Влияние теплового шока на репликацию ДНК, стабильность генома и структуру хроматина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Величко, Артём Константинович

• Величко, Артём Константинович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Величко, Артём Константинович

СОДЕЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Уровни системного ответа организма на тепловой стресс.

1.1.1. Клеточный уровень.

1.1.1.1. Мембраны.

1.1.1.2. Цитоскелет.

1.1.1.3. Цитоплазма и клеточные органеллы.

1.1.1.4. Тепловой шок и клеточная смерть.

1.1.1.5. Клеточный цикл.

1.1.2. Молекулярный уровень.

1.1.2.1. Белки и факторы теплового шока.

1.1.2.2. Транскрипция и метаболизм РНК.

1.1.2.3. Репарация ДНК.

1.1.2.4. Репликация.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.2. Материалы.

2.2.1. Клеточные линии.

2.2.2. Антитела.

2.2.3. Химические реактивы.

2.3. Методы.

2.3.1. Культивирование клеток человека.

2.3.2. Включение аналогов нуклеотидов.

2.3.3. Иммуноцитохимия.

2.3.4. Выделение РНК.

2.3.5. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени на матрице кДНК.

2.3.6. Приготовление белковых экстрактов:.

2.3.6.1. Приготовление клеточных экстрактов:.

2.3.6.2. Приготовление ядерных экстрактов.

2.3.6.3. Экстракция гистонов.

2.3.7. Вестерн-блот гибридизация.

2.3.8. Анализ чувствительности к ДНКазе 1.

2.3.9. Проточная цитофлуориметрия.

2.3.10. З'-Концевое мечение ДНК с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы.

2.3.11. Ник-трансляция in situ (мечение ДНК с использованием ДНК-полимеразы I)

2.3.12. Получение препаратов ДНК-нитей (DNA combing).

2.3.13. РНК-интерференция.

2.3.14. Метод ДНК-комет (гель-электрофорез одиночных клеток).

2.3.14.1. Нейтральная версия.

2.3.14.2. Щелочная версия.

2.3.14.3. Иммунофлуоресцентная версия.

2.3.15. Метод оценки жизнеспособности клеток (МТТ-тест).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Роль белка гетерохроматина 1 в клеточном ответе на тепловой стресс.

3.1.1. Кратковременный тепловой стресс не влияет на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток человека.

3.1.2. Белок гетерохроматина la (HP 1а) диссоциирует из центромерных областей хромосом в условиях теплового стресса.

3.1.3. Диссоциация HP 1 а из центромерных участков хромосом не связана с деметилированием остатков лизина 9 гистона НЗ (НЗК9).

3.1.4. Диссоциация НР1а не приводит к декомпактизации центромерных участков

3.1.5. Обсуждение результатов.

3.2. Роль гистона уН2АХ в клеточном ответе на тепловой стресс.

3.2.1. Тепловой шок индуцирует фосфорилирование гистона Н2АХ в клетках человека

3.2.2. Профиль распределения уН2АХ, индуцированного тепловым шоком, зависит от стадии клеточного цикла.

3.2.3. Тепловой шок индуцирует формирование двуцепочечных разрывов ДНК в Gl - и 02-клетках.

3.2.4. Тепловой шок оказывает пропорциональный своей силе эффект на репликацию ДНК

3.2.5. Молекулы Н2АХ, формирующие Б- и Я-фокусы, фосфорилируются с помощью разных киназ.

3.2.6. Фосфорилирование Н2АХ предотвращает коллапс репликативных вилок.

