Влияние синтетических моющих средств на эколого-биохимические характеристики высшего водного растения Egeria densa тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.08, кандидат биологических наук Мурзин, Илья Радикович

• Мурзин, Илья Радикович
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мурзин, Илья Радикович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 Синтетические поверхностно-активные вещества, как

антропогенный фактор

1.1 Характеристика синтетических поверхностно-активных веществ

1.1.2 Источники поступления и особенности влияния синтетических поверхностно-активных веществ на природные водные объекты

1.1.3 Экологические проблемы, связанные с применением синтетических поверхностно-активных веществ

1.2 Стресс в растениях и способы адаптации к нему

1.3 Характеристика исследуемых биохимических показателей

1.3.1 Общая характеристика ферментов антиоксидантной защиты и их функциональная роль в растительном организме

1.3.2 Роль фотосинтетических пигментов в функционировании растительного организма

1.3.3 Общая характеристика и функции белков разных фракций

в растительных организмах

Глава 2 Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Схема эксперимента

2.3 Методы определения активности ферментов антиоксидантной защиты

2.4 Методы определения содержания основных фотосинтетических пигментов

2.5 Методы определения содержания белков разных фракций

Глава 3 Влияние анионных синтетических поверхностно- 43 активных веществ на Egeria densa

3.1 Особенности протекания первичной индуктивной

стрессовой реакции у Egeria densa в ответ на действие анионных синтетических поверхностно-активных веществ

3.2 Особенности протекания фазы адаптации в стрессовой реакции у Egeria densa в ответ на действие анионных синтетических поверхностно-активных веществ

3.3 Особенности протекания фазы истощения в стрессовой реакции у Egeria densa в ответ на действие анионных синтетических поверхностно-активных веществ

Глава 4 Влияние катионных синтетических поверхностно-активных веществ на Egeria densa

4.1 Особенности протекания первичной индуктивной

83

стрессовой реакции у Egeria densa в ответ на действие катионных синтетических поверхностно-активных веществ

4.2 Особенности протекания фазы адаптации в стрессовой реакции у Egeria densa в ответ на действие катионных синтетических поверхностно-активных веществ

4.3 Особенности протекания фазы истощения в стрессовой реакции у Egeria densa в ответ на действие катионных синтетических поверхностно-активных веществ 103 ВЫВОДЫ 114 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АК - Аскорбиновая кислота АО - Аскорбинатоксидаза

АСПАВ - Анионные синтетические поверхностно-активные вещества

АТФ - Аденозинтрифосфат

АФК - Активные формы кислорода

ДАК - Дегидроаскорбиновая кислота

ИУК - Индолил-3-уксусная кислота

КСПАВ - Катионные синтетические поверхностно-активные вещества

КФК - Концентрационный фотоколориметр

НАД - Никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ - Никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ПАВ - Поверхностно-активные вещества

ПДК - Предельно допустимая концентрация

ПО - Пероксидаза

ПФО - Полифенолоксидаза

CMC - Синтетические моющие средства

СПАВ - Синтетические поверхностно-активные вещества

ССК - Светособирающий комплекс

СФ - Спектрофотометр

ФС - Фотосистема

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние синтетических моющих средств на эколого-биохимические характеристики высшего водного растения Egeria densa»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Рост численности городов сопровождается развитием промышленности, увеличением количества транспорта, развитием сферы бытовых нужд и приводит к увеличению количества техногенных выбросов в биосферу. В последние годы значительно расширился ассортимент химического состава поверхностно-активных веществ (ПАВ) наряду с увеличением масштабов их производства и объемов использования. ПАВ применяют в различных отраслях промышленности, сельского хозяйства и со сточными водами сбрасывают в окружающую среду. Синтетические поверхностно-активные вещества (СПАВ) обладают целым рядом специфических свойств, к числу которых относятся способность к образованию высокократной пены, эмульгированию, усилению явлений смачивания и пр. Благодаря этому указанные соединения находят широкое применение в быту и в самых различных сферах народного хозяйства.

Попадая в водную среду, СПАВ образует пленку на границе раздела фаз, что приводит к изменению качества потоков абиотических факторов. Снижается светопропускная способность на границе раздела фаз, затрудняется обмен газами. Попадая в водоёмы, СПАВ активно участвуют в процессах перераспределения и трансформации других загрязняющих веществ (таких как цинк, канцерогенные вещества, тяжёлые металлы и др.), активизируя их токсическое действие. Даже незначительные концентрации

■у

СПАВ (0,05-0,10 мг/дм) в воде активизируют токсичные вещества, адсорбированные на донных отложениях.

Большинство СПАВ и продукты их распада токсичны для различных групп гидробионтов: микроорганизмов (0,8-4,0 мг/дм ), водорослей (0,5-6,0

3 3

мг/дм ), беспозвоночных (0,01-0,9 мг/дм ) даже в малых концентрациях, особенно при хроническом воздействии. СПАВ способны накапливаться в организме и вызывать необратимые патологические изменения. Очистка вод от СПАВ, на данный момент, остается трудной и, порой, невыполнимой задачей.

На сегодняшний день, большинство СПАВ остается трудно биоразрушаемым антропогенным фактором, и способны оказывать воздействие на организмы достаточно длительное время и формировать к себе адаптивный ответ.

Цель исследования: Анализировать влияние синтетических ПАВ на эколого-биохимические характеристики высшего водного (погруженного) растения Egeria densa.

Задачи исследования:

1. Оценить динамику активности ферментов из группы антиоксидантной защиты в тканях высшего водного растения Egeria densa в различных фазах стрессовой реакции в ответ на действие СПАВ разных классов, входящих в состав синтетических моющих средств, а также в период их последействия (реабилитации).

2. Определить содержание белков разных фракций в тканях высшего водного растения Egeria densa в фазах стрессовой реакции и в период реабилитации в ответ на действие СПАВ различных классов.

3. Выявить особенности содержания фотосинтетических пигментов в тканях высшего водного растения Egeria densa в ответ на действие/последействие СПАВ разных классов.

4. Установить различия в характере влияния СПАВ разных классов на эколого-биохимическое состояние высшего водного растения Egeria densa.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование комплекса биохимических показателей Egeria densa в условиях воздействия СПАВ разных классов, а также реакция растений на них в постстрессовый период. Выявлены реакции ферментов антиоксидантной защиты в тканях Egeria densa в ответ на действие различных СПАВ. Обнаружены специфические реакции организма Egeria densa, выраженные в содержании водорастворимых и мембраносвязанных белков, содержании фотосинтетических пигментов на действие СПАВ разных классов.

Теоретическая значимость работы. Результаты диссертационной работы расширяют представления о механизмах влияния СПАВ различных классов на высшие водные растения, а также могут быть использованы для развития теоретических основ современной экологии водных фитоценозов.

Практическая значимость работы. Материалы диссертации, сформулированные в ней научные положения, и выводы могут найти применение для биоиндикации состояния воды пресных водоёмов посредством некоторых биохимических показателей тканей высшего водного растения Egeria densa. Данные диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе при чтении курсов лекций по физиологии и экологии растений для студентов бакалавров, специалистов и магистров биологических факультетов ВУЗов.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Тема диссертации связана с плановыми исследованиями кафедры биохимии СамГУ по теме: «Деятельность биологических систем и механизмы их регуляции» («Влияние физических и химических факторов на живые системы») и с плановыми исследованиями кафедры экологии и охраны окружающей среды СГОА(Н): «Мониторинг природных экосистем, подвергшихся антропогенному воздействию».

Положения, выносимые на защиту:

1. Динамика активности ферментов антиоксидантной защиты и содержания фотосинтетических пигментов высшего водного растения Egeria densa, зависит от класса СПАВ, их концентрации и продолжительности воздействия.

2. СПАВ разных классов вызывают разнонаправленное изменение содержания водорастворимых и мембраносвязанных белков высшего водного растения Egeria densa.

3. Характер изменений эколого-биохимического состояния высшего водного растения Egeria densa, в значительной степени зависит от класса воздействующего СПАВ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества» (Курск, 2009), V международной научной конференции «Наука. Творчество» (Самара, 2009), международной конференции «Медико-социальная и биологическая адаптация» (Сухум, 2009), международной научно-практической конференции «Физиологические механизмы становления и поддержания функций организма» (Сухум, 2010), VI международной научной конференции «Наука. Творчество» (Самара, 2010), международной научно-практической конференции «Физиологические механизмы живых систем» (Сухум, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы. Библиографический указатель включает 154 источника. Работа изложена на 129 страницах и содержит 80 рисунков.

Глава 1. Синтетические поверхностно-активные вещества, как

антропогенный фактор 1.1. Характеристика синтетических поверхностно-активных веществ

Значительную часть антропогенной нагрузки, приходящейся на поверхностные водные объекты, составляют сточные воды, содержащие синтетические поверхностно-активные вещества (СПАВ), которые входят в состав всех хозяйственно-бытовых и большинства промышленных сточных вод. Приблизительно 95-98 % общего количества применяемых в нашей стране синтетических моющих средств (CMC), вырабатываемых промышленностью, составляют анионные и неионогенные СПАВ и моющие средства на их основе, которые, как правило, характеризуются низкой биологической разлагаемостью и в силу своей химической природы оказывают существенное отрицательное воздействие на водные объекты (Ленова, 1980). Устойчивость СПАВ к биохимическому окислению является причиной накопления их в водных объектах, особенно в донных отложениях, что, в свою очередь, приводит к снижению способности природных вод к самоочистке и создает опасность вторичного загрязнения водоемов и водотоков (Паршикова, 2003). Именно по этой причине СПАВ входят в группу наиболее распространенных загрязняющих веществ в поверхностных водах (Максимов, 1988). В связи с несовершенством методов очистки от СПАВ сточных вод сосредоточенных выпусков и невозможности очистки от них рассредоточенного стока, возникает необходимость в разработке технологий защиты водных объектов от загрязнения указанными веществами, основанных на интенсификации внутриводоемных процессов. Таким требованиям соответствуют биоинженерные системы, сущность которых заключается в использовании приемов повышения ассимилирующей способности водных экосистем путем увеличения в их структуре звена фитоценоза.

Однако существующие разработки биоинженерных систем касаются снижения биогенной нагрузки на водные объекты, защиты от металлов, нефтепродуктов, легко окисляемых органических веществ, и не решают вопроса защиты от таких трудно окисляемых органических веществ, как СПАВ. К разряду СПАВ относят самые разнообразные химические соединения. Свое название СПАВ получили благодаря способности сорбироваться (концентрироваться) на поверхности раздела фаз и снижать межфазную свободную энергию (поверхностное натяжение). Считается, что именно эта группа соединений в наибольшем количестве накапливается в почвах, воде и воздухе вследствие широкого использования в различных отраслях хозяйственной деятельности (Ахмедова, 1987; Айздайчер, 1999; Божков, 1999; Вастернак, 1990).

СПАВ представляют собой органические вещества с гидрофильными и гидрофобными участками различного химического (дефильного) строения. СПАВ - вещества с асимметричной структурой, молекулы которых содержат один или несколько гидрофильных групп и один или несколько гидрофобных радикалов. Такая амфифильная структура обусловливает поверхностную (адсорбционную) активность СПАВ, выражающуюся в способности концентрироваться на межфазных поверхностях раздела, изменяя их свойства.

По характеру диссоциации СПАВ делятся на следующие группы: анионные (анионоактивные) СПАВ, катионные (катионоактивные) СПАВ, неионогенные СПАВ и амфолитные СПАВ (Саут, 1990; Шевердяев, 1992).

