Влияние спектрального состава освещения на изотопный обмен углерода, оптические и электрические свойства в системе атмосфера-растение-почва тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Кулешова Татьяна Эдуардовна

• Кулешова Татьяна Эдуардовна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Кулешова Татьяна Эдуардовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1. Основные принципы технологии мониторинга состояния растений

1.2. Агроэкосистемы и условия выращивания растений

1.3. Кинетические измерения фотосинтеза и влияние световой среды

1.4 Оптические свойства растений и спектрофотометрические методы их исследований

1.5. Роль углекислого газа и изотопных отношений углерода в жизнедеятельности растений

1.6. Генерация биоэлектрических потенциалов. Растительно-микробные топливные

элементы

Выводы по главе 1. Обоснование направления исследования

ГЛАВА 2. Спектры поглощение светочувствительных пигментов in vitro и листьев растений

in vivo в зависимости от спектрального состава освещения

2.1. Параметры выращивания растений: выбор световой среды

2.1.1 Лабораторный фитотрон

2.1.2 Создание спектров освещения с физиологически значимыми характеристиками

2.2 Спектрофотометрический анализ поглощения светочувствительных пигментов в

зависимости от спектральных характеристик освещения

2.2.1 Методика регистрации спектров поглощения пигментов растений

2.2.2 Спектры поглощения светочувствительных пигментов в зависимости от суточной

доли ФАР

2.2.3 Поглощение светочувствительных пигментов в зависимости от спектров освещения

2.3 Спектрометрический анализ поглощения листьев in vivo

2.3.1 Экспериментальная установка

2.3.2 Карта поглощения листовой поверхности

2.3.3 Влияние спектральных особенностей световой среды на поглощение света листьями

салата и его нетто-продуктивность

2.3.3.1 Условия выращивания и вариации световой среды

2.3.3.2 Влияние спектра освещения на продуктивность и биохимический состав

2.3.3.3 Влияние спектральных характеристик освещения на поглощение листовой

поверхности

2.4 Модель поглощения квантов различной энергии растениями

Выводы по главе

ГЛАВА 3. Фракционирование изотопов углерода из окружающей среды в углеродный пул

растений в условиях вариации спектральных характеристик световой среды

3

3.1 Масс-спектрометрический анализ изотопного состава углерода

3.2 Методика и аппаратный комплекс пробоподготовки для изотопного анализа углерода,

участвующего в жизнедеятельности растений

3.2.1 Установка для обогащения углекислого газа и определения изотопного отношения

углерода в атмосфере

3.2.2 Методика для определения изотопного отношение углерода глюкозы в тканях

растений

3.2.3 Каталитическая ячейка для определения изотопного отношения углеродного пула

растений

3.3 Фракционирование изотопов из атмосферы в углеродный пул листьев растений в

зависимости от световой среды

3.4 Скорость ассимиляции изотопов углерода 12С и 13С из углекислого газа атмосферы в

углеродный пул

Выводы по главе

ГЛАВА 4. Биоэлектрические потенциалы, генерируемые в системе корнеобитаемая среда –

растение

4.1 Измерение биоэлектрических потенциалов

4.1.1 Инвазивное измерение биоэлектрических потенциалов растений

4.1.2 Создание неинвазивной автоматической системы регистрации

4.1.3 Биосовместимость электродных систем

4.2 Биоэлектрические потенциалы растений в условиях различного водного режима,

глубины грунта и освещения

4.2.1 Влияние водного режима на величину биоэлектрического потенциала

4.2.2 Градиент биоэлектрических потенциалов в зависимости от глубины почвы

4.2.3 Вариации электрофитограмм в зависимости от спектральных характеристик

освещения

4.3 Модель изменения динамики биоэлектрического потенциала в системе почва-растение,

зависящей от водного режима

4.4 Растительно-микробный топливный элемент

4.5 Эффективность конверсии света в электрическую энергии в ризосферной зоне

Выводы по главе

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

4

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние спектрального состава освещения на изотопный обмен углерода, оптические и электрические свойства в системе атмосфера-растение-почва»

Актуальность темы.

Комплексом взаимосвязанных процессов, определяющим развитие растений и

протекание фотосинтеза, является поглощение света фотосинтетическим аппаратом

растения, ассимиляция углекислого газа из атмосферы, и усвоение питательных веществ и

воды из корнеобитаемой среды.

Основным физическим фактором, обеспечивающим жизнедеятельность растений,

является световая среда. В условиях интенсивной светокультуры решающую роль играют

спектральный состав и интенсивность фотосинтетически активной радиации (ФАР),

определяющие фотосинтез, состояние пигментного аппарата, фотоморфогенез, рост и

развитие, направленность биосинтеза, накопление биомассы и продуктивность растений в

контролируемых условиях среды.

Понимание зависимости протекания физико-химических процессов в растении от

спектральных характеристик освещения в настоящее время ограничено несогласованностью

изучаемых параметров и используемых спектральных комбинаций. Углубленное изучение

отдельных составляющих процесса усвоения света и связанных с этим реакций в

растительном организме при его взаимодействии с окружающей средой – атмосферой и

почвой, позволит расширить представления о влиянии фотосинтетически активного

диапазона излучения и спектрального режима облучения. Исследование механизма действия

света с определенными спектральными характеристиками ФАР на физико-химические

процессы внутри растения, а также на взаимодействие растения с атмосферным воздухом и

корнеобитаемой средой, является актуальной задачей как для развития фундаментальных

знаний, так и для практического применения – разработки энергоэффективных

искусственных источников света, обеспечивающих максимум продуктивности растительных

культур в условиях закрытого грунта. Основным путем повышения урожайности,

продукционного процесса, улучшения качества растительных культур являются

физиологически обоснованные принципы оценки спектральной эффективности действия

ФАР.

Для исследования механизма действия световой среды можно выделить три основных

направления исследований, позволяющих охарактеризовать кинетику процессов, наиболее

значимых для осуществления фотосинтеза и развития растения:

1. Изучение процессов поглощения света фотосинтетическими пигментами в листьях

растений. В связи с тем, что пигменты функционируют в живом листе в жидкой среде и

могут образовывать соединения с другими клеточными структурами, проведения измерений

 5

на экстрагированных пигментах in vitro в растворах для понимания процессов поглощения

света растениями является недостаточным. Измерение оптических характеристик листа

растения in vivo в процессе его роста и развития дает существенно более полную и

правильную информацию о потребностях растений в энергии в области ФАР и скорости

усвоения светового потока.

