Влияние связывания катионов металлов на кооперативность тепловых переходов в парвальбумине тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Бакунц, Ануш Гамлетовна

• Бакунц, Ануш Гамлетовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бакунц, Ануш Гамлетовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Состояния белка и переходы между ними.

Состояния белка.

Развернутое состояние белка.

Состояние расплавленной глобулы.

Предшественник расплавленной глобулы.

Тепловые переходы в белках.

Тепловые переходы в металл-связывающих белках.

Структурная кооперативность белка.

Белки с внутренней неупорядоченностью.

Физико-химические свойства белков с внутренней неупорядоченностью . 19 Особенности аминокислотного состава белков с внутренней неупорядоченностью.

Некоторые представители семейства.

Функции белков с внутренней неупорядоченностью.

Структурирование белков с внутренней неупорядоченностью.

Парвальбумины.

Функции парвальбуминов.

Структура парвальбуминов.29"

Механизм связывания ионов кальция парвальбумином-.36'

Влияние связывания ионов кальция на структурные свойства парвальбумина.

Равновесные константы связывания катионов.

Кинетика связывания катионов.42"

Влияние различных участков парвальбумина на его сродство к Са2+.

Тепловые переходы в парвальбуминах.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Реактивы.

Выделение парвальбуминов крысы.

Выделение парвальбуминов щуки и трески.

Методы.

Очистка белка от ионов кальция.

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Круговой дихроизм.

Флуоресцентные измерения.

Оценка равновесных констант связывания Са2+ белком.

Расчет электростатических взаимодействий в белке.

Предсказания внутренней неупорядоченности белка.

Анализ полостей белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Тепловое поведение апо-парвальбумина.

Измерение сродства парвальбуминов щуки к металлам и получение апоформы белков.

Отсутствие тепловых переходов первого рода в апо-форме парвальбумина щуки.

Сложное тепловое поведение апо-парвальбуминов.

Структурная характеризация апо-парвальбуминов.

Предсказания неупорядоченных областей в парвальбуминах щуки.

Энергетические оценки заряд-зарядовых взаимодействий в парвальбуминах щуки.

Тепловое поведение металл-насыщенного парвальбумина.

Тепловое разворачивание кальций-насыщенных парвальбуминов.

Структурные особенности интермедиата тепловой денатурации Са2+насыщенного а-ПА щуки.

Изменение кооперативности тепловых переходов а-парвальбумина щуки, вызываемое гуанидингидрохлоридом.

Тепловая денатурация магний- и натрий-связанных форм а-парвальбумина щуки.

Структурные детерминанты интермедиата тепловой денатурации Са2+насыщенного а-ПА щуки.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Бакунц, Ануш Гамлетовна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что механизм теплового разворачивания парвальбуминов определяется связыванием катионов металлов. У апо-белков полностью отсутствуют видимые переходы первого рода, в то время как Mg2+- и Na+-насыщенные формы обнаруживают одиночный переход типа «все-или-ничего», а Са2+-насыщенная форма демонстрирует сложный механизм денатурации с участием, по меньшей мере, одного интермедиата. Показано, что Са2+-связанная форма а-ПА щуки претерпевает два последовательных перехода типа «все-или-ничего».

2. Показано, что апо-парвальбумины щуки относятся к семейству белков с внутренней неупорядоченностью, а апо-а-ПА щуки обладает структурными свойствами, характерными для состояния расплавленной глобулы.

3. Показано, что интермедиат, возникающий в ходе тепловой денатурации

2+

Са -связанной формы а-ПА щуки, стабилизируется связанными катионами Са2+.

4. Анализ структурных особенностей ПА показывает, что наличие двух термодинамических доменов в а-ПА щуки является следствием ослабления междоменных взаимодействий за счет изолированных полостей, расположенных между субдоменами EF и CD белка.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность моим руководителям Евгению Анатольевичу и Сергею Евгеньевичу Пермяковым за неоценимую помощь в работе, доброжелательность, внимание и терпение.

Большое спасибо Владимиру Николаевичу Уверскому за интересные научные беседы, ценные советы и помощь в оценках внутренней неупорядоченности белков. Александра Ильича Денесюка хочу поблагодарить за помощь в расчетах электростатических взаимодействий в белке и анализе полостей белка. Я очень признательна Майклу Хенцлу из Университета штата Миссури за предоставление плазмид парвальбуминов крыс.

