Влияние точечных аминокислотных замен на каталитические свойства двухдоменной лакказы Streptomyces griseoflavus» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Коляденко Илья Андреевич

• Коляденко Илья Андреевич
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Коляденко Илья Андреевич

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ферменты. Основные понятия. Краткая история их открытия. Применение ферментов в биотехнологии

1.1.1. Основные понятия о ферментах

1.1.2. Краткая история открытия ферментов

1.1.3. Применение ферментов в биотехнологии

1.2. Трехдоменные лакказы. История их открытия

1.2.1. История открытия лакказ

1.2.2. Идентификация Т1-активного центра лакказ и полифенолоксидаз

1.2.3. Идентификация Т2 медь-связывающего сайта лакказ и полифенолоксидаз

1.2.4. Идентификация Т3 медь-связывающего сайта лакказ и полифенолоксидаз

1.3. Физико-химические особенности и функции трехдоменных лакказ

1.3.1. Лакказы растений

1.3.2. Лакказы насекомых

1.3.3. Лакказы бактерий

1.3.4. Лакказы грибов

1.4. Пространственная структура активного центра лакказ 31 1.4.1. Общее представление о структуре лакказ

1.4.1. Окислительно-восстановительный потенциал Т1 иона меди

1.4.2. Субстрат-связывающий карман лакказ

1.4.3. Т2/Т3 медь-связывающий центр

1.4.3. Встраивание ионов меди в активный центр лакказ. Доступность T2/T3 центра медь-

связывающего центра для растворителя

1.5. Субстратная специфичность трехдоменных лакказ. Медиаторы лакказ

1.6. Применение лакказ в промышленности и биотехнологии

1.7. Двухдоменные лакказы

1.7.1. Идентификация двухдоменных лакказ

1.7.2. Пространственная структура двухдоменных лакказ

1.7.3. ^ центр двухдоменных лакказ

1.7.4. T2/Т3 центр двухдоменных лакказ

1.7.5. Физико-биохимические свойства двухдоменных лакказ

1.7.6. Сайт-направленный мутагенез двухдоменных лакказ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы и приборы

2.1.1. Химические реактивы и ферменты

2.1.2. Микробиологические среды

2.1.3. Штаммы и плазмиды

2.1.4. Приборы

2.2. Методы генной инженерии и микробиологии

2.2.1. Внесение нуклеотидных замен QuikChange методом

2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.3. Обработка ПЦР-продукта и плазмид эндонуклеазами рестрикции

2.2.4. Лигирование Т4-ДНК лигазой

2.2.5. Получение компетентных клеток E. coli

2.2.6. Трансформация клеток E. coli

2.2.7. Проверка клонов на наличие вставки гена лакказы в экспрессионный вектор

2.2.8. Выделение и очистка плазмидной ДНК и ПЦР - фрагментов

2.2.9. Получение штамма-суперпродуцента Е. coli иоптимизация условий индукции синтеза интересующих белков

2.3. Биохимические методы при работе с белками

2.3.1. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН

2.3.2. Гомогенизация бактериальных клеток проточным дезинтегратором высокого давления Avestin. Выделение белков металл-аффинной хроматографией на смоле Ni-NTA агароза

2.3.3. Обработка фактором протеазы Ха

2.3.4. Эксклюзионная хроматография полученных белковых препаратов

2.3.5. Кристаллизация мутантных форм лакказы

2.3.7. Расчет траекторий предполагаемых каналов по полученным пространственным структурам

2.3.8. Определение основных физико-биохимических показателей ферментативной активности белков

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ пространственной структуры 2D лакказы S. griseoflavus

3.2. Отбор потенциально важных для функционирования SgfSL аминокислотных остатков

3.5. Ферментативная активность и анализ структур мутантных форм His165Ala, His165Phe, Ile170Ala, Ile170Phe. Поиск каналов, ведущих к T3 ионами меди

3.6. Ферментативная активность и анализ структур мутантных форм Arg240Ala и Arg240His. Роль Arg 240 в функционировании SgfSL

3.7. Определение основного канала доступа кислорода в Т2/Т3 центр SgfSL

3.8. Исследование активности мутантных форм His165Ala, Arg240Ala и Arg240His в присутствии ингибитора азида натрия (^N3)

3.10. Ферментативная активность и структурный анализ двойных мутантных форм

Ш8165Л1а/Ме119901у, МеИ9901у/А^240Ш8

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АА - акриламид

АБТС - 2,2'-азинобис(3-этил-бензотиазолин-6-сульфоновая кислота) а.о. - аминокислотный остаток

Бис-Трис - бис-(2-гидроксиэтил)имино-трис(гидроксиметил)метан

БФС - бромфеноловый синий

ДДТ - 1,4-дитиотрейтол

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДМСО - диметилсульфоксид

ДСН - додецилсульфат натрия

ИПТГ - изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид

Км - константа Михаэлиса

Ккат - скорость реакции

Ккат/ Км - эффективность катализа

МБА - №,№-метиленбисакриламид

мВ - милливольт

О.Е. - относительные единицы поглощения ОП - оптическая плотность

ОВП - окислительно - восстановительный потенциал ПААГ - полиакриламидный гель п.о. - пара азотистых оснований ПСА - персульфат аммония

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ТЕМЕД - ^^№,№-тетраметилэтилендиамин

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

2,6-ДМФ - диметоксифенол

K4[(FeCN)6] - гексацианоферрат калия

2D - двухдоменная лакказа

3D - трехдоменная лакказа

0С - градус Цельсия

 - ангстрем

NI - нативный интермедиат

MES - 2-(К-морфолино)этансульфоновая кислота PIPES - пиперазин-К,№-бис-(2-этансульфоновая кислота) Р-МЭ - Р-меркаптоэтанол

dATP - 2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат (dGTP, dCTP, dTTP - по аналогии)

PI - перокси интермедиат

Т1 - ион меди Т1

T2/T3 - тринуклеарный центр

HEPES - К-2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновая кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние точечных аминокислотных замен на каталитические свойства двухдоменной лакказы Streptomyces griseoflavus»»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

Ферменты - сложные органические молекулы, ускоряющие химические реакции за счет снижения энергии активации реакции и стабилизации промежуточных состояний субстратов. Ферменты давно и активно применяются в медицине, пищевой и целлюлозно-бумажной промышленностях, биотехнологии и органическом синтезе, научно-исследовательской деятельности. В связи с развитием отраслей производства, которые ухудшают экологическую ситуацию в мире, ведется активный поиск организмов и ферментов, способных к биодеградации токсичных соединений. Одним из таких технологически значимых ферментов являются лакказы.

Лакказа (ЕС 1.10.3.2, п-дифенол - кислород оксидоредуктаза) медьсодержащий фермент, который относится к классу оксидоредуктаз. Лакказы катализируют окисление различных соединений с сопутствующим восстановлением кислорода до воды. Этот фермент открыт немногим позже после открытия первых ферментов (пепсин, инвертаза и другие) и исследуется с конца 19-го века. Лакказы обладают широкой субстратной специфичностью - окисляют множество высоко- и низкомолекулярных соединений различной химической структуры. Благодаря такому свойству они активно изучаются, а также используются в различных отраслях промышленности и биотехнологии. На сегодняшний день лакказы применяются в текстильной промышленности для обесцвечивания красителей, в медицине - для создания биосенсоров и многих других областях.