Анионные (анионоактивные) СПАВ - в водном растворе, ионизируются с образованием отрицательно заряженных органических ионов. Из анионоактивных СПАВ широкое применение нашли соли сернокислых эфиров (сульфаты) и соли сульфокислот (сульфонаты). Радикал (Я-) у них может быть алкильным, алкиларильным, алкилнафтильным, иметь двойные связи и функциональные группы (Остроумов, 2000).

К наиболее распространенным веществам относятся алкилсульфоновые кислоты, у которых остаток серной кислоты образует гидрофильный участок:

^-СН-Из

ЭОз

Среди синтетических анионактивных СПАВ наиболее распространены алкиларилсульфонаты (сульфонолы), особенно додецилбензолсульфонаты, производство которых составляет более половины общего производства СПАВ во всем мире. Общая формула строения алкиларилсульфонатов -[СН3(СН2)п-СбН4-80з]Ма+. К широко распространенными анионактивными веществам также можно отнести синтетические алкилсульфаты, обычно натриевые соли алкилсульфокислот, общая формула которых - 1Ю80зМ1, где М1 - одновалентный металл, чаще всего Иа. Сравнительно меньше промышленностью выпускается алкилсульфонатов (мерзолятов), строение которых можно представить в виде - СпН2п + 1803№. К анионактивным СПАВ относятся также карбоновые соли щелочных металлов с длинными углеводородными радикалами, называемые мылами, и их производные; органические соединения, содержащие фосфор (к примеру, фосфаминовая кислота и ее соль), серу с двумя атомами кислорода (сульфаминовая кислота) и другие аналогичные соединения. Указанные группы веществ растворяются в маслах (Божков, 1999).

Катионные (катионоактивные) СПАВ - вещества, которые ионизируются в водном растворе с образованием положительно заряженных органических ионов. К ним относятся четвертичные аммониевые соли, состоящие из углеводородного радикала с прямой цепью, содержащей 12-18 атомов углерода. Кроме того, они содержат метильный, этильный или бензильный радикал, а также хлор, бром, йод или остаток метил- или этилсульфата. Алкиламмониевые соединения имеют в качестве полярного компонента положительно заряженную третичную аммонийную группу Я -]\Г(СН3)2+. Эти вещества проявляют бактерицидное действие. Алкилдиметиламины - жидкости темно-коричневого цвета с эфирным

запахом, практически не растворяющиеся в воде. Ориентировочный безопасный уровень воздействия в атмосферном воздухе - 0,01 мг/м .

Амфолитные СПАВ - ионизируются в водном растворе различным образом в зависимости от условий среды: в кислом растворе проявляют катионоактивные свойства, а в щелочном - анионоактивные (Божков, 1999).

Неионогенные СПАВ представляют собой высокомолекулярные соединения, которые в водном растворе не образуют ионов. Токсичное действие неионогенных СПАВ определяется главным образом неполярной частью молекулы, при этом оно более выражено при наличии в последней ароматического кольца. По биохимической устойчивости, определяемой структурой молекул, СПАВ делят на мягкие, промежуточные и жесткие.

Таким образом, можно кратко представить классификацию различных групп СПАВ (4 класса):

• Анионоактивные вещества - наиболее распространенные из ПАВ, являются основной составной частью синтетических моющих средств. К ним относятся, главным образом, алкилсульфаты, сульфонолы, алкилсульфонаты, динатриевая соль моноалкилсульфоянтарной кислоты.

• Неионогенные вещества - по объему производства составляют примерно 10% от всех остальных ПАВ. В меньшей мере, чем анионоактивные ПАВ, используются в моющих средствах, больше — для промышленных целей. К ним относятся ОП-7, ОП-Ю, синтанолы, синтамид, проксанолы, проксамины и др.

• Катионоактивные вещества - составляют незначительную часть всех производимых ПАВ (доли процента). В моющих средствах используются как дезинфицирующие агенты.

• Амфолитные вещества - только начинают вырабатываться, практического значения в загрязнении водоемов пока не имеют.

1.1.2. Источники поступления и особенности влияния синтетических

поверхностно-активных веществ на природные водные объекты

Основным источником попадания СПАВ в водоемы является сброс загрязненных сточных вод различных отраслей промышленности, таких как текстильная; целлюлозно-бумажная; горнодобывающая (обогащение руд); химическая; химико-фотографическая; • нефтедобывающая и нефтеперерабатывающая; угольная; фармацевтическая; кожевенная; парфюмерная; черная и цветная металлургия; машиностроение и др (Матвеев, 2007).

Со сточными водами всех видов может выноситься до 70-80%, используемых в производстве СПАВ. Особенно насыщены СПАВ и трудны для очистки воды предприятий черной и цветной металлургии, поскольку в них преобладают смазочные масла и эмульсии, а также все виды и классы СПАВ - от самых простых по химическому строению до самых сложных. В сточных водах коксо-химических производств наряду со СПАВ на основе смоляных и колофеновых кислот обычно присутствуют еще и фенолы, поэтому биохимическая очистка этих вод не обеспечивает их должного качества, вследствие чего недоочищенные сточные воды попадают в хозяйственно-бытовую канализацию предприятий, а затем и городов (Щербаков, 2003).

СПАВ широко применяются и в сельском хозяйстве, они входят в состав многих биологически активных соединений, используемых для регуляции роста организмов, инсектицидов, гербицидов, фунгицидов и дефолиантов. Ощутимо также поступление СПАВ в водоемы при обработке сельскохозяйственных и плодовых насаждений для тех или иных целей, при использовании удобрений, кондиционировании почвы, антиэрозионными составами и т.д. (Вахмистров, 1987; Николаевский, 1979; Абрамзон, 1981).

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что СПАВ, так или иначе, применяются во всех отраслях хозяйства. Существенный вклад в

поступление СПАВ в водные объекты также вносят талые и ливневые стоки с территорий городов, промышленных объектов и сельскохозяйственных угодий.

Различные СПАВ в водоемах чаще всего встречаются в виде смеси отдельных гомологов и изомеров, каждый из которых проявляет индивидуальные свойства при взаимодействии с водой и донными отложениями, различен и механизм их биохимического разложения. Исследования свойств смесей СПАВ показали (Малюсова, 1970; Сафонова, 2009), что в концентрациях, близких к пороговым, эти вещества обладают эффектом суммирования их вредных воздействий. Во взаимодействии анионактивных веществ, входящих в смесь, также наблюдается синергизм.

Большинство, из вновь синтезированных СПАВ, поступающих в водоемы и водотоки со сточными водами, способны накапливаться в них на протяжении длительного времени, особенно если состоят из смеси изомеров с различной скоростью расщепления (Киршанкова, 2006). Исходя из этого, нормирование присутствия в водоемах смеси СПАВ должно производиться по правилам, рекомендованным для смесей химических веществ.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) СПАВ в воде водоемов составляет 0,5 мг/дм . Лимитирующим показателем вредности СПАВ является их пенообразующая способность, которую также необходимо учитывать при повторном использовании очищенных сточных вод в техническом водоснабжении промышленных предприятий (Соломонова, 2007).

Большинство СПАВ обладают чрезвычайно широким диапазоном отрицательного влияния как на организм человека и водные экосистемы, так и на качество вод.

Прежде всего, они придают воде стойкие специфические запахи и привкусы, а некоторые из них могут стабилизировать неприятные запахи, обусловленные другими соединениями. Так, содержание в воде СПАВ в

3 3

количестве 0,4-3,0 мг/дм придает ей горький привкус, а 0,2-2,0 мг/дм -мыльно керосиновый запах (Можаев и др., 1970; Славинская, 2009).

Одним из основных физико-химических свойств СПАВ является высокая пенообразующая способность, причем, в сравнительно низких концентрациях (порядка 0,1-0,5 мг/дм ) (Стокер, 1982). Возникновение на поверхности воды слоя пены затрудняет тепломассообмен водоема с атмосферой, снижает поступление кислорода из воздуха в воду (на 15-20 %), замедляя осаждение и разложение взвесей, , процессы минерализации органических веществ, и тем самым ухудшает процессы самоочищения. Некоторые нерастворимые СПАВ при попадании на поверхность воды образуют нерастворимые пленки, распространяющиеся при достаточной площади растекания в монослои (Никаноров и др., 2000; Ковалева, 2009).

Попадая в водоемы, СПАВ активно участвуют в процессах перераспределения и трансформации других загрязняющих веществ (таких как хлорофос, анилин, цинк, железо, бутилакрилат, канцерогенные вещества, пестициды, нефтепродукты, тяжелые металлы и др.), активизируя их токсическое действие. Со СПАВ связано 6-30 % меди, 3-12 % свинца и 4-50% ртути в коллоидной и растворенной форме. Незначительной концентрации СПАВ (0,05-0,10 мг/дм')

в воде достаточно, чтобы активизировать токсичные вещества, адсорбированные на донных отложениях (Фелленберг, 1997).

При небольшом содержании СПАВ в воде часто наблюдается коагуляция и седиментация примесей, обусловленная уменьшением или даже снятием электрокинетического потенциала частиц вследствие сорбции противоположно заряженных органических ионов СПАВ (Пушкарев, 1975; Малиновский, 2004).

Кроме того, СПАВ несколько тормозят распад канцерогенных веществ, угнетают процессы биохимического потребления кислорода, аммонификации и нитрификации. A CMC также принадлежат к основным источникам загрязнения воды фосфором, который входит в их состав в качестве наполнителя - триполифосфата натрия, составляющего от 20 до 70 % CMC.

При гидролизе детергентов в водной среде образуется комплекс фосфатов, что приводит к эвтрофированию водоемов. CMC в среднем поставляют в природные воды от 20 до 40 % общего фосфора (Можаев, 1970; Env. Dir., 2002).

СПАВ могут способствовать и повышению эпидемиологической опасности воды, а также способствуют химическому загрязнению воды веществами высокой биологической активности.

Большинство СПАВ и продукты их распада токсичны для различных групп гидробионтов: микроорганизмов (0,8-4,0 мг/дм ), водорослей (0,5-6,0

о О

мг/дм ), беспозвоночных (0,01-0,9 мг/дм ) даже в малых концентрациях, особенно при хроническом воздействии. СПАВ способны накапливаться в организме и вызывать необратимые патологические изменения (Можаев, 1970; Липницкая, 1989; Паршикова, 2003; Остроумов, 2005; Айздайчер, 2006; Журавель, 2006; Маркина, 2007).

Также отмечается (Пушкарев, 1975), зависимость степени и характера влияния СПАВ на водные организмы от химической структуры веществ. Наиболее сильное отрицательное влияние оказывают алкиларилсульфонаты, т.е. вещества, имеющие в своей молекуле бензольное кольцо, и некоторые неионогенные вещества. Менее всего токсичны СПАВ на основе полимеров, несколько токсичнее алкилсульфаты и алкилсульфонаты. Соединения, имеющие прямую боковую цепь, более токсичны, чем вещества с сильно разветвленной углеродной цепью (Patoczka, 1990).