Хочется поблагодарить Геннадия Павловича Серегина за починку некстати ломающихся приборов и, особенно, за разработку и техническое воплощение многих очень полезных устройств и приспособлений.

Я также глубоко признательна Екатерине Князевой и Марии Пермяковой за помощь в выделении белков и дружеское отношение, Антону Карнупу и Татьяне Хохловой за помощь в работе и поддержку, а также всему коллективу лаборатории Новых методов в биологии за внимание и участие.

И, конечно, хочу поблагодарить мою маму за то, что она самая лучшая.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные в настоящей работе, показывают, что при изучении апо-форм металл-связывающих белков, обладающих предельно высоким сродством к ионам металлов, необходима тщательная оптимизация экспериментальных условий, обеспечивающая удаление от белка всех катионов, включая моновалентные.

В1 своей работе мы обнаружили, что отсутствие жесткой третичной структуры у апо-ПА обусловлено комбинацией особенностей аминокислотного состава белка, а также дестабилизирующим вкладом заряд-зарядовых взаимодействий карбоксилатов, участвующих в- координации кальция: При связывании» карбоксилатов с катионами кальция заряд-зарядовые взаимодействия становятся стабилизирующими (абсолютные величины энергий практически не- изменяются), что, по-видимому, в значительной степени обуславливает высокую термостабильность металл-загруженной формы белка.

Вызывает интерес возможная физиологическая'роль обнаруженной нами внутренней неупорядоченности апо-парвальбуминов. На первый взгляд, достаточно, высокие концентрации катионов металлов в цитозоле и высокие константы их связывания белком приведут к эффективной загрузке парвальбумина катионами металлов in vivo. Однако, некоторые ткани и клетки позвоночных, содержащие ПА, содержат также высокие концентрации мочевины (Yancey, 1994), что может снижать сродство белка к металлам, в предельном случае вызывая переход белка в апо-форму. Любопытно также то, что недавно ПА был обнаружен в нефронах мыши и человека (Beige et al., 2007), а именно в нефронах происходит концентрирование мочевины.

Обнаруженный в нашей работе непрерывный внутримолекулярный фазовый переход апо-ПА регистрируется в других бежах крайне редко и, по-видимому, является следствием значительной- сохранности вторичной структуры белка. Наблюдаемые в. белках непрерывные фазовые переходы отличаются от аналогичных фазовых переходов, рассматриваемых в классической физике. По этой причине необходимо создание формализованного описания таких переходов в белках.

Удивительной чертой а-ПА щуки является то, что его можно рассматривать как белок с внутренней неупорядоченностью (в апо-форме), как мезофильный белок (в №+-связанной форме), как термофильный (в Mg2+-загруженной форме) и даже как гипертермофильный (в Са2+-насыщенной форме) белок. Эта уникальная способность белка изменять термостабильность в таких широких пределах в ответ на достаточно небольшие изменения заряда и размера лиганда требует проведения дальнейших более детальных структурных исследований- каждой из форм белка, а также энергетики переходов между ними.

Не менее интересной особенностью а-ПА щуки, не обнаруженной ранее ни для одного металл-связывающего белка, является его способность изменять механизм тепловой денатурации в зависимости от вида связанного катиона металла. В то время, как тепловой переход Na и Mg форм, соответствует простому переходу между двумя, состояниями, Са2+-насыщенная форма демонстрирует два последовательных перехода типа «все-или-ничего», что свидетельствует о- наличии двух термодинамических доменов. Остальные исследованные парвальбумины также демонстрируют сложный механизм

9 -4тепловой денатурации в Са -насыщенной форме, однако сильное перекрытие отдельных тепловых переходов не позволяет судить о механизме денатурации. Возможно, что эти парвальбумины также обладают двумя термодинамическими доменами, обладающими, в отличие от доменов а-ПА щуки, сходной термостабильностью.

Термодинамический домен может состоять всего лишь из 20 аминокислотных остатков, как показывают исследования белка Trp-cage (Streicher and Makhatadze, 2007). Наши результаты,свидетельствуют о том,.что дополнительный термодинамический домен может возникать не только вследствие больших размеров белка, но и благодаря стабилизации промежуточного состояния, вызываемой связыванием лиганда. В этом смысле, появление дополнительного термодинамического домена ПА обусловлено не столько самой полипептидной цепью, сколько взаимодействием с лигандом.