В природе найдены трехдоменные (3D) и двухдоменные (2D) лакказы. Первые активно изучаются и применяются ввиду их высокой активности и низкой субстратной специфичности. Вторые открыты намного позже и на сегодняшний день менее изучены. Активность 2D лакказ довольно низкая, однако, они превосходят 3D лакказы по термостабильности, способны функционировать не только в кислых, но и в щелочных условиях среды. Кроме того, на их активность практически не влияют классические ингибиторы 3D лакказ. 2D лакказы продуцируются только некоторыми бактериями, в основном, актинобактериями рода ^1гер1отусе&.

Объектом исследования представляемой работы является наиболее активная из охарактеризованных 2D лакказ - лакказа из Б1терЮтусе$ griseoflavus (8§ЙЬ). Структурно-функциональные исследования и мутантных форм этого фермента позволили выявить

структурные особенности 2D лакказ, которые определяют их каталитическую активность. По результатам работы впервые определены аминокислотные остатки, которые участвуют в переносе протонов, и регулируют доступ кислорода в активный центр Предложена роль

некоторых полярных аминокислотных остатков второй координационной сферы Т2/Т3 центра в функционировании объекта исследования. Выяснены структурные особенности геометрии субстрат-связывающей области 2D лакказ, влияющие на их активность и высокую функциональную стабильность.

Цель работы: изучить структурно-функциональные особенности, определяющие активность, термостабильность и устойчивость к ингибиторам двухдоменной лакказы из бактерии Streptomyces griseoflavus.

Основные задачи работы:

1. Провести анализ пространственной структуры двухдоменной лакказы & griseoflavus (SgfSL) и определить аминокислотные остатки, потенциально важные для функционирования фермента.

2. Получить генетические конструкции и штаммы-суперпродуценты мутантных форм лакказы с заменами выбранных аминокислотных остатков. Получить препараты мутантных форм лакказы с чистотой, пригодной для кристаллизации и биохимических исследований.

3. Определить кинетические параметры ферментативной активности полученных мутантных форм по отношению к различным типам субстратов. Выяснить влияние температуры, ингибиторов и рН среды на активность мутантных форм лакказы.

4. Получить кристаллы мутантных форм лакказы, собрать с них дифракционные данные. Определить и уточнить пространственные структуры мутантных форм лакказы.

5. На основании анализа пространственных структур и биохимических данных установить роль выбранных аминокислотных остатков в функционировании фермента.

Научная новизна.

Изучение влияния аминокислотных остатков второй координационной сферы активных центров SgffSL позволило выяснить некоторые структурные особенности каталитической активности двухдоменных лакказ. Впервые определены аминокислотные остатки, которые участвуют в переносе протонов, и регулируют доступ кислорода в активный центр 2D лакказ. В работе получены уникальные мутантные формы двухдоменной лакказы, обладающие высокой активностью в щелочных условиях, а также в присутствии ингибитора. Впервые показано, что замены в субстрат-связывающей области двухдоменной лакказы по-разному влияют на эффективность окисления субстратов органической и неорганической природы, а также снижают функциональную стабильность фермента. Впервые показано, что низкая активность двухдоменных лакказ может быть обусловлена не только особенностями геометрии их субстрат-связывающего кармана, но также низкой скоростью переноса протонов в Т2/Т3

активный центр. Установлена роль полярного аминокислотного остатка второй координационной сферы иона меди T3p в переносе протонов и доступе кислорода в активный центр 2Б лакказ.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Несмотря на то, что двухдоменные лакказы исследуются более двадцати лет, многие особенности их функционирования остаются неисследованы. Результаты представленной работы существенно расширяют знания об особенностях каталитической активности двухдоменных лакказ, а также открывают новые возможности для направленной инженерии данного типа ферментов. Ввиду высокой структурной и аминокислотной консервативности двухдоменных лакказ, полученные результаты об особенностях функционирования £. griseoflavus можно применить для всех ферментов данного типа. Некоторые из полученных мутантных форм могут использоваться в биотехнологии для синтеза веществ и молекул, производство которых требует высокой стабильности лакказ и их активности в щелочных условиях. Оптимизирована методика кристаллизации препаратов двухдоменных лакказ, которая позволяет выращивать качественные кристаллы за короткий промежуток времени и получать дифракционные данные высокого разрешения, что значительно ускоряет структурные исследования данных ферментов. Результаты работы актуальны как для фундаментальных, так и для прикладных исследований двухдоменных лакказ.

Методология и методы исследования.

Экспрессионные вектора со вставкой гена c различными заменами были получены

при помощи методов генной инженерии. Для получения белковых препаратов фермента дикого типа и его мутантных форм использовали классические методы биохимии (колоночная хроматография, гель-электрофорез и др.). Изучение физико-химических свойств полученных белков осуществляли спектрофотометрическими методами. Исследование каталитических свойств ферментов проводили при помощи стандартных методик определения показателей ферментативной активности. Для структурных исследований мутантных форм и фермента дикого типа использовали методы кристаллизации (метод диффузии паров в его модификации «висячая капля») и рентгеноструктурного анализа (рентгеновско излучение синхротронов и лабораторных установок).

Положения, выносимые на защиту.

• Молекулярный кислород поступает в Т2/Т3 центр двухдоменных лакказ по Т3 каналу, основная роль Т2 канала - транспорт протонов в активный центр.

• Полярный консервативный аминокислотный остаток His165, расположеный в Т3Р канале участвует в процессах переноса протонов и доступе кислорода в активный центр 2D лакказ. Замена His165Ala изменяет специфику ингибирования SgfSL.

• Изменения в субстрат-связывающем кармане SgffSL по-разному влияют на эффективность окисления субстратов органической (АБТС и 2,6-ДМФ) и неорганической (K4[Fe(CN)6] природы.

• Сочетание эффектов оптимизации геометрии субстрат-связывающей области SgffSL и процесса переноса протонов позволило получить мутантную форму с высокой каталитической активностью в щелочных условиях среды.

Степень достоверности и апробация результатов.

Результаты работы получены с помощью современных методов и методик, которые полностью соответствуют целям и задачам работы. Результаты работы воспроизводимы, неоднократно представлялись на конференциях и были опубликованы в высокорейтинговых журналах. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК. Структуры 13-ти мутантных форм SgfSL депонированы в банк данных PDB.

Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором лично. Автор работы принимал непосредственное участие в получении генетических конструкций и штаммов-продуцентов мутантных форм SgfSL, выделении и очистке белковых препаратов, биохимических и биофизических исследованиях каталитических свойств ферментов, кристаллизации, решении и уточнении кристаллических структур мутантных форм.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 50 рисунков и 22 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 130 источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ферменты. Основные понятия. Краткая история их открытия. Применение ферментов в биотехнологии.

1.1.1. Основные понятия о ферментах

Термин «фермент» введен в пользование в 1877 году Вильгельмом Фридрихом Кюне (Wilhelm Friedrich Kühne) (Kühne, 1877). Реакции, в которых участвуют ферменты, называют «ферментативными реакциями», а сам процесс - «ферментативный катализ». Ферменты не расходуются в процессе катализируемой реакции, а лишь ускоряют ее за счет сдвига равновесного состояния в сторону образования продукта. Изначально, к ферментам причисляли только белковые молекулы. С развитием методик исследования клеточных процессов выяснили, что схожим образом биологические реакции могут ускоряться РНК-белковыми комплексами, а также одиночными молекулами РНК. Молекулы РНК, катализирующие некоторые реакции, называют «рибозимы».