3.2.7. Обсуждение результатов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние теплового шока на репликацию ДНК, стабильность генома и структуру хроматина»

Терапевтические свойства высоких температур были известны с древних времен. Однако только в двадцатом веке учёные и медики стали исследовать и применять гипертермию для лечения онкологических, иммунологических, вирусных и других заболеваний. Необходимость в развитии и совершенствовании технологии гипертермии объясняется недостаточной эффективностью хирургических, фармакологических и прочих подходов. Согласно современной точке зрения, гипертермия рассматривается как универсальный и наиболее эффективный модификатор лучевой и химиотерапии, способный повысить их эффективность в 1.5-2.5 раза [1, 2], и только в случае невозможности применения этих подходов рассматривается как монометод. Эффективность локальной гипертермии доказана при подавляющем большинстве видов солидных опухолей и их метастазов в различные органы [1]. Основанием для клинического применения гипертермии является её общее цитотоксическое действие на раковые клетки, включая ингибирование синтеза ДНК, нарушение кальциевого гомеостаза, индукция ареста клеточного цикла и апоптоз. Базисом для терапии рака с помощью высоких температур является понимание физиологической реакции опухоли на тепловой стресс. Микроокружение опухоли характеризуется редукцией кровеносных сосудов, сопровождаемой гипоксией и ацидозом [2]. Клиническая практика показывает, что умеренная гипертермия, в диапазоне 41-42°С, улучшает кровоснабжение опухолей и усиливает их оксигенацию, что способствует более эффективному действию химио- и радиотерапии [2]. Однако понимание молекулярных основ эффекта теплового стресса на клетку по-прежнему остаётся не полным. Считается, что первичными сенсорами температуры в клетке являются б белки. Температурная дисфункция белков обусловлена нарушением термолабильных водородных связей и неполярных гидрофобных взаимодействий, дестабилизацией а-спиралей и Р-структур, приводящей к нарушению вторичной и третичной конформаций белков. Для предотвращения денатурации в ответ на стресс, клетки запускают экспрессию белков теплового шока (от англ. Heat Shock Proteins, HSPs), которые, являясь в частности молекулярными шаперонами, осуществляют стабилизацию и рефолдинг денатурированных молекул белка [2-4]. Однако изменение транскрипционного статуса клетки при тепловом шоке отнюдь не ограничивается повышением экспрессии HSPs. В ряде работ продемонстрировано усиление или, наоборот, уменьшение (прекращение) экспрессии различных групп генов в условии гипертермического стресса [5, 6]. Если за специфическую активацию транскрипции при тепловом стрессе ответственны факторы теплового шока (от англ. Heat Shock Factors, HSFs) [7], то системы обеспечивающие транскрипционную репрессию остаются неизученными. Мы предположили, что в процессе индуцированного стрессом сайленсинга генов могут участвовать структурные белки гетерохроматина, и в частности белок HP 1а. В первой части работы, мы попытались ответить на вопрос, какова функциональная динамика белка HP la, его роль в эпигенетическом контроле и масштабной транскрипционной репрессии генов в клетках человека при гипертермии.

ДНК также является мишенью для высоких температур. Исследования последних лет демонстрируют, что гипертермия индуцирует фосфорилирование гистона Н2АХ по 139 серину [8-14]. Эта модификация, известная как уН2АХ, на сегодняшний день считается универсальным маркёром двуцепочечных разрывов

ДНК [15-17]. Сотни молекул модифицированного Н2АХ аккумулируются в сайте разрыва, фланкируя его на несколько десятков тысяч пар оснований и образуя цитологичсеки детектируемые фокусы. В фокусах уН2АХ непосредственно связывает факторы репарации МБС1 и ЫВ81, которые позволяют набору других белков, в том числе МЕЩ, В11СА1 и 53ВР1 аккумулироваться в сайтах поврежденной ДНК и запускать каскад репарационных процессов [18]. В этой связи логичным представляется предположение о том, что формирование фокусов уН2АХ в условиях гипертермического стресса связано с индуцированными температурой двуцепочечными разрывами ДНК. Хотя это кажется очевидным, исследования ряда авторов демонстрируют, что уровень повреждения ДНК после гипертермического стресса не коррелирует с количеством индуцированных им фокусов уН2АХ. Таким образом, можно полагать, что, помимо маркирования двуцепочечных разрывов ДНК, существуют иные функции фосфорилирования гистона Н2АХ и другие каскадные механизмы индукции его фосфорилирования при гипертермии. Во второй части работы мы попытались охарактеризовать эти механизмы, как элементы эпигенетического контроля и поддержания геномной стабильности клетки в условиях температурного стресса.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Величко, Артём Константинович

5. Выводы

1. Продемонстрировано, что в условиях теплового шока белок НР1а диссоциирует из центромерного гетерохроматина. Диссоциация НР1а не влияет на структурную целостность центромерного гетерохроматина.