Интересно, что наличие и приблизительное расположение термодинамических доменов- в структуре ПА можно предсказать на основе недавних наблюдений (Garbuzynskiy and Kondratova, 2008), свидетельствующих о существенном перекрытии расположения- ядер сворачивания и так называемых «корневых структурных мотивов», обладающих уникальной укладкой и хиральностью (Efimov, 1994). Каждый из кальций-связывающих доменов; ПА (как и тобой- кальций-связывающий центр типа «EF-рука») представляет собой корневой структурный-мотив типа «а-а уголок», который формируется- двумя- последовательными а-спиралями, расположенными крестообразно и образующими, левую суперспираль. Таким образом, субдомены EF и CD должны соответствовать двум различным ядрам сворачивания. Хотя наличие двух ядер сворачивания не обязательно означает, что белок- будет обладать двумя термодинамическими доменами, вероятно, что такая ситуация- возможна в условиях ослабления- взаимодействий между двумя субдоменами.

Известно, что ПА, являясь растворимым фактором- релаксации, ускоряющим фазу мышечного расслабления, переключается между Mg2+-связанным (клетка находится в состоянии покоя) и Са -связанным состояниями. Как мы показали, эти состояния ПА отличаются структурной кооперативностью, что проявляется в возникновении дополнительного термодинамического домена в Са2+-форме. Тем не менее; не ясно, проявляется ли наблюдаемое in vitro металл-зависимое переключение структурной кооперативности белка в клеточных условиях. Такая особенность парвальбумина может благоприятствовать ассоциации с неизвестной мишенью (или мишенями). Недавние экспериментальные работы (см. обзор (Schwaller, 2009)) указывают на то, что, по крайней мере, некоторые из представителей парвальбуминового семейства могут участвовать в опознавании мишени и, таким образом, не являются «чистыми» буферами катионов металлов.

Обнаруженный в данной работе дополнительный высокотемпературный

0 Аti/2~120°C) переход Са -насыщенного а-парвальбумина щуки может объяснить высокую аллергенность представителей парвальбуминового семейства. Общепринятая в домашних условиях термообработка (100°С) не уменьшает аллергенность ПА - такой нагрев недостаточен для необратимого разрушения нативной структуры белка, поскольку первый тепловой переход в Са2+-насыщенном белке полностью обратим. В'то же время, консервирование рыбы с применением высокотемпературной обработки (свыше 120°С) снижает ее аллергенность, что можно объяснить необратимостью высокотемпературного теплового перехода в белке. Крайне высокая термостабильность Са2+-загруженной- формы ранее наблюдалась для другого представителя семейства EF-руки, аллергена тимофеевки луговой, белка Phi р 7, температура середины перехода которого превышает 120°С (Henzl et al., 2008).

Представляет интерес дальнейшее исследование структурных особенностей молекулы ПА, обуславливающих, формирование двух термодинамических доменов. Одним из наиболее прямых методов экспериментальной проверки сделанного в работе вывода о дестабилизации границы раздела между субдоменами EF и CD а-ПА щуки может служить исследование мутантных форм ПА с аминокислотными заменами, приводящими к изменению размеров обнаруженных изолированных полостей белка.

Совокупность полученных в работе данных показывает, что металл-связывающие белки обладают рядом структурных особенностей, которые могут обуславливать необычное тепловое поведение белка. В целом, работа способствует пониманию структурных факторов, влияющих на тепловое поведение металл-связывающих белков, что может быть востребовано при решении многих прикладных задач: создания лекарственных средств белковой природы, различных биотехнологических применений, и пр.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бакунц, Ануш Гамлетовна, 2009 год

1. Acharya, K.R., Stuart, D.I., Walker, N.P., Lewis, M., Phillips, D.C., 1989. Refined structure of baboon alpha-lactalbumin at 1.7 A resolution. Comparison with C-type lysozyme. J.Mol.Biol. 208, 99-127.

2. Agah, S., Larson, J.D., Henzl, M.T., 2003. Impact of proline residues on parvalbumin stability. Biochemistry. 42, 10886-95.