В отличие от катализаторов, которые потенциально способны ускорять широкий спектр химических реакций, большинство ферментов способны взаимодействовать только с определенными химическими соединениями, которые называют «субстратами». Такую особенность ферментов избирательно реагировать с веществами называют «специфичностью» или «сродством фермента к субстрату». Благодаря специфичности, подавляющее большинство изученных ферментов принимают участие только в одной определенной реакции, превращая субстрат в продукт. Введенное биохимиками Леонором Михаэлисом и Мод Леонорой Ментен в 1913 году понятие - константа Михаэлиса (KM) до сих пор используется для характеристики сродства фермента к субстрату. Количественно, сродство фермента к субстрату отражается в единицах концентрации субстрата (нМ, мкМ, мМ). Данный показатель отражает, при какой концентрации субстрата фермент проявляет половину максимальной скорости его превращения в продукт. Количество молекул субстрата, превращаемое одной молекулой фермента в продукт за единицу времени, называют «скоростью» работы фермента (K^). Отношение Kkm/Km является важнейшим показателем эффективности катализа, и называется «константа эффективности». Все три описанные показателя используются для оценки ферментативной активности, а унификация полученных значений позволяет сравнивать свойства различных ферментов между собой.

1.1.2. Краткая история открытия ферментов

Изучение белков началось в 1789 году, когда французский химик Антуан Франсуа де Фуркруа (Antoine François de Fourcroy) ввел понятие «Eiweisskörper» - белковые тела. Он показал, что в состав белковых тел входят атомы серы. Работы велись на белках из семейства альбуминов, обладающих большим количеством дисульфидных связей, что объясняет наличие в них детектируемого количества атомов серы. В 1833 году впервые выделили и в какой-то мере очистили амилазы - белки, катализирующие расщепление крахмала до олигосахаридов (Armstrong, 1933). Довольно быстро для того времени (1836 г.) шведским химиком Йёнесом Якобом Берцелиусом (Jöns Jacob Berzelius) было выдвинуто предположение о существовании «некоторых объектов», ускоряющих процесс образования сахаров из крахмала. Исходя из своих наблюдений, Берцелиус пришел к выводу, что механизм действия этих «объектов» отличается от такового для химических катализаторов (Robertson, 1975). В том же году Теодор Шванн (Theodor Schwann) идентифицировал и выделил из слизистой оболочки желудка белок пепсин (Edaurd Buchner, 1907). Уже в 1838 году Геррит Ян Мульдер (Gerrit Jan Mulder) впервые определил грубую химическую формулу яичного альбумина, а через три года в мазках крови дождевого червя нашли кристаллы белковой природы - гемоглобина (Vickery, 1942). Незадолго до введения термина «фермент», французский физико-химик Пьер Эжен Марселен Бертло (Pierre Eugène Marcellin Berthelot) из дрожжей выделил «компонент», который был способен превращать сахарозу в глюкозу и фруктозу. На сегодняшний день этот «компонент» известен как фермент инвертаза (Edaurd Buchner, 1907).

Несмотря на то, что природа и состав ферментов оставались неизвестны, уже в 1894 году предположили механизм взаимодействия фермента с субстратом, который назвали "ключ-замок" (Fischer, 1894). Позже, когда идентифицировали первые кофакторы ферментов, механизм был дополнен и уточнен. В последующем был проведен ряд работ по определению элементного состава и молекулярной массы известных на то время белков. Параллельно с этими работами велись работы по изучению аминокислот.

Новая веха в исследовании ферментов началась в 1897 году, когда Эдуард Бухнер (Eduard Buchner) доказал, что наблюдаемые реакции расщепления крахмала и брожения могут осуществляться мертвыми дрожжевыми клетками (Edaurd Buchner, 1907). Это дало основание полагать, что реакции превращения осуществляются веществами, которые находятся внутри организмов. Благодаря такой находке, в дальнейшем стали предпринимать попытки выделения ферментов непосредственно из живых клеток. Одна из первых успешных работ по получению очищенных белковых препаратов выполнена в 1926, когда Джеймсу Батчеллеру Самнеру (James B. Sumner) удалось закристаллизовать первый фермент - уреазу (John Northrop, 1946). Самнеру удалось доказать, что ферменты - это вещества именно белковой природы, а не

липиды или углеводы, как предполагали многие ученые того времени. Кристаллы уреазы стали отправной точкой и уже в скором времени были получены кристаллы протеолитических ферментов (трипсина, пепсина и химотрипсина) (John Northrop, 1946). После доказательства белковой природы ферментов, в течение 30 лет велись поиск и исследования различных классов ферментов, субстратов и продуктов, промежуточных состояний ферментативных реакций. Благодаря таким работам удалось обнаружить множество новых свойств ферментов, однако, оставалось неясным, благодаря чему данные белковые молекулы способны катализировать различные реакции.

Фундамент для ответа на этот вопрос заложил Фредерик Сенгер (Frederick Sanger), который в 1951 году расшифровал первичную последовательность белка инсулина, определив точную стехиометрию аминокислотных остатков (Sanger et al., 1951a; Sanger et al., 1951b). На основании того, что белки состоят из аминокислот, соединенных амидными связями, Лайнус Полинг (Linus Carl Pauling) предложил модель образования регулярных структур белка (а-спирали, ß-структуры) (Pauling, 1954). Его предположения практически полностью подтвердились в 1960-1963 годах, когда Джон Кендрю и Макс ГОруц (John Kendrew and Max Perutz) впервые расшифровали дифрактограмму и решили пространственную структуру белка миоглобина (Kendrew, 1963). В последующие годы еще несколько структур белков были решены и предположение о том, что все ферменты похожи друг на друга и выяснение структуры одного из них позволит понять природу функционирования всех других, не подтвердилось. Полученные кристаллические структуры белков, наряду с открытием функции и природы молекулы ДНК, разработки методов генной и белковой инженерии, привели к быстрому развитию новых областей науки - структурной молекулярной биологии и протеомики.

1.1.3. Применение ферментов в биотехнологии

Свойства ферментов использовались людьми задолго до идентификации молекул белков и разработки методов их исследования. Простейшим примером использования ферментов можно назвать производство вина. Сок некоторых деревьев применялся для лакирования предметов быта, что увеличивало срок их использования. В начале 20 века, когда наука о ферментах только начинала развиваться, пектиназа грибов использовалась для удаления мутных примесей из вина и сока (Sumner, 1946). Во время первой мировой войны дрожжи использовали на одной из стадий производства глицерина, а позднее плесневые грибы Aspergillus niger применялись для получения лимонной кислоты в промышленных масштабах (Heckmann et al., 2020). С развитием медицины, методов генной инженерии и науки в целом на поток поставили производство ферментов пищеварения, инсулина, пероксидазы и других ферментов. На 2019

год рынок биотехнологии оценивается в 10 миллиардов долларов, 10% из которых сосредоточены в сфере производства ферментов. Среди огромного множества промышленно-значимых ферментов, лакказы давно нашли свою нишу в биотехнологии.

1.2. Трехдоменные лакказы. История их открытия.

1.2.1. История открытия лакказ

Лакказы (ЕС 1.10.3.2, п-дифенол - кислород оксидоредуктазы) - медьсодержащие ферменты, которые относятся к классу оксидоредуктаз. Лакказы катализируют окисление различных соединений с сопутствующим восстановлением кислорода до воды. Данные ферменты исследуются более 120 лет, и их можно причислить к одним из первых найденных и охарактеризованных белков. Одним из основоположников изучения лакказ является Габриэль Бертранд (Gabriel Bertrand). В 1894 году он предположил, что образование лаковой поверхности из сока дерева Токсикодендрона сочного (Rhus succedanea) происходит не только в присутствии кислорода, но и из-за наличия некоторого вещества, которое он назвал "laccase" (Wisniak, 2014). Стоит отметить тот факт, что в 1883 году Йошида (Yoshida) исследовал похожие свойства сока другого лакового дерева (Rhus vernicifera). Он доказал, что быстрое затвердевание сока с образование лаковой поверхности происходит при помощи некоторого азотсодержащего вещества, которое чувствительно к повышению температуры. Он выдвинул несколько предположений относительно механизма реакции и ее компонентов, однако ему не удалось так детально описать все процессы, как сделал это Габриэль Бертранд (Yoshida, 1883).