2. Тепловой шок индуцирует образование двуцепочечных разрывов ДНК в 01- и 02-фазах клеточного цикла. Эти разрывы маркируются с помощью АТМ-зависимого фосфорилирования гистона Н2АХ.

3. В зависимости от температуры тепловой шок приводит к торможению или полному аресту движения вилок репликации, что стимулирует ОЫА-РК-зависимое фосфорилирование Н2АХ в сайтах репликации.

4. Впервые продемонстрировано, что формирование доменов уН2АХ в сайтах репликации предотвращает репликативный арест при умеренной гипертермии (42, 44°С) и образование двуцепочечных разрывов в 8-фазе клеточного цикла при остром тепловом шоке (45,5°С).

Личный вклад:

Автором работы самостоятельно были проведены все эксперименты, а также обработка и анализ результатов исследования.

4. Заключение

Тепловой шок оказывает на клетку многосторонний эффект, затрагивающий работу практически всех клеточных систем. Некоторые клеточные компоненты, выполняющие в нормальных условиях специфические функции, могут менять свою функциональность при стрессе. В нашей работе мы показали, что подобный феномен характерен для белка НР1а, который в норме функционирует как структурный компонент гетерохроматина, а в условиях теплового стресса перераспределяется по другим, возможно эухроматиновым, компартментам. Пока мы можем только строить предположения по вопросу о функциональной и адаптивной значимости этого явления. Удар теплового шока приходится также на ДНК-ассоциированные процессы, в частности репликацию, которая в зависимости от силы гипертермии либо замедляется, либо полностью останавливается. Тем не менее, клетка имеет механизмы надёжной протекции репликативной машины в стрессовых условиях. Как продемонстрировано в нашей работе, одним из таких механизмов, срабатывающим при тепловом шоке, является фосфорилирование гистона Н2АХ. В целом считается, что главной мишенью гипертермии, в том числе и при использовании ее в клинических целях, являются белки. Однако ДНК также подвержена действию теплового стресса. Мы продемонстрировали, что гипертермия провоцирует образование в клетках человека двуцепочечных разрывов ДНК.

В настоящее время гипертермия является одним из методов лечения онкологических заболеваний. Сочетание химиотерапии и гипертермии увеличивает эффективность лечения различных форм опухолей, включая рак груди и головного мозга. Эффективность локальной гипертермии доказана при подавляющем большинстве видов солидных опухолей и их метастазов в различные органы. Очевидно, что изучение молекулярных механизмов клеточного ответа на тепловой стресс не только расширяет наше фундаментальное понимание механизмов адаптации и защиты клеток при стрессе, но и является необходимым для выработки оптимальной стратегии использования гипертермии в клинических целях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Величко, Артём Константинович, 2012 год

1. Falk М.Н. and Issels R.D. 2001. Hyperthermia in oncology. Int J Hyperthermia, 17(1): 118.

2. Hildebrandt В., Wust P., Ahlers O., Dieing A., Sreenivasa G., et al. 2002. The cellular and molecular basis of hyperthermia Crit Rev Oncol Hematol, 43(1): 33-56.

3. Lindquist S. and Craig E.A. 1988. The heat-shock proteins. Annu Rev Genet, 22: 631-77.

4. Gething M.J. and Sambrook J. 1992. Protein folding in the cell. Nature, 355(6355): 3345.

5. Murray J.I., Whitfield M.L., Trinklein N.D., Myers R.M., Brown P.O., et al. 2004. Diverse and specific gene expression responses to stresses in cultured human cells. Mol Biol Cell, 15(5): 2361-74.

6. Streffer C. 1982. Aspects of biochemical effects by hyperthermia Natl Cancer Inst Monogr, 61: 11-7.

7. Akerfelt M., Morimoto R.I., and Sistonen L. 2010. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat Rev Mol Cell Biol, 11(8): 545-55.

