y. Activity of protegrins against yeast-phase Candida albicans / Y. Cho, J. S. Turner, N. N. Dinh // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 2486 -2493.

93. Comparable efficacies of the antimicrobial peptide human lactoferrin 111 and gentamicin in a chronic methicillin-resistant Staphylococcus aureus osteomyelitis model / C. Faber, H. P. Stallmann, D. M. Lyaruu et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2005. - Vol. 49. - P. 2438 - 2444.

94. Crystal structure of defensin HNP-3 an amphiphlic dimer mechanisms of membrane permabilization / C.P. Hill, J. Yee, M.E. Selsted et al. // Scince. -1991. - Vol. 251. - P.1481-1485.

95. Cutaneous injury induces the release of cathelicidin anti-microbial peptides active against group A Streptococcus / R. A. Dorschner, V. K. Pestonjamasp, S. Tamakuwala et al. // J. Investig. Dermatol. - 2001. - Vol. 117. -P. 91-97.

96. Daher, K.A. Direct inactivation of viruses by human granulocyte defensins / K. A. Daher, M.E. Selsted, R. Lehrer // J. Virol. - 1986. - Vol. 60. - P. 1068-1074.

97. Dathe, M. Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells /M. Dathe, T. Wieprecht//Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 1462. - P. 71-87.

98. De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use / E. De Clercq // J. Clin. Virol. - 2004. - Vol. 30. - P. 115-133.

99. Defensins modulates tissue-type plasminogen activator and plasminogen binding to fibrin and endothelian cells / A.A. Higazi, T. Ganz, E.K. Kariko et al. // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271 (30). - P. 17650-17655.

100. De Lucca, A. J., Walsh T. J.. Antifungal peptides: novel therapeutic compounds against emerging pathogens / A. J. De Lucca, T. J. Walsh. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. - P. 1-11.

101. Donaldson, D.M. Studies on serum bactericidal activity / D.M. Donaldson, S. Marcus //J. Immunology. - 1958,- Vol. 81.- P. 292-296.

102. Donaldson, D.M. Separation and purification of ß - lysine from normal serum / D.M. Donaldson, C. Matheson, B. Ellsworth // J. Bacteriol. - 1964. - Vol. 92. - P. 897-901.

103. Donaldson, D.M. Beta - lysin of platelet / D.M. Donaldson, J.G. Tew // J. Bacteriol. Rev. - 1977. - Vol. 41. - P. 501- 513.

104. Dual role of alpha-defensin-1 in anti-HIV-1 innate immunity / T. L. Chang, J. Vargas, A. DelPortillo et al. // J. Clin. Investig. - 2005. - Vol. 115. - P. 765-773.

105. Effects of corticostatin-1 on rat adrenal cells in vitro / T. Tominaga, J.Fukata, Y. Naito et al. // J. Endocrinol. - 1990. - Vol. 125. - P. 287-292.

106. Fungicidal effect of three new synthetic cationic peptides against Candida albicans / H. Nikawa, H. Fukushima, S. Makihira et al. // Oral Dis. - 2004. -Vol. 10. - P. 221-228.

107. Ganz, T. Antimicrobial activity of phagocyte granule proteins / T. Ganz, M.E. Selsted, R.I. Lehrer // Semin. Respir. Infect. - 1986,- Vol. 1. - P. 107117.

108. Hallock, K.J. MS 1-78, an analogue of the magainin antimicrobial peptides, disrupts lipid bilayer structure via positive curvature strain / K.J. Hallock,

D.K. Lee, A. Ramamoorthy // Biophys. J. - 2003. - Vol. 84. - P. 3052-3060.

109. Hancock, R.E.W. Cationic peptides: a new source of antibiotics / R.E.W. Hancock, R. Lehrer // Trends Biotechnol. - 1998. - Vol. 16. - P. 82-88.

110. Hancock, R.E.W., Peptide antibiotics / R.E.W. Hancock, D. S. Chappie //Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. - P. 1317-1323.