Название "laccase" Габриэль Бертранд дал из-за того, что сок данного дерева в странах Дальнего Востока использовали для лакирования различных предметов быта. Используя различные растворители и их смеси, ему удалось отделить субстрат, который он назвал "laccol", от всех компонентов сока, в том числе и от самого фермента (Wisniak, 2014). Спустя много лет будет выяснено, что "laccol" в большей степени представлен пиракатехолом. Дальнейшие эксперименты позволили ему сделать следующий вывод: для образования конечного продукта (твердая глянцевая пленка), необходимы субстрат, фермент и кислород. Чтобы убедиться в необходимости кислорода для проведения ферментативной реакции, был проведен ряд экспериментов на веществах, по свойствам похожих на "laccol" (гидрохинон, пирогаллол, галловая кислота и танин). Субстраты добавляли к раствору "laccase" и выдерживали в закрытых пробирках. Показательные эксперименты получились для гидрохинона: цвет реакции изменялся со временем, а при длительной инкубации образовывались кристаллы синтезированного продукта. Бертранд выяснил, что в ходе реакции окисления гидрохинона

образуется хингидрон, который, как и гидрохинон, не может окисляться кислородом сам по себе с той же скоростью, как в исследованной ферментативной реакции (Wisniak, 2014).

В конце 19 века не было известно ферментов, для функционирования которых строго необходим кислород, поэтому Габриэль Бертранд предположил, что содержащееся в соке дерева вещество можно отнести к новому типу ферментов. Кроме того, он показал, что такой тип ферментов присутствует не только в первоначальном объекте исследования, но и во многих других высших растениях и грибах. Несмотря на ограниченное число биохимических методов исследования белков в начале 20 века, Габриэль Бертранд смог установить, что лакказы способны взаимодействовать не только с фенольными соединениями, но и с другими веществами, гидроксильная группа которых находится в орто- и пара-положениях. Таким образом, он был первым, кто показал низкую субстратную специфичность лакказ.

Некоторые из фракций, выделенного Бертрандом белкового препарата, проявляли высокую оксидазную активность, в то время как другие - низкую. Для фракций с высокой

оксидазной активностью характерным признаком являлось повышенное содержание ионов

2+

марганца (Mn ). На основании результатов таких экспериментов Габриэль Бертранд сделал вывод, что ионы марганца необходимы для функционирования фермента. Сегодня известно, что это не так, и в состав лакказ входят ионы меди (Cu ), а не Mn . Вероятнее всего, ионы Mn2+ были найдены в выделенных препаратах ввиду несовершенства методик очистки белков, из-за чего, наряду с лакказами, в финальном препарате могли присутствовать другие белки. Таким образом, в начале 20 века был найден уникальный фермент, обладающий низкой субстратной специфичностью, и для работы которого необходимы ионы металлов и кислород (Wisniak, 2014). Уникальность такого объекта подтолкнула исследователей того времени к более углубленному изучению лакказ.

Более 30 лет накапливались данные об активности лакказ из различных организмов, что позволяло проводить сравнительный анализ их ферментативной активности. Развивались новые методы очистки и анализа белковых препаратов. Работы, проведенные различными группами в 30-е годы 20 века, поставили под сомнение необходимость присутствия ионов марганца для функционирования лакказ. Проблема окончательно решилась в 1939-1940 годы, когда немецкие исследователи Кейлин и Манн (Keilin and Mann) усовершенствовали методику получения полифенолоксидаз грибов (в то время лакказами называли только полифенолоксидазы растений) и лакказ растений (Keilin et al., 1940).

Исследователям удалось получить препарат лакказы из того же объекта, что и Бертранду, но с более высокой чистотой (65%). Белковый препарат имел ярко выраженный синий цвет, который обратимо менялся (исчезал) при добавлении восстанавливающих агентов и субстратов, и необратимо пропадал при прогреве образца (Anson et al., 1945). Было замечено, что образец

белка с концентрацией 0,015 мг/мл по цвету эквивалентен 7% раствору сульфата меди (CuSO4).

3+ 2+

Выяснилось, что высокоочищенный препарат не содержит ионов Fe или Мп . При этом, фенолоксидазная активность полученных белковых фракций отличались между собой. Эти отличия коррелировали с содержанием в белковых фракциях ионов Си . Активность полученного фермента ингибировалась азидом натрия цианидом калия (КС^ и

диэтилдитиокарбаматом (С5Щ0№2-), в то время как монооксид углерода (СО) не оказывал влияния на его активность. Все это указывало на то, что именно ионы Си2+ необходимы для проявления фенолоксидазной активности лакказы (Keilin et я1., 1940).

Для подтверждения этой теории Кейлин и Манн выделили полифенолоксидазы грибов и лакказы из некоторых растений. Провели анализ образцов и подтвердили наличие именно ионов меди в выделенных белковых препаратах. Полученные белковые фракции содержали не только ионы Си2+, но и большое количество полисахаридов. На тот момент посчитали, что именно пигмент полисахаридной природы придает выраженный синий цвет препарату белка, а примесь полисахаридов наблюдается из-за несовершенства техники очистки образцов. Однако выводы о том, что полифенолоксидазы грибов и лакказы растений гликозилируются, цвет белковых препаратов обусловлен ионами Си в активном центре, и что выделенные ими ферменты из грибов также могут являться лакказами, сделаны не были. Несколько позже, учёные из того же университета провели ряд экспериментов, которые подтвердили наличие ионов Си2+ в лакказах. Но самое важное в этих экспериментах - это доказательство необходимости ионов меди для фенолоксидазной активности лакказ (Tissieres, 1948).

Таким образом, Кейлин и Манн провели сравнительную характеристику лакказ растений и полифенолоксидаз грибов. Они первыми нашли отличия в субстратной специфичности ферментов грибов и растений. Им удалось установить, что лакказы растений лучше окисляют аминофенолы (п-фенилендиамин) и слабо окисляют дифенолы (катехол), в то время как полифенолоксидазы грибов окисляют катехол намного лучше, чем п-фенилендиамин.

п-кречол

Рисунок 1. Структурные формулы некоторых субстратов лакказ и полифенолоксидаз

Также они установили, что лакказы растений способны окислять гидрохинон, но не монофенолы (п-крезол), тогда как полифенолоксидазы грибов - наоборот. Плохо очищенные препараты лакказ растений окисляли аскорбиновую кислоту, а ферменты, выделенные из грибов, окисляли аскорбиновую кислоту только через посредника - катехол (Anson et al., 1945). Основываясь на сравнительной характеристике ферментов из растений и грибов, авторы пришли к выводу, что полифенолоксидазы грибов более активны, чем лакказы растений. Вывод, сделанный в этой работе, справедлив и на сегодняшний день.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Коляденко Илья Андреевич, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Andberg M., Hakulinen N., Auer S., Saloheimo M., Koivula A., Rouvinen J., Kruus K. Essential role of the C-terminus in melanocarpus albomyces laccase for enzyme production, catalytic properties and structure: function of C-terminus in M. albomyces laccase // FEBS Journal. 2009. V. 276. P. 6285-6300.