8. Hunt C.R., Pandita R.K., Laszlo A., Higashikubo R., Agarwal M., et al. 2007. Hyperthermia activates a subset of ataxia-telangiectasia mutated effectors independent of DNA strand breaks and heat shock protein 70 status. Cancer Res, 67(7): 3010-7.

9. Laszlo A. and Fleischer I. 2009. The heat-induced gamma-H2AX response does not play a role in hyperthermic cell killing. Int J Hyperthermia, 25(3): 199-209.

10. Roti Roti J.L. 2008. Cellular responses to hyperthermia (40-46 degrees C): cell killing and molecular events. Int J Hyperthermia, 24(1): 3-15.

11. Roti Roti J.L., Pandita R.K., Mueller J.D., Novak P., Moros E.G., et al. 2010. Severe, short-duration (0-3 min) heat shocks (50-52 degrees C) inhibit the repair of DNA damage. Int J Hyperthermia, 26(1): 67-78.

12. Takahashi A., Matsumoto H., Nagayama K., Kitano M., Hirose S., et al. 2004. Evidence for the involvement of double-strand breaks in heat-induced cell killing. Cancer Res, 64(24): 8839-45.

13. Takahashi A., Mori E., Somakos G.I., Ohnishi K., and Ohnishi T. 2008. Heat induces gammaH2AX foci formation in mammalian cells. Mutat Res, 656(1-2): 88-92.

14. Takahashi A. and Ohnishi T. 2005. Does gammaH2AX foci formation depend on the presence of DNA double strand breaks? Cancer Lett, 229(2): 171-9.

15. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., and Bonner W.M. 1999. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol, 146(5): 905-16.

16. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., and Bonner W.M. 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem, 273(10): 5858-68.

17. Sedelnikova O.A., Rogakou E.P., Panyutin I.G., and Bonner W.M. 2002. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res, 158(4): 486-92.

18. Bonner W.M., Redon C.E., Dickey J.S., Nakamura A.J., Sedelnikova O.A., et al. 2008. GammaH2AX and cancer. Nat Rev Cancer, 8(12): 957-67.

19. Vigh L., Maresca B., and Harwood J.L. 1998. Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes? Trends Biochem Sei, 23(10): 369-74.

20. Carratu L., Francescheiii S., Pardini C.L., Kobayashi G.S., Horvath I., et al. 1996. Membrane lipid perturbation modifies the set point of the temperature of heat shock response in yeast Proc Natl Acad Sei USA, 93(9): 3870-5.

21. Lin P.S., Lui P.S., and Tsai S. 1978. Heat induced ultrastructural injuries in lymphoid cells. Exp Mol Pathol, 29(3): 281-90.

22. Lin P.S. and Butterfield C.E. 1977. Hyperthermic treatment (43 degrees C) rapidly impedes attachment of fibroblasts to culture substrates. Cell Biol Int Rep, 1(1): 57-61.

23. Sato C., Nakayama T., Kojima K., Nishimoto Y., and Nakamura W. 1981. Effects of hyperthermia on cell surface charge and cell survival in mastocytoma cells. Cancer Res, 41(10): 4107-10.

24. Mikkelsen R.B. and Koch B. 1981. Thermosensitivity of the membrane potential of normal and simian virus 40-transformed hamster lymphocytes. Cancer Res, 41(1): 20915.

25. Park H.G., Han S.I., Oh S.Y., and Kang H.S. 2005. Cellular responses to mild heat stress. Cell Mol Life Sei, 62(1): 10-23.

26. Wrabl J.O., Larson S.A., and Hilser V.J. 2002. Thermodynamic environments in proteins: fundamental determinants of fold specificity. Protein Sei, 11(8): 1945-57.

27. Stevenson M.A., Calderwood S.K., and Hahn G.M. 1987. Effect of hyperthermia (45 degrees C) on calcium flux in Chinese hamster ovary HA-1 fibroblasts and its potential role in cytotoxicity and heat resistance. Cancer Res, 47(14): 3712-7.