111. Hancock, R.E.W. The role of antimicrobial peptides in animal defenses / R.E.W. Hancock, M.G. Scott // PNAS. - 2000. - Vol. 97. - P. 8856-8861.

112. Hancock, R.E.W. Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials / R.E.W. Hancock // Lancet Infect. Dis. - 2001. - Vol. 1. - P. 156-164.

113. Helmerhorst, E. J 2001. The human salivary peptide histatin 5 exerts its antifungal activity through the formation of reactive oxygen species / Helmerhorst,

E. J., R. F. Troxler, F. G. Oppenheim // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol. 98. - P. 14637-14642.

114. High through put generation of small antibacterial peptides with improved activity / K. Hilpert, R. Volkmer-Engert, T. Walter et al. // Nat. Biotechnol. - 2004. - Vol. 23. - P. 1008-1012.

115. Hirsch, J.W. Comparative bactericidal activities of blood serum and plasma serum / J.W. Hirsch // J. Exper. Med. - 1960. - Vol. 112. - P. 15-22.

116. Human lactoferrin and peptides derived from its N terminus are highly effective against infections with antibiotic-resistant bacteria / P.H. Nibbering, E. Ravensbergen, M.M. Welling et al. // Infect. Immun. - 2001. - Vol. 69. - P. 14691476.

117. Immunomodulatory activities of small host defense peptides / D. M. Bowdish, D. J. Davidson, M. G. Scott et al. // Antimicrob. Agents Chemother. -2005.-Vol. 49.-P. 1727-1732.

118. Inhibition of early steps in the lentiviral replication cycle by cathelicidin host defense peptides / L. Steinstraesser, B. Tippler, J. Mertens et al. // Retrovirology . - 2005. - Vol. 2. - P.2.

119. Insights into the anti-microbial defense of marine invertebrates: the penaeid shrimps and the oyster Crassostrea gigas / E. Bachere, Y. Gueguen, M. Gonzalez et al. // Immunol. Rev. - 2004. - Vol. 198. - P. 149-168.

120. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia / D. Hultmark, H. Steiner, T. Rasmuson et al. // Biochem. - 1980. -Vol.106. - P. 7-16.

121. In vitro and in vivo antimicrobial activity of two alpha-helical cathelicidin peptides and of their synthetic analogs / M. Benincasa, B. Skerlavaj, R. Gennaro et al. //Peptides. - 2003. - Vol. 24. -P. 1723-1731.

122. In vitro antibacterial properties of pexiganan, an analog of magainin / Y. Ge, D. L. MacDonald, K. J. Yeman et al. // Holroyd Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. - P. 782-788.

123. In vivo efficacy of beta-cyclodextrin derivatives against anthrax lethal toxin / M. Moayeri, T.M. Robinson; S.H. Leppl et al. // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2008. - Vol. 6. - P. 2239-2241.

124. Insights into the anti-microbial defense of marine invertebrates: the penaeid shrimps and the oyster Crassostrea gigas / E. Bachere, Y. Gueguen, M. Gonzalez et al. // Immunol. Rev. - 2004. - Vol. 198. - P. 149-168.

125. Interaction of an anti-HIV peptide, T22, with gpl20 and CD4 / H.Tamamura, A. Otaka, T. Murakami et al. / Biochem Biophys // Res. Commun. -1996. - Vol. 219. - P. 555-559.

126. Internalization of tenecin 3 by a fungal cellular process is essential for its fungicidal effect on Candida albicans / D. H. Kim, D. G. Lee, K. L. Kim et al. // Eur. J. Biochem. - 2001. - Vol. 268. - P. 4449-4458.

127. Isolation and characterization of two bacteriocins of Lactobacillus acidophilus LF221 / B. Bogovic-Matijasic, I. Rogelj, I.F. Nes, H. Holo // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - № 49(5). - P. 606-612.

