Влияние структурной организации коллагенового материала, используемого для регенерации соединительной ткани, на М1/М2-поляризацию макрофагов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат наук Калмыкова Нина Владимировна

• Калмыкова Нина Владимировна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Калмыкова Нина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Внеклеточный матрикс: структура, свойства и функции

1.2. Децеллюляризированный ВКМ

1.3. Применение очищенного ВКМ в медицине

1.4. Регенерация, репарация, процесс заживления ран

1.4.1. Регенерация и репарация

1.4.2. Заживление ран

1.5. Ответ организма хозяина на введение очищенного ВКМ

1.6. Роль Мф в заживлении ран

1.6.1. Роль Мф в процессе заживления ран

1.6.2. М1 и М2 Мф

Роль Мф М1 в заживлении ран

1.6.4. Роль Мф M2 в заживлении ран

1.7. Конструктивное ремоделирование

1.8. / ^2 ответ на биоматериалы при имплантации

1.9. Роль Мф M1 и Ш в РИТ

1.10. Поляризация Мф, зависящая от структурных свойств биоматериала

Топография поверхности биоматериалов

Пористость биоматериалов

1.11. Использование сигналов микроокружения для контролируемой поляризации Мф

1.12. Заключение обзора литературы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Очистка ВКМ и получение из него мембраны, порошка, суспензии и

гидрогеля

2.1.1. Очистка ВКМ

2.1.2. Изготовление порошка ВКМ

2.1.3. Изготовление суспензии волокон ВКМ

2.1.4. Изготовление гидрогеля

2.2. Исследование структуры и свойств ВКМ в форме мембраны, порошка, суспензии, гидрогеля

2.2.1. Гистологическое исследование ВКМ

2.2.2. Сканирующая электронная микроскопия

2.2.3. Атомно-силовая микроскопия

2.2.4. Электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли

2.2.5. Количественное определение дцДНК в образцах очищенного

ВКМ

2.2.6. Определение термомеханических свойств

2.3. Характеристика тканевой реакции при имплантации ВКМ

2.3.1. Подкожная имплантация порошка, суспензии, гидрогеля

2.3.2. Подкожная имплантация ВКМ в форме мембраны

2.3.3. Макроскопический анализ биодеградации

2.3.4. Гистологическое исследование образцов тканей

2.3.5. Характеристика тканевой реакции

2.4. Модель полнослойной кожной раны

2.4.1. Группа: суспензия, гидрогель

2.4.2. Группа: мембрана, порошок, гидрогель

2.5. Анализ маркеров Мф и ТИ-лимфоцитов

2.5.1. Иммуногистохимическое исследование

2,5.2. Анализ поляризации Мф по профилям М1 и М2

2.6. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Общая схема работы

3.2. Очистка ВКМ и изготовление форм, соответствующих разным уровням организации

3.2.1. Очистка ВКМ

Получение форм, соответствующих разным уровням структурной организации ВКМ

3.3. Тканевая реакция на имплантацию исследуемых форм ВКМ

3.3.1. Имплантация ВКМ в форме порошка, суспензии и гидрогеля

3.3.2. Имплантация ВКМ в форме мембраны

3.4. Оценка влияния разных форм ВКМ на процесс заживления раны

3.4.1. Исследование форм: суспензия, порошок

3.4.2. Исследование форм: мембрана, порошок, гидрогель

3.5. Анализ маркеров Мф и ТИ-лимфоцитов

3.5.1. Исследование форм ВКМ: порошок, суспензия, гидрогель

3.5.2. Исследование форм ВКМ: суспензия, контроль

3.5.3. Исследование форм ВКМ: гидрогель, контроль

3.5.4. Исследование форм ВКМ: мембрана, контроль

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Данные анализа тканевой реакции

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

DAMP- фрагменты, ассоциированные с повреждениями (damage associated molecular pattern АГ -антиген АТ - антитело

ВКМ- внеклеточный матрикс

ГКИТ- гигантские клетки инородных тел

дВКМ - децеллюляризированный внеклеточный матрикс

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дцДНК - двухцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота

ИГХ- иммуногистохимия

КРС- крупный рогатый скот

ЛПС - липополисахарид

Мф- макрофаг

ПААГ -полиакриламид

п.о. - пары оснований

ПОСК - подслизистая основа стенки кишечника

ПЯЛ - полиморфно-ядерные лейкоциты

РИТ - реакция на инородное тело

РНК - рибонуклеиновая кислота

ФНО - фактор некроза опухоли

IFNy - интерферон гамма

IL - интерлейкин

MMP-9- металлопротеиназа

PDGF - фактор роста тромбоцитов (англ. Platelet-derived growth factor) PCL - поликапролактон PTFE - политетрафторэтилен

TGF-ß- трансформирующий ростовой фактор бета (англ. transforming growth factor beta)

Th-Т-хелперные клетки

TLR - толл-подобные рецепторы (англ. toll-like receptor, TLR) TNF- фактор некроза опухоли (ФНО, англ. tumor necrosis factor, TNF) UBS - подслизистая мочевого пузыря

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов (англ. vascular endothelial growth factor)

WT - мыши дикого типа

ВВЕДЕНИЕ

Макрофаги (Мф) представляют собой гетерогенную популяцию клеток иммунной системы, выполняющую разнообразные функции и присутствующую в большинстве тканей организма. Данные клетки играют центральную роль в регуляции многих биологических процессов, включающих, поддержание тканевого гомеостаза, защиту от вторгающихся патогенов, а также гистогенез и репаративную регенерацию тканей. В физиологических условиях резидентные Мф принимают участие в обеспечении гомеостаза путем выделения факторов, стимулирующих процессы физиологической регенерации, а также фагоцитируя апоптотические тельца погибших клеток. Однако при воздействии различных стимулов микроокружения как тканевые Мф, так и мигрирующие из кровотока моноциты, могут активироваться и поляризоваться в разные функциональные фенотипы [Ariganello, 2011]. В настоящее время общепризнано, что все фенотипическое разнообразие Мф можно рассматривать как непрерывное множество [Mosser, 2008], состоящее из нескольких различных функциональных состояний, каждый из которых имеет свой уникальный профиль транскрипции генов [Gautier, 2012]. В наиболее упрощенной форме выделяют два основных типа активации Мф: классический (М1) и альтернативный (М2). Мф M1 выделяют оксид азота и активные формы кислорода (ROS), которые являются цитотоксическими медиаторами, помогающими бороться с инфекцией, а также различные провоспалительные цитокины. Фенотип M2 подразделен на подкатегории M2a, M2b и M2c, основываясь на их специфических функциях. Все три подтипа обладают противовоспалительными свойствами, участвуют в опосредовании Th-2 ответа и в ремоделировании внеклеточного матрикса (ВКМ) [Mantovani, 2004]. Кроме того, Мф M2a и M2c также секретируют факторы роста, которые способствуют ангиогенезу и регенерации тканей [Jetten, 2014].

Мф обоих фенотипов играют важную роль в процессе репарации. Переход от воспалительного типа ответа (M1 / Th1) к противовоспалительному (M2 / Th2) проходит постепенно от ранних стадий воспалительной фазы до поздних стадий

пролиферативной. Пик активности М1 Мф приходится на 1-2 сутки репаративного процесса, а М2 на 4-6. Таким образом, переход от иммунной реакции 1 типа ко 2 типу отражает переход на следующую стадию процесса репарации. Было показано, что персистирование М1 Мф в области повреждения сопровождается развитием длительно-незаживающих ран [Novak, 2014]. M2 Мф являются доминирующим фенотипом на стадиях пролиферации и ремоделирования, однако могут быть причиной развития реакции на инородное тело, проявляющейся в формировании капсулы. Таким образом, при течение патологических процессов и восстановлении тканей после повреждения важное значение имеет соотношение М1/И2 субпопуляций и изменение его во времени.

Пластичность Мф проявляется в их способности изменять фенотипическое состояние в ответ на постоянно меняющееся микроокружение. Определенный характер фенотипической поляризации Мф часто сопровождает различные физиологические и патологические состояния [Lumeng, 2008]. Известно, что Мф играют важную роль в развитии патофизиологических состояний, включающих рак, сердечно-сосудистые заболевания, ожирение, заживление ран и реакцию на инородное тело. Например, при развитии новообразований Мф M1 обладают противоопухолевыми функциями, тогда как Мф M2 помогают опухолевым клеткам в уклонении от разрушения иммунными клетками хозяина и способствуют ангиогенезу, инвазии и метастазированию. Большинство опухолеассоциированных Мф принимают М2-подобный фенотип, и их присутствие в опухолях напрямую коррелирует с плохим прогнозом хода заболевания [Lewis, 2006]. Напротив, при атеросклерозе Мф M1 обычно рассматриваются как атерогенные, в то время как Мф M2 рассматриваются как атеропротекторные.

Чтобы реализовать потенциал макрофагов в качестве терапевтической цели для лечения различных патологий, требуется более глубокое понимание воздействия факторов микроокружения на фенотипическую поляризацию данных клеток. Одним из важнейших факторов является контакт клеток с компонентами окружающего их внеклеточного матрикса (ВКМ). Основным компонентом ВКМ соединительных тканей является коллаген I типа. Он составляет около 30% всех

белков организма. Принцип организации коллагена иерархический: три альфа цепи образуют молекулу белка, которые организуются в фибриллу, фибриллы формируют волокно, которые могут образовывать пучки разных порядков. Пучки образуют трехмерную сеть переплетающихся волокон, являясь каркасом ткани. Так, макрофаги, как и другие клетки, постоянно контактируют с ВКМ, получая при этом множество сигналов как химической, так и физической природы. Данные взаимодействия, по-видимому, играют ключевую роль в реализации репаративного действия различных медицинских изделий и препаратов, изготавливаемых на основе очищенного от клеточных компонентов ВКМ различных тканей. Однако вклад структурных особенностей биоматериалов в их терапевтическую эффективность, опосредованную активацией, пролиферацией, миграцией и дифференцировкой различных клеток остается до конца не охарактеризованным. Так был сформулирован фундаментальный вопрос: как структурная организация ВКМ влияет на профиль М1/М2-поляризации Мф. Проведено сравнительное исследование поляризации макрофагальных субпопуляций при подкожной имплантации различных инъекционных форм очищенного ВКМ у мелких лабораторных животных. В данной работе материалы на основе ВКМ были применены в следующих формах: порошка, суспензии, а также гидрогеля. Данные формы различаются степенью сохранности характера укладки волокон коллагена в их составе. Так, ВКМ в форме порошка представлен частицами измельченных пучков волокон коллагена. ВКМ в форме суспензии состоит из механически диспергированных до фибриллярного уровня коллагеновых волокон. В свою очередь гидрогель представляет собой термически солюбилизированный матрикс.

Цели и задачи

Цель работы: установить влияние структурной организации коллагенового материала, используемого для регенерации соединительной ткани, на М1 /М2-поляризацию макрофагов, и определить взаимосвязь профиля с процессом заживления ран.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1)Подобрать методику получения очищенного коллагенового материала.

2)Подобрать способ получения форм, соответствующих разным уровням организации коллагена I типа: тканевой, пучкам волокон, волокнам и пептидам.

3)Исследовать тканевую реакцию при подкожной имплантации разных уровней организации коллагена I типа

4)Проанализировать профиль поляризации макрофагов в зоне имплантации путем полуколичественного анализа панмакрофагальных, М1 и М2 маркеров, а также цитокинов ТЫ и ТМ иммунного ответа.

5)Провести исследование влияния разных уровней организации коллагена I типа на процесс заживления полнослойных кожных ран.

Научная новизна и практическая значимость работы

Научная новизна работы обусловлена, во-первых, проведением оценки профиля поляризации Мф на модели исследования, основанной на сравнении разных уровней организации фибриллярного компонента ВКМ, а именно коллагена I типа. Благодаря этому удалось установить, что уровень организации коллагена I типа, определяет поляризацию Мф в М1 и М2 фенотип: тканевая организация стимулирует смешанный тип ответа с равным соотношением М1 и М2 Мф, а пучки волокон, волокна и пептиды стимулируют ответ со значительным преобладанием М2 Мф. Также удалось выявить, что волокна подавляют выработку

иммунокомпетентными клетками в области раневого дефекта, а пучки волокон, наоборот, стимулируют выработку Ш^, а также ^-6, при этом выявлено, что увеличение уровня экспрессии в области репарации ассоциировано с ингибированием роста грануляционной ткани. Во-вторых, в рамках работы впервые разработана новая форма очищенного фибриллярного компонента ВКМ, а именно суспензия волокон.

Практическая значимость исследования заключается в том, что показана возможность использования биоматериалов, представляющих собой разные уровни организации внеклеточного матрикса, в различных клинических случаях для замещения тканевого дефекта (подтверждено актом о внедрении ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и

репродуктологии им. Д.О. Отта»). Также была разработана суспензионная форма волокнистого компонента ВКМ. Показано ее положительное влияние на процесс заживления ран, посредствам стимуляции образования грануляционной ткани. Было показано, что данная форма сдвигает профиль поляризации Мф в преобладание М2 фенотипа на всех этапах репаративного процесса. По результатам разработки оформлен патент РФ №2627844. 2017. Бюл. № 23 (подтверждено актом о внедрении ООО «БиоФАРМАХОЛДИНГ»).