28. Kiang J.G., Gist I.D., and Tsokos G.C. 2000. Regulation of heat shock protein 72 kDa and 90 kDa in human breast cancer MDA-MB-231 cells. Mol Cell Biochem, 204(1-2): 169-78.

29. Moulin M. and Arrigo A.P. 2006. Long lasting heat shock stimulation of TRAIL-induced apoptosis in transformed T lymphocytes. Exp Cell Res, 312(10): 1765-84.

30. Moulin M., Carpentier S., Levade T., and Arrigo A.P. 2007. Potential roles of membrane fluidity and ceramide in hyperthermia and alcohol stimulation of TRAIL apoptosis. Apoptosis, 12(9): 1703-20.

31. Huang J., Zhang X., and McNaughton P.A. 2006. Modulation of temperature-sensitive TRP channels. Semin CellDev Biol, 17(6): 638-45.

32. Patapoutian A., Peier A.M., Story G.M., and Viswanath V. 2003. ThermoTRP channels and beyond: mechanisms of temperature sensation. Nat Rev Neurosci, 4(7): 529-39.

33. Pollard T.D. 2003. The cytoskeleton, cellular motility and the reductionist agenda Nature, 422(6933): 741-5.

34. Armour E.P., McEachern D., Wang Z., Cony P.M., and Martinez A. 1993. Sensitivity of human cells to mild hyperthermia Cancer Res, 53(12): 2740-4.

35. Luchetti F., Mannello F., Canonico B., Battistelli M., Burattini S., et al. 2004. Integrin and cytoskeleton behaviour in human neuroblastoma cells during hyperthermia-related apoptosis. Apoptosis, 9(5): 635-48.

36. Pawlik A., Nowak J.M., Grzanka D., Gackowska L., Michalkievvicz J., et al. 2012. Hyperthermia induces cytoskeletal alterations and mitotic catastrophe in p53-deficient HI299 lung cancer cells. Acta Histochem.

37. Vidair C.A., Doxsey S.J., and Dewey W.C. 1993. Heat shock alters centrosome organization leading to mitotic dysfunction and cell death. J Cell Physiol, 154(3): 443-55.

38. Nakahata K., Miyakoda M., Suzuki K., Kodama S., and Watanabe M. 2002. Heat shock induces centrosomal dysfunction, and causes non-apoptotic mitotic catastrophe in human tumour cells. Int J Hyperthermia, 18(4): 332-43.

39. Wang T.T., Chiang A.S., Chu J.J., Cheng T.J., Chen T.M., et al. 1998. Concomitant alterations in distribution of 70 kDa heat shock proteins, cytoskeleton and organelles in heat shocked 9L cells. IntJBiochem Cell Biol, 30(6): 745-59.

40. Coss R.A., Alden M.E., Wachsberger P.R., and Smith N.N. 1996. Response of the microtubular cytoskeleton following hyperthermia as a prognostic indicator of survival of Chinese hamster ovary cells. IntJRadiat Oncol Biol Phys, 34(2): 403-10.

41. Wang Y., Guan J., Wang H., Leeper D., and Iliakis G. 2001. Regulation of dna replication after heat shock by replication protein a-nucleolin interactions. J Biol Chem, 276(23): 20579-88.

42. Vanderwaal R.P., Maggi L.B., Jr., Weber J.D., Hunt C.R., and Roti Roti J.L. 2009. Nucleophosmin redistribution following heat shock: a role in heat-induced radiosensitization. Cancer Res, 69(16): 6454-62.

43. Boulon S., Westman B.J., Hutten S., Boisvert P.M., and Lamond A.l. 2010. The nucleolus under stress. Mol Cell, 40(2): 216-27.

44. Jolly C., Konecny L., Grady D.L., Kutskova Y.A., Cotto J.J., et al. 2002. In vivo binding of active heat shock transcription factor 1 to human chromosome 9 heterochromatin during stress. J Cell Biol, 156(5): 775-81.