2. Anson M. L., Edsall J. T. Advances in Protein Chemistry. New York: Academic Press Publisher, 1945. 210-214 c.

3. Armstrong E. F. Enzymes: a discovery and its consequences // Nature. 1933. V. 131. P. 535-537.

4. Arregui L., Ayala M., Gómez-Gil X., Gutiérrez-Soto G., Hernández-Luna C. E., Herrera de los Santos M., Levin L., Rojo-Domínguez A., Romero-Martínez D., Saparrat M. C. N., Trujillo-Roldán M. A., Valdez-Cruz N. A. Laccases: structure, function, and potential application in water bioremediation // Microb Cell Fact. 2019. V. 18. P. 200.

5. Bento I., Martins L. O., Gato Lopes G., Arménia Carrondo M., Lindley P. F. Dioxygen reduction by multi-copper oxidases; a structural perspective // Dalton Trans. 2005. P. 3507.

6. Berthet S., Thevenin J., Baratiny D., Demont-Caulet N., Debeaujon I., Bidzinski P., Leple J.-C., Huis R., Hawkins S., Gomez L.-D., Lapierre C., Jouanin L. Role of plant laccases in lgnin polymerization // Advances in Botanical Research. : Elsevier, 2012. P. 145-172.

7. Bertrand T., Jolivalt C., Briozzo P., Caminade E., Joly N., Madzak C., Mougin C. Crystal structure of a four-copper laccase complexed with an arylamine: Insights into substrate recognition and correlation with kinetics // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 7325-7333.

8. Brijwani K., Rigdon A., Vadlani P. V. Fungal Laccases: Production, Function, and Applications in Food Processing // Enzyme Research. 2010. V. 2010. P. 1 -10.

9. Buch-Pedersen M. J., Pedersen B. P., Veierskov B., Nissen P., Palmgren M. G. Protons and how they are transported by proton pumps // Pflugers Arch - Eur J Physiol. 2009. V. 457. P. 573-579.

10. Camarero S., Pardo I., Cañas A. I., Molina P., Record E., Martínez A. T., Martínez M. J., Alcalde M. Engineering platforms for directed evolution of laccase from Pycnoporus cinnabarinus // Appl Environ Microbiol. 2012. V. 78. P. 1370-1384.

11. Chauhan P. S., Goradia B., Saxena A. Bacterial laccase: recent update on production, properties and industrial applications // 3 Biotech. 2017. V. 7. P. 323.

12. Chen Y., Luo Q., Zhou W., Xie Z., Cai Y.-J., Liao X.-R., Guan Z.-B. Improving the catalytic efficiency of Bacillus pumilus CotA-laccase by site-directed mutagenesis // Appl Microbiol Biotechnol. 2017. V. 101. P. 1935-1944.

13. Colao M., Lupino S., Garzillo A., Buonocore V., Ruzzi M. Heterologous expression of lcc1 gene from Trametes trogii in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme // Microb Cell Fact. 2006. V. 5. P. 31.

14. Couto S., Herrera L. Inhibitors of laccases: a review // CEI. 2006. V. 2. P. 343-352.

15. Coy M. R., Salem T. Z., Denton J. S., Kovaleva E. S., Liu Z., Barber D. S., Campbell J. H., Davis

D. C., Buchman G. W., Boucias D. G. Phenol-oxidizing laccases from the termite gut // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2010. V. 40. P. 723-732.

16. D'Acunzo F., Baiocco P., Fabbrini M., Galli C., Gentili P. The radical rate-determining step in the oxidation of benzyl alcohols by two N-OH-type mediators of laccase: the polar N-oxyl radical intermediate // New J. Chem. 2002. V. 26. P. 1791-1794.

17. Dasgupta R., Gupta K. B. S. S., Groot H. J. M., Ubbink M. The resting oxidized state of small laccase analyzed with paramagnetic NMR spectroscopy // ChemPhysChem. 2021. V. 22. P. 733-740.

18. Decembrino D., Girhard M., Urlacher V. B. Use of Copper as a Trigger for the in Vivo Activity of

E. coli Laccase CueO: A Simple Tool for Biosynthetic Purposes // ChemBioChem. 2021. V. 22. P. 1470-1479.

19. Dittmer N. T., Gorman M. J., Kanost M. R. Characterization of endogenous and recombinant forms of laccase-2, a multicopper oxidase from the tobacco hornworm, Manduca sexta // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2009. V. 39. P. 596-606.

20. Dittmer N. T., Kanost M. R. Insect multicopper oxidases: diversity, properties, and physiological roles // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2010. V. 40. P. 179-188.

21. Ducros V., Brzozowski A. M., Wilson K. S., Brown S. H., 0stergaard P. R., Schneider P., Yaver D. S., Pedersen A. H., Gideon J D. Crystal structure of the type-2 Cu depleted laccase from Corpinus cinereus at 2,2A resolution // Nature structural biology. 1998. V. 5. P. 310-316.

22. Durao P., Chen Z., Fernandes A., Hildebrandt P., Murgida D., Todorovic S., Pereira M., Melo E., Martins L. Copper incorporation into recombinant CotA laccase from Bacillus subtilis: characterization of fully copper loaded enzymes // J Biol Inorg Chem. 2008. V.13. P. 183-193.

23. Edaurd Buchner. Cell-free fermentation // 1907.

24. Emsley P., Lohkamp B., Scott W. G., Cowtan K. Features and development of Coot // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010. V. 66. P. 486-501.

25. Endo K., Hayashi Y., Takahiro H., Hosono K., Beppu T., Ueda K. Enzymological characterization of EpoA, a laccase-like phenol oxidazes produced by Streptomyces griseus // The Japannese biochemical society. 2003. V. 133. P. 671-677.

26. Fahraeus G., Reinhammar B. Large scale production and purification of laccase from culture of the fungus Polyporus versicolor and some properties of Laccase A // Acta chemica scandinavica. 1967. P. 2367-2378.

27. Fee J., Malkin R., Malmstrom B. G., Vanngard T. Anaerobic oxidation-reduction titrations of fungal laccase // The journal of biological chemistry. 1969. V. 244. P. 4200-4207.

28. Fischer E. Einfluss der configuration auf die wirkung der enzyme. II // Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1894. V. 27. P. 3479-3483.

29. Garzillo A. M., Colao M. C., Buonocore V., Oliva R., Falcigno L., Saviano M., Santoro A. M., Zappala R., Bonomo R. P., Bianco C., Giardina P., Palmieri G., Sannia G. Structural and kinetic characterization of native laccases from Pleurotus ostreatus, Rigidoporus lignosus, and Trametes trogii // Journal of Protein Chemistry. 2001. V. 20. P. 191-201.

30. Gavnholt B., Larsen K. Molecular biology of plant laccases in relation to lignin formation // Physiologia Plantarum. 2002. V. 116. P. 273-280.

31. Geibel S., Lörinczi E., Bamberg E., Friedrich T. Voltage Dependence of Proton Pumping by Bacteriorhodopsin Mutants with Altered Lifetime of the M Intermediate // PLoS ONE. 2013. V. 8. P. e73338.

32. Geng A., Wu J., Xie R.-R., Li X., Chang F.-X., Sun J.-Z. Characterization of a laccase from a wood-feeding termite, Coptotermes formosanus // Insect Science. 2018. V. 25. P. 251-258.

33. Germann U. A., Lerch K. Isolation and partial nucleotide sequence of the laccase gene from Neurospora crassa: amino acid sequence homology of the protein to human ceruloplasmin. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1986. V. 83. P. 8854-8858.