2. Исследование взаимодействия растения с атмосферой – ассимиляции углекислого

газа и синтеза органических соединений в процессе роста и развития растения. Превращения

углерода, захваченного из воздушной среды, в ходе биохимических реакций в органическое

вещество тканей растительного организма сопровождается значительным

фракционированием легкого изотопа углерода 12

С. При этом изотопные отношения 13

С/12С

углекислого газа внешней среды и синтезируемых растением углеводов будут существенно

различаться в зависимости от внешних условий, и их измерение в динамике роста растения

даст объективную информацию о скорости протекания фотохимических реакций.

3. Исследование взаимодействия растения с почвой путем измерения биоэлектрических

потенциалов (БЭП) его корневой системы, отражающих характер протекания в реальном

времени метаболических процессов, коррелирующих со световым режимом и связанных с

водным режимом, транспортом ионов и минеральных веществ в корнеобитаемой среде.

Изменение биопотенциалов растений с течением времени, представленное в виде графиков –

«электрофитограмм» является объективным показателем состояний растительных

организмов, и могут использоваться как параметр для выбора путей стимуляции их развития.

Кроме того, генерируемые при этом биотоки могут быть основой для создания технологии

получения электроэнергии с помощью комбинации высших растений и микробной среды

почвы – растительно-микробных топливных элементов (РМТЭ). Электроэнергия при этом

производится за счет переработки микробами органических веществ, выделяемых в

ризосфере, и создания корневой системой растений градиента потенциала, связанного с

транспортом ионов и минеральных веществ.

Таким образом, исследование влияния спектрального состава освещения на фотосинтез

листьев растений, изотопный состав углерода при фотосинтезе в системе растение –

атмосфера и контроль оптимальных условий в системе растение – почва является крайне

актуальной задачей. Для ее решения необходимо проведение исследований в развивающемся

(интактном) растении без его повреждения и в любой момент времени для изучения

скорости световой конверсии – преобразования растениями энергии света и усвоенного

углерода в процессе фотосинтеза в биоэлектричество, генерируемое за счет комплекса

процессов в ризосферной зоне, для чего необходимо создание новых методов

фитомониторинга и устройств для их осуществления.

 6

Цель работы.

Исследование влияния спектрального состава освещения на свойства растений, в

наибольшей степени характеризующие кинетику процессов, значимых для осуществления

фотосинтеза и развития растения, а именно оптические характеристики листьев растения,

скорость ассимиляции изотопов углерода 12

С и С из углекислого газа атмосферы в

13

углеродный пул и конверсии фотосинтетически активной радиации в электрический ток в

ризосферной зоне, и оценка их роли в механизме развития растения.

Задачи, решаемые при выполнении работы:

1. Выбор и обоснование диапазона изменений комплекса варьируемых параметров

световой среды – спектральных характеристик, интенсивности и суточной экспозиции и их

реализации в виде климатической камеры для выращивания растений.

2. Определение изменения оптических свойств листьев растений в выбранном

диапазоне спектрального состава освещения в процессе их развития, включая как

спектрофотометрические измерения спектров поглощения светочувствительных пигментов

in vitro, так и создание метода и установки для проведения анализа светопоглощательной

способности листьев in vivo.

3. Получение данных об изотопном отношении 13

С/12С одновременно как в

атмосферном углекислом газе около растения, так и в тканях растения в ходе его

жизнедеятельности в условиях различного спектра освещения и разработка метода сбора и

подготовки пробы для проведения соответствующего масс-спектрометрического анализа.

4. Получения данных о биоэлектрических потенциалах (БЭП) в системе почва-растение

в условиях нормального функционирования растения без травматического стресса,

отражающих характер протекания метаболических процессов в реальном времени и

коррелирующих со световым и водным режимами. Разработка метода и реализующего его

устройства, позволяющего проводить неинвазивные измерения, создание электродных

систем, биосовместимых с корневой системой растения, пригодных для длительного

проведения высокоточных измерений и автоматизации регистрации биопотенциалов в виде

электрофитограмм.

Методы исследования.

В качестве методов исследования использовались: оптическая спектроскопия,

изотопная и химическая масс-спектрометрия и электрические измерения биопотенциалов и

токов в электродах.

 7

Объекты исследования.

В работе исследовались как модельные растения – хлорофитум хохлатый, так и

сельскохозяйственно значимые культуры – салаты сорта Азарт, Тайфун, овес посевной,

ячмень яровой сорта Ленинградский.

Научная новизна работы.

1. На основе измеренных спектров поглощения листьев in vivo и светочувствительных

пигментов in vitro в видимом диапазоне частот в зависимости от спектральных

характеристик освещения и интенсивностей фотосинтетического потока в интервале от 40

μмоль·м-2·с-1 до 350 μмоль·м-2·с-1, как в узких диапазонах частот (красный, зеленый, синий),

так и для их комбинаций и сложных спектров освещения, включающих физиологически

значимые для растений длины волны, определены скорости усвоения ФАР и потребности

растений в отношении поглощения квантов различной энергии. Показано, что спектр

освещения, приводящий к высокой продуктивности салата (5990 г/м2), с плотностью

фотосинтетического потока фотонов ~25 μмоль·м-2·с-1 в диапазоне 400-500нм, ~150 μмоль·м-

2

·с-1 в 500-600 нм, ~150 μмоль·м-2·с-1 в 600-700 нм приводит к поглощению ~140 μмоль·м-2·с-1

на грамм листовой поверхности в течение 10 дней.