128. Jenssen, H. Modelling of anti-HSV activity of lactoferricin analogues using amino acid descriptors / H. Jenssen, T.J. Gutteberg, T. Lejon // J. Pept. Sci. -2005. - Vol. 11. - P. 97-103.

129. Jenssen, H. Peptide antimicrobial agents / H. Jenssen, P. Hamill, R.E. Hancock // Clinical Microbiology Reviews.- 2006. - Vol. 19. - No 3. - P. 491-511.

130. Kavanagh, K. Histatins: antimicrobial peptides with therapeutic potential / K. Kavanagh., S. Dowd // J. Pharm. Pharmacol. - 2004. - Vol. 56. -P285-289.

131. Klaenhammer, T.R. Bacteriocins of lactic acid bacteria / T.R. Klaenhammer // Biochimie. - 1988. - Vol. 70. - P. 337-349.

132. Lactobacillus bacteremia, clinical significance, and patient outcome, with special focus on probiotic L. rhamnosus G.G. Salminen M. K., Rautelin H., Tynkkynen S. et al. // Clin. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 38. - P.62-69.

133. Lay, F.T. Defensins - ccomponents of the innate immune System in Plants / F.T. Lay, M.A. Anderson // Current Protein and Peptide Science. - 2005. -Vol. 6. - P. 85-101.

134. Lee I. H. Styelins broad-spectrum antimicobiol peptides from the solitary tunicate, Styela clava / I.H. Lee, Y. Cho, R.I. Lehrer // Comp. Biochem and Physiol. B. - 1997. - Vol. 118 B. - P. 515- 521.

135. Lee, D.G. Structure and fungicidal activity of a synthetic antimicrobial peptide, PI8, and its truncated peptides / D.G. Lee, K.S. Hahm, S.Y. Shin // Biotechnol. Lett. - 2004. - Vol. 26. - P. 337-341.

136. Lehrer, R. I. Defensins: natural peptide antibiotics from neutrophils / R. I. Lehrer, T. Ganz, M. E. Selsted // ASM News. - 1990. - Vol. 56,- P. 315-318.

137. Lehrer, R. Defensins: Antimicrobial and Cytotoxic Peptides of Mammalian Cell / / R. Lehrer, T. Ganz, A. Lichtenstein // Ann. Rev. Immunol. -1993.-Voll.-P. 105-128.

138. Lehrer, R.I., Endogenous vertebrate antobiotics. Defensins, protegrins and other cysteine-rich antimicrobial peptides / R.I. Lehrer, T. Ganz // Acid. Sci.-1996.-Vol. 191.- P. 228- 239.

139. Lehrer, R.I. Defensins of vertebrate animals / R.I. Lehrer, T. Ganz // Curr. Opin. Immunol. - 2002. - Vol. 14. - P. 96-102.

140. Li, C.Y. Proline-rich domain of penaeidin molecule exhibits autocrine feature by attracting penaeidin-positive granulocytes toward the wound-induced inflammatory site / C.Y. Li, Y.L. Song // Fish Shellfish Immunol. - 2010,- Vol. 29(6). - P. 1044-1052.

141. Marcus, S.J. Studies on human platelet granules and membranes / S.J. Marcus, Zucker - Franklin, L.B. Safier // J. Clin. Invest. - 1968,- Vol. 46,- P. 580584.

142. Martin, E. Defensins and other endogenous peptide antibiotics of vertebrates / E. Martin, T. Ganz, R.I. Lehrer // Leukoc. Biol. - 1995. - Vol. 8. -P.128-136.

143. Matheson, A.R., Effect of ß- lysine on isolated Cell Wals and Protoplasts of Bacillus subtilis / A.R. Matheson, Donaldson D.M. // J. of Bacteriol. - 1970. -V. 101. - P. 314-317.

144. Matsuyama, K. Purification of three antibacterial proteins from the culture medium of NIH-Sape-4, an embryonic cell line of Sarcophaga peregrine / K Matsuyama, S. Natori // The Journal of biological chemistry. - 1988. - Vol. 32. -P. 126-127.