34. Germann U. A., Müller G., Hunziker P. E., Lerch K. Characterization of two allelic forms of Neurospora crassa laccase // Journal of Biological Chemistry. 1988. V. 263. P. 885-896.

35. Granja-Travez R. S., Bugg T. D. H. Characterization of multicopper oxidase CopA from Pseudomonas putida KT2440 and Pseudomonas fluorescens Pf-5: Involvement in bacterial lignin oxidation // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2018. V. 660. P. 97-107.

36. Grass G., Rensing C. CueO Is a multi-copper oxidase that confers copper tolerance in Escherichia coli // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001. V. 286. P. 902-908.

37. Guan Z.-B., Luo Q., Wang H.-R., Chen Y., Liao X.-R. Bacterial laccases: promising biological green tools for industrial applications // Cell. Mol. Life Sci. 2018. V. 75. P. 3569-3592.

38. Gunne M., Höppner A., Hagedoorn P.-L., Urlacher V. B. Structural and redox properties of the small laccase Ssl1 from Streptomyces sviceus // FEBS J. 2014. V. 281. P. 4307-4318.

39. Gupta A., Nederlof I., Sottini S., Tepper A. W. J. W., Groenen E. J. J., Thomassen E. A. J., Canters G. W. Involvement of Tyr108 in the enzyme mechanism of the small laccase from Streptomyces coelicolor // J. Am. Chem. Soc. 2012. V. 134. P. 18213-18216.

40. Heckmann C. M., Paradisi F. Looking back: a short history of the discovery of enzymes and how they became powerful chemical tools // ChemCatChem. 2020. V. 12. P. 6082-6102.

41. Heinfling A., Martinez M.-J., Martinez A. T., Bergbauer M., Szewzyk U. Purification and characterization of peroxidases from the dye-decolorizing fungus Bjerkandera adusta // FEMS Microbiology Letters. 1998. V. 165. P. 43-50.

42. John Northrop. The preparation of pure enzymes and virus protein // 1946.

43. Jones S. M., Solomon E. I. Electron transfer and reaction mechanism of laccases // Cell. Mol. Life Sci. 2015. V. 72. P. 869-883.

44. Kabsch W. XDS // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010. V. 66. P. 125-132.

45. Kallio J. P., Auer S., Jänis J., Andberg M., Kruus K., Rouvinen J., Koivula A., Hakulinen N. Structure-function studies of a Melanocarpus albomyces laccase suggest a pathway for oxidation of phenolic compounds // Journal of Molecular Biology. 2009. V. 392. P. 895-909.

46. Kamitaka Y., Tsujimura S., Kataoka K., Sakurai T., Ikeda T., Kano K. Effects of axial ligand mutation of the type I copper site in bilirubin oxidase on direct electron transfer-type

bioelectrocatalytic reduction of dioxygen // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2007. V. 601. P. 119-124.

47. Keilin D., Mann T. Some properties of laccase from the latex of lacquer trees // Nature Publishing Group. 1940. V. 145. P. 304.

48. Kendrew J. C. Myoglobin and the structure of proteins // Science. 1963. V. 139. P. 1259-1266.

49. Kertész D. State of copper in polyphenoloxidase // Nature. 1957. V. 180. P. 506-507.

50. Kertész D., Zito R. Polyphenoloxidase ('tyrosinase'): purification and molecular properties // Nature. 1957. P. 1017-1018.

51. Khan M. T., Shah I. A., Ihsanullah I., Naushad Mu., Ali S., Shah S. H. A., Mohammad A. W. Hospital wastewater as a source of environmental contamination: An overview of management practices, environmental risks, and treatment processes // Journal of Water Process Engineering. 2021. V. 41. P. 101990.

52. Kiiskinen L.-L., Kruus K., Bailey M., Ylösmäki E., Siika-aho M., Saloheimo M. Expression of Melanocarpus albomyces laccase in Trichoderma reesei and characterization of the purified enzyme // Microbiology. 2004. V. 150. P. 3065-3074.

53. Kim C., Lorenz W. W., Hoopes J. T., Dean J. F. D. Oxidation of phenolate siderophores by the multicopper oxidase encoded by the Escherichia coli yacK gene // J Bacteriol. 2001. V. 183. P. 48664875.

54. Klonowska A., Gaudin C., Fournel A., Asso M., Le Petit J., Giorgi M., Tron T. Characterization of a low redox potential laccase from the basidiomycete C30 // European Journal of Biochemistry. 2002. V. 269. P.6119-6125.

55. Komori H., Miyazaki K., Higuchi Y. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a putative two-domain-type laccase from a metagenome // Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 2009a. V. 65. P. 264-266.

56. Komori H., Miyazaki K., Higuchi Y. X-ray structure of a two-domain type laccase: a missing link in the evolution of multi-copper proteins // FEBS Letters. 2009b. V. 583. P. 1189-1195.

57. Kudanga T., Nemadziva B., Le Roes-Hill M. Laccase catalysis for the synthesis of bioactive compounds // Appl Microbiol Biotechnol. 2017. V. 101. P. 13-33.

58. Kühne W. F. Verhandlungen des naturhistorisch-medizinischen vereins zu Heidelberg. , 1877. 190-198 c.

59. Kumar V., Sonkar P. Laccases: sources and their environmental application // International Journal of Bioassays. 2013. V. 2. P. 909-911.

60. Kunamneni A., Plou F., Ballesteros A., Alcalde M. Laccases and their applications: a patent review // BIOT. 2008. V. 2. P. 10-24.

61. Kwon H., Basran J., Devos J. M., Suardíaz R., Kamp M. W. van der, Mulholland A. J., Schrader T. E., Ostermann A., Blakeley M. P., Moody P. C. E., Raven E. L. Visualizing the protons in a metalloenzyme electron proton transfer pathway // Proc Natl Acad Sci USA. 2020. V. 117. P. 64846490.

62. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the dead of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

63. Li X., Wei Z., Zhang M., Peng X., Yu G., Teng M., Gong W. Crystal structures of E. coli laccase CueO at different copper concentrations // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2007. V. 354. P. 21-26.

64. Lu L., Zeng G., Fan C., Zhang J., Chen A., Chen M., Jiang M., Yuan Y., Wu H., Lai M., He Y. Diversity of two-domain laccase-like multicopper oxidase genes in Streptomyces spp.: identification of genes potentially involved in extracellular activities and lignocellulose degradation during composting of agricultural waste // Appl. Environ. Microbiol. 2014. V. 80. P. 3305-3314.

65. Machczynski M. C., Babicz J. T. Correlating the structures and activities of the resting oxidized and native intermediate states of a small laccase by paramagnetic NMR // Journal of Inorganic Biochemistry. 2016. V. 159. P. 62-69.

66. Machczynski M. C., Vijgenboom E., Samyn B., Canters G. W. Characterization of SLAC: A small laccase from Streptomyces coelicolor with unprecedented activity // Protein Sci. 2004. V. 13. P. 23882397.

67. Madzak C., Mimmi M. C., Caminade E., Brault A., Baumberger S., Briozzo P., Mougin C., Jolivalt C. Shifting the optimal pH of activity for a laccase from the fungus Trametes versicolor by structure-based mutagenesis // Protein Engineering, Design and Selection. 2006. V. 19. P. 77-84.

68. Majumdar S., Lukk T., Solbiati J. O., Bauer S., Nair S. K., Cronan J. E., Gerlt J. A. Roles of small laccases from Streptomyces in lignin degradation // Biochemistry. 2014. V. 53. P. 4047-4058.