2. Впервые методом сравнения изотопных отношений 13

C/12C между углекислым газом

воздуха около растений и в углеродным пуле растений установлено различие в усвоении

изотопа углерода 13

С из воздуха атмосферы в зависимости от различных спектральных

составов освещения. При освещении с преобладанием красной составляющей они

составляют ~15‰, а синей ~9‰. Найденная зависимость является важной составляющей

механизма ассимиляции углекислого газа и его преобразования в органическое вещество в

ходе фотосинтеза, что позволяет интерпретировать различия в изотопных отношениях как

меру усвоения растением фотосинтетического потока, скорости усвоения CO2 и синтеза

биомассы.

3. В процессе длительных измерений по созданной методике динамики биоэлектрических

потенциалов в системе почва-растение в условиях различных водного и светового режимов

показано, что при переходе из темнового в световой режим возникают воспроизводимые

циклические изменения БЭП порядка 20 мВ и в ответ на полив – скачкообразные изменения

БЭП порядка 100-200 мВ в зависимости от степени вододефицита, изменяющиеся по

величине по градиенту глубины почвы. Предложена модель, описывающая взаимосвязь

вариации биопотенциалов и тока воды и минеральных веществ из почвы в корень.

4. Разработаны экспериментальные методики и реализующие их устройства для измерений

спектров поглощения листьев растений in vivo; для сбора и подготовки пробы для

 8

изотопного масс-спектрометрического анализа и для обеспечения неинвазивного контакта

корней растений с электродной системой для измерения биоэлектрических потенциалов.

Практическая значимость работы.

Разработан комплекс методик и реализующих их устройств для исследования механизма

действия света на физико-химические процессы внутри растения, на взаимодействие

растения с атмосферным воздухом и корнеобитаемой средой. Создана климатическая камера

– компактный фитотрон, специализированный для лабораторного использования и

проведения исследований влияния световой среды – спектра, интенсивности, длительности

освещения на жизнедеятельность растений. Разработана и изготовлена установка для

измерения спектров поглощения листьев растений in vivo, адаптированная к измерениям

свойств листьев, неоднородных по длине и ширине, без причинения вреда растению и

позволяющая осуществлять многодневный мониторинг изменения поглощения в

зависимости от периода развития и параметров внешней среды. На основе полученных

характеристик светопоглощательной способности растений предложен спектр освещения,

который может быть основой для создания энергоэффективных источников света с учетом

реальных данных о состоянии и физиологических показателях растений. Разработана и

оттестирована система сбора и подготовки пробы, позволяющая осуществлять масс-

спектрометрический анализ изотопного состава углерода в тканях растений и окружающей

их воздушной среде в реальном времени в ходе развития растения. Разработана

эквивалентная схема измерений БЭП с учетом электрических свойств растений и установка

для автоматизированного получения электрофитограмм на основе предложенного метода

обеспечения неинвазивного контакта корней растений с электродной системой за счет их

прорастания. Создан прототип растительно-микробного топливного элемента на основе

сельскохозяйственно значимой культуры – салата.

Положения, выносимые на защиту:

1. При освещении желто-оранжевым светом с превалированием красной составляющей и

добавлением ~10-20% от общей ФАР в ближнем ИК (700-1000 нм) при выращивании

растений на 1N питательном растворе Кнопа приращение интегрального поглощения на

прирост биомассы составило ~140 μмоль·м-2·с-1 на грамм листовой поверхности в течение 10

дней и было наиболее эффективным из всех использованных спектров освещения.

2. Разность между изотопным составом углекислого газа в воздухе около растений и в тканях

растений в зависимости от спектра освещения изменяется в 2-3 раза, причем скорость

 9

обогащения тканей растений легким изотопом углерода из атмосферного воздуха возрастает

при увеличении красной составляющей в спектре.

3. В условиях достаточной влажности почвы биоэлектрический потенциал в среднем

постоянен и флуктуирует стохастически в интервале от 245 мВ до 275 мВ, значение

биопотенциала падает почти в два раза при уменьшении влажности до критической и

восстанавливается после полива с задержкой в интервале 3-3000 с, увеличивающейся с

ростом вододефицитного периода.

4. Биоэлектрический потенциал в системе почва-растение циклически изменяется с

изменением светового режима: равномерно увеличивается на ~10% при включении света и в

середине светового цикла равномерно падает до прежнего уровня ~240 мВ,

соответствующего темновой стадии.

Достоверность результатов работы обеспечивается использованием современного

научного оборудования, высокопрецизионными изотопными измерениями с точностью не

хуже 0,1 %, измерениями оптических спектров с разрешением не хуже 2 нм, проведением

экспериментов с достаточной воспроизводимостью; статистической обработкой полученных

данных с заданной вероятностью и необходимым количеством повторных испытаний;

сопоставлением результатов, полученных разными методами, а также сравнением с

аналогичными результатами, полученными другими авторами.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 6 статей

в рецензируемых журналах. Основные положения и результаты диссертационной работы

представлялись и докладывались на следующих научных и научно-практических

конференциях: Международной зимней школе по физике полупроводников «Свет,

полупроводники и технологии» (Зеленогорск, 2015), IV Всероссийском конгрессе молодых

ученых (СПб: ИТМО, 2015), Первой российской конференции «Физика – наукам о жизни»

(СПб.: ФТИ, 2016), VII Всероссийской конференции с международным участием «Масс-

спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2017), Второй российской конференции

с международным участием «Физика – наукам о жизни» (СПб.: ФТИ, 2017), VIII

Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и

медицине» (СПб, 2018), Международной конференции ФизикА (СПб: ФТИ, 2018), VI Съезде

биофизиков России (Сочи, 2019), II Международной научной конференции «Тенденции

развития агрофизики: от актуальных проблем земледелия и растениеводства к технологиям

будущего», посвященной памяти академика Е.И. Ермакова (СПб: АФИ, 2019).

 10

Работа также докладывалась на семинарах лаборатории Физики адсорбционно-

десорбционных процессов, Санкт-Петербург, «Фракционирование изотопов 13

С/12С и

вариации светопоглощения пигментов растений в ходе фотосинтетических реакций под

действием света различного спектрального состава» 20 июня 2017 г., «Разработка устройства

для концентрирования углекислого газа вымораживанием для измерения изотопных

отношений углерода в процессе фотосинтеза и фотодыхания растений» 12 декабря 2017 г,

«Спектрометрический метод измерения поглощения света листьями растений» 14 июня

2018 г., «Неинвазивное измерение биоэлектрических потенциалов растений» 04 декабря

2018 г.