3. Ahmed, F.R., Przybylska, M., Rose, D.R., Birnbaum, G.I., Pippy, M.E., MacManus, J.P., 1990. Structure of oncomodulin refined at 1.85 A resolution. An example of extensive molecular aggregation via Ca2+. J Mol Biol. 216, 12740.

4. Ahmed, F.R., Rose, D.R., Evans, S.V., Pippy, M.E., To, R., 1993. Refinement of recombinant oncomodulin at 1.30 A resolution. J Mol Biol. 230, 1216-24.

5. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J., 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25,3389-402.

6. Annoh, H., Inokuchi, Т., Ohta, K., Wakimoto, M., Ueda, Т., 1995. Immunohistochemical investigations of parvalbumin localization in the skeletal muscle fibers of rats. Okajimas Folia Anat Jpn. 72,221-6.

7. Aune, K.C., Tanford, C., 1969. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme by guanidine hydrochloride. II. Dependence on denaturant concentration at 25 degrees. Biochemistry. 8,4586-90.

8. Baum, J., Dobson, G.M., Evans, P.A., Hanley, C., 1989. Characterization of a partly folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig alpha-lactalbumin. Biochemistry. 28, 7-13.

9. Berchtold, M.W., Means, A.R., 1985. The Ca2+-binding protein parvalbumin: molecular cloning and developmental regulation of mRNA abundance. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 1414-8.

10. Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., Bourne, P.E., 2000. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28, 235-242.

11. Blum, H.E., Lehky, P., Kohler, L., Stein, E.A., Fischer, E.H., 1977. Comparative properties of vertebrate parvalbumins. J.Biol.Chem. 252, 28342838.

12. Bottoms, C.A., Schuermann, J.P., Agah, S., Henzl, M.T., Tanner, J.J., 2004. Crystal structure of rat alpha-parvalbumin at 1.05 Angstrom resolution. Protein Sci. 13, 1724-34.

13. Breen, P.J., Hild, E.K., Horrocks, W.D., Jr., 1985a. Spectroscopic studies of metal ion binding to a tryptophan-containing parvalbumin. Biochemistry. 24, 4991-7.

14. Breen, P.J., Johnson, К.A., Horrocks, W.D., Jr., 1985b. Stopped-flow kinetic studies of metal ion dissociation or exchange in a tryptophan-containing parvalbumin. Biochemistry. 24, 4997-5004.

15. Brew, K., Vanaman, T.C., Hill, R.L., 1967. Comparison of the amino acid sequence of bovine alpha-lactalbumin and hens egg white lysozyme. J.Biol.Chem. 242, 3747-3749.

16. Burstein, E.A., 1971. Mol.Biol.(Mosk). 5, 214-225.

17. Burstein, E.A., 1977. Intrinsic protein fluorescence: Origin and applications, Vol. 7, VTNITI, Moscow.

18. Bussell, R., Jr., Eliezer, D., 2001. Residual structure and dynamics in Parkinson's disease-associated mutants of alpha-synuclein. J Biol Chem. 276, 45996-6003.

19. Bychkova, V.E., Ptitsyn, O.B., 1993. The state of unfolded globules of protein molecules is more quickly becoming a rule, rather than an exception., Biofizika. 38, 58-66.

20. Cates, M.S., Teodoro, M.L., Phillips, G.N., Jr., 2002. Molecular mechanisms of calcium and magnesium binding to parvalbumin. Biophys J. 82, 1133-46.

21. Cave, A., Pages, M., Morin, P., Dobson, C.M., 1979. Conformational studies on muscular parvalbumins cooperative binding, of calcium (II) to parvalbumins. Biochimie. 61, 607-13.

22. Celio, M.R., 1986. Parvalbumin in most gamma-aminobutyric acid-containing neurons of the rat cerebral cortex. Science. 231, 995-7.

23. Chaffotte, A.F., Guijarro, J.I., Guillou, Y., Delepierre, M*., Goldberg;. M.E., 1997. The "pre-molten globule," a new intermediate in protein folding. J Protein Chem. 16,433-9.

24. Chandra, N., Brew, K., Acharya, K.R., 1998. Structural evidence for the presence of a secondary calcium binding site in human alpha-lactalbumin. Biochemistry. 37,4767-4772.

25. Closset, J., Gerday, C., 1975. Conformational studies on parvalbumins by circular dichroism. Biochim Biophys Acta. 405,228-35.