69. Malkin R., Malmström B. G., Vänngärd T. The requirement of the "non-blue" copper (II) for the activity of fungal laccase // FEBS Letters. 1968. V. 1. P. 50-54.

70. Malkin R., Malmström B. G., Vänngärd T. The reversible removal of one specific copper(II) from fungal laccase // Eur J Biochem. 1969. V. 7. P. 253-259.

71. Malmström B. G. Rack-induced bonding in blue-copper proteins // Eur J Biochem. 1994. V. 223. P. 711-718.

72. Malmström B. G., Aasa R., Vänngärd T. The effect of increased pH on the spectral properties of fungal laccase // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology and Biological Oxidation. 1965. V. 110. P. 431-434.

73. Malmström B. G., Mosbach R., Vänngärd T. An electron spin resonance study of the state of copper in fungal laccase // Nature. 1959. V. 183. P. 321-322.

74. Malmström B. G., Reinhammar B., Vänngärd T. Two forms of copper (II) in fungal laccase // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1968. V. 156. P. 67-76.

75. Malmström B. G., Vänngärd T., Malkin R. Spectroscopic differentiation of the electron-accepting sites in fungal laccase // Eur J Biochem. 1969. V. 10. P. 324-329.

76. Martins L. O., Soares C. M., Pereira M. M., Teixeira M., Costa T., Jones G. H., Henriques A. O. Molecular and Biochemical Characterization of a Highly Stable Bacterial Laccase That Occurs as a Structural Component of the Bacillus subtilis Endospore Coat // Journal of Biological Chemistry. 2002. V. 277. P. 18849-18859.

77. Matera I., Gullotto A., Tilli S., Ferraroni M., Scozzafava A., Briganti F. Crystal structure of the blue multicopper oxidase from the white-rot fungus Trametes trogii complexed with p-toluate // Inorganica Chimica Acta. 2008. V. 361. P. 4129-4137.

78. McCoy A. J., Grosse-Kunstleve R. W., Adams P. D., Winn M. D., Storoni L. C., Read R. J. Phaser crystallographic software // J Appl Crystallogr. 2007. V. 40. P. 658-674.

79. Mehra R., Muschiol J., Meyer A. S., Kepp K. P. A structural-chemical explanation of fungal laccase activity // Sci Rep. 2018. V. 8. P. 17285.

80. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin // Eur J Biochem. 1990. V. 187. P. 341-352.

81. Messerschmidt A., Luecke H., Huber R. X-ray structures and mechanistic implications of three functional derivatives of ascorbate oxidase from zucchini. Reduced, peroxide and azide forms. // Journal of Molecular Biology. 1993. V. 230. P. 997-1014.

82. Minuth W., Esser K., Klischies M. The phenoloxidases of the ascomycete Podospora anserina. Structural differences between laccases of high and low molecular weight // Eur J Biochem. 1978. V. 90. P. 73-82.

83. Morozova O. V., Shumakovich G. P., Gorbacheva M. A., Shleev S. V., Yaropolov A. I. "Blue" laccases // Biochemistry Moscow. 2007a. V. 72. P. 1136-1150.

84. Morozova O. V., Shumakovich G. P., Shleev S. V., Yaropolov Ya. I. Laccase-mediator systems and their applications: a review // Appl Biochem Microbiol. 2007b. V. 43. P. 523-535.

85. Murshudov G. N., Skubak P., Lebedev A. A., Pannu N. S., Steiner R. A., Nicholls R. A., Winn M. D., Long F., Vagin A. A. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2011. V. 67. P. 355-367.

86. Nakamura K., Kawabata T., Yura K., Go N. Novel types of two-domain multi-copper oxidases: possible missing links in the evolution // FEBS Letters. 2003. V. 553. P. 239-244.

87. Nakamura T. Purification and physico-chemical properties of laccase // Biochimica et Biophysica Acta. 1958. V. 30. P. 44-52.

88. Nyman K., Hakala T. Decolorization of inkjet ink and deinking of inkjet-printed paper with laccase-mediator system // BioResources. 2011. V. 6. P. 1336-1350.

89. Nyman P. O., Briving C., Gandvik E.-K. Structural studies around cystein and cystine residues in the «Blue» oxidase fungal laccase B. Similarity in amino acid sequence with ceruloplasmin // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1980. V. 93. P. 454-461.

90. Olbrich A. C., Schild J. N., Urlacher V. B. Correlation between the T1 copper reduction potential and catalytic activity of a small laccase // Journal of Inorganic Biochemistry. 2019. V. 201. P. 1-9.

91. Osipov E., Polyakov K., Kittl R., Shleev S., Dorovatovsky P., Tikhonova T., Hann S., Ludwig R., Popov V. Effect of the L499M mutation of the ascomycetous Botrytis aclada laccase on redox potential and catalytic properties // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2014. V. 70. P. 2913-2923.

92. Otto H., Marti T., Holz M., Mogi T., Lindau M., Khorana H. G., Heyn M. P. Aspartic acid-96 is the internal proton donor in the reprotonation of the Schiff base of bacteriorhodopsin. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1989. V. 86. P. 9228-9232.

93. Pardo I., Rodríguez-Escribano D., Aza P., Salas F. de, Martínez A. T., Camarero S. A highly stable laccase obtained by swapping the second cupredoxin domain // Sci Rep. 2018. V. 8.

94. Pauling L. Modern structural chemistry // 1954.

95. Petrek M., Otyepka M., Banás P., Kosinová P., Koca J., Damborsky J. CAVER: a new tool to explore routes from protein clefts, pockets and cavities // BMC Bioinformatics. 2006. V. 7. P. 1-9.

96. Piontek K., Antorini M., Choinowski T. Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-Á resolution containing a full complement of coppers // Journal of Biological Chemistry. 2002. V. 277. P. 37663-37669.

97. Piscitelli A., Giardina P., Lettera V., Pezzella C., Sannia G., Faraco V. Induction and transcriptional regulation of laccases in fungi // CG. 2011. V. 12. P. 104-112.

98. Polyakov K. M., Gavryushov S., Fedorova T. V., Glazunova O. A., Popov A. N. The subatomic resolution study of laccase inhibition by chloride and fluoride anions using single-crystal serial crystallography: insights into the enzymatic reaction mechanism // Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019. V. 75. P. 804-816.

99. Reinhammar B. Purification and properties of laccase and stellacyanin from Rhus vernicifera // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1970. V. 205. P. 35-47.

100. Roberts S. A., Wildner G. F., Grass G., Weichsel A., Ambrus A., Rensing C., Montfort W. R. A labile regulatory copper ion lies near the T1 copper site in the multicopper oxidase CueO // Journal of Biological Chemistry. 2003. V. 278. P. 31958-31963.

101. Robertson A. J. B. The early history of catalysis // Platinum Metals Review. 1975. P. 64-69.

102. Sadhasivam S., Savitha S., Swaminathan K., Lin F.-H. Production, purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoderma harzianum WL1 // Process Biochemistry. 2008. V. 43. P. 736-742.

103. Sanger F., Tuppy H. The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin 1. The identification of lower peptides from partial hydrolysates // Biochemical Journal. 1951a. V. 49. P. 463-481.

104. Sanger F., Tuppy H. The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin 2. The identification of lower peptides from partial hydrolysates // Biochemical Journal. 1951b. V. 49. P. 481-490.

105. Sekretaryova A., Jones S. M., Solomon E. I. O2 reduction to water by high potential multicopper oxidases: contributions of the T1 copper site potential and the local environment of the trinuclear copper cluster // J. Am. Chem. Soc. 2019. V. 141. P. 11304-11314.