145. Mattick, A.T.R.. Further observations on an inhibitory substance (nisin) from lactic streptococci / A.T.R. Mattick, A. Hirsch // Lancet. - 1947. - Vol. 5. - P. 5-7.

1 A r TV A _ TV------- CI TP T1. -___t-x___J _ --<• -f 1_________ _____J 1 nrMTl 1 \___J

14u, rnu jvcuwu, o.i. xiic cyluiuaic ciieci ux numou pcpuu-i (rxiNrij aiiu

lactoferrin on oral squamous cell carcinoma (OSCC) in vitro / S.T. Mc Keown // Oral oncol. - 2006. - Vol. 42 (7). - P. 685.

147. Membrane damage by hemolytic toxins, complement, and other cytotoxic agents / C.L. Bashford, G.M. Alder, G. Menestrina et al. // J. Biol. Chem.

- 1986. - Vol. 261. - P. 9300-9308.

148. Mersacidin eradicates methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a mouse rhinitis model / D. Kruszewska, H.G. Sahl, G. Bierbaum et al. // J. Antimicrob. Chemother. - 2004. - Vol. 54. - P. 648-653.

149. Mikloska, Z. Alpha and gamma interferons inhibit herpes simplex virus type l infection and spread in epidermal cells after axonal transmission / Z. Mikloska, A. L. "Cunningham ii J. Virai. - zOGi.- Vol. 75. - P. Ir821-11*826.

150. Myrvik, Q.N. Studies on antibacterial factors in mammalian tissues and fluids. I A Serum Bactericidin for Bacillus subtilis / Q.N. Myrvik, R.S. Weiser // J. Immunol. - 1956. - V. 74. - № 9. - P. 9-16.

151. Myrvik, Q.N. Studies on antibacterial factors in mammalian tissues and fluids. IV. Demonstration of two nondislisable Components in the Serum Bactericidin Sistem for Bacillus subtilis / Q.N. Myrvik, E.S. Leake // J. Immunol. -

1 /" A Y T r> 4 -*<» T-v A 4 ^ A ^ A

t5tju. - "v . '54. - ansra. - t. z4 / - z jv.

152. Natural peptide antibiotics of human neutrophils / T. Ganz, M.E. Selsted, D. Szklarek et al. // Clin. Invest. - 1985. - Vol. 76. - P. 1427-1435.

153. Neutron scattering in the plane of membranes: structure of alamethicin pores / K. He, S.J. Ludtke, D.L. Worcester et al. // Biophys. J. - 1996. - Vol. 70. -P. 2659-2666.

154. Ourth, D.D. Induction of cecropin-like and attacin-like antibacterial but not antiviral activity in Heiiothis virescens larvae / D.D. Ourth, T.D. Lockey, H.E. Renis // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1994. - Vol. 200. - P. 35-44.

155. Parente, E. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria /E. Parente, A. Ricciardi // Appl.Microbiol. Biotechnol. - 1999.

- № 52(5). -P.628 - 638.

r c/" TTn/i a\______:„ o /1 1_ ______ 1________x." j _ ______

iju. raus., 1. rir(z-?j-inagaiJim ¿(i-iz), a ^yiiuicat; nyuuu pcpuuc, cxciib its antifungal effect on Candida albicans by damaging the plasma membrane / Y.

Park. D.G. Lee. K.S. Hahm // J. Pent. Sei. - 2004. - Vol. 10. - P. 204-209.

■> i

157. Patterson-Delafield, J. Microbicidal cationic proteins in rabbit alveolar macrophages: a potential host defense mechanism // J. Patterson-Delafield, R. J. Martinez, and R. I. Lehrer // Infect. Immun. - 1980. - Vol. 30. - P. 180-192.

158. Pettersson, A. Die adsorption der ß - lysine aus dem Blutserum / A. Pettersson // Aus der hygienischen. Abteilung der TCarolinischen Instituts in Stockhoim. - 1935. -P. 408-416.