45. Biamonti G. 2004. Nuclear stress bodies: a heterochromatin affair? Nat Rev Mol Cell Biol, 5(6): 493-8.

46. Anderson P. and Kedersha N. 2002. Stressful initiations. J Cell Sci, 115(Pt 16): 3227-34.

47. Anderson P. and Kedersha N. 2008. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends Biochem Sci, 33(3): 141-50.

48. Kedersha N., Stoecklin G., Ayodele M., Yacono P., Lykke-Andersen J., et al. 2005. Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling. J Cell Biol, 169(6): 871-84.

49. Vidair C.A. and Dewey W.C. 1988. Two distinct modes of hyperthermic cell death. Radial Res, 116(1): 157-71.

50. O'Neill K.L., Fairbairn D.W., Smith M.J., and Poe B.S. 1998. Critical parameters influencing hyperthermia-induced apoptosis in human lymphoid cell lines. Apoptosis, 3(5): 369-75.

51. Falcieri E., Luchetti F., Burattini S., Canonico B., Santi S., et al. 2000. Lineage-related sensitivity to apoptosis in human tumor cells undergoing hyperthermia Histochem Cell Biol, 113(2): 135-44.

52. Amarante-Mendes G.P., McGahon A.J., Nishioka W.K., Afar D.E., Witte O.N., et al. 1998. Bcl-2-independent Bcr-Abl-mediated resistance to apoptosis: protection is correlated with up regulation of Bcl-xL. Oncogene, 16(11): 1383-90.

53. Milleron R.S. and Bratton S.B. 2006. Heat shock induces apoptosis independently of any known initiator caspase-activating complex. J Biol Chem, 281(25): 16991-7000.

54. Palzer R.J. and I-Ieidelberger C. 1973. Studies on the quantitative biology of hyperthermic killing of HeLa cells. Cancer Res, 33(2): 415-21.

55. Westra A. and Dewey W.C. 1971. Variation in sensitivity to heat shock during the cell-cycle of Chinese hamster cells in vitro. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med, 19(5): 467-77.

56. Bhuyan B.K., Day K.J., Edgerton C.E., and Ogunbase O. 1977. Sensitivity of different cell lines and of different phases in the cell cycle to hyperthermia Cancer Res, 37(10): 3780-4.

57. Valenzuela M.T., Nunez M.I., Villalobos M., Siles E., McMillan T.J., et al. 1997. A comparison of p53 and pi6 expression in human tumor cells treated with hyperthermia or ionizing radiation. Int J Cancer, 72(2): 307-12.

58. Furusawa Y., Iizumi T., Fujiwara Y., Zhao Q.L., Tabuchi Y., et al. 2012. Inhibition of checkpoint kinase 1 abrogates G2/M checkpoint activation and promotes apoptosis under heat stress. Apoptosis, 17(1): 102-12.

59. Madlener S., Rosner M., Krieger S., Giessrigl B., Gridling M., et al. 2009. Short 42 degrees C heat shock induces phosphorylation and degradation of Cdc25A which depends on p38MAPK, Chk2 and 14.3.3. Hum Mol Genet, 18(11): 1990-2000.

60. Nitta M., Okamura H., Aizawa S., and Yamaizumi M. 1997. Heat shock induces transient p53-dependent cell cycle arrest at Gl/S. Oncogene, 15(5): 561-8.

61. Fuse T., Yamada K., Asai K., Kato T., and Nakanishi M. 1996. Heat shock-mediated cell cycle arrest is accompanied by induction of p21 CKI Biochem Biophys Res Commun, 225(3): 759-63.

62. Nunes E. and Siede W. 1996. Hyperthermia and paraquat-induced G1 arrest in the yeast Saccharomyces cerevisiae is independent of the RAD9 gene. Radiat Environ Biophys, 35(1): 55-7.

63. Rowley A., Johnston G.C., Butler B., Werner-Washburne M., and Singer R.A. 1993. Heat shock-mediated cell cycle blockage and G1 cyclin expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 13(2): 1034-41.

64. Ritossa F.M. 1962. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila Experientia, 18: 571-573.