106. Sherif M., Waung D., Korbeci B., Mavisakalyan V., Flick R., Brown G., Abou-Zaid M., Yakunin A. F., Master E. R. Biochemical studies of the multicopper oxidase (small laccase) from Streptomyces coelicolor using bioactive phytochemicals and site-directed mutagenesis // Microbial Biotechnology. 2013. V. 6. P. 588-597.

107. Silva C. S., Damas J. M., Chen Z., Brissos V., Martins L. O., Soares C. M., Lindley P. F., Bento I. The role of Asp116 in the reductive cleavage of dioxygen to water in CotA laccase: assistance during the proton-transfer mechanism // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2012. V. 68. P. 186-193.

108. Skálová T., Dohnálek J., 0stergaard L. H., 0stergaard P. R., Kolenko P., Dusková J., Stepánková A., Hasek J. The structure of the small laccase from Streptomyces coelicolor reveals a link between laccases and nitrite reductases // Journal of Molecular Biology. 2009. V. 385. P. 1165-1178.

109. Solano F., Lucas-Elio P., Lopez-Serrano D., Fernandez E., Sanchez-Amat A. Dimethoxyphenol oxidase activity of different microbial blue multicopper proteins // FEMS Microbiology Letters. 2001. V. 204. P. 175-181.

110. Solomon E. I., Heppner D. E., Johnston E. M., Ginsbach J. W., Cirera J., Qayyum M., Kieber-Emmons M. T., Kjaergaard C. H., Hadt R. G., Tian L. Copper active sites in biology // Chem. Rev. 2014. V. 114. P. 3659-3853.

111. Sondhi S., Sharma P., Saini S., Puri N., Gupta N. Purification and characterization of an extracellular, thermo-alkali-stable, metal tolerant laccase from Bacillus tequilensis SN4 // PLoS ONE. 2014. V. 9. P. 1-9.

112. Sumner J. B. The chemical nature of enzymes // Nobel lecture. 1946. P. 114-121.

113. Tissieres A. Reconstruction of laccase from its protein and copper // Nature. 1948. V. 162. P. 340-341.

114. Tittor J., Soell C., Oesterhelt D., Butt H. J., Bamberg E. A defective proton pump, point-mutated bacteriorhodopsin Asp96 - Asn is fully reactivated by azide. // The EMBO Journal. 1989. V. 8. P. 3477-3482.

115. Toscano M. D., De Maria L., Lobedanz S., 0stergaard L. H. Optimization of a small laccase by active-site redesign // ChemBioChem. 2013. V. 14. P. 1209-1211.

116. Trubitsina L. I., Tishchenko S. V., Gabdulkhakov A. G., Lisov A. V., Zakharova M. V., Leontievsky A. A. Structural and functional characterization of two-domain laccase from Streptomyces viridochromogenes // Biochimie. 2015. V. 112. P. 151-159.

117. Uthandi S., Saad B., Humbard M. A., Maupin-Furlow J. A. LccA, an archaeal laccase secreted as a highly stable glycoprotein into the extracellular medium by Haloferax volcanii // Appl Environ Microbiol. 2010. V. 76. P. 733-743.

118. Vandeyar M. A., Weiner M. P., Hutton C. J., Batt C. A. A simple and rapid method for the selection of oligodeoxynucleotide-directed mutants // Gene. 1988. V. 65. P. 129-133.

119. Vickery H. B. Liebig and proteins // J. Chem. Educ. 1942. V. 19. P. 73.

120. Wang H., Liu X., Zhao J., Yue Q., Yan Y., Gao Z., Dong Y., Zhang Z., Fan Y., Tian J., Wu N., Gong Y. Crystal structures of multicopper oxidase CueO G304K mutant: structural basis of the increased laccase activity // Sci Rep. 2018. V. 8. P. 14252.

121. Wariishi H., Valli K., Gold M. H. Manganese(II) oxidation by manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium // Journal of Biological Chemistry. 1992. V. 267. P. 23688-23695.

122. Wisniak J. Gabriel Bertrand // Revista CENIC. Ciencias Biológicas. 2014. V. 45. P. 230-245.

123. Yang J., Li W., Ng T. B., Deng X., Lin J., Ye X. Laccases: production, expression regulation, and applications in pharmaceutical biodegradation // Front. Microbiol. 2017. V. 8. P. 832.

124. Yin Q., Zhou G., Peng C., Zhang Y., Kues U., Liu J., Xiao Y., Fang Z. The first fungal laccase with an alkaline pH optimum obtained by directed evolution and its application in indigo dye decolorization // AMB Expr. 2019. V. 9. P. 151.

125. Yoon J., Solomon E. I. Electronic structure of the peroxy intermediate and Its correlation to the native intermediate in the multicopper oxidases: insights into the reductive cleavage of the O-O bond // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 13127-13136.

126. Yoshida H. Chemistry of Lacquer (Urushi) Part 1 // Journal of the Chemical Society. 1883. V. 43. P. 472-486.

127. Zerva A., Simic S., Topakas E., Nikodinovic-Runic J. Applications of microbial laccases: patent review of the past decade (2009-2019) // Catalysts. 2019. V. 9. P. 1023.

128. Zhang L., Cui H., Zou Z., Garakani T. M., Novoa-Henriquez C., Jooyeh B., Schwaneberg U. Directed evolution of a bacterial laccase (CueO) for enzymatic biofuel cells // Angew. Chem. Int. Ed. 2019. V. 58. P. 4562-4565.

129. Zhu Y., Zhang Y., Zhan J., Lin Y., Yang X. Axial bonds at the T1 Cu site of Thermus thermophilus SG0.5JP17-16 laccase influence enzymatic properties // FEBS Open Bio. 2019. V. 9. P. 986-995.

130. Zimbardi A., Camargo P., Carli S., Aquino Neto S., Meleiro L., Rosa J., De Andrade A., Jorge J., Furriel R. A high redox potential laccase from Pycnoporus sanguineus RP15: Potential Application for Dye Decolorization // IJMS. 2016. V. 17. P. 672.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу выразить благодарность моему научному руководителю Габдулхакову Азату Габдрахмановичу, который принял меня под своё руководство, помогал в постановке и решении задач, а также курировал и обсуждал результаты работы. Отдельную благодарность научному руководителю хочу вынести за систематическое проведение семинаров и возможность посещать конференции и школы, которые мотивировали на дальнейшую работу. Хочу выразить благодарность соруководителю Тищенко Светлане Викторовне, за предоставление объекта исследования, обсуждение результатов работы и помощь в написании статей и диссертационной работы. Также хочу поблагодарить Костареву Ольгу, Михайлину Алису, Джус Ульяну за помощь в освоении методов, используемых в работе, за проявленные терпение и выдержку.

Благодарен Никулину Алексею Донатовичу и Марии Борисовне Гарбер за

предоставленную возможность работать в лаборатории, за отзывчивость и чуткое отношение ко всем работникам лаборатории. Отдельную благодарность за ценные советы и исправления хотелось бы выразить Никонову Олегу Станиславовичу. Хочу поблагодарить Мельника Богдана Степановича и Балобанова Виталия Александровича за возможность работать на оборудовании лаборатории физики белка РАН.

Я благодарен каждому сотруднику лаборатории структурных исследований аппарата трансляции, группы структурных исследований рибосомных белков и группы структурных исследований макромолекулярных комплексов за создание позитивной атмосферы, а также за ценные советы и всестороннюю помощь.