Среди основных причин загрязнения водоемов этими веществами также часто отмечают способность СПАВ, выбрасываемых выпускающими их предприятиями в воздух в значительных количествах, проникать с атмосферными осадками в открытые водоемы и просачиваться в подземные ближние слои грунтовых вод (Николаевский, 1979). В грунтовые воды СПАВ попадают также при очистке сточных вод на полях фильтрации и при этом, как правило, увлекают за собой и другие загрязнения. Из подземных вод СПАВ практически беспрепятственно проходят в поверхностные

водоисточники и через очистные сооружения в питьевую воду. Кроме того, попадая в природные воды, СПАВ сорбируются содержащимися в них частицами минерального и органического происхождения, оседают на дно водоемов и тем самым создают очаги вторичного загрязнения.

Токсичность СПАВ в водной среде в значительной степени уменьшается за счет их способности к биодеградации. СПАВ, в той или иной степени, поглощаются всей флорой и фауной водных объектов (К1тег1е, 1977).

Регулирование качества вод наряду с другими мероприятиями может включать в себя и целенаправленное культивирование водных растений, как высших, так и низших: фитомелиорацию, интродукцию растений и наращивание биомассы гидрофитов и их сообществ в нужное время, в нужных местах и в необходимых количествах. Интенсификация процессов самоочищения вод от различных видов загрязнений с помощью высшей водной растительности в симбиозе с другими звеньями экосистемы в большинстве случаев является экономичным и эффективным методом (Остроумов, 2005). Выделяя кислород и аэрируя воду, высшие водные растения способствуют окислению органических загрязнений бактериями, одновременно используя полученные продукты распада для своей жизнедеятельности. В некоторых случаях степень удаления органических примесей с помощью макрофитов выше, чем при использовании промышленных методов очистки воды в аэротенках (Олейник, 1993; Косолапое, 2000).

Поэтапная деструкция высокомолекулярных органических соединений, к которым относятся СПАВ, осуществляется многочисленными группами микроорганизмов. Характер образующихся продуктов разложения зависит от структуры микробного сообщества, ферментативной активности его членов, а также от условий окружающей среды. Ведущими абиотическими факторами, регулирующими направление микробиологических процессов,

являются температура и содержание растворенного в воде кислорода (Липницкая, 1992; Вайтнер, 2003).

Быстро окисляются те органические соединения, продукты разрушения которых соответствуют общей схеме метаболизма, но если по структурным причинам происходит отклонение от общей схемы, то окисление протекает очень долго. В том случае, когда гидроксильная группа вещества не может окисляться без разрыва молекулы, окисление совершается крайне медленно, поскольку разрыв молекулы для бактериального метаболизма явление не совсем обычное (Дзюбан, 1979). Так, незначительное биохимическое окисление большинства СПАВ, выпускаемых промышленностью, является одной из основных причин нарушения самоочищения водоемов.

1.1.3. Экологические проблемы, связанные с применением синтетических поверхностно-активных веществ

Широкое применение СПАВ для коммунальных целей приводит к тому, что данные вещества поступают непосредственно в бытовую канализацию населенных пунктов, что в свою очередь вызывает серьезные нарушения в работе городских очистных сооружений и загрязнение водоемов. СПАВ являются обязательным компонентом современных хозяйственно-бытовых сточных вод, в том числе и прошедших полную биологическую очистку, эффективность которой по этим ингредиентам составляет 48-80, а в зимний период - лишь 20 %. Некоторые СПАВ способны оказывать отрицательное влияние на процессы биологической очистки сточных вод в результате стабилизации коллоидных суспензий и смывания биопленки с поверхности загрузки фильтров (Калениченко, 1985).

Водные растворы СПАВ в большей или меньшей концентрации поступают в стоки промышленных вод и, в конечном счете - в водоемы. Очистке сточных вод от СПАВ уделяется большое внимание, т. к. из-за низкой скорости разложения СПАВ вредные результаты их воздействия на

природу и живые организмы непредсказуемы. Сточные воды, содержащие продукты гидролиза полифосфатных СПАВ, могут вызвать интенсивный рост растений, что приводит к загрязнению ранее чистых водоемов: по мере отмирания растений начинается их гниение, а вода обедняется кислородом, что в свою очередь ухудшает условия существования других форм жизни в воде (Alder, 1990; Devliegher, 1995).

Практикуемые в настоящее время методы очистки вод от СПАВ сводятся, в основном, к механической очистке, обработке сточных вод коагулянтами и флотационной очистке. Достигаемая при этом степень удаления СПАВ требует подачи воды на биологические очистные сооружения или допускает ее сброс в водоем при соответствующем разбавлении (Лукиных, 1970; Браяловский, 1989; Куренкова, 2009). При широком применении в быту СПАВ промежуточной группы, а в некоторых случаях даже и "биологически мягких" веществ, снижение их концентрации в ходе протекания процесса биохимической очистки может оказаться недостаточным для обеспечения требований сброса сточных вод в водоемы. Так, после биологической очистки городских сточных вод с концентрацией СПАВ порядка 20-30 мг/дм3 и при удалении их на 60-80 %, очищенные

о

сточные воды будут содержать от 4 до 12 мг/дм СПАВ, а для достижения санитарных норм выпуска сточных вод в водоем потребуется минимальное разбавление их в 8-24 раза, либо дополнительная доочистка перед сбросом в водоем (Можаев, 1970; Фелленберг, 1997).

Среди способов очистки сточных вод в отстойниках - перевод СПАВ в пену, адсорбция активным углем, использование ионообменных смол, нейтрализация катионактивными веществами и др (Angeletti, 1987; Leenheer, 1991). Эти методы дороги и недостаточно эффективны, поэтому предпочтительна очистка сточных вод от СПАВ в отстойниках (аэротенках) и в естественных условиях (в водоемах) путем биологического окисления под действием гетеротрофных бактерий (преобладающий род -

Pseudomonas), которые входят в состав активного ила (Волченко, 2004; Павлова, 2004).

На биоразлагаемость СПАВ влияет способ их получения. Так, степень разложения алкилбензолсульфоната натрия, получаемого из парафинов, 8092%, а из керосиновой фракции - 60 %.

В настоящее время приняты законы, разрешающие производство и применение СПАВ для CMC, биоразлагаемых не менее чем на 80%.

Теоретически биоокисление идет до превращения органических веществ в воду и углекислый газ, практически проблема сводится лишь к времени окисления, т.е. к кинетике процесса. Если окончательное окисление происходит медленно, СПАВ успевает произвести вредное влияние на живые организмы и природную среду.

Неионогенные ПАВ разлагаются легче, чем анионоактивные, но биоразлагаемость их понижается с увеличением числа присоединенных групп этиленоксида и разветвленности гидрофобной части молекулы (Leenheer, 1991).

На сегодняшний день, большинство СПАВ остается трудно биоразрушаемым антропогенным фактором, и способны оказывать воздействие на организмы достаточно длительное время и формировать к себе адаптивный ответ.

1.2. Стресс растений и способы адаптации к нему

Растительные организмы в природных условиях очень часто подвергаются воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Способность растений сопротивляться экстремальным условиям произрастания, приспосабливаться к ним и сохранять при этом свой жизненный потенциал является одним из определяющих условий существования растений и зависит от возможности реализовать защитно-приспособительные механизмы, т.е. адаптироваться к разнообразным стрессовым воздействиям (Шакирова, 2001).

Согласно концепции о стрессе, сформулированной Г. Селье (Селье, 1987), в ответ на сильное неблагоприятное воздействие в организме индуцируются неспецифические реакции, сопровождающиеся перестройкой защитных систем во времени. Генерализованный адаптационный синдром включает три стадии: реакция тревоги, стадия адаптации, стадия истощения. Реакция тревоги - первоначальная реакция, сопровождающаяся процессами катаболизма различных полимеров, призывающая к активации защитных механизмов. Стадия адаптации характеризуется активацией синтетических процессов, приводящих часто к усилению выше нормы степени сопротивляемости клеток организма, в ответ на более длительное воздействие любого ксенобиотика. При продолжающемся повреждающем действии стрессора наступает стадия истощения, в которой исчерпываются компенсаторные механизмы организма, теряется достигнутая адаптация и сопротивляемость падает ниже нормы.

Следует специально отметить, что строгое разделение на фазы стрессовых ответных реакций в ходе формирования механизмов адаптации на воздействие стрессоров разной силы четко прослежено для животных организмов. Однако растительные организмы также претерпевают цепь сходных реакций в ответ на разнообразные неблагоприятные воздействия разной природы (неспецифический ответ) в ходе формирования адаптационных процессов, которые, в свою очередь, также в широкой степени неспецифичны.

При сопоставлении фаз триады у растений и животных наибольшее сомнение возникало в идентичности первой фазы. Судя по доминирующим в ней реакциям, она не могла быть названа фазой тревоги. Ее называют первичной индуктивной стрессовой реакцией. Вторая фаза - фаза адаптации и третья - истощения ресурсов надежности (Чиркова, 2002). Данная классификация легла в основу хронологии нашего эксперимента. Контрольные точки отбора проб: первые, третьи и десятые сутки экспозиции

растений в растворах с добавлением СПАВ, отражают фазы ответной реакции организма на стресс.

1.3. Характеристика исследуемых биохимических показателей

В качестве исследуемых биохимических показателей, были выбраны активность ферментов антиоксидантной защиты (пероксидаза, полифенолоксидаза, аскорбинатоксидаза), содержание белков и фотосинтетических пигментов. На наш взгляд, изменение характеристик вышеперечисленных веществ может указывать на интенсивность протекания ряда физиологических процессов, без которых существование растительного организма невозможно.

1.3.1. Общая характеристика ферментов антиоксидантной защиты и их функциональная роль в растительном организме

Характеристика фермента пероксидазы Ферменты, катализирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления, называют оксидоредуктазами. Все они относятся к I классу ферментов. Растительные пероксидазы представляют собой оксидоредуктазы, катализирующие окисление широкого ряда субстратов с использованием перекиси водорода в качестве акцептора (Газарян, 2006; Минибаева, 2003).

Растительные пероксидазы являются гликопротеидами с молекулярной массой 40-50 кДа и составляют единственный подподкласс (1.11.1), где под кодовым номером семь стоит истинная пероксидаза: Н202-оксидоредуктаза (КФ 1.11.1.7). Это геминовый диссоциирующий металлоэнзим с молекулярной массой около 44 кДа (Паду, 1995; Roberts, 1999; Veitch, 2004)

Пероксидаза относится к группе двухкомпонентных ферментов -гемпротеинов. Простетической группой является гем, который представлен

протопорфирином IX в комплексе с трехвалентным железом (феррипротопорфирин IX). Согласно принятым большинством

исследователей взглядам, валентность железа, входящего в состав простетической группы пероксидазы, не изменяется на всех этапах каталитического процесса.

Фермент представляет собой глобулярный белок диаметром 5 нм, содержащий около 43% а-спиральных участков в составе белковой части молекулы. Полипептидная цепь включает от 203 до 3.08 аминокислот, из которых от 22 до 26% составляют заряженные аминокислоты. 3/4 части полипептидной цепи пероксидазы представлены гидрофобными и незаряженными аминокислотами. (Андреева, 1988; Воронков, 1970; John, 1961).

Гем можно обратимо отделить от белка при кислых рН. Удаление гема приводит к потере пероксидазной активности фермента, но не сказывается на его оксидазной функции (Иванова, 1962; Wallace, 1999).

На поверхности белковой глобулы фермента находятся углеводные фрагменты, ковалентно связанные с белком, содержащие нейтральные и аминосахара в количестве до 20% общего веса. Молекула пероксидазы содержит восемь полисахаридных цепочек. Они покрывают апобелок снаружи и предохраняют фермент от инактивации радикалами, образующимися в ходе реакций, а также увеличивают термическую стабильность пероксидазы (Lazor, 1975; Рогожин, 2004).