Методы исследования

В ходе выполнения диссертационной работы использован комплекс физико-химических, микроскопических, гистологических, молекулярно-биологических, иммунохимических методов исследования. Очистка ВКМ была произведена общелабораторными методами. Для оценки свойств полученного ВКМ были проведены исследования, с применением термомеханических методов. Структурные исследования были проведены с применением методов световой, сканирующей и атомно-силовой микроскопии. Уровень регенерации оценивался на нескольких уровнях. Оценку на органном уровне осуществляли с применение макроскопических методик, таких как оценка площади ран на макро и микрофотоснимках, оценка резорбции материалов. На тканевом уровне оценку регенерации проводили методом прямого подсчета клеточных популяций с применением методов микроскопии. Оценка профиля поляризации Мф и Т^ лимфоцитов оценивалась на клеточном уровне с применением иммуногистохимического анализа.

Личный вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в проведении исследований, в анализе, трактовке и обсуждении полученных данных, написании и оформлении работы. Все исследуемые образцы фибриллярного компонента внеклеточного матрикса были изготовлены автором. Все иммунологические и морфологические исследования были проведены автором самостоятельно. Обработка дермы кожи быка домашнего для получения очищенного внеклеточного матрикса проведена совместно с сотрудниками лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета

ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи». Микроскопические исследования внеклеточного матрикса проводили совместно с сотрудниками лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета и сотрудниками лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» под руководством д.м.н. Л.В. Диденко.

Положения, выносимые на защиту

1. Выявлено, что уровень структурной организации коллагена I типа, определяет поляризацию макрофагов в М1 и М2 фенотип: тканевая организация стимулирует смешанный тип ответа с равным соотношением М1 и М2 макрофагов, а пучки волокон, волокна и пептиды стимулируют ответ со значительным преобладанием М2 макрофагов.

2. Показано, что волокна подавляют выработку иммунокомпетентными клетками в области раневого дефекта, а пучки волокон, наоборот, стимулируют выработку Ш^, а также ГЬ-6, при этом выявлено, что увеличение уровня экспрессии в области репарации ассоциировано с ингибированием роста грануляционной ткани

3. Показано, что при оценке количества активированных макрофагов предпочтительнее использовать в качестве пан-маркера CD68, а не F4/80.

4. Впервые разработана новая форма очищенного фибриллярного компонента внеклеточного матрикса, а именно суспензия волокон.

5. Разработана модель исследования влияния уровня организации фибриллярного компонента внеклеточного матрикса, а именно коллагена I типа, на миграцию, активацию и поляризацию клеток миелоидного ряда-провоспалительных (М1) и противовоспалительных макрофагов (М2).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние структурной организации коллагенового материала, используемого для регенерации соединительной ткани, на М1/М2-поляризацию макрофагов»

Апробация работы

Результаты проведенных исследований были представлены в виде стендовых докладов и тезисов на российских и международных конференциях: на XVI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». (Санкт-Петербург - 2017); I

Калининградском научном форуме (Калининград - 2016); III Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва -2017).

Апробация диссертации состоялась 19.12.2017 г. на совместной научной конференции Отдела иммунологии и Отдела интерферонов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Протокол № 2).

Публикации

Результаты диссертации опубликованы в 6 печатных работах, из них: статьи в журналах, рекомендованных ВАК - 2; патент Российской Федерации на изобретение - 1; доклады и тезисы на международных и всероссийских конференциях - 3.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: список используемых сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 158 страницах, содержит 47 рисунков и 21 таблицу.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Внеклеточный матрикс: структура, свойства и функции

Внеклеточный матрикс - это набор молекул, секретируемых клетками, выполняющий механическую, сигнальную и транспортную функции. ВКМ обладает рядом свойств, которые потенциально могут оказывать влияние на клетки. Например, такие механические свойства как упругость и эластичность, которые могут сильно отличаться в зависимости от ткани. Зависит это от соотношения коллагена и эластина в их составе [Alberts, 2002]. Клетки могут взаимодействовать с окружающей их средой, путем применения силы и оценки степени ответного воздействия [Plotnikov, 2012]. Такая способность помогает клеткам регулировать много важных клеточных процессов, таких как пролиферация, дифференцировка, миграция и смерть [Hadjipanayi, 2009].

Основными компонентами ВКМ соединительных тканей являются белки, протеогликаны, гликопротеины и полисахариды (Рисунок 1, а). Коллаген относится к фибриллярным белкам и является преобладающим в количественном отношении, составляя около 30% от всей массы белков организма. Именно коллаген отвечает за каркасную функцию ВКМ и обеспечивает механическую поддержку клеток. Благодаря своим физико-химическим свойствам, способности к биодеградации и слабой антигенности данный белок широко применяется в области регенеративной медицины [Chattopadhyay, 2014]. Коллаген I типа преобладает в составе ВКМ: Молекула коллагена I типа построена из трех пептидных цепей, двух альфа 1(1) цепей и одной альфа 2(1) цепи. Каждая цепь содержит домен из 338 повторов, образованных из аминокислотных триплетов Gly-X-Y, где Х и Y могут быть любой аминокислотой, но в большинстве случаев X представлен пролином, а Y - гидроксипролином. В молекуле коллагена все три спирали переплетены друг с другом, формируя микрофибриллы (мономеры тропоколлагена), которые в свою очередь, формируют более толстые фибриллы, а из них образуются волокна и пучки волокон (Рисунок 1, б). Другой структурный

белок - эластин, отвечающий, соответственно, за эластичность тканей. Среди гликопротеинов стоит выделить фибронектин, который обеспечивает контакт клеток с фибриллами коллагена через интегрины, что необходимо для их передвижения по матриксу. Стоит также отметить, что фибронектины играют чрезвычайно важную роль в процессах заживления поврежденных тканей, а именно связывают тромбоциты при образовании кровяного сгустка и способствуют передвижению клеток в сайт повреждения [Р1оррег, 2007].

Рисунок 1 .Компоненты ВКМ. а) Внеклеточный матрикс соединительной ткани [МеБсИег , 2013]; б) Схематическое изображение структуры иерархической

укладки коллагена [ВиеЫег, 2006].

1.2. Децеллюляризированный ВКМ

Децеллюляризация - это процесс очистки ВКМ различных тканей или целых органов от клеток, как основных источников антигенов. Основной проблемой при имплантации или трансплантации является отторжение, вызванное ответом организма-хозяина на антигены, избавление от которых позволяет применять децеллюляризированные ВКМ (дВКМ), или очищенный ВКМ, в различных областях медицины начиная от общей хирургии и до косметологии. Бесклеточные матриксы получают из различных тканей и органов, таких как дерма кожи, кость,

перикард, мочевой пузырь, сосуды, для каждого из которых предпочтительна своя область медицины. Например, дВКМ на основе дермы применяются при лечении ран различной этиологии, ожогов и косметологических операциях. Во многих исследования показана способность децеллюляризированного матрикса, полученного по различным технологиям из различных источников, способствовать хемотаксису, миграции и дифференцировки клеток, а также ремоделированию собственных тканей организма [Crapo, 2011]. Таким образом, дВКМ- это тип биоматериалов, полученных путем удаления клеток из тканей человеческого или животного происхождения, состоящие из ВКМ.

Все материалы на основе дВКМ получены из разных тканей млекопитающих, например, таких как дерма, перикард, мочевой пузырь, подслизистая основа стенки кишечника (ПОСК), но по своему составу они схожи. Все они состоят из волокон коллагена, гликозаминогликанов (ГАГ) и ряда неколлагеновых белков [Cornwell, 2009]. При этом их физические и механические свойства отличаются. дВКМ сохраняют некоторые свойства своей первоначальной ткани даже после проведенной очистки (структура сети волокон, рыхлость, содержание эластина, содержание ГАГ). Однако, эти проявление этих свойств можно регулировать, таким образом определяя область применения материала. Также широко распространен метод дополнительного сшивания коллагена глутаральдегидом и карбодиимидом в составе дВКМ, чтобы увеличить срок его биодеградации после имплантации [Jorge-Herrero, 1999].

Существует много методов децеллюляризации ВКМ, но все их можно разделить на группы по типу очистки: химические и физические. К химическим методам относят обработку кислотами, щелочами, различными ферментами, например, трипсином и нуклеазами, детергентами, растворами солей. К физическим методам относят циклы замораживания-оттаивания и ультразвуковую обработку [Keane, 2015]. Выбор конкретного метода децеллюляризации, режима обработки реагентов определяется всегда индивидуально опытным путем с учетом особенностей используемого исходного сырья.

После проведения всех этапов очистки и модификации дВКМ подвергают финальной стерилизации методом радиационной стерилизации (гамма излучение), потоком быстрых электронов или обработкой этиленоксидом. На выходе получают дВКМ в форме мембраны - это классическая форма, применяемая в медицине. Из нее путем измельчения может быть получен порошок, который также широко применяется в медицинских целях. Если мембрана обладает прочностью, то порошок наоборот более пластичен, отсюда и различные области применения. Мембрану, в основном, фиксируют швами, создавая механически прочную конструкцию. Порошком же заполняют дефекты, например, в стоматологии после удаления третьих моляров. Из порошка можно получить дВКМ в форме гидрогеля, путем обработки коллагеназой. Помимо медицинского применения (инъекционного, заполнения дефектов и последующая фиксация) гидрогели широко применяются в лабораторной практике в качестве матрикса для выращивания клеток [Barker, 2011]. Показано, что на гидрогелевых формах дВКМ увеличивается степень пролиферации клеток и их жизнеспособность, в сравнении с клетками, выращенными на таких субстратах, как Matrigel™ (Extracellular Matrigel matrix, BD, США) или на коллагене I типа [Sawkins, 2013; Wolf, 2012].

Методика получения очищенного ВКМ как правило включает стадии децеллюляризации и/или химическое сшивание для маскирования или разрушения антигенных эпитопов, удаления ДНК и молекулярных фрагментов, ассоциированных с повреждениями (damage associated molecular pattern (DAMP) [Badylak, 2008]. ДНК является показателем эффективности децеллюляризации и считается самым важным показателем чистоты дВКМ. После очистки от клеточных компонентов при получении дВКМ, в составе готового продукта могут содержаться остатки двухцепочечной ДНК ксеногенного/ аллогенного происхождения. Они могут быть причиной развития воспалительной реакции при имплантации данного изделия [Gilbert, 2009].

Таблица 1.

Обзор доступных для клинической практики дВКМ [Cornwell, 2009].

Тгзи^ Мазг» ^ ' I" mr* С Teirjiii^l :•:■ :•:-:•: о» х- :■:-:■: ;>.v ■:•: ::;x ТПЗскпгки^ ■■■ ■■ ■:■ ■:■ ■■ ■■■ :■ ■:■ ■:■ ■■■ ■:■ ■:■ ■: :■ ........... ;:■-■:; -x S3 :■:-:■: -x« :;:■ :■: -!i ^anufecturer

F4ial StfAW HCHC Hr* Temparaiurt Elh^vH arida t if" iwi&Ki re^vforejemeiit SlfyHW OrfiwnMiiw

¿ищайдо Hemibnepsli Pfcutfc ft nmmhipllva 444 j

SyigMtod ¿Л ЗД4Д NoftlSlii SJCWIW ' 3. вг*лтл TH B^fliimcw

РПИАЗЙ!* (-"KBl 1 t FPfT^ Sir1 ЧП0 wwnd

Релтасс* 1 i 1 Aifolt ! Porcine 1 Denrt* 1 HMOl Omnia Irafi iiliu- 0.S - 1.5 mm P^ptf, a rowieiutihs EiiJSB^ йшИал Тй&ю Stsar#ie j ICevkiien}

Ztnfifni CeBaflWi Polish ■ 1.S mm Т»цйдп ГИТЪШНПЧШ JSmmer

OjlLuMfird EDC ElhttMt OtHls G.S ■ 1.2 null i-IWTli гчмЬ Р!авЬ& а пеалйШОча suiftety MugfWM)

СЙГЯЩ? EbSaV TM&KI nKifcui^nnwi* Tyiiiip ! ун fHci)

Hnmif nepjl'

Alumni ! i Mi* ч л - :S.3 ;mn

CirtJiofctf 0 i ■ J 5 mm Wrtslt МнЛс* _________________________!

f-fc:« AJiiP^r AJ&IU Hyms&i 1 i j 04 4 nm ily LIS lim, ::яг til ri* Inn* liwiisowilv tor ЬсглоЮохв 'jes ЕМдчШЛ Г Vuait*)s"4iKi)! ТцрчрйпГ i^ftjfdiritafi

MleMrf bnn Irwmlitin O.S-l.i fiitfiitfoois

iied-'j™

iinsinre 1 1 s™u A.h jft j IrTinciinfd Р"гГЙ|№ ! SUtflUJCjWB (8B) Ё-ЗЕВ171 IbriSuHen 0Л-1ЛМП iwiiori ranfsrainisii! UnPiiy

iuluiiis Sirr-Hiiji-I EJhytang CiiiJu (J.3 "iirai: RtwanclTIXlua i-.^S'iiV Hem!« ДО* Cwk

OKJM - 0.1 1Я1И 3lil ««J MOtilS ИнвЭги; MaaThpartL

CL-WlSltil ITI5C Gamma InjlFfltilT? - Тшгт = rttifoncamen! В1ЙЙ1К1/

QriMAipt -ijffjU j Fflutu j кх; as .. iiira Hiinia rapeii T«An miftlBKiwitaflt Pega^^a

ifniti 0.Э ■ O t mr. Sir fl»d W7jrrf hemng fliuipj^». saj si i 20CB1

VeniSi AAitt 1 Hem Ё-Эеапч этЬог 0.1-linvn He?na nepubf Mi.Wij iijt rdr/ji^mm j Synoirts :

Pi-ji-SSifE Sisp'elke rarvforaniBnt

Несмотря на применение даже самых жестких методов обработки, таких как сочетание химических и физических агентов одновременно, маловероятно полное удаление всех клеток и клеточных продуктов/остатков. Большинство имеющихся в продаже материалов на основе дВКМ содержат следовые количества остаточной ДНК [Derwin, 2006]. Остаточная ДНК обычно присутствует в виде небольших фрагментов менее чем 300 пар оснований в длину [Gilbert, 2009]. Несмотря на доказанное присутствие остатков дцДНК в коммерчески доступных матриксах, их клиническая эффективность в значительной степени положительная. Таким образом, возможно, что некое пороговое количество дцДНК требуется, чтобы вызвать отрицательную реакцию. Так содержание дцДНК в очищенном ВКМ в количестве менее 50 нг/мг сухой массы ранее было предложено в качестве критерия эффективной децеллюляризации [Crapo, 2011].