Работа выполнялась при финансовой государственной поддержке молодых российских

ученых (стипендия Президента Российской Федерации для молодых ученых и аспирантов,

осуществляющих перспективные научные исследования и разработки по приоритетным

направлениям модернизации российской экономики) и поддержке правительства Санкт-

Петербурга и комитета по науке и высшей школе (грант для студентов и аспирантов ВУЗ,

расположенных на территории Санкт-Петербурга).

Публикации по теме диссертации

Статьи в рецензируемых российских и зарубежных журналах

1. Березкина Т.Э., Блашенков М.Н., Кулешов Д.О. Активность растений в зависимости от

особенностей спектра освещения // Сборник трудов IV Всероссийского конгресса молодых

ученых – СПб: Университет ИТМО. 2015. C. 62-66.

2. Березкина (Кулешова) Т.Э., Блашенков М.Н., Кулешов Д.О., Галль Н.Р.

Экспериментальный лабораторный фитотрон с программируемым светодиодным

источником для изучения влияния длительности светового дня и спектра излучения на

растения. // Приборы и техника эксперимента. 2016. № 6. С. 129-130.

3. Кулешова Т.Э., Блашенков М.Н., Кулешов Д.О., Галль Н.Р. Разработка лабораторного

фитотрона с возможностью варьирования спектра излучения и длительности суточной

экспозиции и его биологическое тестирование. // Научное приборостроение. 2016. Т. 26. № 3.

С. 35-43.

4. Кулешова Т.Э., Лихачев А.И., Павлова Е.С., Кулешов Д.О., Нащекин А.В., Галль Н.Р.

Взаимосвязь спектров поглощения пигментов растений и светодиодного освещения с

различным спектральным составом // ЖТФ, 2018. Т. 88. № 9. C. 1285-1286.

5. Kuleshova T.E., Seredin I.S., Cheglov S.A., Blashenkov M.N., Chumachenko A.V., Feofanov

S.V., Kiradiev V.K., Odnoblyudov M.A. Spectrometric method for measuring light absorption by

plant leaves // J. Phys.: Conf. Ser. 2018. V. 1135. 012013. doi:10.1088/1742-6596/1135/1/012013.

 11

6. Кулешова Т.Э., Бушлякова А.В., Галль Н.Р. Неинвазивное измерение биоэлектрических

потенциалов растений // Письма в ЖТФ. 2019. Т. 45. Вып. 5. С. 6-8.

Материалы конференций

7. Березкина Т.Э. Измерение электрической активности и анализ содержания хлорофилла в

растениях в зависимости от длительности освещения // Международная зимняя школа по

физике полупроводников. Научные сообщения молодых ученых. 2015. С. 28-30.

8. Березкина Т.Э., Кулешов Д.О., Блашенков М.Н., Галль Н.Р., Галль Л.Н. Изучение влияния

светового потока и низкочастотного электромагнитного излучения на биохимический состав

растений // I российская конференция «Физика – наукам о жизни». Сборник тезисов. 2016. С.

175.

9. Кулешова Т.Э., Павлова Е.С., Галль Н.Р. Биологическое фракционирование изотопов

углерода при фотосинтезе в зависимости от освещения //Тезисы докладов II российской

конференции с международным участием «Физика–наукам о жизни». 2017. С. 68.

10. Кулешова Т.Э., Лихачев А.И., Нащекин А.В., Галль Н.Р. Взаимосвязь спектров

поглощения пигментов растений и светодиодного освещения с различным спектральным

составом // Тезисы докладов II российской конференции с международным участием

«Физика – наукам о жизни». 2017. С. 69.

11. Кулешова Т.Э., Павлова Е.С., Галль Н.Р. Влияние низкочастотного слабоинтенсивного

магнитного поля на ход фотосинтетической реакции в растениях при различном

спектральном составе освещения // I Всероссийская конференция с международным

участием «Физика и экология ЭМИ». 2017. Научные труды конференции. Т. 1. С. 35.

12. Кулешова Т.Э., Павлова Е.С., Галль Н.Р. Фракционирование изотопов 13

С/12С в ходе

фотосинтезирующих реакций в растениях под действием света различного спектрального

состава // Тезисы VII Всероссийской конференции с международным участием «Масс-

спектрометрия и ее прикладные проблемы». 2017. С. 40.

13. Кулешова Т.Э. Влияние спектра и интенсивности светодиодного излучения на спектры

поглощения пигментов растений // Двадцать вторая Санкт-Петербургская Ассамблея

молодых ученых и специалистов: Сборник тезисов – СПб.:Изд-во СПБГУПТД. 2017. С. 193.

14. Бушлякова А.В., Кулешова Т.Э., Галль Н.Р. Регистрация биоэлектрических потенциалов

растений - система мониторинга транспирации // Сборник тезисов докладов конгресса

молодых ученых. СПб:ИТМО. http://openbooks.ifmo.ru/ru/file/6593/6593.pdf

15. Бушлякова А.В., Кулешова Т.Э., Галль Н.Р. Автоматизация и тестирование регистрации

биоэлектрических потенциалов растений // VI Научно-практическая конференция с

международным участием «наука настоящего и будущего» для студентов, аспирантов и

молодых ученых. Сборник материалов конференции. СПб.: Изд-во СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2018.

 12

С. 389-391.

16. Кулешова Т.Э., Бушлякова А.В., Галль Н.Р. Система неинавизвного снятия

биоэлектрических потенциалов растений и влияние водного режима на их изменение

// Научные труды VIII Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения

в биологии и медицине». СПб. 2018. Т. 8. C. 132-133.

17. Кулешова Т.Э., Середин И. С., Щеглов С. А., Блашенков М. Н., Чумаченко А. В.,

Феофанов С. В., Кирадиев В. К., Одноблюдов М. А. Спектрометрический метод измерения

поглощения света листьями растений // Тезисы докладов международной конференции

ФизикА.СПб. 2018. С. 36-37.