Фермент в клетках растений представлен большим набором изоэзимов (от 3 до 42 молекулярных форм) с широким диапазоном ферментативной активности, в пределах рН от 3 до 14. Пероксидаза является индуцибельным ферментом, реагирует на самые разнообразные воздействия, либо изменяя при этом набор своих изоэнзимов, либо повышая активность уже присутствующих молекулярных форм (Андреева, 1988; Roberts, 1999; Wallace, 1999).

Активный центр пероксидазы представляет область белковой глобулы, расположенной с дистальной стороны гема. Роль активного центра выполняет феррипротопорфирин IX, составляющий порфириновое кольцо гема. Он участвует в разложении или активации перекиси водорода, в результате чего возникают радикалы соответствующих субстратов. Именно гидрофобное взаимодействие порфиринового кольца с белком формирует третичную структуру нативной пероксидазы, представленную двумя доменами (большим и малым). Третичная структура фермента скрепляется четырьмя дисульфидными мостиками между аминокислотными остатками, которые расположены внутри молекулы.

Весьма широкая специфичность пероксидазы к субстратам различной природы вызывает самый пристальный интерес. По реакционной способности окисляющиеся субстраты Данфорд предложил разделить на три группы: 1) легко окисляемые - фенолы и амины с электронодонорными заместителями в бензольном кольце; 2) средне окисляемые - ферроцианид-, сульфит- и нитрит-ионы, а также фенолы и амины с электроноакцепторными заместителями в бензольном кольце; 3) трудно окисляемые - иодид-ионы (Рогожин, 2004).

Некоторые авторы обнаружили, что индивидуальные изопероксидазы с различной скоростью окисляют все множество свойственных им субстратов, но не все множество изоформ фермента присутствует в растении постоянно (Рубин, 1975; Рогожин, 2004).

Пероксидаза - один из ключевых ферментов, контролирующих рост растений, их дифференциацию и развитие. Этот фермент участвует в формировании, реологии и лигнификации клеточных стенок, биосинтезе этилена, метаболизме индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), дыхании растений, защите тканей от поражения и инфекции патогенными микроорганизмами (Газарян, 1992; Максимов, 2006).

Показано, что исследование пероксидазной активности в растениях следует проводить при рН буфера, соответствующим рН растительной клетки.

Для проявления каталитической активности пероксидазы в некоторых растениях необходимы кофакторы. В роли кофакторов для этого фермента могут выступать ионы таких металлов, как Мп2+, Zn2+, Си2+, Са2+ и др., или сложные органические соединения, вступающие во временное взаимодействие с молекулой пероксидазы.

Ингибиторами пероксидазы могут служить все соединения, которые способны образовать с железом соединения, разрывающие хотя бы одну из шести координационных связей в гемпротеиновом комплексе, или делают невозможным доступ перекисей к железу и таким образом обратимо или необратимо инактивируют фермент (Рубин, 1966; Ладыгина, 1974).

Особенностью механизма действия пероксидазы в оксидазных

реакциях является способность фермента в процессе каталитической реакции

2 2

генерировать свободные радикалы: О , НО , и радикал органического субстрата (Андреева, 1988; Кретович, 1973; Ьагог, 1975; Максимов, 2006).

Кислород может участвовать не только в ферментативной реакции, но и в реакции с радикалами субстрата. Последняя приводит к образованию гидроперекисного радикала, который далее превращается в молекулу гидроперекиси при отрыве водорода от молекулы субстрата. Образующаяся в реакции перекись водорода и гидроперекиси являются субстратами пероксидазы. Реакция их с ферментом приводит к образованию соединения I, которое далее взаимодействует с субстратом, инициирует образование дополнительных количеств радикалов в системе и способствует увеличению скорости окисления субстрата. При высоких концентрациях пероксидазы отмечается значительное возрастание скорости инициирования свободных радикалов. При этом увеличивается вероятность взаимодействия промежуточного соединения III со свободными радикалами (Ьагог, 1975). Эта реакция может быть причиной отклонения от линейной зависимости

между скоростью реакции окисления субстрата и концентрацией пероксидазы, что отмечалось при высоких концентрациях фермента.

Образование перекиси водорода в ходе оксидазных реакций пероксидазы является пусковым механизмом для последующего протекания пероксидазных реакций фермента (Полевой, 1989).

Реакция пероксидазы с перекисью водорода приводит к образованию нескольких промежуточных соединений. Впервые эти соединения спектрофотометрически различил Чане.

Присутствующий в пероксидазе единственный ион железа обладает способностью не только активировать перекись водорода, но и сообщать ей способность вступать в реакции окисления различных субстратов. Источником активного кислорода при каталитическом действии пероксидазы могут, наряду с перекисью водорода, служить и органические перекиси, в том числе перекиси ненасыщенных жирных кислот, образующиеся при действии липооксидазы, а также перекиси каротина. К субстратам, окисляемым пероксидазой в присутствии перекиси, можно отнести большинство фенолов (пирокатехин, пирогаллол, гидрохинон, резорцин, гваякол), а также бензидин, адреналин, ароматические амины (анилин, диметилаланин, паратоллуидин, н-толуидин), ароматические кислоты (бензойную, салициловую, галловую), легкоокисляемые вещества (аскорбиновую кислоту, нитриты) и ряд других соединений (Андреева, 1988; Рогожин, 2004; Филлипцова, 2004)

Для этого фермента многие авторы (John, 1961; Газарян, 2006) отмечают видовую, органогенную, тканевую и внутриклеточную специфичность распределения изопероксидаз. Присутствие фермента в хлоропластах указывает на его участие в окислительно-восстановительных реакциях в процессе фотосинтеза, а обнаружение пероксидазы в митохондриях - на участие в энергетическом обмене клетки. Значительная пероксидазная активность определена в очищенных препаратах рибосом, и,

как считают авторы, фермент прочно связан с их структурой, являясь, видимо, составной частью этих органелл.

Местом локализации пероксидазы в растительных клетках могут быть также гранулы, вакуоли, а также шероховатый эндоплазматический ретикулум, пузырьки и цистерны аппарата Гольджи. Синтез пероксидазы происходит на полисомах, а местом гликозилирования является аппарат Гольджи. Биосинтез фермента регулируется поступлением перекиси водорода, которая образуется в реакциях, катализируемых НАДФН-оксидазой, диамино- и полиаминооксидазами, супероксиддисмутазой, а также и самой пероксидазой в присутствии ионов марганца в реакциях окисления НАДФ'Н2 (Газарян, 1992).

Пероксидаза растительных клеток способна перемещаться по эндоплазматическому ретикулуму и аппарату Гольджи, а затем проникать в пространство между клеточной мембраной и клеточной стенкой. Этот процесс активно протекает при образовании лигнифицированной клеточной стенки и оболочки семян растений с образованием дитирозиновых связей. Таким образом, фермент может участвовать в формировании ковалентных поперечных связей в клеточных стенках в процесс развития растений и при заражении их патогенами (Андреева, 1988).

Обнаружено увеличение активности пероксидазы в участках листовой пластинки пшеницы, где элонгация клеток замедляется и останавливается. Это может свидетельствовать об участии фермента в терминации клеточного роста путем сшивания полисахаридов клеточной стенки через образование диферуловой кислоты.

На основании цитохимических исследований пероксидазная активность была обнаружена в цитоплазме, клеточной стенке, хромосомах и ядрышках. В молодых клетках кончика лука наивысшая активность пероксидазы сосредоточена в ядрах. Это свидетельствует о возможном участии пероксидазы в специфической ядерной функции, а так как часть изоэнзимов являются щелочными белками, то не исключено, что они могут

выполнять функцию, подобную функции гистонов. Данные о роли пероксидазы в клетках, полученные на основе цитохимических исследований, находят все больше подтверждений и на биохимическом уровне. Так, Зигель и Галстон, изучая изопероксидазы гороха, показали увеличение числа щелочных изоэнзимов в связи с ростом и дифференцировкой клеток. На этом основании ими высказано предположение, что щелочные пероксидазы могут функционировать как модификаторы генной активности.

Пероксидаза активируется при очень многих изменениях и нарушениях метаболизма растений, а некоторые изоэнзимы в ответ на стресс синтезируются de novo. Однако до сих пор нет достаточно полного объяснения механизма регуляции синтеза изоэнзимов и проявления их свойств при стрессовых и патологических воздействиях. Сложность изучения пероксидазы состоит в том, что действие фермента в нативной клетке невозможно со всей полнотой моделировать in vitro. Очевидно, именно этим объясняется то, что до настоящего времени нет единой теории о связи всех многообразных реакций, в которых участвует пероксидаза (Рогожин, 2004; Veitch, 2004).

Таким образом, широкая субстратная специфичность пероксидазы обеспечивается разнообразными механизмами ее окислительных реакций, которые осуществляются, главным образом, за счет высокой реакционной способности промежуточных форм фермента, образующихся только при наличии стабильного гем-белкового комплекса (Воронков, 1970; Lazor, 1975).

Особый интерес представляет способность пероксидазы окислять предварительно окисленным триметанол-флороглюцином такие биологически важные соединения, как НАДН2 и НАДФН2. Это свойство фермента свидетельствует о принципиальной возможности участия пероксидазы в нормальном дыхании клетки путем активации кислорода

воздуха для окисления обычных субстратов дыхания - метаболитов цикла Кребса.

Б.А. Рубин и Л.И. Логинова (Рубин, 1971) показали, что пероксидаза может осуществлять альтернативные пути окислительно-восстановительных реакций. Так, одна или больше митохондриальных изопероксидаз участвуют в побочном пути электронного транспорта без связи с участком окисилительного фосфорилирования. Пероксидаза может выполнять роль и аэробной дегидрогеназы (НАДН2-дегидрогеназы или НАДН-цитохром-с-редуктазы), что свидетельствует о вероятном функционировании этого фермента в качестве переносчика электронов. Электроны, получены от восстановленных пиридиннуклеотидов, пероксидаза передает на различные акцепторы и, следовательно, представляет собой одно их звеньев цепи переноса электронов в митохондриальной альтернативной дыхательной цепи.

Б.А. Рубин и др. (Ладыгина М.Е., Рубин Б.А, 1975) указывали на возможность участия пероксидазы в процессе аэробного дыхания и запасания энергии через окисление НАДН2. Пероксидаза особенно легко окисляет полифенолы, поэтому она играет важную роль в дыхании растений, так как наряду с полифенолоксидазой может катализировать окисление фенолов в хиноны.

Изучение пероксидазы растений показало, что это весьма динамичный фермент, чутко реагирующий при различных воздействиях на растительный организм. Большое значение придается пероксидазе в устойчивости растений к неблагоприятным факторам. Установлено, в частности, значительное активирование пероксидазы при ухудшении аэрации.

Характеристика фермента аскорбинатоксидазы

Аскорбинатоксидаза (аскорбатоксидаза) (КФ. 1.10.3.3) (АО) -глобулярный конъюгированный медьсодержащий белок. Медь в молекуле фермента находится в смешанном валентном состоянии: два атома -

одновалентные, они не несут ферментативной функции; шесть -двухвалентные, ответственные за оксидазную активность и голубую окраску водного раствора очищенного фермента. В молекуле белка содержится 18 различных аминокислот и гексозамин. Апофермент содержит 10 сульфгидрильных групп. Предполагается, что каталитические функции осуществляются не только при обратимом изменении валентности меди, но и при обратимых структурных изменениях белковой части молекулы фермента.