Влияние различных этапов обработки на иммунный ответ организма-хозяина к настоящему моменту не изучено. В недавнем исследовании, было проведено сравнение пяти различных дВКМ, все из которых были получены с помощью

разных методик обработки. При этом острая реакция характеризовалась интенсивной инфильтрацией мононуклеарных клеток. Долгосрочная реакция варьировалась от хронического воспаления, фиброза, образования рубца и инкапсуляции до формирования новообразованной ткани [Valentin, 2006]. Очевидно, что методы получения биологических матриксов играют важную роль в определении пути развития иммунного ответа. Описано множество способов децеллюляризации тканей путем разнообразных химических и физических воздействий [Badylak, 2011]. С одной стороны, применяемая для очистки ВКМ методика должна обеспечивать максимальную сохранность его трехмерной ультраструктуры, пространственной топологии и химического состава. Однако, поскольку преобладающим источником для изготовления большинства децеллюляризированных матриксов для медицинского применения являются ксеногенные ткани [Badylak, 2004], то процедура получения очищенного ВКМ должна обеспечивать отсутствие реакции отторжения ксенотрансплантата при его имплантации в ткани пациента. В связи с этим распространение получили методики децеллюляризации ВКМ растворами на основе щелочей. Щелочные растворы вызывают эффективный гидролиз и солюбилизацию клеточных компонентов, а также белков и гликопротеинов ВКМ, чье присутствие в матриксе может провоцировать неблагоприятный ответ организма реципиента. В то же время, использование щелочных растворов может вызывать существенные изменения структурных и механических характеристик матрикса за счет частичных гидролиза и денатурации молекул коллагена, разрушения межмолекулярных сшивок, модификации боковых групп аминокислот, дезорганизации пучков волокон коллагена вследствие чрезмерного набухания [Goissis, 2003; Reing, 2010; Sheridan, 2012; Mendoza-Nuvelo, 2011; Tsuchiya, 2014; Keane, 2015]. В этой связи, при осуществлении очистки ВКМ щелочами тщательно контролируют pH используемых растворов и продолжительность очистки для обеспечения приемлемых целостности структуры, биологических, химических и физических параметров. Кроме того, в ряде работ предложено вносить в щелочные растворы для очистки соли, например, сульфатов, чтобы избежать избыточного набухания

пучков волокон коллагена ВКМ [Mendoza-Novelo, 2011; Goissis, 1998; Bet, 2001]. Таким образом, исследования оптимальных условий получения очищенного ВКМ путем обработки растворами на основе щелочей является актуальными.

1.3. Применение очищенного ВКМ в медицине

Регенеративная медицина - это бурно развивающееся в последние годы дисциплина, направленная на восстановление морфологической и функциональной целостности тканей и органов. Механизм восстановления основан на активации эндогенных клеток или же трансплантации извне аутологичных. В первом случае, применяются различные материалы, выполняющие и кондуктивные и индуктивные свойства. В основном применяются биодеградируемые материалы. К ним относятся как материалы, полученные из синтетических компонентов, так и тканевые внеклеточные матриксы [Banyard, 2015]. Качественно очищенные материалы биологического происхождения являются наиболее предпочтительными в регенеративной медицине ввиду высокой биосовместимости и сниженного риска отторжения. Тканевые матриксы, в отличие от синтетических, обладают сложной природной структурой, необходимой для миграции клеток и их последующей дифференцировки [Banyard, 2015]. В настоящий момент среди хирургических материалов представлено много биодеградируемых матриксов ксеногенного и аллогенного происхождения. Что касается восстановления поврежденных тканей или же создания тканеинженерных конструкций, ВКМ направлен на две основные цели. Первая, это предотвращение реакции иммунной системы, сопровождающуюся воспалением. Вторая: ВКМ помогает окружающим клеткам восстанавливать ткань, вместо того, чтобы формировать рубцовую ткань [Godwin, 2006]. Доказано, что ВКМ способствует заживлению и восстановлению тканей. Тем не менее, механизм способствующий конструктивному ремоделированию ткани все еще не изучен.

Самым распространенным путем применения ВКМ является область регенерации и заживления раневых поверхностей. ВКМ, полученные из дермы

крупного рогатого скота (КРС) стимулируют заживление сухожилий коленного сустава, которые не восстанавливаются самостоятельно. ВКМ, полученные из костной ткани широко применяются при в травматологии и ортопедии для восстановления костей. Ткани сердца успешно применяются при создании искусственных клапанов [Zimmermann, 2004]. Также ВКМ применяют при лечении язв желудка, путем фиксации ВКМ в форме мембран на поврежденной зоне желудка.

Белки ВКМ широко применяются при работе с культурами клеток: для поддержания их жизнеспособности в недифференцированном состоянии и, в то же время, для стимуляции дифференцировки эпителиальный, эндотелиальных и гладкомышечных клеток in vitro. На основе белков ВКМ создают 3D клеточные культуры для исследования модели развития опухолей [Kleinman, 1987].

1.4. Регенерация, репарация, процесс заживления ран

1.4.1. Регенерация и репарация

Под регенерацией понимают процесс обновления и восстановления тканей. Регенерация также может быть физиологической, если она не связана с повреждением, а лишь является частью нормальной жизнедеятельности организма, при котором постоянно обновляются клетки и ткани. Так, за день в организме человека погибает около 1,2 кг клеток и столько же восстанавливается вновь, а в течение всей жизни это количество доходит до 20 тонн. Регенерация может быть репаративной, по-другому репарация, если она происходит в случае повреждения целостности органа или ткани и направлена на ее восстановление. Репарация может проходить по двум путям: реституция и субституция. При реституции происходит полное восстановление первоначальной ткани, а при субституции новообразованная ткань не идентична первоначальной и представлена рубцовой тканью. Также регенерация может быть патологической, если процесс восстановления поврежденных тканей нарушен. При этом возможна

гиперрегенерация, гипорегенерация и метаплазия. При гиперрегенерации не образуется достаточного количества ткани, при гиперрегнерации, наоборот, образуется избыточное количество ткани. При метаплазии происходит процесс замещения ткани на родственную.

Важно отметить, что способностью к истинной реституции после повреждения или утери ткани обладают многие представители царства животных. Самые наглядные примеры- восстановление хвоста у ящериц Lacertilia или полное восстановление целого организма из небольшого фрагмента у гидры Hydra. Что касается человека, то к истинной реституции способны только эндометрий [Gargett, 2012], костная ткань, печень, почки [Song, 2013] и кончики пальцев (до первой фаланги). Остальные ткани не могут истинно регенерировать или нуждаются в дополнительных стимулирующих факторах. Исследования по открытию данных факторов и путей их воздействия сейчас активно ведутся в области регенеративной медицины.

На данном этапе развития науки наибольшее соприкосновение с прикладной медициной все же имеет область репаративной регенерации с образование замещенной ткани, то есть субституция. Субституция - относится к типу заживления, при котором поврежденные или нерегенерирующие ткани восстанавливаются путем укладки новой соединительной ткани. В то время как некоторые мелкие повреждения без потери тканей иногда могут заживать первичным натяжением, таким образом, что никакого постоянного повреждения не остается, большая часть травм приводит к формированию рубца. При репарации могут восстанавливаться некоторые из первоначальных структур поврежденной ткани (например, эпителиальный слой), но полного структурного восстановления не происходит, что может привести к нарушению функции органа (например, шрам, образованный при инфаркте миокарда).

Пойдет ли репарация по пути реституции или субституции зависит, в первую очередь, от ткани. Некоторые ткани организма обладают большим потенциалом к клеточной пролиферации (и, следовательно, к регенерации), чем другие. В связи с этим существуют три типа тканей: непрерывно пролиферирующие ткани,

покоящиеся ткани и непролиферирующие ткани. Непрерывное пролиферирующие ткани (также известных как лабильные ткани, или стабильные) состоят из клеток, которые постоянно делятся, чтобы заместить погибшие клетки. Примерами таких тканей являются эпителий (такие как кожа, желудочно-кишечный эпителий и ткань слюнной железы) и гемопоэтические ткани. Эти ткани содержат пулы стволовых клеток, которые обладают огромной пролиферативной способностью. Ассиметричная репликация, при которой каждая стволовая клетка порождает две дочерние клетки, одна из которых дифференцирует и созревает, а другая остается недифференцированной и будет участвовать в следующем цикле обновления ткани. Некоторые ткани, известные как лабильные ткани, состоят из клеток, которые обычно существуют в не делящемся состоянии, но могут входить в клеточный цикл в ответ на определенные раздражители, такие как повреждение клеток. Ткани, попадающие в эту категорию, включают паренхиматозные клетки печени, почек и поджелудочной железы, мезенхимальные клетки, такие как фибробласты и клетки гладкой мускулатуры, эндотелиальные клетки и лимфоциты. Следует отметить, что печень, в отличие от других покоящихся тканей, обладает относительно устойчивой пролиферативной способностью. Когда долю печени иссекают, например, для трансплантации донору, оставшиеся клетки печени размножаются с такой скоростью, чтобы печень достигла такого размера, который был до резекции, то есть наблюдается гипертрофия, а не гипертрофия. Хотя этот процесс обычно описывается как регенерация, он более точно рассматривается как компенсаторный рост, поскольку первоначальная доля не восстанавливается. Есть несколько тканей, которые не могут регенерировать вообще, так как клетки в их составе не могут пролиферировать, следовательно, при повреждении таких тканей всегда формируется фиброзная ткань [Laflamшe, 2005]. К таким тканям относятся сердечная и скелетные мышцы.

1.4.2. Заживление ран

Процесс заживления ран относится к субституции и его результатом является формирование рубцовой ткани. Цель заживления ран - это как можно быстрее восстановить целостность органа. В проекции на кожные раны- это как можно быстрее восстановить барьерную функцию, а именно закрыть дно раны грануляционной тканью и сформировать эпителий, и лишь затем постепенно ремоделировать соединительно-тканные волокна. Весь процесс заживления раны представляет собой сложный скоординированный процесс, разделенный на четыре этапа: гемостаз, воспаление (иногда гемостаз относят к этапу воспаления) пролиферация, ремоделирование (Рисунок 2) [Gosain, 2004; Gonzalez, 2016].

Рисунок 2.Этапы заживления раны [Parks-Miller, 2017].

Все этапы заживления раны проходят в строгой последовательности и занимают определенное время [Stein, 2013; Sun, 2014]. Инициацией процесса заживления служит контакт тромбоцитов с фибриллами коллагена в составе поврежденных стенок сосудов или внеклеточного матрикса соединительной ткани. Таким образом, начало процесса -это сворачивание крови. В течении нескольких минут после повреждения, тромбоциты, находящиеся в крови, начинают прикрепляться в месте повреждения. При этом тромбоциты активизируются, что вызывает возникновение нескольких явлений. Они приобретают аморфную форму, более приспособленный к процессу сворачивания и подают химические сигналы,

способствующие дальнейшему свёртыванию. Это приводит к активизации фибрина, который образует сетку и играет роль клея, связывая тромбоциты друг с другом. При этом образуются тромбы, которые перекрывают разрывы кровеносных сосудов, предотвращая дальнейшее кровотечение (Рисунок 3) [Chow, 2014; Rasche, 2001; Versteeg, 2013; Stein, 2013]. (Рисунок 3) [Chow, 2014; Rasche, 2001; Versteeg, 2013; Stein, 2013].

Рисунок З.Фазы заживления раны [Sun, 2014].