159. Plasmid-Mediated Resistance to Thrombin-Induced Platelet Microbicidal Protein in Staphylococci: Role of the qac A Locus / L.I. 'Kupferwasser, R.A. Skyrray, M/H. Brown ex m. ii Amimicrobiai agenxs and chemotherapy. - 1999. - V. 43. - № 10. - P. 2395-2399.

160. Platelet Microbicidal Activity Is an Important Defense Factor against

Virirtans ^trpntnrnrriil T^nrlnrfirrlitiQ / T P)?inl<rprt T TcTriiasvpIrl T van Hpr Wprf pt

al. // The Journal of Infectious Diseases. - 2001. - Vol. 184. - P. 597-605.

161.Porcine polymorphonuclear leukocytes generate extracellular microbicidal activity by elastase-mediated activation of secreted proprotegrins / A. Panyuiich, J.'Shi, P:L. Bouiz el ai. riinfect Immun. - i997. - Vol. 65. - P. '97'8-y8*5.

162. Protection against enteric salmonellosis in transgenic mice expressing a human intestinal defensin / N.H. Salzman, D. Ghosh, K.M. Huttner et al. // Nature. - 2003. - Vol. 422. - P. 522-526.

163. Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides that combine features of corticostatic defensins and tachyplesins / V. Kokryakov, S. Harwig, E. Panyutich et al. // II FEBS Lett. - 1993. - Vol. 327. - P. 231-236.

164. Protegrin-1: a broad-spectrum, rapidly microbicidal peptide with in vivo activity / D.A. Steinberg, M.A. Hurst, C.A. Fujii et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1997. - Vol. 41. - P. 1738-1742.

165. Ranadive, N.S. C.G.. Isolation and characterization of permeability factors from rabbit neutrophils /N.S. Ranadive, C.G. Cochrane // J. Exp. Med. (USA). - 1968. - Vol.128. - P. 605 - 622.

166. Retrocyclin: a primate peptide that protects cells from infection by Tand M-tropic strains of HIV-1 / A.M. Cole, T. Hong, L.M. Boo et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - Vol. 99. - P. 1813 -1818.

167. Riley, M.A. Molecular mechanisms of bacteriocin evolution / M.A. Rijey,/,/ Annu. Rev. Genet. - 1998. - Vol. 32,- P. 255-278.

168. Roch, P. Antiprotozoan and antiviral activities of non-cytotoxic truncated and variant analogues of mussel defensin / P. Roch, A. Beschin, E. Bernard // Evid Based Complement Alternat. Med. - 2004. - Vol. 1. - P. 167-174.

169. 'Roie of positional hydropnobicity in xhe ieishmanicidai activity of magainin 2 / E.Guerrero, J. M. Saugar, K. Matsuzaki et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2004. - Vol. 48. - P. 2980-2986.

170. Safety and efficacy of antimicrobial peptides against naturally acquired leishmaniasis / J. Alberola, A. Rodriguez, O. Francino et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2004. - Vol. 48. - P. 641 - 643.

171. Scott, M.G. Cationic antimicrobial peptides and their multifunctional roie in the immune system / M/G. Scott, R.E. Hancock ri Crri. Rev. 'Immunol. -2000. - Vol. 20. - P. 407-431.

172. Shultz, L.D. Cytotoxity of Rabbit Blood for Listeria monocytogenes / L.D. Shultz, M.S. Wilder // Infect and Immunity. - 1971. - V. 4. - № 6. - P. 703708.

173. Secretion of microbicidal alpha-defensins by intestinal Paneth cells in response to bacteria / T. Ayabe, D.P. Satchell, C.L. Wilson et al. // Nat. Immunol. -

A A A /> T T ■» t -r\ 1 ^ ^ 1 A

ZVKJK). - 'vol 1. -r. i'l^-'iro.

174. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity / H. Steiner, D. Hultmark, A. Engstrom et al. // II Nature. - 1981. - Vol. 292. - P. 246-248.

175. Selstcu, M.E. ivlaimiialiaii defensnis in tlic antimicrobial immune response / M.E. Selsted, A.J. Ouellette // Nat. Immunol. - 2005. - Vol. 6. - P. 551557.

176. Solution structure of Alo-3: a new knottintype antifungal peptide from the insect Acrocinus longimanus / F. Barbault, C. Landon, M. Guenneugues et al. //Biochemistry. - 2005. - Vol. 42. - P. 14434-14442.

177. Soravia E. Antimicrobial properties of peptides from Xenopus granular gland secretions / E. Soravia , G. Martini, M. Zasloff// FEBS Lett. - 1988. - Vol. 228. - P. 337-340.

178. Spellberg B. The epidemic of antibiotic resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America / B.'Sperrberg /rCiin. Infect. Dis. - 2008. - Vol46. -P.i 55-164.

179. Structure and mechanism of action of an indolicidin peptide derivative with improved activity against gram-positive bacteria / C. L. Friedrich, A. Rozek, A. Patrzykat et al. // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276. - P. 24015-24022.

180. Structural and DNA-binding studies on the bovine antimicrobial peptide, indolicidin: evidence for multiple conformations involved in binding to membranes and DNA / C. H. Hsu, C. Chen, M. L. Jou et al. // Nucleic Acids Res. -

^ A A i" T 7 "I A ^ J A ^ ^ i A /■ J

ZUUD. - 'VOL 33. -r. <TOD3-<TOm.

181. Sublethal concentrations of pleurocidin-derived antimicrobial peptides inhibit macromolecular synthesis in Escherichia coli / A. Patrzykat, C.L. Friedrich, L. Zhang et al. // Antiroicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - P. 605-614.

182. Subbalakshmi, C. Mechanism of antimicrobial action of indolicidin / C. Subbalakshmi, N. Sitaram // FEMS Microbiol. Lett. - 1998. - Vol. 160. P. 91-96.

r83. 'Sublethal concentrations of pieurociain-aerived antimicrobial peptides inhibit macromolecular synthesis in Escherichia coli / A. Patrzykat, C.L. Friedrich, L. Zhang et al. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - P. 605-614.

184. Synthesis and HIV-1 integrase nihibitory activity of diiiicric and tetrameric analogs of indolicidin / K. Krajewski, C. Marchand, Y.Q. Long et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2004. - Vol. 14. - P. 5595-5598.

185. Tang, Yi-Quan. Antimicrobial Peptides from Human Platelets / Yi-Quan Tang, M.R. Yeaman, M.E. Selsted // Infection and immunity. - 2002. - Vol. 70. - P. 6524-6533.

186. The antimicrobial peptides lactoferricin B and magainin 2 cross over the bacterial cytoplasmic membrane and reside in the cytoplasm / H. H. Haukland, H. Ulvatne, K. Sandvik et al. // FEBS Lett. - 2001. - Vol. 508. - P. 389-393.

187. The cellular target of histatin 5 on Candida albicans is the energized mitochondrion / E.J. Helmerhorst, P. Breeuwer, W. van't Hof et al. // E J. Biol. Chem. - "î'999. - 'Vol 274. -'P. 728^-729*1.

188. The effect of bovine lactoferrin and lactoferricin B on the ability of feline calicivirus (a norovirus surrogate) and poliovirus to infect cell cultures / K. B. Mc Cann, A. Lee, J. Wan et al. // J. Appl. Microbiol. - 2003. - Vol. 95. - P. 1026-1033.

189. The human cationic peptide LL-37 induces activation of the extracellular signalregulated kinase and p38 kinase pathways in primary human monocytes /' 'D.îvi 'Bowdish, -D.J. Davidson, D.P. Speen ex ai. ri J. immunoi.-2004. - Vol. 172. - P. 3758-3765.