18. Кулешова Т.Э., Иванова А.Г., Кручинина И.Ю., Шеина И.Ю., Удалова О.Р., Жестков

А.С., Галушко А.С., Панова Г.Г., Галль Н.Р. Растительно-микробные топливные элементы на

основе неинвазивных электродных систем // Сборник научных трудов VI съезда биофизиков

Росии. Т. 1. 2019. С. 382-383.

Личный вклад: Личный вклад автора заключается в получении всех представленных в

диссертации экспериментальных результатов. Автором был осуществлен анализ

литературных источников по теме диссертации, разработаны, изготовлены и запущены

экспериментальные установки, кроме изотопного и химического масс-спектрометров и

регистрирующей части оптического спектрографа, проведено их тестирование, предложены

и проработаны методики, использованные в работе, осуществлена подготовка проб,

проведен анализ и обработка массива экспериментальных данных, предложены алгоритмы

расчета ключевых параметров. Автор самостоятельно выдвигала гипотезы, ставила задачи,

предлагала пути их достижения, активно обсуждала полученные результаты,

интерпретировала данные, писала тексты научных публикаций.

Структура диссертации:

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы из 198

наименований. Текст диссертации изложен на 180 страницах, содержит 58 рисунков, 48

формул и 20 таблиц.

 13

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1. Основные принципы технологии мониторинга состояния растений

Фитомониторинг – информационная технология, основанная на автоматизированной,

непрерывной и не нарушающей условий среды регистрации характеристик интактных

растений и параметров фитоклимата; его основным методологическим принципом является

системный анализ временного хода характеристик растения и среды [1]. Данная технология

позволяет не только получать, обрабатывать, анализировать и хранить информацию о

физиологическом состоянии растения, но и принимать решение об управлении его

развитием.

Исследования в области физиологических процессов в интактных растениях с

применением систем автоматической регистрации и созданию на их основе систем

управления жизнедеятельностью растений были начаты В.Г Карманов еще в 1950-х годах

[2]. На начальном этапе это направление называлось «физиологический мониторинг»,

термин «фитомониторинг» был введен в 1987 году, а в качестве базовых физиологических

показателей, поддающихся непрерывной автоматической регистрации, были предложены:

ксилемный поток, тургор, рост [3]. Основными принципами методики, используемой в

фитомониторинге, являются непрерывность регистрации информации, безвредность для

растения, сохранность условий внешней среды и синхронность получения информации о

разных физиологических процессах, происходящих в растительных организмах [4,5].

Системный анализ физиологических процессов в растении основан на многоканальности и

разнообразие регистрируемых параметров. Наиболее информативными и

репрезентативными являются не абсолютные значения регистрируемых параметров, а формы

кривых, образованных в результате суточной регистрации, а также многосуточные тренды

изменений параметров [6]. В фитомониторинге используют как первичные характеристики

растения и окружающей, регистрируемые непосредственно в опыте, так и вторичные

показатели, рассчитываемые на основе первичных данных по соответствующим формулам

[7].

Фитомониторинг часто рассматривают и как раздел биофизики растений или

биокибернетики, и как новую методологию физиологии растений, и как информационную

технологию в растениеводстве [7,8] Основные направления использования включают в себя

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кулешова Татьяна Эдуардовна, 2019 год

- -

‰ -20±2 -25±1 16,4±0,7 -18±2 -15±1 16,1±0,5 -17±1

- - - - - - -

δ13C листа, ‰ 27,9±0,4 34,9±0,6 -31±1,3 28,8±0,4 32,4±0,6 -35±1,2 23,6±0,4 31,6±0,6 24,3±0,8

Δ= δ13C

воздуха - δ C

13

листьев 7,9±2 9,9±1,2 14,6±1,5 10,8±2 17,4±1,2 18,9±1,3 14,6±1,2

На наш взгляд, наблюдаемые вариации изотопного состава указывают на значительную

роль спектра излучения в фотосинтезе и изотопном обмене метаболического углерода со

средой. Значение Δ меняются в пределах от 7 до 19 ‰ (рис. 3.12). Чем больше присутствие

красной составляющей спектра, тем ярче выражена разница. Для белого и синего освещения

с возрастом Δ практически не меняется, что говорит о постоянной скорости обмена

изотопами в условиях среда-растение. Тогда как при наличии красного света разница между

δ13C воздуха и δ13C растения растет, что связано с более быстрым обогащением легким

изотопом живой ткани. Это подтверждает значительную роль красного диапазона света в

развитии растений, его влияние на морфологию и скорость роста.

 123

Рисунок 3.12 – Значения Δ=δ13Cвоздуха - δ13Cлистьев, отражающие степень взаимообмена

углерода между атмосферой и растением, в зависимости от дня развития растения

3.4 Скорость ассимиляции изотопов углерода 12С и 13С из углекислого газа

атмосферы в углеродный пул

Скорость перераспределение изотопов между молекулами одинакового или

различного химического состава может быть охарактеризована коэффициентом k [103,110].

13

СO2(газ)+12СО2(раст)↔ 12СO2(газ)+13СО2(раст) (42)

(13C⁄12C)газ (43)

k= = 1 + (δ13Cатм − δ13Cраст) = 1 + Δ

(13C⁄12C)раст

Концентрация органического вещества Сt в момент времени t пропорциональна этой

константе и может быть рассчитана из начальной концентрации реагента С 0 – углекислого

газа по следующей формуле:

Ct ~C0 e−kt (44)

Полученные значения коэффициента k, пропорционального скорости ассимиляции

изотопов углерода 12С и 13С из углекислого газа атмосферы в углеродный пул, в зависимости

от спектральных характеристик освещения и величины фотосинтетически активной

радиации приведены на рис. 3.13.

 124

25

красно-синий

свет

20

красный свет

15 холодный теплый

синий свет белый белый

k

свет свет

10

5

0

0 50 100 150 200 250

интенсивность света, μмоль·м-2·с-1

Рисунок 3.13 – Коэффициент k, отражающий степень взаимообмена углерода между

атмосферой и растением, в зависимости от спектральных характеристик освещения

Таким образом, изотопное отношение 13

С/12С может быть использовано как важный

показатель скорости протекания реакции фотосинтеза, а разница между δ13C окружающего

растение воздуха, вовлеченного в его метаболизм, и δ13C углеродного пула тканей

растительного организма потенциально отражает степень фракционирования изотопов в ходе

жизнедеятельности растений.