Затем начинается этап воспаления, во время которого повреждённые и мёртвые клетки вычищаются, наряду с бактериями, болезнетворными микроорганизмами и дебрисом. Это происходит посредством процесса фагоцитоза. Также на этом этапе в рану выделяются тромбоцитарные факторы роста, стимулирующие миграцию и деление клеток во время пролиферативной фазы. Следующий этап-пролиферация. На этом этапе происходит рост новой ткани: ангиогенез, отложение коллагена, формирование грануляционной ткани, эпителизация и сокращение раны, то есть контракция [Midwood, 2004]. Грануляционная ткань представляет собой новый тканевой матрикс, который

заполняет всю поверхность раны. Его основу составляет коллаген III типа - менее прочный, чем коллаген I типа, но при этом гораздо быстрее синтезирующийся (на последующем этапе ремоделирования коллаген III типа будет заменен на коллаген I типа). Клеточная компонента представлена фибробластами, Мф и лейкоцитами. Именно фибробласты являются теми клетками, которые синтезируют волокнистую основу грануляционной ткани, формируя провизорный матрикс [Midwood, 2004]. Мф и нейтрофилы необходимы именно на данном этапе, чтобы фагоцитировать старые поврежденные ткани и защищать новую ткань от патогенной инфекции, пока не сформирован защитный эпителиальный барьер. При ангиогенезе эндотелиальные васкулярные клетки образуют новые кровеносные сосуды, чтобы обеспечить доступ клеткам иммунной системы, питать растущую ткань, а также эффективно транспортировать клеточный дебрис. Одновременно с этим процессом происходит повторная эпителизация эпидермиса, при котором эпителиальные клетки пролиферируют и мигрируют выше раневого слоя, обеспечивая укрытие новой ткани, и сокращение раны. Миофибробласты уменьшают размер раны за счет захвата краев раны и сокращаются по механизму, схожему на аналогичный в гладкой мускулатуре. Когда этап пролиферации подходит к концу, клетки погибают путем апоптоза. Ремоделирование - последний этап и самый длительный. В это время происходит перестройка волокнистого компонента ВКМ, формирование кросс-сшивок и расположение его вдоль линий растяжения, коллаген III типа замещается коллагеном I типа. При этом повышается прочность рубцовой ткани, к 8 неделе почти достигая максимума, что составляет 80% от прочности неповрежденной ткани [Laurel, 2016]. Рубец становится менее красным, что свидетельствует об уменьшении количества сосудов в области раны. Стадия ремоделирования обычно проходит размеренно и без осложнений, но если процесс нарушается, то рана может перейти в разряд длительно незаживающих или хронических, например, венозные язвы или патологические рубцы, такие как келоидные [Desmoulière, 2005].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Калмыкова Нина Владимировна, 2018 год

- - -«

—- ,,

Порошок

V V/

•Л

Контроль

Рисунок 26. Участок области имплантации образцов на поперечных гистологических срезах кожного лоскута. Окраска гематоксилином и эозином.

1 сут

5 сут

Гидрогель

Суспензия

Порошок

~ * N .

ЧГ . - 'Ч-С^Л *

т ^ « * *

- - '- X.

50 цш

и

— %

•--- - '.* .

1 -

• - • * V - ---V - -

^ - ' ^ ; * • ' ^ . .г.

■ < • •

»Я'. # ___

V* -V ^ / »-• ■ «г^ с ' » «

% ¿Г /

✓

♦ +9 .

, —

л * ' - Ч ' V - •чг ¿4 ••

V ^ Л

0 --1 ' -«С 1 •

*

V/ \ " » « т.» . -г; _

- ♦ ч* V

Контроль

— »г

Рисунок 27. Участок области имплантации образцов на поперечных гистологических срезах кожного лоскута. Иммуногистохимическое выявление макрофагального антигена F4/80. Визуализация при помощи АВС-пероксидазы (коричневое окрашивание), ядра окрашены гематоксилином.

Соединительная ткань в зоне инъекций контрольного раствора на обоих сроках эксперимента была, как правило, слабоотечна (Рисунок 26, Рисунок 27). На 1-е сутки в ней присутствовал смешанный нейтрофильно-макрофагальный лейкоцитарный инфильтрат. На 5-е сутки основной клеточной формой, инфильтрирующей область введения, являлись Мф.

Для объективной оценки тканевой реакции в зоне инъекций исследуемых форм была проведена полуколичественная оценка выраженности отека и лейкоцитарной инфильтрации в соединительной ткани области их введения. Полуколичественный анализ не выявил различий между всеми исследованными группами по степени отека на 1-е сутки после введения (0, Таблица 19). Однако на 5-е сутки снижение отечности соединительной ткани в контрольной группе происходило достоверно быстрее по сравнению с другими экспериментальными группами (0, Таблица 20). В то же время наибольшее среднее значение данного показателя было отмечено в группе, которой имплантировали порошок.

Анализ клеточных и тканевых реакций показал, что подкожное введение экспериментальных образцов, включая контрольный, вызывало развитие в зоне имплантации альтеративно-воспалительных изменений, проявляющихся в лейкоцитарной инфильтрации и отеке. При этом интенсивность воспалительной реакции в зоне инъекций падала со временем. Гистологическое исследование выявило интенсивное внедрение лейкоцитов во всю толщу всех экспериментальных образцов. Данный факт позволяет судить о том, что компоненты ВКМ обладают хемоаттрактантными свойствами, а также могут выступать в качестве эффективного субстрата для миграции клеток.

Полуколичественная оценка отека выявила его большую выраженность на 5-е сутки по сравнению с контрольным образцом во всех экспериментальных группах. При этом средняя величина увеличивалась в ряду «Суспензия» -«Гидрогель» - «Порошок», что соответствует количеству сохранившихся у животных различимых имплантатов и их величине. В связи с этим, наблюдаемый эффект можно отчасти объяснить механическим воздействием имплантатов на

окружающие ткани, стимулирующим дегрануляцию тучных клеток [Zhang, 2012; Fowlkes, 2013].

Рисунок 28. Средние показатели выраженности отека соединительной ткани в области введения исследуемых образцов ВКМ на 1-е и 5-е сутки после

имплантации. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р < 0,05) отличаются от значений контрольной группы, ромбом - от группы «суспензия»,

кругом - от группы «порошок».

Исследование показателей инфильтрации ПЯЛ выявило их значительное и достоверное увеличение на 1-е сутки у животных, которым инъецировали суспензию и порошок, по сравнению с контрольной группой (Рисунок 29, Таблица 19). Это свидетельствует об интенсификации острой фазы воспалительной реакции под воздействием исследуемых форм. На 5-е сутки происходило снижение выраженности инфильтрации во всех исследованных группах. Однако значение данного показателя в группе, получавшей суспензию было достоверно выше по сравнению с группами, получавшими порошок и контрольной (Рисунок 29, Таблица 20). На основании полученных данных можно заключить, что введение суспензии вызывает увеличение продолжительности нейтрофильной стадии воспаления. Ранее было показано, что низкомолекулярные коллагеновые пептиды вызывают активацию, стимулируют миграцию и уменьшают уровень апоптоза нейтрофилов [Козлов, 1999]. Высвобождение низкомолекулярных фрагментов

коллагена из частиц ВКМ может обуславливать полученную динамику клеточных реакций.

Рисунок 2е). Средние показатели выраженности инфильтрации ПЯЛ области введения исследуемых образцов ВКМ на 1-е и 5-е сутки после имплантации. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р < 0,05) отличаются от значений контрольной группы, ромбом - от группы «суспензия»,

кругом - от группы «порошок».

Анализ моноцитарно/макрофагальной инфильтрации выявил присутствие большого числа клеток данного типа в соединительной ткани области имплантации во всех исследованных группах на обоих сроках резорбции (Рисунок 30, Таблица 19, Таблица 20). На 1-е сутки достоверных различий между группами выявлено не было. На 5-е сутки было отмечено достоверное снижение числа данных клеток у животных, контрольной группы по сравнению со всеми остальными экспериментальными группами. Также на этом же сроке было выявлено небольшое достоверное снижение значения показателя численности моноцитов/Мф в группе суспензии, по сравнению с группой порошка. По данным литературы, фрагменты деградировавшего коллагена, могут оказывать хемоаттрактантное действие на моноциты [Postlethwaite А.Е, 1976], что объясняет полученный эффект.

Рисунок 30. Средние показатели выраженности моноцитарно /макрофагальной инфильтрации области введения исследуемых образцов ВКМ на 1-е и 5-е сутки после имплантации. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р < 0,05) отличаются от значений контрольной группы, решеткой - от группы «гидрогель», ромбом - от группы «суспензия», кругом - от группы «порошок».

Оценка числа лимфоцитов показала значительное достоверное увеличение их числа в зоне имплантации на 1 -е сутки во всех экспериментальных группах по сравнению контролем (Рисунок 31, ПРИЛОЖЕНИЕ Таблица 19). На 5-е сутки происходило снижение лимфоцитарной инфильтрации у всех животных с имплантатами. Однако достоверное увеличение числа лимфоцитов сохранялось в группах, получавших гидрогель и порошок (Рисунок 31 , ПРИЛОЖЕНИЕ Таблица 20). Это можно объяснить тем, что в определенных концентрациях, продукты протеолиза коллагена могут способствовать пролиферации лимфоцитов и препятствовать их апототической гибели [Yemelyanov, 1998].

Полуколичественный анализ наличия ГКИТ показал достоверное присутствие данной клеточной формы в области имплантации лишь на 5-е сутки в группе животных, которым вводили «Порошок» (ПРИЛОЖЕНИЕ Таблица 19, Таблица 20). При этом крайне низкое значение средней полуколичественной оценки подтверждает наблюдение о редкой встречаемости ГКИТ. Полученный результат, очевидно, обусловлен наличием в составе имплантата данного типа

значительного количество не резорбируемого в течение всего срока эксперимента стабильного при температуре тела материала.

Для оценки миграции фрагментов имплантатов по лимфатической системе были изучены препараты гистологических срезов паховых лимфоузлов экспериментальных животных. Однако проведенное исследование не выявило фрагментов введенных образцов в данных органах ни в одной из исследованных групп. Кроме того, на качественном уровне не было обнаружено каких-либо различий в морфологии самих лимфоузлов. Возможно, небольшие пептидные фрагменты гидролизованного коллагена быстро переваривались, как фагоцитами непосредственно в зоне введение, так и (что более вероятно) в лимфоидных органах, будучи разнесенными током тканевой жидкости и лимфы.

Рисунок 3 1. Средние показатели выраженности лимфоцитарной инфильтрации области введения исследуемых образцов ВКМ на 1-е и 5-е сутки после имплантации. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (p < 0,05) отличаются от значений контрольной группы, решеткой - от группы «гидрогель», ромбом - от группы «суспензия», кругом - от группы «порошок».

На основе данных полуколичественного исследования была проведена оценка раздражающего действия экспериментальных образцов по сравнению с контрольной группой по системе, предложенной в ГОСТ ISO 10993-6-2011. По результатам проведенного анализа гидрогель не оказывал раздражающего действия на окружающую соединительную ткань на обоих сроках имплантации (Таблица 19, Таблица 20). В свою очередь суспензия и порошок оказывали легкое

раздражающее действие на 1-е сутки после введения и не оказывали раздражающего действия на 5-е сутки.

3.3.2. Имплантация ВКМв форме мембраны

Макроскопическое исследование областей имплантации образцов выявило на 1 -е сутки наличие гиперемии тканей кожного лоскута, а также отека фасции кожной мышцы как в опытных, так и контрольных группах. На 5-е сутки данные признаки воспаления уменьшались более выражено в контрольной группе. В одной опытной области имплантации на 1 -е сут, а также в двух контрольных на 1 -е и 5-е сутки соответственно выявлены кровоизлияния в подкожной соединительной ткани.

Гистологическое исследование полученных образцов показало развитие воспалительных изменений тканей в местах имплантации на 1 -сутки, которые характеризовались развитием отека подкожной соединительной ткани, в некоторых случаях выявляемого и в кожной мышце, а также лейкоцитарной инфильтрацией (Рисунок 32, Рисунок 33). В среднем выраженность отека в опытных областях была выше, чем в контроле (2,3 балла против 1,5). Лейкоцитарный инфильтрат в обеих группах состоял преимущественно из нейтрофилов. Патологические изменения окружающих тканей кожи в обеих группах проявлялись в наличие выраженного полнокровия сосудов дермы и гиподермы, а также лейкоцитарной инфильтрации дермы, несколько более выраженной в опытных областях имплантации. В трех опытных областях имплантации обнаружены единичные некрозы отдельных мышечных волокон кожной мышцы.

Рисунок 32. Участок области имплантации образцов на поперечных гистологических срезах кожного лоскута. Окраска гематоксилином и эозином.

Увеличение х100.

Гистологическая картина контрольных образцов на 5-е сутки заживления характеризовалась уменьшением уровня отечности подкожной соединительной ткани при сохранении полнокровия сосудов окружающих тканей. В лейкоцитарном инфильтрате присутствовали преимущественно Мф. В опытной группе образцов отечность соединительной ткани была гораздо более выражена (в среднем 1,83 балла против 0,83). В лейкоцитарном инфильтрате присутствовали как нейтрофилы, так и Мф в сопоставимом соотношении. В двух образцах выявлены в большом количестве ГКИТ. Также во всех образцах наблюдается полнокровие сосудов дермы и гиподермы. В двух образцах выражена нейтрофильная инфильтрация дермы. Полуколичественный анализ раздражающего действия мембраны показал, что данная форма оказывает легкое раздражающее действие на окружающую соединительную ткань на обоих сроках имплантации.