190. Theta defensins protect cells from infection by herpes simplex virus by inhibiting viral adhesion and entry / B. Yasin, W. Wang, M. Pang et al. // J. Virol. -2004. - Vol. 78. - P. 5147-5156.

191. Trombin-induced rabbit platelet microbicidal proteins is fungicidal in vitro / M.R. Yeaman, A.S. Ibrahim, J.E. Edwards et al. //Antimicrob. Agents Chemother. - i993. - Vol. 37. - r. 546-553.

192. Two-dimensional NMR studies of the antimicrobial peptide NP-5 / A.C. Bach, M.E. Selsted, A. Pardi et al. // Biochemistry. -1987. - Vol. 26. - P. 4389-4397.

193. Walton, E. The preparation, properties and action on Staphylococcus aureus of purified fractions from the cationic proteins of rabbit polymorphonuclear leukocvtes/E. Walton //Brit. J. Exn. Pathol. - 1978. - Vol. 59. - P. 416-431.

v i

194. Walton, E. Factors affecting the susceptibility of staphylococci to killing by cationic proteins from rabbit polymorthonuclear leukocytes: the effects of alteration of cellular energetics and of various jon compounds / E. Walton // Brit. J. Exp. Pathol. - 1976. - Vol. 57. - P. - 560-570.

195. Wang, Z. APD: the Antimicrobial Peptide Database / Z. Wang, G. Wang // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32. - P. 590-592.

196. Weksler, B.B. Rabbit platelet bactericidal protein / B.B. Weksler, R.L. Nachman // J. Exp. Med. -1971. - Vol. 134. - P. 114-1130.

197. work, 'E. Some componenxs of Lysozyme digesi from various grampositive bacteria / E. Work. Abstracts of 3rd Intern. Symp. on Fleming's Lysozyme, 1964.-Milan, I Sez.-P.13.

198. Yamasaki, K.. Antimicrobial peptides in human skin disease / K. Yamasaki, R.L. Gallo // J. Dermatol. - 2008. - Vol. 18(1). - P. 11-21.

199. Yasin B. Evaluation of the inactivation of infectious herpes simplex virus by host-defense peptides / B. Yasin, M. Pang, J. S. Turner // Clin. Microbiol. Infecí. Dis. - 2060. - Vol. Í9. - P. f87-i94.

200. Zannetti, M. Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain / M. Zannetti, R. Gennaro, D. Romeo // IIFEBS Lett. - 1995. - Vol. 374. - P. 1-5.

201. Zasloff, M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms and partial cDNA seguence of a precursor ff Proc / M. Zasloff// Nat. Acad. Sci. USA. - 1987. - Vol. 84. - P.54.

АЛЛ Г-Ж 1 Г» Г» Л Г А • ■ 1 ' 1 •• Г* * • • ' 1 1

zvz. z,asion, ivj. /\mimicruDiai aeuvny от synmeuc magaimn peptides ana several analogues / M. Zasloff, B. Martin, H.C. Chen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1988. - Vol. 85. - P. 910-913.

203. Zhang, L. Antimicrobial peptides-therapeutic potential / L. Zhang, T.J. Falla // Expert Opin. Pharmacother. - 2006. - Vol. 7. - P. 653-663.

204. Zhang, L. Interaction uf catioiiic antimicrobial peptides with iiiudel membranes / L. Zhang, A. Rozek, R.E. Hancock // J. Biol. Chem. - 2001.- Vol. 276. - P. 35714-35722.

205. Zeya, H. Antimicrobial specificity of leukocyte lysosomal cationic proteins /H. Zeya, J. Spitznagel // Scince. - 1966. - Vol. 154. - P. 1049-1051.

206. Zeya, H. Argenin-rich proteins of polymorphonuclear leukocyte lysosomes. Antimicrobial spexificity and biochemical heterogenecity / H. Zeya, J. Spitznagel // J. Exp. Med. (USA.).- 1968. - Vol. 127. - P. 927-941.