Аскорбатоксидаза катализирует реакцию окисления аскорбиновой кислоты (АК) в дегидроаскорбиновую кислоту (ДАК): С6Н806 + 1/2 02 С6Н606 + Н20.

АК ДАК

Методом ЭПР-спектрометрии было показано возникновение свободных радикалов АК в этой реакции (Yamazaki, 1961).

Аскорбатоксидаза обнаружена практически во всех хлорофиллоносных клетках (Гофман, 1971).

В процессе роста и старения растений аскорбатоксидазная активность меняется. При снижении интенсивности света за счет общей освещенности и удалении УФ-излучения в растениях в онтогенезе активность аскорбактоксидазы понижается (Толибеков, 1986).

В литературе имеются данные, указывающие на индукцию светом активности АО (Верхотурова, 1987).

Было обнаружено (Мерзляк, 1999; Liso, 2004), что АО локализован не только внутри, но и во внеклеточном пространстве (апопласте). Оказалось, что апопластный аскорбат защищает от повреждающего действия озона и других загрязнителей атмосферы, которые проникают в ткань листа через устьица. А в недавних работах (Fotopoulos et al., 2007) показано, что дегидроаскорбиновая кислота участвует в регуляции закрытия устьиц.

Характеристика фермента полифенолоксидазы Полифенолоксидаза относится к классу оксидоредуктаз и, согласно новой классификации, предложенной комиссией по ферментам, рекомендуется термин о-дифенолоксидаза, КФ 1.10.3.1 (о-дифенол: 02-оксидоредуктаза). Входит в подкласс аэробных дегидрогеназ или оксид аз (катализируют перенос протонов (электронов) непосредственно на кислород). Оксидазы представляют собой металлопротеиды с активным центром, включающим один или несколько атомов (ионов) металла переменной валентности (Бе, Си, Ъх\, Мо, Мл, Со). Часто металл входит в состав гемовых структур, представляющих собой систему пиррольных колец с расположенным в центре атомом металла (Бе, Си). Эти ферменты играют важнейшую роль в процессе кислородного дыхания. Они способствуют как генерации активных форм кислорода (ксантиноксидаза, оксидазы аминокислот), так и их утилизации (каталаза, пероксидаза, супероксиддисмутаза). о-Дифенолоксидаза является представителем группы ферментов, называемых медь-протеидами. Эти ферменты содержат в простетической группе атом меди.

Ферментативное действие, приводящее к окислению монофенолов и полифенолов, известно еще с конца XIX в. Каталитические системы, принимающие участие в этих процессах (дифенолоксидазы), называются по-разному: тирозиназа, фенолоксидаза, фенолаза, фенолазный комплекс, катехолоксидаза и т.д.

В отличие от большей части ферментов, обладающих высокой субстратной специфичностью, дифенолоксидазы мало специфичны. Они катализируют окисление в присутствии молекулярного кислорода не только разнообразных полифенолов и их производных, но также и ряда монофенолов с образованием соответствующих хинонов (Энгельгард, 1952).

Дифенолоксидазы способны катализировать две следующие сильно различающиеся по механизму реакции: 1) окисление о-диоксифенолов в о-хиноны (так называемая «катехолоксидазная активность»), 2)

гидроксилирование монооксифенолов с образованием о-диоксифенолов («крезолазная активность») (Михлин, 1960).

Реакция, катализируемая дифенолоксидазой, может быть представлена в следующем виде (рис. 1.1).

Общепринято мнение, что медь находится в ферменте в двухвалентном состоянии и каталитическая активность основывается на изменении валентности.

ОН

ОН

+ 02

\/

Пирокатехин

О

/N=0

4- н2о

V

о-Хинон

Рис. 1.1. Реакция, катализируемая дифенолоксидазой.

Действие дифенолоксидазы угнетается рядом веществ. Она ингибируется оксидом углерода (II), диэтилдитиокарбаматом, салицилальдоксимом, фенилтиомочевиной, тиомочевиной. Ингибиторы реагируют с ферментом или фенолами или одновременно с тем и другими.

Полифенолоксидаза легко растворима в воде, поэтому большинством авторов она классифицируется как растворимая оксидаза.

Вместе с тем за последние годы накоплены данные, свидетельствующие о том, что полифенолоксидаза связана со структурными элементами клетки. Неоднократно сообщалось об обнаружении дифенолоксидазной активности во фракции хлоропластов.

Е.В. Арциховской (Арциховская, 1954) установлено, что в тканях недозрелых яблок полифенолоксидазная активность сосредоточена во фракции пластид, однако по мере созревания происходило возрастание количества растворимого фермента и снижение активности в пластидах.

Подтверждение гетерогенности о-дифенолоксидазы получено и в других работах. В тканях яблок, например, установлено наличие двух дифенолоксидаз: одна связана с фракцией митохондрий (имеет оптимум при рН 7,2), другая - с хлоропластами (оптимум активности при рН 5,1). При этом активность о-дифенолоксидазы значительно выше в хлоропластах, чем в митохондриях.

Значительный интерес представляют данные по исследованию локализации дифенолоксидазы в тканях чайного листа. Так, было установлено, что в листьях чая содержатся водорастворимые и водонерастворимые компоненты дифенолоксидазы; причем, второй компонент отличается повышенной активностью (Запрометов, 1993).

Обработка водонерастворимых компонентов детергентами вызвала возрастание активности в 4-5 раз. В связи с этим, становится ясным вопрос о природе так называемой латентной фенолазы. Предполагается, что в экстрактах присутствует предшественник фенолазы либо комплекс фенолаза-белок-ингибитор, который разрушается при обработке экстракта детергентами или протеолитическими ферментами. Не исключено, что активация фермента, обусловленная тем или иным фактором, является следствием отделения липидного компонента, ассоциированного с латентным ферментом. Вопрос о локализации фермента требует дальнейшего детального изучения.

Дифенолоксидазы обладают способцостью гидроксилировать некоторые монооксифенолы в о-диоксифенолы. Эта реакция часто неправильно рассматривается как «крезолазная активность тирозиназы», хотя в данном случае фермент выступает лишь в качестве оксигеназы.

При окислении монооксифенолов происходит введение в молекулу ОН-группы в орто-положении. Вследствие этого дифенолоксидазы нередко включаются в группу оксигеназ, что дает основание для различного рода дискуссий по поводу природы фенолоксидаз.

Вышеперечисленные ферменты входят в группу ферментов антиоксидантной защиты, действие которых направлено на дезактивацию активных форм кислорода.

В основном состоянии молекулярный кислород представляет собой относительно стабильную молекулу, спонтанно не реагирующую с различными макромолекулами. Это объясняется его электронной конфигурацией: основная форма кислорода в атмосфере (ЗО ) находится в триплетном состоянии. Однако аэробные организмы сталкиваются с постоянной опасностью, связанной с тем, что многие процессы с участием молекулярного кислорода сопровождаются образованием так называемых активных форм кислорода (АФК), обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью (Полесская, 2007). В настоящее время к числу АФК относят производные кислорода радикальной природы (супероксид-радикал (анион-радикал) 02", гидроперекисный, радикал Н02\ гидроксил-радикал НО"), а также его реактивные производные (перекись водорода Н202, синглетный кислород 102 и пероксинитрит) (Колупаев, 2007; Przymusinski и др., 1995). Поскольку растения неподвижны и находятся под постоянным воздействием меняющихся условий среды, а также осуществляют оксигенный фотосинтез, в их тканях концентрация молекулярного кислорода оказывается более высокой, чем у других эукариот (Yu, 1994). При этом, по оценкам исследователей (Smirnoff, 2000), примерно 1% поглощаемого растениями кислорода преобразуется в его активные формы, что неизбежно связано с неполным восстановлением молекулярного кислорода.

Сингл етный кислород (102) образуется в хлоропластах в результате взаимодействия молекулярного кислорода с хлорофиллом, возбужденным квантом света и находящимся в триплетном состоянии. Энергия, необходимая для этого перехода, составляет примерно 22 ккал/моль. В результате поглощения избыточной энергии (что часто имеет место в реальных условиях) происходит обращение спина одного электрона и формирование синглетного кислорода (Asada, 1999).

Образование супероксидного анион-радикала (Ог~) происходит в фотосистеме I (ФС I) и II (ФС II) хлоропластов и на комплексах дыхательной цепи в митохондриях, а также в ряде реакций, протекающих в пероксисомах (при окислении ксантина ксантиноксидазой) (Уашапе, 1998). 02~ является источником образования других, более токсичных активных форм кислорода.

Супероксидрадикал может протонироваться до гидропероксидного радикала. Дисмутация двух анион-радикалов приводит к образованию перекиси водорода Н202 (Чеснокова, 2006).

Несмотря на имеющиеся в литературе (Гарифзянов и др., 2011) сведения о физиологической роли образующихся в растительной клетке АФК, следует понимать, что их избыточная генерация может привести клетку к неминуемой гибели. Однако в норме этого не происходит, что объясняется наличием пула большой группы ферментов, проявляющих антиоксидантные свойства и обезвреживающих реактивные производные молекулярного кислорода без образования каких-либо других токсичных веществ (Саприн, 1991).

1.3.2. Роль фотосинтетических пигментов в функционировании

растительного организма

У всех высших растений, водорослей и цианобактерий содержится хлорофилл а, хлорофилл Ъ имеется у высших растений и зеленых водорослей. Хлорофилл с, лишенный фитола, содержится в бурых и диатомовых водорослях, хлорофилл с1 - в красных водорослях. Фотосинтезирующие зеленые бактерии имеют бактериохлорофиллы с и с?, пурпурные бактерии - бактериохлорофиллы аиЬ.

Хлорофиллы хорошо растворимы в органических растворителях (этиловом эфире, бензоле, хлороформе, ацетоне, этиловом спирте) и нерастворимы в воде. Хлорофиллы имеют максимумы поглощения света в

красной и синей частях спектра. Растворы хлорофиллов обладают флуоресценцией и фосфоресценцией.

Каротиноиды - жирорастворимые пигменты, присутствующие в хлоропластах всех растений. Они входят в состав хромопластов в незеленых частях растений, например, корнеплодов моркови. К каротиноидам относят 3 группы соединений: 1) оранжевые или красные каротины, 2) желтые ксантофиллы, 3) каротиноидные кислоты. Каротины и ксантофиллы состоят из 8 остатков изопрена, которые образуют цепь конъюгированных двойных связей. Основные каротиноиды - [3-каротин, лютеин, виолаксантин и неоксантин.

Главные функции каротиноидов: поглощение света в качестве дополнительных пигментов, защита молекул хлорофиллов от необратимого фотоокисления, тушение активных радикалов, участие в фототропизме, так как способствуют определению направления роста побега (Малиновский, 2004).

Роль каротиноидов в процессах, имеющих прямые и косвенные связи с фотосинтезом, многогранна и различно трактуется исследователями. Наряду с хлорофиллом Ь они входят в состав светособирающего комплекса и участвуют в поглощении световой энергии. Существенное значение в реакциях фотосинтеза имеет защитная функция каротиноидов, которые, поглощая в области больших энергий, играют роль защитных экранов, предохраняя хлорофилл а и другие биологически активные соединения клетки от фотодеструкции. Кроме того, за последние годы исследования по каротиноидам активизировались в связи с новыми данными по их антиоксидантной активности, и регулировании окислительно-восстановительных условий в хлоропласте (Кулаева, 1996; Ладыгин, 2000).