1 сут 5 сут

¿п... _

■ Эт*- ' -¿к

Мембрана

|

"■« ", .'' • * г*- '' Контроль »: ч*

л

- г-, -*

• • • *. '

- Ч ? , •> '

».-, • V т » "Ч - • А -

э с— --^. , V. . V '

Рисунок 33. Участок области имплантации образцов на поперечных гистологических срезах кожного лоскута. Окраска гематоксилином и эозином.

Увеличение х400.

Суммируя полученные результаты, проведенного полуколичественного анализа клеточных и тканевых реакций можно говорить о том, что все исследуемые формы очищенного ВКМ (мембрана, порошок, суспензия и гидрогель) стимулируют лимфоцитарную инфильтрацию области введения и способствуют значительному усилению острой фазы воспалительной реакции в зоне имплантации. При этом продолжительность острой фазы при введении суспензии увеличивается, а при введении порошка и гидрогеля не отличается от контроля. Лейкоциты активно инфильтрируют имплантаты всех экспериментальных образцов, проникая во всю толщу. Преобладание моноцитов/Мф в соединительной ткани, окружающей образцы, активное внедрение фагоцитов в толщу самих имплантатов, а также формирование ГКИТ (при введении порошка и мембраны) свидетельствуют об активном протекании процессов резорбции биоматериалов. Известно, что Мф [Delavary, 2011] и лимфоциты [Monako, 2003; Бабаева, 2009] являются ключевыми клеточными формами, регулирующими течение воспалительной реакции и переход альтеративно-экссудативных процессов в пролиферативные. Тем не менее, в условиях нашего эксперимента мы не наблюдали новообразования тканей в месте имплантации образцов. Вероятно, что для активации данного процесса необходимы факторы, возникающие при

повреждении ткани, такие как PDGF и ТЫБ-а, выделяемые тромбоцитами при дегрануляции [Мопако, 200]. Возможно, описанный эффект образования соединительной ткани будет наблюдаться при проведении исследования на модели полнослойной кожной раны у грызунов.

3.4. Оценка влияния разных форм ВКМ на процесс заживления раны

3.4.1. Исследование форм: суспензия, порошок

Макроскопическое исследование области раневого дефекта показало развитие покраснения и небольшой отечности краев ран в течение первых минут после их нанесения во всех экспериментальных группах. Данные видимые признаки воспаления практически полностью исчезали ко 2-м суткам заживления у всех животных. Фотопланиметрическая оценка площади ран выявила значительное достоверное (р < 0,05) ускорение их контракции в опытной группе, получавшей суспензию, по сравнению с контролем (Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36) начиная со 2-х суток заживления. Среднее значение данного показателя в опытной группе, получавшей порошок, также было ниже, чем в контроле, однако различия между группами не были статистически достоверными (Рисунок 34).

Рисунок 34.

Время, сут

Площадь ран в динамике эксперимента. Сравнение групп «Порошок», «Суспензия» и контроль.

Рисунок 35. Изменение относительной площади раневой поверхности у животных опытных и контрольной групп. Значения, отмеченные звездочкой, достоверно (р < 0,05) отличаются от значений контрольной группы.

Контроль Суспензия Порошок

0 сут л ИГ

7 сут , * V

Рисунок 36. Макрофотоснимки раневой области у животных опытных и контрольной групп после проведения операций (0 сутки) и перед забором материала для гистологического исследования (7 сутки).

Качественный морфологический анализ полученных гистологических препаратов показал наличие краевой эпителизации раневого дефекта во всех исследованных группах (Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39). Патологические изменения в неповрежденной коже на границе ран отсутствовали за исключением наличия у некоторых животных небольшого отека. Раны всех животных характеризовались развитием грануляционной ткани в краевых зонах на границе с интактной кожей (Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39). В новообразованной соединительной ткани мышей контрольной группы и опытной группе «Порошок», преобладали клетки смешанного лейкоцитарного инфильтрата с преобладанием клеток моноцитарно/макрофагальной линии дифференцировки. Также в небольшом количестве присутствовали фибробласты и новообразованные сосуды микроциркуляторного русла. В свою очередь, грануляционная ткань животных группы «Порошок», казалась более зрелой, чем в остальных группах, что выражалось в большей доле фибробластов среди других клеточных форм, а также большем количестве микрососудов (Рисунок 39). Центральная зона раневого дефекта в контрольной группе была представлена струпом, состоящим из фибрина и лейкоцитов, главным образом сегментоядерных (Рисунок 37). Центральный участок ран животных обеих опытных групп был заполнен раневыми покрытиями в виде переплетающихся тяжей (Рисунок 38, Рисунок 39). Промежутки между тяжами были инфильтрированы моноцитами/Мф и сегментоядерными лейкоцитами. В группе «Суспензия» некоторые тяжи имели ярко выраженную базофилию (Рисунок 38). Морфометрическое исследование не выявило статистически значимых различий между всеми экспериментальными группами по уровню эпителизации раневой поверхности (Рисунок 40). Однако среднее значение данного показателя превышало таковое в контрольной группе более чем в 1,5 раза. Анализ площади грануляционной ткани показал её статистически значимое (р < 0,05) более чем трехкратное увеличение в группе «Суспензия» по сравнению с контролем (Рисунок 41 ).

Микрофотографии поперечных гистологических срезов ран животных контрольной группы. А - краевая зона раневого дефекта. Б -участок грануляционной ткани краевой зоны раневого дефекта. В - участок центральной зоны раневого дефекта. Окрашивание гематоксилином и эозином.

Рисунок 38. Микрофотографии поперечных гистологических срезов ран животных опытной группы «Суспензия». А - краевая зона раневого дефекта. Б - участок грануляционной ткани краевой зоны раневого дефекта. В - участок центральной зоны раневого дефекта. Окрашивание гематоксилином и эозином.

Рисунок 3е). Микрофотографии поперечных гистологических срезов ран животных опытной группы «Порошок». А - краевая зона раневого дефекта. Б - участок грануляционной ткани краевой зоны раневого дефекта. В - участок центральной зоны раневого дефекта. Окрашивание гематоксилином и эозином.

Контроль

Суспензия

Порошок

Рисунок 40.

Эпителизации раневой поверхности у животных опытных и контрольной групп.

Контроль

Суспензия

Порошок

Рисунок 41. Площадь грануляционной ткани на гистологических срезах ран животных опытных и контрольной групп. Значение, отмеченное звездочкой, достоверно ф < 0,05) отличается от значений контрольной группы.

В опыте по заживлению полнослойных кожных ран очищенный ВКМ в форме суспензии волокон стимулирует процесс репарации, посредством значительного увеличения количества новообразованной соединительной ткани в зоне раневого дефекта, а также усиления сокращения площади ран. Анализ площади грануляционной ткани выявил ее достоверное увеличение более чем в 4 раза, по сравнению с контролем. В тоже время не было выявлено достоверных различий между контролем и опытной группой, в которой применяли порошок. Было показано, что обе экспериментальные формы заполняют рану и служат эффективным субстратом для миграции по ним клеток. Согласно данным литературы сила контракции ран пропорциональна количеству новообразованной соединительной ткани в зоне дефекта [Higton, 1964]. Вероятно, что наблюдаемый эффект сокращения площади ран под воздействием суспензии отчасти обусловлен стимуляцией образования грануляционной ткани. Также можно предположить, что наличие в ранах сети из волокон коллагена может способствовать механическому «скреплению» краев ран и способствовать их стягиванию.

Раны всех опытных групп характеризовались развитием грануляционной ткани, в составе которой выявлялись фибробласты и новообразованные сосуды. В

опытной группе «Порошок» и контрольной в составе новообразованной ткани преобладали клетки моноцитарно/макрофагальной линии. Важно отметить, что грануляционная ткань в группе «Порошок» была более зрелой (по сравнению со всеми другими группами), что выражалось большей долей фибробластов среди всех клеточных форм.

По результатам проведенной работы можно заключить, что экспериментальное форма очищенного ВКМ в виде суспензии волокон стимулирует регенерации кожи, путем увеличения площади грануляционной ткани и уменьшения площади раны, а порошок стимулирует созревание грануляционной ткани.

3.4.2. Исследование форм: мембрана, порошок, гидрогель

Гистологическое исследование поперечных срезов центральной области ран показало, что на 7-е сутки заживления во всех исследованных группах животных дно раневого дефекта на всем своем протяжении заполнено грануляционной тканью (Рисунок 42). При этом ткани интактной кожи, окружающей раны, не имеют каких-либо видимых патологических изменений. В новообразованной соединительной ткани преобладают веретеновидные низкодифференцированные фибробласты, между которыми присутствует небольшое количество внеклеточного матрикса, окрашивающегося пикрофуксином в слабый розовый цвет. Также в грануляционной ткани присутствует большое количество сосудов микроциркуляторного русла и клеток смешанного воспалительного инфильтрата, представленных преимущественно нейтрофилами, моноцитами/Мф и лимфоцитами. Наблюдается краевая эпителизация ран пластами утолщенного эпидермиса, в некоторых случаях с явлением погружного роста, наиболее выраженная в экспериментальной группе «Гидрогель» (Рисунок 42).

А Б

Рисунок 42. Гистологические срезы центральной области ран животных контрольной группы (А, Б), а также опытных групп «Мембрана» (В, Г), «Порошок» (Д, Е) и «Гидрогель» (Ж, З) на 7-е (А, В, Д, Ж) и 14-е (Б, Г, Е, З) сутки

заживления. Окрашивание гематоксилином и эозином. Увеличение 40Х. Стрелками и пунктирной линией отмечены пласты регенерирующего эпидермиса.

На 14-е сутки заживления раневой дефект у всех животных заполнен незрелой рубцовой тканью (Рисунок 42). В соединительнотканном регенерате преобладают переплетающиеся, ориентированные преимущественно параллельно поверхности раны зрелые пучки коллагеновых волокон, окрашивающиеся

пикрофуксином в красный цвет. Между волокнами внеклеточного матрикса присутствуют зрелые фибробласты. По сравнению с 7-ми сутками заживления, как общее число клеточных форм, так и число клеток воспалительного инфильтрата, а также сосудов микроциркуляторного русла в новообразованной соединительной ткани значительно снижено. Количество рубцовой ткани, а также её толщина в различных участках среза сильно варьирует у отдельных животных внутри всех исследованных групп. Поверхность ран в разной степени покрыта новообразованным эпидермисом, местами утолщенным и в некоторых случаях с явлениями погруженного роста. У крыс контрольной группы полностью эпителизированные раны не выявлены. В то же время на 14-е сутки в опытной группе «Мембрана» поверхность ран полностью закрыта эпидермисом у 3-х животных, в группе «Порошок» - также у 3-х животных, а в группе «Гидрогель» -у 5-и животных из 10-и.

Морфометрический анализ показателей репаративной регенерации кожи (Таблица 9) выявил статистически достоверное увеличение степени эпителизации раневой поверхности в опытных группах «Порошок» (p = 0,004) и «Гидрогель» (p = 0,002) по сравнению с контрольной группой на 7-е сутки заживления. В свою очередь достоверность различий между контролем и группой «Мембрана» также приближалась к уровню статистической значимости (p = 0,059). Кроме того, на данном сроке было обнаружено, что площадь грануляционной ткани на срезах ран животных из групп «Порошок» (p = 0,048) и «Гидрогель» (p = 0,009) меньше по сравнению с крысами контрольной группы (Таблица 9).

Количественное гистологическое исследование ранозаживления на 14-е сутки эксперимента показало статистически достоверное увеличение степени эпителизации ран в опытных группах «Мембрана» (p = 0,026) и «Гидрогель» (p = 0,002) по сравнению с контрольными животными (Таблица 9). При этом среднее значение данного показателя в группе «Гидрогель» двукратно превосходило таковое в контрольной группе.

Таблица 9.

Морфометрические показатели репаративных процессов в области раневого дефекта кожи на 7-е и 14-е сутки заживления.

Морфометрический параметр Срок (сУт) Группы животных

Контроль «Мембрана» «Порошок» «Гидрогель»

Степень эпителизации раны, % 7 18,5 ± 4,4 24,2 ± 4,5 27,4 ± 6,6* 28,6 ± 8,6*

14 42,5 ± 23,0 71,6 ± 29,5* 65,4 ± 27,6 84,1 ± 20,5*

Площадь грануляционной (7е) или рубцовой (14е сут.) ткани, мм2/срез 7 17,8 ± 5,9 12,7 ± 5,3 12,5 ± 4,3* 10,5 ± 6,4*

14 8,0 ± 2,5 8,3 ± 3,6 7,1 ± 4,4 6,0 ± 2,9

Число нейтрофилов в грануляционной (7е) или рубцовой (14е сут.) ткани/мм2 7 662,2 ± 558,8 510,8 ± 342,7 644,9 ± 378,2 718,4 ± 373,7

14 562,9 ± 539,5 649,3 ± 489,4 450,1 ± 331,8 290,2 ± 303,5

Число профилей сосудов в грануляционной (7е) или рубцовой (14е сут.) ткани/мм2 7 5,8 ± 2,6 5,2 ± 3,2 6,6 ± 2,3 7,0 ± 4,2

14 6,8 ± 4,0 3,6 ± 2,5 4,0 ± 3,4 4,3 ± 2,9

Объемная плотность сосудов в грануляционной (7е) или рубцовой (14е сут.) ткани, % 7 6,8 ± 3,7 8,0 ± 3,7 5,9 ± 1,7 8,4 ± 5,5

14 4,8 ± 2,7 2,8 ± 2,8 3,3 ± 3,7 2,2 ± 1,9

Примечание: *- р < 0,05 по сравнению с контрольной группой. Данные представлены в

виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение.