Выводы по главе 3

Предложено рассматривать процесс фракционирования изотопов углерода из

воздушной среды в органическое вещество тканей растительного организма для

исследования взаимодействия растения с атмосферой и, в частности, для характеризации

скорости ассимиляции углекислого газа и протекания фотосинтетических реакций.

Для проведения изотопного масс-спектрометрического анализа с целью изучения

различий в степени ассимиляции изотопов 13

С и 12

С в ходе жизнедеятельности растений

разработан ряд методик и создан аппаратный комплекс сбора и подготовки пробы. Так как

отношение С/12С определяется в газе CO2, концентрация которого в пробе должна быть

13

достаточно высока (более 2–3 %) и постоянна, необходимо обогащение газовой смеси и

перевод твердого вещества в газообразное состояние. Разработанные для этого методики и

изготовленные аппаратные комплексы включили в себя:

 125

1. Установку для сбора и обогащения пробы углекислого газа из воздуха окружающего

растения in vivo путем вымораживания углекислого газа и очистки от органических

примесей путем их каталитического дожигание. Время, необходимое для сгорания

органических примесей в закрытом объеме V на поверхности катализатора S, составило

τ=0.013·V·ϰ/S с учетом вычисленного экспериментально поправочного коэффициента

ϰ=6250.

2. Методику получения пробы углекислого газа из содержащейся в листья глюкозы

путем их биохимического окисления дрожжами. Отношение изотопов углерода в углекислом

газе, выделяемом при окислении растительной ткани дрожжами в течение 3 часов остается

неизменным. Однако отмечено различие в изотопном составе углерода для разных частей

листа растения. При окислении дрожжами полученное отношение изотопов углерода

составило δ13С=-33,6±0,9‰ для листа С3-растения, δ13С=-33,4±1,9‰ для свекольного сахара,

выделенного из С3-растений, δ13С=-14,6±1,6‰ для тростникового сахара, синтезированного

из С4-растения, эти значения согласуются с литературными данными для этих типов

фотосинтеза, что позволяет применять предложенную методику для широкого круга

объектов.

3. Установку для получения пробы углекислого газа путем каталитического сжигания

листьев растений. В разработанной каталитической ячейке для газификации обеспечивается

создание и поддержание температуры, достаточной для полного сгорания исследуемого

образца до углекислого газа, воды и золы, отсутствие образования продуктов неполного

сгорания, удобство и простота использования. Суммарное количество органических веществ

при газификации листа растения не превышает 0.2% от содержания в пробе углекислого газа,

а при газификации сахара ~0.01%. Рассчитанное по полученным данным изотопное

отношение с учетом возможной вносимой погрешности микропримесями органических

веществ составило для листа растения δ13С=-32,65±0,03‰, для свекольного сахара δ13С=-

33,40±0,005‰, что совпадает с значениями δ13С, полученными в ходе окисления ткани

растения дрожжами.

Предложенный система сбора и подготовки пробы обеспечила существенное

повышение точности изотопных измерений за счет концентрирования углекислого газа из

пространства вокруг растения и устранения интерферирующих органических примесей.

Таким образом, на основе разработанного комплекса методов и устройств проведено

исследование влияния спектральных характеристик освещения на степень взаимообмена

изотопов углерода между атмосферным воздухом и органами растений, осуществляющими

фотосинтез. Наблюдаемые вариации изотопного состава указывают на значительную роль

красной составляющей спектра. Разница между изотопным составом углерода в воздухе

 126

около растений и в их листьях меняется в пределах от 7 до 19 ‰, отражает степень

фракционирования изотопов в ходе жизнедеятельности растений и может быть использована

в качестве параметра фитомониторинга. Полученное различие в изотопном составе углерода

для разных частей листа растения характеризует скорость ассимиляции углерода за счет

протекания фотосинтетических реакций и фотодыхания: метаболические реакции идут

интенсивнее в новой части растения – верхушке листа,

 127

ГЛАВА 4. Биоэлектрические потенциалы, генерируемые в системе

корнеобитаемая среда – растение

Для оценки величины генерируемых в системе корнеобитаемая среда-растение

биоэлектрических потенциалов в зависимости от параметров растительного организма,

факторов внешней среды – влажности, минерального питания, светового режима,

конфигурации и материала электродных систем была проведена серия экспериментов.

Изменение биопотенциалов растений можно использовать как систему

фитомониторинга, т.е. отслеживания состояний растительных организмов и регистрации

электрофитограмм с целью диагностики стрессовых ситуаций и корректировки технологий

выращивания. С другой стороны, генерируемые при этом биотоки могут быть основой для

создания технологии накопления и производства электроэнергии с помощью комбинации

микробных топливных элементов и высших растений – растительно-микробного топливного

элемента.

4.1 Измерение биоэлектрических потенциалов

В качестве объекта исследования были выбраны Хлорофитумы хохлатые

(Chlorophytum comosum). Преимуществом данного вида является быстрый рост растения и

размножение вегетативным способом, следствие которого – получение большого количества

образцов с идентичным генетическим кодом и отсутствием различий в наследственных

признаках. С морфологической точки зрения хлорофитумы удобны тем, что имеют развитую

корневую систему потенциально способную обеспечить большую площадь контакта с

электродами.

C методической точки зрения для корректного измерения биоэлектрических

потенциалов растений необходимо обеспечить режим измерения, который не влиял бы

существенно на рост и функционирование растений. Кроме неинвазивности (отсутствия

механических повреждений тканей) значительным является то, чтобы отбираемый для

измерений ток был минимален и не вызывал поляризации ткани. Это накладывает

ограничения на входное сопротивление измерительных приборов, которое в наших

экспериментах были не ниже 105 Ом.