В хлоропластах каротиноиды играют двойную роль. С одной стороны, они являются вспомогательными пигментами светособирающей антенны, улавливающими солнечный свет определенного спектрального состава. С другой - каротиноиды выполняют защитные функции: они принимают на

себя энергию от избыточного количества возбужденных молекул хлорофилла, которую молекулы каротиноидов безопасным для фотосинтетического аппарата способом рассеивают в виде тепловой энергии. В тех случаях, когда структурно-функциональные нарушения белков фотосинтетического аппарата все же происходят, вступает в действие еще один удивительный механизм эшелонированной защиты. Речь идет о репарации (исправлении) поврежденных белковых комплексов путем обновления инактивированных белков (Витковская, 1998).

Эти процессы наиболее подробно изучены для ФС2. Именно белки ФС2 являются наиболее уязвимым звеном в цепи электронного транспорта хлоропластов, подверженным разрушающему действию побочных фотохимических продуктов фотосинтеза. Если в одном из комплексов ФС2, состоящем из нескольких полипептидов, появляются структурные дефекты, препятствующие его нормальному функционированию, то это служит сигналом для разборки комплекса на составляющие его части и удаления поврежденного полипептида. Затем включается механизм экспрессии гена, кодирующего синтез поврежденного полипептида. После этого происходит сборка "вылеченного" комплекса, в котором вновь синтезированный полипептид занимает место удаленной испорченной субъединицы (Тихонов, 1998; Шестаков, 1998).

1.3.2. Общая характеристика и функции белков разных фракций в

растительных организмах

Белки - разнообразные ферменты, транспортные белки, рецепторы, поры, каналы и др. Они также вносят существенный вклад в формирование структуры клеточных мембран.

Биомембраны характеризуются чрезвычайным разнообразием и способны не только отделять содержимое клетки от внешней среды и обеспечивать разделение внутреннего объема клетки на компартменты, но и

участвовать в регуляции множества процессов (Болдырев, 1990; Геннис, 1997; Gil, 1998; Kruiff, 1997). Например, плазматические мембраны обеспечивают диффузионный барьер, активный транспорт, электрическую возбудимость, межклеточную коммуникацию, синтез компонентов клеточной стенки растений и др. На мембранах эндоплазматической сети происходит синтез белков, жиров и углеводов. Уникальность функций каждой мембраны в значительной степени определяется свойствами мембранных белков, входящих в ее состав (Гринштейн, 2001).

Среднее содержание белков в мембранах составляет примерно 60% (по массе сухого вещества), при этом в состав биомембран также входят липиды - 30% и углеводы - 10% (Болдырев, 1990). Естественно, соотношение между этими компонентами может значительно меняться в зависимости от природы мембран. Липиды - фосфолипиды, гликолипиды, холестерин - составляют костяк мембраны и ответственны за целостность мембранной структуры. Углеводы обнаруживаются в составе мембранных белков (гликопротеинов и протеогликанов) или липидов (гликолипидов). Кроме того, в мембранах содержится относительно большое количество (около 30%) связанной невымерзающей воды.

Несмотря на многообразие биомембран основные принципы структурной организации всех мембран животного, растительного и бактериального происхождения- одинаковы. Биомембрана представляется как текучий фосфолипидный бислой, в который погружены белки. Все мембранные белки свободно диффундируют в жидком липидном бислое (Уголев, 1972; Геннис, 1997; Gil, 1998).

В настоящее время считают, что сложная динамическая структура биомембран, для которой характерны искривления, фазовые переходы, вариации толщины, образование небислойных структур, определяется специфическими взаимодействиями мембранных белков с липидами (Epand, 1998). Такие взаимодействия во многом обеспечивают эффективное

выполнение мембранами разнообразных клеточных функций, возникающих в ходе метаболизма.

Белковая молекула может фиксироваться в бислое с помощью различных типов взаимодействий, включая электростатические (на уровне полярных головок липидов) и гидрофобные (в толще бислоя).

Мембранные белки подразделяют на два типа: периферические и интегральные. Периферические белки отличаются от интегральных меньшей глубиной проникновения в бислой и степенью воздействия на состояние и подвижность углеводородных цепей липидов.

Вторая группа мембранных белков - интегральные, которые связаны с мембраной за счет более прочных гидрофобных взаимодействий. Интегральные белки можно извлечь из мембраны только при разрушении липидного бислоя детергентами или органическими растворителями. Такие белки можно подразделить на внутренние трансмембранные и наружные, имеющие гидрофобный якорь. Основная функционально значимая часть молекулы внутреннего трансмембранного белка при встраивании практически полностью погружается в мембрану (Курганов, 1984).

Таким образом, многие белки могут присутствовать в организме как в мембраносвязанной, так и в растворимой циркулирующей формах. Полагают, что свойственный для этих белков баланс форм необходим для их нормального функционирования (Локшина, 1998; Van Hoof, 1997).

Изучение роли мембранной организации белков непосредственно в живом организме затруднено из-за сложной организации живой материи и одновременного протекания множества взаимосвязанных процессов. Биологическая роль различных мембранных ферментов может в значительной степени определяться их способностью к связыванию с мембраной. Во-первых, связывание с биомембраной обеспечивает локализацию (концентрирование) ферментов в определенной части клетки и/или в той области мембраны, где концентрируется субстрат. Во-вторых,

адсорбция ферментов на мембране создает возможность для сопряжения процессов катализа и трансмембранного переноса.

Мембранное окружение существенно влияет на проявляемые ферментами каталитические свойства.

Функциональная активность мембранных белков в первую очередь зависит от динамических свойств липидного матрикса мембраны, обеспечивающих конформационную подвижность фермента - способность белковой молекулы совершать обратимый конформационный переход из напряженного состояния в расслабленное. Такая возможность зависит от плотности упаковки липидов, которая в свою очередь зависит от состава мембран (Джемухадзе, 1975; Таджибаева, 1999).

От поверхностного заряда биомембран зависит электрический потенциал, который определяет локальную концентрацию заряженных субстратов и протонов вблизи мембраны. Влияние поверхностного потенциала может проявляться в сдвиге рН оптимума активности ферментов, активный центр которых локализован у поверхности мембраны, и в изменении измеряемой величины константы Михаэлиса (Кт) для заряженных субстратов (Теннис, 1997). Для ряда ферментов показана регуляция ферментативной активности изменением поверхностной плотности заряда мембран.

Синтетические поверхностно-активные вещества попадая в среду, образуют пленку на границе раздела фаз: воздушная среда - водная среда, водная среда - растение.

Пленка на границе фаз воздушная среда - водная среда ухудшает светопропускную способность поверхности водной среды, увеличивая количество отраженных лучей, преломляя свет, наблюдается явление интерференции (Ахманов, 2004). Это приводит к изменению интенсивности

. , РОС /| ' /1

41 ro"VJ с -' 1 <-

&!/, ÜJiVl О I .'.-.к Р.

фотосинтеза в водном растении уже с первых суток воздействия ксенобиотика.

Также пленка СПАВ механически ухудшает газообмен между средами, что может приводить к гипоксии растения и возникновению окислительного стресса (Кулинский, 1999; Гарифзянов, 2011). Окислительный стресс характеризуется появлением АФК, которые активируют работу ферментов антиоксидантной защиты.

Пленка СПАВ на границе фаз водная среда - растение приводит к механической закупорке устьиц, тем самым вызывая нарушение транспорта веществ, гипоксию и окислительный стресс. Кроме того, молекулы СПАВ солюбилизируют белки поверхностных тканей растения.

Дальнейшее попадание молекул СПАВ в растение приводит к перекрытию апопласта и началу солюбилизации белков клеточных мембран тканей Egeria densa. Наблюдается сначала частичное, а в дальнейшем и полное разрушение клеток с вымыванием органических компонентов из растения.

Заключение диссертации по теме «Экология (по отраслям)», Мурзин, Илья Радикович

ВЫВОДЫ

1. Анионные и катионные синтетические поверхностно-активные вещества, входящие в состав синтетических моющих средств, приводят к изменению эколото-биохимическото состояния высшего водного (погруженного) растения Egeria densa, выражающееся в повышении с первых суток активности ферментов антиоксидазной защиты: пероксидазы и полифенолоксидазы, уменьшению активности аскорбинатоксидазы на первые и третьи сутки эксперимента и увеличении активности аскорбинатоксидазы к десятым суткам воздействия.

2. Анионные и катионные синтетические поверхностно-активные вещества, входящие в состав синтетических моющих средств, вызывают разнонаправленные изменения содержания водорастворимых и мембраносвязанное в зависимости от длительности фактора.

3. Катионные синтетические поверхностно-активные вещества, входящие в состав синтетических моющих средств, оказывают более значительное действие на исследованные биохимические показатели, чем анионные синтетические поверхностно-активные вещества во всех концентрациях.

4. Анионные и катионные синтетических поверхностно-активных вещества, входящие в состав синтетических моющих средств, приводят к необратимым изменениям в тканях Egeria densa к десятым суткам эксперимента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мурзин, Илья Радикович, 2011 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абрамзон A.A. «Поверхностно-активные вещества: Свойства и применение» Второе изд., перераб. и доп. - JL: Химия, 1981. 304 с.

2. Айздайчер Н. А., Маркина Ж. В. «Токсическое действие детергентов на водоросль Plagioselmis prolonga (Cryptophyta)» // Биология моря. 2006. Т. 32. № 1. С. 50-54.

3. Айздайчер H.A., Малынова С.И., Христофорова Н.К. «Влияние детергентов на рост микроводорослей» // Биология моря. 1999. Т. 25. № 3. С. 234-238.

4. Андреева В.А. «Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений». — М.: Наука, 1988. 130 с.

5. Арциховская Е.В., Рубин Б.А. «Дыхание растений как приспособительная функция» // Усп. Современ. Биол. -1954. Т. 37. №. 2. С. 136 - 157.

6. Ахманов С.А. «Физическая оптика». Учебник. 2-е изд. - М.: Изд-во МГУ Наука, 2004. 656 с.

7. Ахмедова К. С., Петрянова-Соколова И. В. «Успехи коллоидной химии» Ташкент, 1987. 156 с.

8. Божков А.И. «Ограничения в использовании водорослей как объектов биохимических исследований и экотоксикологического тестирования» // Альгология. 1999. Т. 9. № 2. С. 18.

9. Болдырев A.A., Котелевцев С.В.,Ланио М., Альварес К., Перес П. «Введение в биомембранологию». - М: Изд-во МГУ, 1990. 208 с.

10. Браяловский Б.С. «Удаление ПАВ из водных растворов фильтрацией: Прогноз и регулирование качества воды». - Красноярск: СибНИИГИМ, 1989. С. 75-79.

П.Бриттон Г. «Биохимия природных пигментов». Пер. с англ. - М.: Мир, 1986. 422 с.

12. Вайтнер Е.В., Попов А.Н. «Влияние рогоза узколистного и рдеста

гребенчатого на динамику процессов трансформации СПАВ в природных водах» // Водное хозяйство России. 2003. Т. 5. № 5. С. 437 - 448.

13. Вастернак К., Остроумов С.А. «Воздействие загрязнения водной среды CMC Био-С на эвглену» // Гидробиол. журн. 1990. Т. 26. № 6. С. 78 - 79.