Результаты проведенного морфологического исследования свидетельствуют об усилении процесса регенерации эпидермиса в полнослойных кожных ранах у крыс при их заживлении под различными формами ВКМ, соответствующими разными уровням структурной организации матрикса, на модели полнослойной кожной раны у крыс. Вместе с тем, на обоих исследованных сроках наиболее выраженная стимуляция эпителизации раневых дефектов наблюдалась при применении гидрогеля, то есть пептидов ВКМ. Статистически достоверное усиление эпителизации при использовании очищенного ВКМ в форме «Порошка» выявлено на более раннем (7 сутки), а «Мембраны» - на более позднем (14 сутки) сроках заживления.

Восстановление эпителиального покрова над областью раневого дефекта кожи является одним из ключевых параметров, характеризующим успешность его заживления. Нарушение процессов эпителизации является одним из факторов, в значительной степени способствующих развитию длительно незаживающих ран [Pastar, 2014]. Основным клеточным компонентом эпидермиса, составляющим его структурную основу и принимающим основное участие в его физиологической и репаративной регенерации, являются кератиноциты. Из литературы известно, что контакт кератиноцитов с коллагеном I типа необходим для инициации процесса регенерации поврежденного эпидермиса [Plicher, 1997]. Данный факт может отчасти обуславливать выявленные в настоящем эксперименте репаративные свойства коллагеновых раневых покрытий, направленные на ускорение восстановления эпителиального покрова раневого дефекта кожи. Ранее было показано, что ферментативная деградация коллагена I типа матриксными металлопротеиназами, выделяемыми кератиноцитами, обязательно предшествует началу направленной миграции эпителиальных клеток в область раны [Ranagari, 2011;Rohani, 2015 ]. Можно предположить, что различная доступность коллагена, присутствующего в составе исследованных форм раневых покрытий, для деградации данными ферментами приводит к наблюдаемым отличиям в эффекте форм очищенного ВКМ на показатель эпителизации ран на разных сроках эксперимента. Так, гидратация раневого покрытия раневым экссудатом, содержащим протеолитические ферменты, очевидно, осуществляется быстрее в случае заполнения раны мелкодисперстным порошком, нежели наложения на неё пластиной. В свою очередь форма коллагенового гидрогеля при аппликации на раневую поверхность уже содержит в своем составе значительное количество влаги, способствуя, таким образом, эффективному поступлению коллагена в область повреждения, а также ускорению его ферментативного гидролиза. Необходимо отметить, что само по себе увлажнение раневого дефекта широко известно, как отдельный фактор, стимулирующий процессы репаративной регенерации кожи, включая и миграцию кератиноцитов [Mosti, 2015; Vasconcelos, 2011]. В связи с этим можно предположить, что заживления ран в условиях

влажной среды при применении гидрогеля, также может обуславливать повышенную эффективность данной формы очищенного ВКМ к стимуляции эпителизации.

Помимо эффекта на показатель эпителизации ран было показано статистически достоверное снижение количества грануляционной ткани в раневых дефектах кожи, заживавших под очищенным ВКМ в форме порошка и гидрогеля на 7-е сутки эксперимента. В то же время не выявлено значимых отличий между группами по показателям воспалительной нейтрофильной инфильтрации и васкуляризации новообразованной соединительной ткани. Ранее при исследовании биохимических свойств коллагенсодержащего материала для заживления ран была показана способность коллагена, наряду с окисленной восстановленной целлюлозой, нековалентно обратимо связывать факторы роста [Си11еп, 2002]. Экстраполируя эти данные на результаты, полученные в настоящем эксперименте, можно предположить, что снижение скорости новообразования соединительной ткани на раннем этапе заживления ран при нанесении порошка и гидрогеля, вызвано частичным временным депонированием ростовых факторов, способствующих стимуляции новообразования соединительной ткани (например, PDGF и TGF-P). Последующее же высвобождение ростовых факторов приводит к нормализации процесса регенерации соединительной ткани, приводящей к нивелированию отличий между группами на 14-е сутки заживления. Способность к обратимому связыванию факторов роста коллагеном в составе очищенного ВКМ может играть главенствующую роль в их защите от протеолиза в условиях длительно незаживающих ран различной этиологии, обуславливая терапевтическую эффективность изделий на основе компонентов ВКМ.

Обобщая данные двух экспериментов по заживлению полнослойных кожных ран у грызунов под разными формами очищенного ВКМ, можно отметить, что все формы стимулируют заживление ран, но посредством разных эффектов и в разной динамике. Так гидрогель стимулирует эпителизацию как на ранних, так и на поздних стадиях заживления раны, но не стимулирует образование грануляционной ткани в зоне повреждения. Суспензия стимулирует в

значительной степени образование грануляционной ткани. Порошок стимулирует эпителизацию на ранних сроках. Он также влияет на формирование более зрелой грануляционной ткани, но на показателе общей площади новообразованной ткани это не сказывается. Мембрана усиливает эпителизацию на поздних сроках репарации.

3.5. Анализ маркеров Мф и ТИ-лимфоцитов

Весь эксперимент по оценке дифференцировки Мф и ТИ-лимфоцитов в ответ на введение разных форм коллагеновых материалов необходимо было разделить на две части. Первая группа форм вводилась инъекционно и в качестве контроля использовался раствор глюкозы для инфузий, чтобы нивелировать в оценке результатов эффект механического растяжения ткани и повреждение тканей иглой. Мембрану ВКМ стоило рассматривать в отдельном опыте, так как ее внедрение под кожу сопровождается операцией. Контролем к данной группе служили ложно оперированные животные.

Для оценки профиля поляризации Мф в тканях при имплантации ВКМ в разных формах был произведен подсчет числа меченых специфичными маркерами (Таблица 6) клеток (Рисунок 43). Полученные значения были подвергнуты статистическому анализу. Для оценки статистической значимости различий между группами использовали непараметрические критерий Краскела-Уоллиса. Для оценки статистической значимости отличий между двумя экспериментальными группами применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия также при р<0,05.

Рисунок 43. Анализ маркеров макрофагов и ТИ-лимфоцитов иммуногистохимическим методом.

3.5.1. Исследование форм ВКМ: порошок, суспензия, гидрогель

Результаты подсчета и первичного анализа данных для групп порошок, суспензия, гидрогель и контроль представлены в Таблица 10. Суммарные данные по всем статистически значимым отличиям по экспрессии маркеров среди групп представлены в Таблица 11. Данные по оценке динамики изменения экспрессии маркеров приведены в Таблица 12.

Таблица 10.

Анализ маркеров макрофагов и ТИ-лимфоцитов в группах гидрогель, суспензия, порошок и контроль. Указанные значения соответствуют количеству клеток на 10 полей зрения. Достоверное отличие от контроля: * - р<0,05; **- р<0,01. Достоверное отличие от группы «порошок»: ■- р<0,05; ■■- р<0,01.

Образец Соединительная ткань Дерма Соединительная ткань Дерма

1 сутки 1 сутки 5 сутки 5 сутки

СБ68

Гидрогель 242,6±57,1 192,0±49,8 321,2±113,0 64,8±39,9

Суспензия 782,5±338,4** 227,5±62,3 395,8±144,5 64,3±24,3

Порошок 1092,8±655,2** 313,7±78,9** 474,8±49,1** 68,3±26,9

Контроль 147,3±50,5 167,2±40,2 183,6±67,6 47,8±22,1

Е4/80

Образец Соединительная ткань Дерма Соединительная ткань Дерма

1 сутки 1 сутки 5 сутки 5 сутки

Гидрогель 419,8±127,2 8,4±5,9 118,8±33,7 7,2±5,2

Суспензия 378,3±145,2 6,5±3,4 248,0±40,7 7,8±2,8

Порошок 386,3±70,8 7,0±3,2 415,8±90,0** 9,7±3,5

Контроль 272,0±89,8 7,7±3,9 143,2±85,9 13,4±5,8

СБ80

Гидрогель 26,0±15,5 9,0±5,1 6,7±2,7 3,8±2,5

Суспензия 14,3±9,6 6,0±2,6 6,5±6,4 2,2±2,1

Порошок 10,2±10,3 4,4±1,9 7,3±11,1 3,5±4,5

Контроль 19,3±6,9 7,8±3,5 8,2±4,9 3,6±2,1

ССЯ7

Гидрогель 29,0±16,6 17,8±8,8 54,0±18,9 19,4±7,9

Суспензия 106,2±85,0 21,2±10,5 72,3±19,8* 22,5±13,6

Порошок 39,8±25,9 28,8±16,6 42,3±16,6 12,5±4,4

Контроль 41,3±11,7 32,8±9,7 40,7±21,9 14,0±6,8

С0206

Гидрогель 210,0±84,9 86,0±61,9 164,7±61,3 95,0±35,7

Суспензия 200,5±150,0 87,0±53,9 244,2±60,1 142,8±57,9

Порошок 174,8±152,0 65,7±34,6 213,7±84,8 109,7±38,1

Контроль 100,2±152,2 35,5±40,7 207,6±39,9 127,0±57,7

С0163

Гидрогель 115,8±37,9 256,6±119,5 131,8±22,4 238,2±60,7

Суспензия 144,5±62,1 214,0±112,7 129,3±51,9 224,0±41,4

Порошок 139,7±59,6 269,5±137,7 151,8±61,8 256,5±25,9

Контроль 126,7±65,8 169,8±56,3 95,8±43,9 175,0±47,0

1Ь-6

Гидрогель 22,6±18,9 2,8±3,1 13,0±8,3н 6,0±3,6

Суспензия 42,3±40,3 6,0±4,6 44,5±15,2 5,8±3,0

Порошок 13,3±16,8 5,7±5,0 76,0±45,7** 9,3±7,8

Контроль 31,3±28,9 6,5±4,7 16,4±5,1 6,6±6,0

№N7

Гидрогель 44,8±30,7 16,2±9,0 49,7±36,0 46,3±68,9

Суспензия 88,5±39,9 8,2±1,7* 32,3±19,3^ 8,5±4,5

Порошок 132,3±96,7 47,3±65,9 151,5±124,9 65,2±97,9

Контроль 186,8±133,1 203,5±156,4 49,0±37,3 11,0±11,5

Таблица 11.

Суммарные данные сравнения количества экспрессируемых маркеров в группах порошок, суспензия, гидрогель и контроль. Отображены статистически различимые данные (пБ-не значимые отличия).

Соединительная Дерма 1 сутки Соединительная Дерма 5 сутки

ткань 1 сутки ткань 5 сутки

СБ68 суспензия> контроль (р=0,007) порошок> контроль (р=0,002) порошок> контроль (р=0,007) порошок> контроль (р=0,005) ПБ

Е4/80 ПБ ПБ порошок> контроль (р=0,008) порошок> гидрогель (р=0,0012) ПБ

СБ80 ПБ ПБ ПБ ПБ

ССЯ7 ПБ ПБ суспензия> контроль (р=0,05) ПБ

СБ163 ПБ ПБ ПБ ПБ

СБ206 ПБ ПБ ПБ ПБ

№N7 ПБ суспензия <контроль (р=0,03) порошок> суспензия (р=0,05) ПБ

ТЬ-6 ПБ ПБ порошок> контроль (р=0,016) порошок> гидрогель (р=0,002) ПБ

Таблица 12.

Динамика изменения экспрессии маркеров от 1 к 5 суткам в рамках одной группы. Указаны статистически значимые различия | роста или | снижения

экспрессии маркера (р=0,05, ш-не значимые отличия). С.Т. - соединительная ткань.

С.Т. Гидрогель Суспензия Порошок Контроль

СБ68 1 ПБ

Б4/80 1 ПБ ПБ 1

СБ80 1 ПБ ПБ 1

ССЯ7 ПБ ПБ ПБ ПБ

СБ163 ПБ ПБ ПБ ПБ

СБ206 ПБ ПБ ПБ ПБ

1Ь-6 ПБ ПБ т ПБ

IFNy ПБ 1 ПБ

Дерма Гидрогель Суспензия Порошок Контроль

СБ68 1 1 1 1

F4/80 ns ns ns

CD80 ns м ns 1

CCR7 ns ns 1 1

CD163 ns ns ns

CD206 ns ns м т

ГЬ-6 ns ns ns

IFNy ns м ns 1

Было вычислено соотношение М1/М2 для всех групп, на всех сроках исследования и для всех маркеров. Так как в работе применялось иммуномечение по двум маркерам для каждой группы, то отношение вычисляли для каждой пары маркеров: CD80/CD163, CD80/CD206; CCR7/CD163, CCR7/CD206. Первичные данные анализа соотношения М1/М2 представлены в Ошибка! Источник ссылки не найден..

Результаты подсчета М1/М2. Группы: гидрогель, суспензия, порошок, контроль.