Также было важно убедиться, что наводки, возникающие в результате

электромагнитного фона лаборатории, не искажают проводимые измерения. Для учета их

роли мы использовали два подхода. Во-первых, тестовые измерения проводились внутри

металлического экрана («клетки Фарадея») что должно было снизить роль электрической

части наводки. Во-вторых, измерения проводили в различных локациях на базе Физико-

 128

технический института и Агрофизического института, поскольку уровень электромагнитного

фона сильно меняется от точки к точке. Во всех случаях мы получили схожие стационарные

результаты измерений, так что можно сделать вывод, что роль наводок лежит на пределе

чувствительности используемых измерительных приборов.

4.1.1 Инвазивное измерение биоэлектрических потенциалов растений

На первом этапе была проведена серия измерений БЭП в листе хлорофитума

относительно его корневой системы с использованием инвазивных контактов.

Первоначально измерения проводили с использованием пятиразрядного вольтметра В7-34А

с входным сопротивлением 10 МОм. Однако в связи с неудобством размещения габаритного

оборудования в зоне роста растения, вольтметр был заменен на мультиметр, специально

предназначенный для использования как в лабораторных, так и в полевых условиях, и

обладающий чувствительностью 100 мкВ. Получаемые значения биоэлектрического

потенциала образца совпадали на обоих приборах. Вольтметр с внутренним сопротивлением

1МOм был оснащен модифицированными игольчатыми электродами в виде тонкой трубки

из твёрдой нержавеющей стали с диаметром 0,25 мм. Расстояние между электродами

составляло 200 мм. Один электрод помещался в ткань растения вблизи почвы, второй в лист.

Биоэлектрический потенциал материнского хлорофитума, росшего в условиях

естественного освещения, составил 70 мВ в момент введения электродов в ткани растения.

Надземная часть растения была заряжена положительно относительно корня. После этого

был зарегистрирован экспоненциальный спад сигнала до величин меньше чувствительности

прибора в 100 мкВ в течение 30 минут.

Группа дочерних хлорофитумов на 14 дней была помещена в условия искусственного

освещения с одинаковым спектральным составом и различным световым днем: от

оптимального времени облучения до светодефицита. Методика измерения БЭП была та же.

В этих растениях начальная величина БЭП, а также скорость и характеристики его спада

сильно разнились (рис. 4.1).

 129

Рисунок 4.1 – Спад БЭП, измеренного инвазивным способом, для хлорофитумов,

освещаемых 1 – 15 минут, 2 – час, 3 – 3 часа, 4 – 9 часов в сутки

Для растений из исследуемой группы хлорофитумов, освещаемых в течение 9, 3, 1

часов и 15 минут в сутки, имеется явно выраженная зависимость увеличения времени спада

биоэлектрического потенциала от степени светодефицитности. Для растений,

развивающихся в условиях максимального дефицита света (кривые 1 и 2 на рис. 4.1)

скорость спада уменьшена в несколько раз по сравнению с растениями, которые находились

в условиях достаточного освещения (кривые 3 и 4). Также эти кривые существенно

немонотонны, в противоположность кривым для растений, развивавшихся в более

комфортных условиях. На наш взгляд, это указывает на повышение адаптивности для

растений, подвергшихся тренировке в условиях светодефицита.

Спад БЭП с течением времени связан с нарушением структуры тканей хлорофитума

во время введения электродов, что приводят к изменению разности потенциалов между этим

участком и другими частями растительного организма. В ответ на вносимое электродами

механическое повреждение, растение для ограничения действия стрессора включает работу

защитных механизмов – от возникновения некроза в области контакта ткани с электродом до

синтеза регуляторных молекул и образования экранирующего слоя, отделяющий

некротические участки от здоровых. Измеряемый потенциал характеризует реакцию на рану.

Как видно, получающиеся кривые сложны и не поддаются корректной интерпретации, так

как являются следствием очень многофакторных процессов. Они слабо пригодны для оценки

текущего физиологического состояния растения.

 130

4.1.2 Создание неинвазивной автоматической системы регистрации

Как альтернатива описанному выше традиционному решению, нами была разработана

схема проведения эксперимента методом, не повреждающим растение, что позволяет

изучать электрофизиологический сигнал растительного организма непосредственно в

условиях нормальной жизнедеятельности. Мы использовали метод поверхностных

неинвазивных измерений биоэлектрических потенциалов. Токособирающими контактами

служили две проводящих сетки из нержавеющей стали с размером ячейки 7х7мм 2, которые

помещались на расстоянии 50 мм друг от друга в емкость объемом 500 мл, заполненную

субстратом для выращивания хлорофитума (рис. 4.2). Выращенное ранее растение

освобождалось от почвы и помещалось в субстрат так, чтобы его корни прошли через ячейки

сетки. Сетки выводились наружу через боковую поверхность емкости для выращивания и

подключались к измерительному прибору.

Рисунок 4.2 – Схема неинвазивного измерения биопотенциалов в системе почва-высшее

растение: 1 – растительный организм, 2 – электроды в виде сеток с выводами из емкости с

субстратом, 3 – микроконтроллер, 4 – персональный компьютер

Для автоматизации эксперимента и on-line мониторинга биоэлектрических

потенциалов растений использована платформа для разработки электронных устройств

Arduino Mega 2560, базирующаяся на микроконтроллере ATmega2560 и связанная с ПК через

USB-кабель. Входное сопротивление устройства составляет 100 кОм. Программный код

(скетч), написанный на языке Arduino, позволяет регистрировать и записывать разность

потенциалов на электродных сетках раз в секунду или реже, в зависимости от задачи. В

 131

программе позволяющей применять микроконтроллер в качестве вольтметра,

записывающего данные в режиме реального времени, использовали: библиотеку для работы

с шиной SPI для адаптера карт MicroSD и библиотеку для работы с адаптером карт MicroSD;

функцию pinMode, которая устанавливает режим работы заданного входа; функцию

analogRead для чтения данных с указанного аналогового входа; функцию dataFile.print для

сохранения информации на SD-карту, функцию delay для остановки выполнения программы

на заданное в параметре количество миллисекунд.

При отсутствии растения разности потенциалов между сетками зафиксировано не

было, это позволило исключить предположение о возникновение контактных потенциалов.

Сопротивление почвы в такой системе составило ~0,5 МОм. При внесении в емкость 50 мл

воды сопротивление падало до 0,3 МОм, а при насыщении субстрата добавлением 150 мл

воды, его величина снижалась до 0,12 МОм.