14. Вахмистров Д.Б., Зверкова O.A., Дебец Е.Ю., Мишустина Н.Е. «Гуминовые кислоты: связь между поверхностной активностью и стимуляцией роста растений» // Докл. АН СССР. 1987. Т. 293. № 5. С. 1277 - 1280.

15. Верхотурова Г.С., Кудинова Л.И., Астафурова Т.П. «Функциональная связь фотосинтеза и дыхания в разновозрастных участках листа ячменя» // Физиология растений. 1987. Т. 33. № 2. С. 261 - 265.

16. Витковская Н.М. «Метод молекулярных орбиталей: Основные идеи и важные следствия» // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 6. С. 58-64.

17. Волченко H.H., Самков A.A. «Локализация биопав в культуре Rhodococcus sp. Fl, влияние состава среды на ее поверхностно-активные свойства» // Биология - наука XXI века: 8-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино 17-21 мая 2004 г.): Тез. докл. Пущино: Пущинский науч. центр РАН. 2004. С. 144

18. Воронков Л. А., Живописцева И. В. «Физиология и биохимия здорового и больного растения». М.: МГУ, 1970. 470 с.

19. Газарян И. Г., Хушпульян Д. М., Тишков В. И. «Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений» // Успехи биол. химии. 2006. Т. 46. С. 303 -322.

20. Газарян И. Г. «Пероксидазы растений» // Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. - М.: ВИНИТИ, 1992. Т. 36. С. 4 - 25.

21. Гарифзянов А.Р., Жуков H.H., Иванищев В.В. «Образование и физиологические реакции активных форм кислорода в клетках растений» // Современные проблемы науки и образования. 2011. № 2. 21с.

22. Геннис Р. «Биомембраны: молекулярная структура и функции». М.: Мир, 1997.624 с.

23. Горелова C.B., Гарифзянов А.Р., Ляпунов С.М., Горбунов A.B., Окина О.И., Фронтасьева М.В. «Оценка возможности использования древесных растений для биоиндикации и биомониторинга выбросов предприятий металлургической промышленности» // Проблемы биогеохимии и геохимической экологии. 2010. № 1. С.155 - 163.

24. Гофман Э. «Динамическая биохимия». М.: Медицина, 1971. 311 с.

25. Гринштейн C.B., Кост O.A. «Структурно-функциональные особенности мембранных белков» // Успехи биологической химии. 2001, Т. 41. С. 77 -104.

26. Давлетшин А.И., Сильвестрова И.Г., Зубов. В.П., Егоров В.В. «Влияние ПАВ различной природы на активность пероксидазы и трипсина» // Вестник Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 1998. Т.39. №4. С. 272-275.

27. Дзюбан А.Н. «Микробиологические и химические процессы деструкции органического вещества в водоемах». Л.: Наука, 1979. 235 с.

28. Энгельгардт В.А. «Дыхательные ферменты». - М.: Изд-во иностранной литературы, 1952. 415 с.

29. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И., Ярош Н.П., Луковникова Г.А. «Методы биохимического исследования растений». Л.: Изд-во Колос, 1972. С. 49 - 50.

30. Журавель Е.В., Маркина Ж.В., Христофорова Н.К., Айздайчер H.A. «Использование микроводоросли Dunaliella salina, эмбрионов и личинок плоского морского ежа Scaphechinus mirabilis как тест-организмов для оценки качества воды в заливе Петра Великого Японского моря» // Биология моря. 2006. Т. 32. № 3. С. 188 - 196.

31. Запрометов М.Н. «Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях». - М.: Наука, 1993. 272 с.

32. Захаров В.П., Тимченко Е.В., Тимченко П.Е., Золотухина А.Д., Алембеков

C.B. «Изменение оптических характеристик гидросферы в присутствии синтетически активных веществ» // Компьютерная оптика. 2011. Т. 35 №2. С. 238-241.

33. Иванова Т.М., Рубин Б.А. «О природе фенолоксидазного дейстия пероксидазы» // Биохимия. 1962.Т 6. С.67 - 79

34. Калениченко В.П. «О влиянии некоторых факторов на скорость биораспада ПАВ» // Гидробиологический журнал. 1985. Т. 21. № 3. С. 34 -39.

35. Киршанкова Е. В. «Ультразвуковая электрокоагуляционная очистка сточных вод от поверхностно-активных веществ». Дис. канд. техн. наук: 05.17.08: Москва, 2006. 151 с.

36. Кнорре Д.Г. Мызина С.Д. «Биологическая химия». М.: Высш.шк. 1998. 479 с.

37. Ковалева О.В., Славинская Г.В. «Перспективные сорбенты для очистки воды от анионных ПАВ» // «Инновации. Интеллект. Культура»: материалы XVI Всеросс. науч.- практич. конф. молодых ученых и студ., 20 ноября 2009. Тобольск, 2009. С. 47 - 49.

38. Козел Н.В., Шалыго Н.В. «Антиоксидантная система листьев ячменя при фотоокислительном стрессе, индуцированном бенгальским розовым» // Физиология растений. 2009. Т. 56. С. 351 - 358.

39. Кокин К. А. «Экология высших водных растений». М.: МГУ, 1982. 160 с.

40. Колу паев Ю.Е. «Активные формы кислорода в растениях при действии стрессоров: образование и возможные функции» // Вестник Харьковского национального аграрного университета. Сер. Биология. 2007. № 3. С. 6 -26.

41. Косолапое Д.Б., Намсараев Б.Б. «Микробный метаболизм органического углерода в донных отложениях Рыбинского водохранилища» // Гидробиологический журнал. 2000. Т. 36. № 3. С. 44 - 50.

42. Кретович В.JI. «Основы биохимии растений» М.: Высшая школа, 1973. -342с.

43. Кулаева О.Н. «Хлоропласт и его полуавтономность в клетке» // Соросовский образовательный журнал. 1997. № 7. С.2 - 9.

44. Кулинский В.И. «Обезвреживание ксенобиотиков» // Соросовский образовательный журнал. 1999. №1. С. 8 - 12.

45. Курганов Б.И. «Адсорбция периферических ферментов олигомерными «якорными» белками мембран» // Биол. мембраны. 1984. Т.1. № 4. С. 363 -371.

46. Куренкова О.В., Славинская Г.В. «Очистка питьевой воды от ПАВ» // «Чистая вода - 2009»: труды Междунар. науч.- практич. конф., 20-21 октября 2009 г. Кемерово, 2009. С. 243 - 246.

47. Ладыгин В.Г. Биосинтез каротиноидов в хлоропластах водорослей и высших растений // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 6. С. 904 - 923.

48. Ленова Л.И., Ставская С.С., Ратушная М.Я. «Влияние додецилсульфата натрия на одноклеточные зеленые водоросли» // Гидробиол. журн. 1980. Т. 16. №3. С. 83 -87.

49. Липницкая Г.П., Паршикова Т.В. «Изменения в прочности хлорофилл-белково-липидного комплекса под влиянием поверхностно-активных веществ» // Гидробиол. журн. 1992. Т. 28. № 6. С. 60 - 67.

50. Липницкая Г.П., Паршикова Т.В., Топалова Е.К. «Влияние хлорного додецилсульфата натрия на рост хлореллы и макроцистиса в культуре» // Гидробиол. журн. 1989. Т. 25. № 2. С. 63 - 66.

51. Лукина Л.Ф., Смирнова H.H. «Физиология высших водных растений». Киев: Наукова думка, 1988. 186 с.

52. Лукиных H.A. Разумовский Э.С. Липман Б.Л. «Очистка в аэротенках и на биофильтрах сточных вод, загрязненных синтетическими поверхностно-активными веществами» // Научные труды АКХ: Городская канализация. ОНТИ АКХ. 1970. Вып 63. №5. С.22 - 32.

53. Максимов В.Н., Нагель X., Ковалева Т.Н., Остроумов С.А. «Биотестирование вод, загрязненных сульфонолом» // Вод. ресурсы. 1988. Т. 1.С. 165- 168.

54. Максимов И.В. «Про-/антиоксидантная система и устойчивость растений к патогенам» / / Успехи современной биологии. 2006. Т. 126. № 3. С.250 -261.

55. Малиновский В.И. «Физиология растений». Учеб. пособие. - Владивосток: Изд-во ДВГУ, 2004. 105 с.

56. Малюсова М.М. «Влияние трех моющих средств состава БМС-8 на метановое брожение осадка сточных вод» // Научные труды АКХ: Городская канализация. ОНТИ АКХ. 1970. Вып 63. №5. С.64 - 71.

57. Маркина Ж.В., Айздайчер H.A. «Влияние детергентов на динамику численности и физиологическое состояние бентосной микроводоросли Attheya ussurensis (Bacillariophyta) в лабораторной культуре» // Биология моря. 2007. Т. 33. №6. С. 432 - 439.

58. Матвеев А.Н. «Оценка воздействия на окружающую среду». Учебное пособие. Иркутск: Изд-во Иркутского гос. ун-та, 2007. - 179 с.

59. Мерзляк М.Н. «Активированный кислород и жизнедеятельность растений» // Соросовский образовательный журнал. 1999. №9. С. 20 - 26.

60. Джемухадзе K.M., Бузин Г.А., Милешко Л.Ф., Гелашвили H.H. «Методы современной биохимии» М.: Изд-во Московск. Ун-та, 1975. - 412 с.

61.Минибаева Ф. В., Гордон Л.Х. «Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе» // Физиология растений. 2003.Т.50. № 3. С.459 - 464.

62. Михлин Д.М. «Биохимия клеточного дыхания». М.: Изд-во АН СССР, 1960.416 с.

63. Можаев Е.А. Гаршенин В.Ф. Соловьева Л.Н., Капырина Л.М., Крятов И.А. «Гигиенические исследования по разработке нормативов допустимого содержания анионных поверхностно-активных веществ в воде водоемов»

// Научные труды АКХ: Городская канализация. ОНТИ АКХ. 1970. Вып. 63. №5. С.89 - 93.

64. Никаноров A.M., Хоружая Т.А., Бражникова JI.B., Жулидов A.B., «Мониторинг качества поверхностных вод: оценка токсичности. Серия "Качество вод"». СПб: Гидрометеоиздат, 2000. 159 с.

65. Николаевский B.C. «Биологические основы газоустойчивости растений» Новосибирск: Наука, 1979. 280 с.

66. Олейник Г.Н. «Деструкция органического вещества в донных отложениях в зависимости от его концентрации в придонной воде» // Водные ресурсы. 1993. №3. С. 313-319.

67. Остроумов С.А. «Биологические эффекты поверхностно-активных веществ в связи с антропогенными воздействиями на биосферу». М.: МАКС Пресс, 2000. 166 с.

68. Остроумов С.А. «Загрязнение, самоочищение и восстановление водных экосистем». М.: МАКС Пресс, 2005. 100 с.

69. Павлова О. Н. «Бактерии рода Pseudomonas в микробном сообществе озера Байкал». Дис. канд. биол. наук: 03.00.16: Иркутск, 2004. 146 с.

70. Паду Э.Х. «Свойства пероксидазы и фенилаланин-аммиак-лиазы при образовании и лигнификации клеточных стенок стебля пшеницы» // Физиология растений. 1995. Т.42. № 3. С.408 - 415.

71.Паршикова Т.В. «Участие поверхностно-активных веществ в регулировании развития микроскопических водорослей» // Гидробиол. журн. 2003. Т. 39 № 1. С. 64 - 70.

72. Полевой В.В. «Физиология растений» М.: Высшая школа, 1989. 464 с.