Образец Соединительная ткань Дерма Соединительная ткань Дерма

1 сутки 1 сутки 5 сутки 5 сутки

СБ80/СБ163

Гидрогель 0,245±0,170 0,0422±0,030 0,0509±0,021 0,0156±0,0120

Суспензия 0,111±0,078 0,036±0,020 0,053±0,041 0,008±0,008

Порошок 0,063±0,036 0,018±0,006 0,047±0,065 0,013±0,017

Контроль 0,189±0,109 0,045±0,011 0,111±0,089 0,021±0,017

СБ80/СБ206

Гидрогель 0,130±0,069 0,174±0,203 0,042±0,013 0,037±0,025

Суспензия 0,125±0,127 0,134±0,156 0,026±0,024 0,018±0,025

Порошок 0,065±0,034 0,094±0,079 0,034±0,058 0,029±0,035

Контроль 4,070±4,007 1,775±2,318 0,038±0,025 0,027±0,010

ССЯ7/СБ163

Гидрогель 0,255±0,144 0,095±0,088 0,346±0,236 0,071±0,052

Суспензия 0,706±0,404 0,115±0,066 0,625±0,228 0,099±0,048

Порошок 0,292±0,150 0,131±0,088 0,363±0,323 0,050±0,021

Контроль 0,417±0,258 0,231±0,155 0,499±0,265 0,079±0,027

ССЯ7/СБ206

Гидрогель 0,162±0,106 0,335±0,264 0,324±0,191 0,201±0,170

Суспензия 0,640±0,446 0,488±0,702 0,311±0,105 0,219±0,255

Порошок 0,303±0,225 0,543±0,393 0,221±0,105 0,142±0,115

Контроль 8,383±8,752 12,020±19,591 0,169±0,057 0,138±0,078

С применением критерия Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни была оценена динамика соотношения М1/М2 маркеров как в рамках одного срока (Опытные группы - Контроль), так и в рамках одной пары сравнения (М1/М2 в одной группе на 1 и 5 сутки). Все достоверно значимые отличия по выявлению динамики во времени в рамках одной группы представлены в Таблица 13.

При сравнении соотношения М1/М2 между группами было выявлено только одно достоверное отличие: в паре маркеров CD80/CD163 на первые сутки после имплантации в соединительной ткани соотношение М1/М2 было меньше в группе «Порошок», чем в группе «Гидрогель». Остальные все множественные сравнения не привели к выявлению отличий между группами.

Таблица 13.

Динамика значения соотношения М1/М2 от 1 к 5 суткам в рамках одной группы. Указаны статистически значимые различия | роста или | снижения экспрессии маркера (р<0,05, щ-не значимые отличия). С.Т. -соединительная ткань.

С.Т. Гидрогель Суспензия Порошок Контроль

СБ80/СБ163 1 ПБ ПБ

СБ80/СБ206 1 ПБ ПБ 1

ССЯ7/СБ163 ПБ ПБ ПБ ПБ

ССЯ7/СБ206 ПБ ПБ ПБ ПБ

Дерма Гидрогель Суспензия Порошок Контроль

СБ80/СБ163 ПБ 1

СБ80/СБ206 1 1 ПБ 1

ССЯ7/СБ163 ПБ ПБ ПБ 1

ССЯ7/СБ206 ПБ ПБ 1 1

Был проведен анализ соотношения М1/М2 с точки зрения преобладания фенотипов. Если значение больше 1, то М1 популяция преобладает, если меньше 1, то преобладает М2 (Рисунок 44). При этом выяснили, что почти во всех парах преобладает М2 фенотип. В парах, где в качестве маркера CD206 на первых сутках в контроле преобладал фенотип М2.

Рисунок 44.

1 сутки 5 сутки

Диаграмма соотношения фенотипов М1 и М2 Мф.

При анализе данных, полученных методом ИГХ, обращались к результатам тканевой реакции. Так, при оценке тканевой реакции, а именно инфильтрации Мф в ответ на имплантацию, отличие от контроля было выявлено у групп «Порошок», «Суспензия» и «Гель» на 5 сутки, а на 1 сутки все группы и опытные и контрольные были примерно на одном уровне значений. В этом опыте в качестве маркера использовали F4/80. Данные из опыта по оценке поляризации подтверждают это, а именно отсутствие каких-либо отличий между группами по маркеру F4/80. Но, на этом же сроке подсчет по маркеру CD68 показал два достоверных отличия опытных групп («Порошок» больше в среднем в 10 раз, а «Суспензия» в 6 раз) относительно контроля (Таблица 11). Именно формы, используемые в этих группах, на первых сутках в опыте по оценке тканевой реакции оказывали легкое раздражающее действие. К тому же было неясно, почему 2 классических пан-макрофагальных маркера демонстрируют разные результаты (Рисунок 45). Предположительно это могло быть связано с корреляцией степени активации или поляризации Мф и экспрессией данных маркеров. Оказалось, что в литературе имеются данные, что CD68 является маркером активированных Мф как резидентных так и рекрутированных [Kim, 2017], а F4/80 экспрессируется на

достаточно высоком уровне только в резидентных клетках [Gordon, 2014; Wu, 2013]. Несмотря на это и CD68 и F4/80 широко применяются как пан-макрофагальные маркеры [Murray, 2011]. Более того, экспрессия F4/80 может меняться под воздействие множества факторов, в том числе ингибироваться под действием IFNy [de Visser, 2005]. Все эти данные говорят о том, что для оценки количества активированных Мф следует использовать маркер CD68, F4/80 использовать для оценки тканевых локальных реакций.

Рисунок 45. Микрофотографии препаратов, меченых пан-макрофагальными маркерами CD68 и F4/80.

Более того, в литературе имеются данные, что CD68 экспрессируется не только на клетках миелоидного происхождения [Gottfried, 2008; Kunz-Schughart, 2003]. Авторы сравнивали экспрессию белка комплекса CD68 и его мРНК в фибробластах и моноцитах/макрофагах с методами ИГХ, ПЦР с обратной транскрипцией и проточной цитометрии. Выяснилось, что фибробласты, выделенные из нормальной кожи, нормальной ткани молочной железы, ткани опухоли молочной железы и воспалительного выпота при остеоартрите, экспрессировали белок CD68 на уровнях, сравнимых с Мф. Это очень важно для экспериментальных и диагностических целей, поскольку антитела против CD68 используются как общепринятые идентификации Мф. Также есть данные об экспрессии CD68 на поверхности CD19+ B лимфоцитов и CD4+ T лимфоцитов,

конечно, на гораздо более низком уровне, чем на макрофагах [Chistiakov, 2017]. Инфильтрация лимфоцитами при введении суспензии и порошка была выше, чем у контрольной группы. Таким образом, возможен также вклад лимфоцитов и фибробластов при подсчете маркера CD68.

Сведения о том, что F4/80 является маркером в основном резидентных Мф, позволяет переформулировать заключение о тканевой реакции на имплантацию очищенного ВКМ. На первые сутки суспензия и порошок в большей степени рекрутировали Мф, нежели чем гидрогель и контроль. А на резидентные Мф на первые сутки никакая группа значительного влияния не оказывала. На пятых сутках порошок в большей степени, чем контроль активировал и рекрутированные и резидентные Мф.

Необходимо также учитывать, что при анализе временной динамики количества пан-макрофагальных маркеров (Таблица 12) было выявлено их снижение от 1 к 5 суткам. Так их количество в дерме во всех группах достоверно уменьшалось к 5 суткам, то есть вся реакция на имплантацию приобретала локальный характер. Это заключение подтверждает и результаты оценки раздражающего действия, при котором на 5 сутки ни одна форма не оказывала такового. При сравнении соединительной ткани на 1 и 5 сутки при имплантации порошка не было выявлено достоверных отличий, то есть порошок поддерживает макрофагальный ответ на стабильном уровне как на ранних, так и на поздних этапах реакции. В группе, где вводили гидрогель и суспензию, к пятым суткам уменьшалось количество Мф по маркерам F4/80 и CD68 соответственно.

Суммарно картина иммуномечения Мф говорит о том, что исследуемые формы ВКМ в форме порошка и суспензии на 1 сутках стимулируют активацию Мф как в соединительной ткани, так и в дерме, а порошок продолжает поддерживать активированный уровень Мф и на 5 сутки.

Среди важных результатов также необходимо отметить, что суспензия - это единственная форма, в которой наблюдалась достоверная разница с контролем по маркеру М1 профиля CCR7.

IFNy является маркером провоспалительного иммунного ответа. Он участвует сразу в нескольких путях активации: он стимулирует дифференцировку Мф в М1 фенотип, затем он секретируется М1 Мф создавая перекрестную активацию с Th1-лимфоцитами и ингибирует Th2 ответ. Такая реакция происходит при нормальном процессе репарации и уровень экспрессии при этом должен снижаться во времени, чтобы весь процесс переключился на Th2 путь. Единственная группа, которая продемонстрировала достоверное снижение выработки IFNy во времени это суспензия (Рисунок 46, Таблица 12). Это может означать, либо что в данной группе на первых сутках экспрессия была завышена, либо на 5 сутках занижена, по сравнению с другими образцами, либо, третий вариант, во всех группах идет снижение экспрессии, но только в группе суспензии это снижение значимое. Так как уровень экспрессии IFNy в группе суспензии не отличался от других групп на 1 и 5 сутках, то возможным остается только третий вариант. Обращаясь к первичным данным (Таблица 10) видно, что экспрессия снижается почти в 10 раз. При оценке реакции окружающих тканей, то есть дермы, выявлено, что уровень снижается от 1 к 5 суткам в контроле. Но при оценке экспрессии маркеров видно, что даже это сниженное значение больше, чем в группе суспензии. Следовательно, можно заключить, что суспензия вызывает локальное снижение выработки IFN у на поздних сроках воспалительного этапа заживления ран. Эти данные соотносятся с данными литературы, где было показано, что Мф, высаженные на поверхность, покрытую фибриллами диаметром около 2 мкм снижают выработку IFNy [McWhorter, 2015].

IL-6 - многопрофильный маркер. С одной стороны, он является одним из ключевых цитокинов иммунного пути 1 типа [Diehl, 2002; Tidball, 2010], а с другой стороны он экспрессируется и М2Ь Мф. Также известно, что IL-6 обладает хемоаттрактантными свойствами и привлекает моноциты и Мф в область раны. Показано, что блокировка IL-6 в рамках процесса репарации приводит к тому, что весь процесс в целом не запускается [Brown, Ratner, 2012]. Следовательно, его экспрессия необходима для инициации определенного уровня воспаления. Таким образом значение экспрессии данного маркера должно коррелировать с F4/80 и

CD68 (маркером активированных Мф). Но результаты проведенного эксперимента выявляют только рост экспрессии 1Ь6 к 5 суткам в группе порошка относительно контроля и гидрогеля. При этом результаты оценки тканевой реакции говорят о том, что к 5 суткам в этой группе наоборот снижается раздражающее действие в целом. А оценка динамики маркеров во времени показывает уменьшение суммарного количества Мф к 5 суткам (Таблица 12). Можно предположить, что тот 1Ь-6, который увеличивает количество этого маркера к 5 суткам, экспрессируется М2 Мф. В пользу этого предположения говорит общий характер поляризации Мф: фенотип М2 преобладает на всех этапах эксперимента во всех опытных группах. Увеличение экспрессии относительно контрольной группы было выявлено у суспензии на 5 сутки в соединительной ткани (Таблица 14). Делать заключение на основании экспрессии данного маркера не предоставляется возможным, ввиду неоднозначности полученных результатов. Для верной интерпретации уровня экспрессии 1Ь-6 необходимо провести дополнительное исследование по маркеру 1Ь-10, который является однозначным цитокином М2 Мф, а также ГЬ-4, который является цитокином, обуславливающим взаимодействие ^2 лимфоцитов и М2 Мф.

Рисунок 46. Микрофотографии препаратов группы «суспензия»,

меченых маркером ШКу.

При оценке реакции тканей на введение контрольного раствора, видно, что весь процесс постоянно меняется: преобладание М1 фенотипа сменяется М2

фенотипом, уменьшается экспрессия CCR7 и CD80, увеличивается CD206. Все это необходимо для переключения процесса на противовоспалительный тип. В то время как в опытных образцах групп порошок, суспензия и гидрогель весь процесс проходит в противовоспалительной «зоне»: всегда значительно преобладает фенотип М2.

В опыте по заживлению ран данными формами было выяснено, что все формы обладают тем или иным потенциалом к заживлению. Гидрогель стимулировал эпителизацию, но не стимулировал образование грануляционной ткани. При оценке тканевой реакции гидрогель не вызывал раздражающего действия. А в данном опыте показано, что он на низком количественном уровне стимулирует макрофагальную реакцию, достоверно снижая ее к 5 суткам, но при этом всегда преобладает противовоспалительный фенотип. Гидрогель -единственная форма при которой происходило значимое снижение количества Мф, меченых по CD80 к 5 суткам. Также гидрогель - это единственная форма, при которой соотношение M1/M2 Мф достоверно снижалось к 5 суткам, причем этот результат был получен по двум парам маркеров в каждой из которых М1 фенотип определяли маркер CD80. Для выявления более однозначных особенностей гидрогелевой формы было проведено ее парное сравнение с контрольной группой (раздел 3.5.3.).