Эквивалентная схема измерений представлена на рис. 4.3: R1 – это сопротивление

почвы, шунтирующее измерительную цепь, сопротивления R2 и R3 определяются

процессами, протекающими на границе между тканями растения и соприкасающейся с ними

сеткой, R4 – это эквивалентное внутреннее сопротивление корней, обусловленное

физиологическими особенностями растения, а E – его эквивалентная ЭДС, создающая

измеряемый БЭП. Все эти величины не могут произвольно меняться в ходе эксперимента,

так как являются характеристиками растения и его текущего физиологического состояния.

Отчасти мы можем влиять только на величину R1, которая зависит от степени

увлажненности почвы. Наоборот, R5 – сопротивление прибора, который используется для

измерения БЭП. Мы стремились к тому, чтобы сопротивление R5 было значительно

большим, чем величины R2-R4. В экспериментах снижение величины R5 от 10 МOм до 1

МOм никак не сказывалось на величине измеряемых потенциалов.

 132

Рисунок 4.3 – Эквивалентная схема измерений биоэлектрических потенциалов. R1 –

сопротивление почвы, R2, R3 – сопротивление утечек между корнями и почвой, R4 –

сопротивление корней, R5 – измерительное сопротивление регистрирующего прибора, Е –

эквивалентная ЭДС участка корня, V – вольтметр; 1 – надземная часть растения, 2 – нижняя

часть корня, 3 – емкость с субстратом, 4 – измерительный прибор

При подключении к системе нагрузки <10кОм БЭП значительно падает и

восстанавливается лишь на 1/3, а спустя полтора часа только наполовину (рис. 4.4). Это

говорит об ограниченных возможностях отвода тока от растения без внесения изменений в

их жизнедеятельность.

 133

Рисунок 4.4 – А – Величина биоэлектрического потенциала в зависимости от

сопротивления подключаемой нагрузки, Б – повтор через 1,5 часа

Новый способ обеспечения контакта «растение-электрод» с помощью прорастания

корней через электродные сетки является простым и относительно легко реализуемым,

видимо на широком круге растений. Он не вызывает физиологического ответа на рану по

сравнению с инвазивным методом, и не вносит значительных изменений в

жизнедеятельность растения, за счет того, что корни самопроизвольно прорастают сквозь

металлические контактные сетки.

4.1.3 Биосовместимость электродных систем

Идеальные электродные материалы должны обладать: хорошей электропроводностью и

низким сопротивлением, биосовместимостью, химической стабильностью, коррозионной

стойкостью, большой площадью поверхности, и соответствующей механической

прочностью.

Наиболее распространенные материалы для электродов, широко применяемые в

ячейках растительно-микробных топливных элементов, это нержавеющая сталь и

модификации графита. В нашей работе мы изучали влияние на биосовместимость и

 134

величину генерируемых БЭП электродов из нержавеющей стали, графитового войлока,

графитовой ткани и графитовых стержней.

Шесть исследуемых образцов – хлорофитумов хохлатых размещали в ячейках

следующим образом (рис. 4.5): в емкости для выращивания

(длина:ширина:высота=160:90:130мм, объем = 1.1л) устанавливали электроды – первый на

расстоянии 35мм от дна, второй через 50мм от предыдущего, после этого туда помещали

растение и заполняли объем субстратом – кварцевым песком с добавлением микроэлементов

для избегания влияния почвенных микроорганизмов. Биоэлектрические потенциалы

измерялся в режиме реального времени между электродов, выполненных из: 1) комбинации

графитового стержня, графитового войлока и нержавеющей стали, соединенных между

собой – контроль без растения (U1); 2) графитовой ткани шириной 40мм, длиной 125мм с

двумя прорезями для прорастания корней 80х5мм (U2); 3) графитового войлока шириной

40мм, длиной 125мм, толщиной 5мм с двумя прорезями 80х5 мм (U3); 4) стержней из

нержавеющей стали, покрытых графитовой смазкой (U4); 5) стержней из нержавеющей

стали диаметром 5мм, длиной 180мм (U5); 6) графитовых стержней диаметром 6мм, длиной

180мм (U6).

Рисунок 4.5 – Конфигурации ячеек для исследования влияния на БЭП параметров

материала электрода: 1 – контроль: комбинация графитового стержня, графитового войлока,

 135

нержавеющей стали, 2 – графитовой ткани, 3 – графитового войлока, 4 – стержни из

нержавеющей стали, покрытые графитовой смазкой, 5 – стержни из нержавеющей стали, 6 –

графитовые стержни

Измеренное сопротивление сухого материала до помещения в емкость составляет: для

графитовой ткани Rгт=250 Ом, для графитового войлока Rгв=50 Ом, для графитового стержня

Rгс=8 Ом и для материала при влажности, соответствующий условиям в грунте после полива:

Rгт =30 Ом, Rгв =5 Ом, Rгс=3 Ом. Наименьшим сопротивлением, приближенным к таковому

для стержня из нержавеющей стали (~0,01 Ом) обладает графитовый стержень.

Тестируемые объекты помещали в фитотрон (рис. 4.6) с освещением RGBWW-

светодиодами, излучающих фиолетовый свет – смесь теплого белого, красного и синего.

Рисунок 4.6 – А Вид ячейки для измерения БЭП с подключенным вольтметром, Б

Исследуемые образцы, содержащие разные электроды, в фитотроне с подключенной

автоматической системой регистрации

Возникновение биоэлектрических потенциалов связано не только с

жизнедеятельностью растений, но и с окислительно-восстановительными реакциями

превращений соединений железа, марганца, азота, серы, окислением органических вещества

и др., протекающих в корнеобитаемой среде. Основное влияние на окислительно-

восстановительное состояние почвы оказывают кислород, растворенный в почвенной влаге и

находящийся в равновесии с кислородом воздуха, свойства почвы и редуцирующие

вещества, выделяемые микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности, а главные

условия, определяющие интенсивность и направленность окислительно-восстановительных

процессов — состояние увлажнения и аэрации почв, содержание органических вещества и

деятельность микрофлоры [198].