Суспензия при заживлении ран показала особые результаты в формировании грануляционной ткани. По среднему значению интенсивности макрофагального ответа суспензия располагается между гидрогелем и порошком. Причем, от порошка она отличается меньшим уровнем экспрессии IFNy. Еще одним показателем, который был выявлен только у суспензии - это достоверное увеличение экспрессии CCR7, по сравнению с контролем. Суспензия-единственная форма продемонстрировавшая достоверное снижение числа активированных Мф к 5 суткам. При введении суспензии наблюдается интересный баланс: с одной стороны, данная форма ингибирует выработку IFNy, чтобы ничего не препятствовало переходу к пролиферативной фазе репарации, а с другой стороны стимулирует поляризацию Мф в М1 фенотип. Таким образом

восполняется необходимое, по-видимому достаточное, соотношение фенотипов М1 и М2, чтобы процесс репарации сопровождался и воспалением тоже.

При заживлении ран порошок продемонстрировал стимуляцию эпителизации на 7 сутках эпителизации и формирование более зрелой грануляционной ткани. В целом результаты можно отнести к промежуточным, между группами суспензии и гидрогеля. В опыте по оценке поляризации Мф группа порошка показала самое низкое соотношение М1 к М2 на первых сутках имплантации. На протяжении всего эксперимента в группе порошка выявлялась самая сильная активация Мф. Порошок - единственная форма, вызывающая экспрессию 1Ь-6 и с достоверным отличием. Следует обратить внимание, что суспензия тоже вызывала сильную активацию Мф, однако она наоборот подавляла экспрессию Ш^. Возможно в этом и заключается отличие, за счет которого порошок не обладает таким же регенераторным потенциалом, как суспензия. Известно, что тормозит активацию ТМ--лимфоцитов, которые в свою очередь активируют М2 фенотип Мф, а, следовательно, и привлечение фибробластов и переход к пролиферативной фазе репарации.

3.5.2. Исследование форм ВКМ: суспензия, контроль

Суспензия представляет собой абсолютно новую форму очищенного ВКМ. На методику получения данной формы волокнистого матрикса соискателем был получен патент на изобретение. В связи с этим, исследование ответа Мф на введение данной формы представляло особый интерес. Некоторые особенности реакции со стороны Мф уже были выявлены при сравнении с порошком и гидрогелем при групповом непараметрическом анализе. Для возможного выявления дополнительных свойств провели сравнение данной группы с контрольной при парном анализе. Результаты анализа данных приведены в Таблица 10. Суммарные данные по всем статистически значимым отличиям представлены в Таблица 14.

На первых и пятых сутках отмечается статистически значимое различие в количестве Мф в зоне имплантации в исследуемых группах. На обоих сроках в области введения суспензии обнаруживалось в среднем почти в шесть раз больше Мф, чем в контрольной группе. Количество М1 Мф в зоне введения материала достоверно выше, чем в контроле.

Таблица 14.

Суммарные данные сравнения количества экспрессируемых маркеров в группах суспензия и контроль (р<0,05, ш-не значимые отличия).

Соединительная ткань 1 сутки Соединительная ткань 5 сутки Дерма 1 сутки Дерма 5 сутки

СБ68 суспензия> контроль суспензия > контроль ИБ ИБ

Е4/80 ИБ ИБ ИБ ИБ

СБ80 ИБ ИБ ИБ ИБ

ССЯ7 ИБ суспензия> контроль ИБ ИБ

СБ163 ИБ ИБ ИБ ИБ

СБ206 ИБ ИБ ИБ ИБ

№N7 ИБ ИБ суспензия <контроль ИБ

ТЬ-6 ИБ суспензия> контроль ИБ ИБ

Было также вычислено соотношение М1/М2 для опытной и контрольной группы, на всех сроках исследования и для всех маркеров. С применением критерия Манна-Уитни была оценена динамика соотношения М1 к М2 маркерам как в рамках одного срока (Опытная группа- Контроль), так и в рамках одной пары сравнения (М1/М2 в одной группе на 1 и 5 сутки). Достоверно значимых отличий соотношения М1/М2 между группами на всех сроках выявлено 2:

- на 1 сутках имплантации соотношение М1/М2 в группе суспензии меньше, чем в контроле по паре CCR7/CD206 в дерме

-на пятых сутках соотношение М1/М2 было больше в суспензии, чем в контроле также по паре CCR7/CD206 в соединительной ткани.

Таким образом при парном сравнении не было выявлено новых данных о свойствах суспензии, которые бы отличались от данных при групповом анализе.

Так как критерий анализа групп менее чувствительный, то можно утверждать, что эффект вызываемый суспензией значителен.

3.5.3. Исследование форм ВКМ: гидрогель, контроль

Оценивая в целом группу гидрогеля в рамках группы сравнения четырех форм, можно отметить что динамика всей реакции экспрессии маркеров в месте имплантации схожа с контролем (Таблица 12). Для более детального рассмотрения влияния пептидной формы очищенного ВКМ на активацию Мф было принято решение сравнить эти две группы парно, с применением критерия Манна-Уитни. Результаты анализа данных приведены в Таблица 10. Суммарные данные по всем статистически значимым отличиям представлены в Таблица 15.

На первых и пятых сутках отмечается статистически значимое различие в количестве рекрутированных Мф в зоне имплантации в исследуемых группах. Можно сделать вывод, что на обоих сроках в области введения гидрогеля обнаруживалось в среднем почти в два раза больше Мф, чем в контрольной группе.

Таблица 15.

Суммарные данные сравнения количества экспрессируемых маркеров в группах гидрогель и контроль (р<0,05, ш-не значимые отличия).

Соединительная ткань 1 сутки Соединительная ткань 5 сутки Дерма 1 сутки Дерма 5 сутки

СБ68 Гидрогель> контроль Гидрогель> контроль ИБ ИБ

Е4/80 ИБ ИБ ИБ Гидрогель <контроль

СБ80 ИБ ИБ ИБ ИБ

ССЯ7 ИБ ИБ Гидрогель> контроль ИБ

СБ163 ИБ ИБ ИБ ИБ

СБ206 ИБ ИБ ИБ ИБ

№N7 ИБ ИБ ИБ ИБ

ТЬ-6 ИБ ИБ ИБ ИБ

Было также вычислено соотношение М1/М2 для опытной и контрольной группы, на всех сроках исследования и для всех маркеров. Достоверно значимых

отличий соотношения М1/М2 между группами на всех сроках выявлено не было. При сравнении соотношения М1/М2 во времени был выявлен ряд достоверных отличий, все из которых указаны в Таблица 12.

При сравнении гидрогеля и контроля видно, что характер всей реакции в целом схож в двух группах: общее уменьшение числа маркеров к 5 суткам, снижение соотношение фенотипов Мф с постепенным увеличение М2 фенотипа. Но все же можно отметить увеличение числа рекрутируемых Мф в область имплантации на первых сутках. Причем при оценке соотношения М1 и М2 Мф становится ясно, что состав активированных Мф сильно отличается. Так при введении геля на всех сроках преобладал М2 фенотип, а в контрольной группе на первых сутках преобладал М1 фенотип. Гидрогель - это единственная форма в которой происходило значимое снижение количества Мф, меченых по CD80 к 5 суткам. Таким образом можно сделать вывод, что очищенный ВКМ в форме гидрогеля вызывает поляризацию Мф со значимым подавлением в популяции М1 фенотипа на всех сроках имплантации. Скорее всего такое сильное подавление активности М1 Мф приводит к недостаточной выраженности воспалительного этапа репарации. Данные тканевой реакции подтверждают это- гидрогель единственная форма, которая не вызывала раздражающего действия.

3.5.4. Исследование форм ВКМ: мембрана, контроль

Провели сравнение макрофагального ответа при имплантации очищенного ВКМ в форме мембраны с ложно оперированными случаями. Результаты анализа данных приведены в Таблица 16. Суммарные данные по всем статистически значимым отличиям представлены в Таблица 17.

Таблица 16.

Анализ маркеров макрофагов и Т^лимфоцитов в группах мембрана и контроль.

Указанные значения соответствуют количеству клеток на 10 полей зрения. _Достоверное отличие от контроля: * - р<0,05._

Образец Соединительная ткань Дерма Соединительная ткань Дерма

1 сутки 1 сутки 5 сутки 5 сутки

СБ68

Мембрана 8,8±5,3* 2,0±1,1 88,7±44,6 4,2±3,9

Контроль 55,2±33,5 5,0±4,2 78,8±39,2 4,0±2,5

Е4/80

Мембрана 1,7±1,2* 1,0±1,3 60,1±16,3 3,3±5,6

Контроль 8,5±8,3 0,3±0,8 86,2±43,8 3,3±1,9

СБ80

Мембрана 0,8±0,9 2,0±2.3 1,2±1,2* 3,0±1,4

Контроль 4,8±4,4 2,2±1.4 10,7±3,2 3,0±2,1

ССЯ7

Мембрана 7,2±8,7 2,3±2,7 23,2±21,2 4,5±3,0

Контроль 18,8±12,6 2,7±2,8 10,8±12,4 3,0±2,5

СБ206

Мембрана 7,3±5,8* 5,2±3,4 41,5±27,0 11,7±7,0

Контроль 26,2±15,5 5,8±3,2 41,5±18,8 11,0±8,7

СБ163

Мембрана 32,3±27,6 57,0±32,6 103,3±53,4* 41,7±36,5

Контроль 30,7±16,1 50,2±33,0 27,8±23,1 14,0±9,8

№N7

Мембрана 0,0±0,0 2,0±2,3 6,2±3,9 2,0±1,1

Контроль 0,0±0,0 1,3±0,5 2,8±4,6 1,3±1,0

Таблица 17.

Динамика изменения экспрессии маркеров от 1 к 5 суткам в рамках одной группы.

Указаны статистически значимые различия | роста или | снижения экспрессии __маркера (р<0,05, щ-не значимые)._

Соединительная ткань Дерма

Мембрана Контроль Мембрана Контроль

СБ68 1 ИБ

Е4/80 1 т ИБ т

СБ80 ИБ т ИБ ИБ

ССЯ7 ИБ ИБ ИБ ИБ

СБ163 т ИБ ИБ ИБ

СБ206 т ИБ ИБ ИБ

1Ь-6 ИБ ИБ ИБ

№N7 1 т ИБ ИБ

Было также вычислено соотношение М1/М2 для опытной и контрольной группы, на всех сроках исследования и для всех маркеров (Таблица 18).

Таблица 18.

Результаты подсчета М1/М2. Группы: мембрана, контроль (* - р<0,05 _относительно контроля)._

Группа/ маркеры Соединительная ткань Дерма Соединительная ткань Дерма

1 сутки 1 сутки 5 сутки 5 сутки

СБ80/СБ163

Мембрана 0,049±0,077 0,049±0,057 0,017±0,017* 0,613±0,158

Контроль 0,150±0,182 0,032±0,035 0,522±0,555 0,186±0,233

СБ80/СБ206

Мембрана 0,296±0,431 1,277±2,342 0,063±0,090* 0,358±0,324

Контроль 0,135±0,129 0,994±1,969 0,312±0,173 0,715±0,686

ССЯ7/СБ163

Мембрана 0,510±0,544 0,077±0,094 0,231±0,112 0,422±0,644

Контроль 1,080±1,272 0,205±0,390 0,423±0,427 0,220±0,212

ССЯ7/СБ206

Мембрана 0,978±0,811 0,490±0,4307 0,951±0,860 0,676±0,840

Контроль 1,000±1,167 0,739±0,838 0,214±0,195 0,437±0,391

Был проведен анализ соотношения М1/М2. Если значение больше 1, то М1 популяция преобладает, если меньше 1, то преобладает М2 (Рисунок 47). Было выявлено преобладание М1 фенотипа на 1 сутки в дерме по паре маркеров CD80/CD206 в опытной и контрольной группах. На 1 сутки в соединительной ткани преобладание М1 в контроле в парах, где в качестве маркера М1 брали CCR7, а также в опытной группе в паре CCR7/CD206. На 5 сутках преобладание М1 фенотипа не выявляли. Как видно из полученных данных (Таблица 16, Таблица 17), на первые сутки в зоне имплантации мембраны подавлена активация Мф. Оба маркера и CD68 и Б4/80 выявляются в опытной группе в несколько раз в меньшем количестве, чем в контроле. На пятых сутках по данным маркерам нет отличий от контроля. Но сравнивая количество Мф на 1 и 5 сутках, видно, что оно достоверно снижается. Это может говорить только о подавлении общей макрофагальной активации.

Рисунок 47.

1 сутки 5 сутки

Диаграмма соотношения фенотипов М1 и М2 Мф.

Мембрана оказалась единственной исследуемой в работе формой очищенного ВКМ, которая достоверно усиливала поляризацию Мф в М2 фенотип к пятым суткам. Но в то же время, по результатам оценки соотношения М1 к М2 мембрана оказалась единственной формой очищенного ВКМ, у которой наблюдается преобладание М1 фенотипа на каком-либо сроке, а именно на первом. То есть характер ответа на введение мембраны можно назвать смешанным: от провоспалительного к противовоспалительному. В целом, характер ответа Мф на введение мембраны можно назвать сложным. С одной стороны динамика процесса соблюдена: наблюдается переход от М1 к М2 полюсу. С другой стороны, ответ явно подавлен. При этом мембрана оказывала легкое раздражающее действие и стимулировала эпителизацию на 14 сутки процесса ранозаживления.