73. Полесская О.Г. «Растительная клетка и активные формы кислорода». Учебное пособие. М: КДУ, 2007. 140 с.

74. Пушкарев В.В., Трофимов Д.И. «Физико-химические особенности очистки сточных вод от поверхностно-активных веществ». М.: Химия, 1975. 144 с.

75. Рогожин В. В. «Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы

живых организмов». СПб: ГИОРД, 2004. 240 с.

76. Розенцвет O.A., Макурина О.Н., Косицына A.A., Мурзин И.Р. «Исследования влияния ионов кадмия и некоторых поверхностно-активных веществ на содержание пигментов в тканях водного растенияEgeria densa» // Изв. Самар. НЦ РАН. 2009. Т.П. № 1. С. 733 -736.

77. Рубин Б.А., Арциховская Е. В, Аксенова В.А. «Биохимия и физиология иммунитета растений». М.: Высшая школа, 1975. 320 с.

78. Ладыгина М.Е., Рубин Б.А. «Физиология и биохимия дыхания растений». М.: Изд-во Моск. ун-та, 1974. 512 с.

79. Рубин Б.А. «Энзимология и биология дыхания растений». Учеб. пособие для студ.ун-тов. Казань: Высш.шк., 1966. 288 с.

80. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.1.4.107401

81. Саприн А.Н. «Ферменты метаболизма и детоксикации ксенобиотиков» // Успехи биологической химии. 1991. Т. 32. С. 146 - 172.

82. Саут Г., Уиттик А. «Основы альгологии». М.: Мир. 1990. 597 с.

83. Сафонова Е. А. «Структурные, термодинамические и реологические свойства водных растворов смесей анионного ПАВ и алкилдиметиламиноксида». Дис. канд. хим. наук: 02.00.04: Санкт-Петербург, 2009. 117 с.

84. Северин С.Е. «Практикум по биологической химии». 2-е изд. М.: Изд-во МГУ, 1989. 509 с.

85. Селье Г. «От мечты к открытию: Как стать ученым». М.: Прогресс, 1987. 368 с.

86. Соломонова Е.А. «Изучение устойчивости макрофитов к анионным ПАВ и ПАВ-содержащим смесевым препаратам в целях разработки научных основ фитотехнологий». М.: МАКС-Пресс, 2007. 38 с.

87. Скоупс Р. «Методы очистки белков» Пер. с англ. М.: Мир, 1985. С. 34 - 52.

88. Славинская Г.В., Ковалева О.В. «Влияние поверхностно-активных веществ естественного и искусственного происхождения на качество питьевой воды» // Безопасность жизнедеятельности. 2009. Т. 12. С. 21 - 25.

89. СтокерХ.С., Сигер C.JI. «Загрязнение органическими веществами (нефть, пестициды и ПАВ)" в кн.: «Химия окружающей среды». Пер. с англ. (Под. Ред. Цыганкова А.П.) М.: Химия, 1982. 672 с.

90. Таджибаева Э.Т., Ватина О.Н., Замараева М.В., Гагельганс А.И., Тукфатуллина И.И., Салахутдинов Б.А., Арипов Т.Ф. «Роль структуры мембран в активации митохондриальных фосфолипаз,2. Возможные механизмы модификации крамбином фосфолипазной активности и микровязкости мембран митохондрий» // Биол. мембраны. 1999. Т. 16. № 1. С. 57-63.

91. Тарчевский И.А. «Катаболизм и стресс растений». М.: Наука, 1993. 83 с.

92. Таубман А.Б. «Коллоидные поверхностно-активные вещества». М.: Мир. 1960. 320 с.

93. Титов А.Ф., Таланова В.В., Казнина Н.М., Лайдинен Г.Ф. «Устойчивость растений к тяжелым металлам». Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. 172 с.

94. Тихонов А.Н. «Защитные механизмы фотосинтеза» // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 9. С. 16-21.

95. Ткаченко Ф.П., Куцын Е.Б. «Влияние детергентов на аминокислотный состав белка зеленой водоросли Cladophora vagabunda (L.) Hoek» // Гидробиол. журн. 2002. Т. 38. № 3. С. 94 - 98.

96. Уголев А.М. «Мембранное пищеварение. Полисубстратные процессы, организация и регуляция». Ленинград: Наука, 1972. 260 с.

97. Фелленберг Г. «Загрязнение природной среды. Введение в экологическую химию» Пер. с нем. М.: Мир, 1997. 232 с.

98. Филипцова Г.Г., Смолич И.И. «Основы биохимии растений». Минск: БГУ, 2004. 136 с.

99. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. «Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах» // Успехи современного естествознания. 2006. №7. С. 29 - 36.

100. Чиркова Т.В. «Физиологические основы устойчивости растений». СПб: Изд-во СПб ун-та, 2002. 244 с.

101. Цвелёв H.H. «Семейство Водокрасовые (Hydrocharitaceae)» // Под ред. А. JL Тахтаджяна. Жизнь растений. В 6-ти т. М.: Просвещение, 1982. Т.6. С. 275.

102. Шакирова Ф.М. «Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция». Уфа: Гилем, 2001.160 с.

103. Шапиро Д.К. «Практикум по биологической химии». Минск: Вышэйшая школа, 1970. 288 с.

104. Шевердяев О.Н. Белов П.С. Шкитов A.M. «Поверхностно-активные вещества: Свойства, технология, применение, экологические проблемы». Учебное пособие. М.: Изд-во ВЗПИ, 1992, 172 с.

105. Шестаков C.B. «Молекулярная генетика фотосинтеза» // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 9. С. 22 - 27.

106. Щербаков С. Н. «Комплексные методы очистки хозяйственно-питьевых вод». Дис. канд. техн. наук : 25.00.36 : Москва, 2003. 170 с.

107. Ямпольская Г.П., Задымова Н.М., Тарасевич Б.Н., Еленский A.A. «Исследование взаимодействия неионного поверхностно-активного вещества (Твин-80) с сывороточным альбуминомоптическими методами» // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. Химия. 2004. Т. 45. №6. С. 371 - 375.

108. Angeletti G., Bjorseth A. «Organic micropollutants in the aquatic environment» // Proceedings of the 5th European Symposium, Rome, Italy, Oct. 20-22, 1987. 1988. P. 108-115.

109. Alder A.C., Siegriest H., Gujer W., Giger W. «Behavior of NTA and EDTA in biological wastewater treatment» // Water Research. 1990. V. 24. P. 733 -742.

110. Alvarez M.E., Pennel R.I., Meijer P.J., Ishikawa A., Dixon R.A., Lamb C. «Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity» // Cell. 1998. V. 92 P. 773 -784.

111. Asada K. «The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons» // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 601 - 639.

112. Bacon M., Thompson D., Davies W. «Can cell wall peroxidase activity explain the leaf growth response of Lolium temulentum L. during drought?» // J. Exp. Bot. 1997. V. 48 № 12. P. 2075 - 2085.

113. Bredford M. M. «А Rapid and Sensitive Method for Principle of Protein-Dye Binding» // Analyt. Biochem. 1976. V. 72.

114. Coffey B.T., Clayton J.S. «Submerged macrophytes of Lake Pupuke, Takapuna, New Zealand» // New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research. 1986. V. 21. P. 193 - 198.

115. Dawson. «Probing structure-function relations in heme-containing oxygenases and peroxidases» // Science. 1989. V. 151. P. 222-227.

116. Devliegher W., Syamsul M., Verstraete W. «Survival and Plant Growth Promotion of Detergent-Adapted Pseudomonas fluorescens ANP15 and Pseudomonas aeruginosa 7NSK2» // J. Biosciences. 1995. V. 61. № 11. P. 3865 -3871.

117. Diederix R., Busson S., Ubbink M., Canters G. W. «Increase of the peroxidase activity of cytochrome c-550 by the interaction with detergents» // J. Mol. Cat. B- Enzym. 2004. V. 27. № 2. P. 75 - 82.

118. Djakovic Т., Jovanovic Z. «The role of cell wall peroxidase in the inhibition of leaf and fruit growth» // Plant physiol. Special Issue 2003 .P. 264 - 272.

119. EU Enviroment Directorate. PHOSPHATES and ALTERNATIVE Detergent Builders - Final Report. Wre Ret: UC 4011 june, 2002. P. 334.

120. Felton G.W., Donato K., Del Vecchio R.J., Duffey S.S. «Activation of plant foliar oxidases by insect feeding reduces nutritive quality of foliage for noctuid

herbivores» // Journal of Chemical Ecology 1989. V. 15. P. 2667-2694.

121. Fotopoulos et al. «Altered stomatal dynamics in ascorbate oxidase over-expressing tobacco plants suggest a role for deliydroascorbate signaling» // J. Exp.Bot. 2007. V.59 № 4. P. 729 - 737.

122. Gaspar at al. «Peroxidases in plant growth, differentiation and development processes». In: Welinder. «Biocemical, Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases» , Oxford University Press. 1979. 568 p.

123. Gibbons, M.V., Gibbons H.L., Systma M.D. «A citizen's manual for developing intedrated aquatic vegetation management plants, first edition». Washington State Department of Ecology, 01ympia,WA, 1991. 360p.

124. Gould KS, McKelvie J, Markham KR. «Do anthocyanins function as antioxidants in leaves? Imaging of H202 in red and green leaves after mechanical injury» // Plant, Cell and Environment. 2002. V. 25. P. 1261-1269.

125. Gülen H., et al. «Peroxidase activity and Lipid Peroxidation in Strawberry (Fragaria X ananassa) plants uder low temperature» // J. Biol.Environ. SCL, 2008. V.2. № 6. P. 95- 100.

126. Hanke G., Bowsher C., Jones M.N. et al. «Proteoliposomes and plant transport proteins» // J. Exp. Bot. 1999. Vol. 50. P. 1715 - 1726.

127. Helenius A., Simons K. «Solubilization of membranes by detergents» // Biochim Biophys Acta. 1975. V. 415. №. 1. P. 29 - 79.

128. Hiraga S.et al. «A Large Family of Class III Plant Peroxidases» // Plant Cell Physiol. 2001. V. 42 № 5. P. 462 - 468.

129. Imanishi A., Momotani Y., Isemura T. «The Interaction of Detergents with Proteins: The Effect of Detergents on the Conformation of Bacillus subtilis a-Amylase and Bence-Jones Protein» // J. Biochem. 1965. V. 57. № 3. P. 417 -429.

130. John H. «Monograph of the genus Egeria Planchón». Darwiniana. 1961. V. 12. P. 293-307.

131. Kimerle R.A., Swisher R.D. «Reduction of aquatic toxicity of linear

alkylbenzene sulfonate (LAS) by biodégradation» // Water Research. 1977. V. 11. P. 31 -37.

132. Lazor R.L. «The ecology, nomenclature and distribution of hydrilla (Hydrilla verticillata Casp.) and Brazilian elodea (Egeria densa Planch.)» // Proceedings of the Southern Weed Science Society. 1975. V.38. P. 269 - 273.

133. Leenheer J.A., Wershaw R.L., Brown P.A., Noyes T.I. «Detection of poly(ethylene glycol) residues from nonionic surfactants in surface water by 'H and 13C nuclear magnetic resonance spectrometry» // Environmental Science and Technology. 1991. V. 25. P. 161-168.

134. Liso R., De Tullio MC. «Localization of ascorbic acid, ascorbic acid oxidase, and glutathione in roots of Cucurbita maxima L» // J Exp Bot. 2004.V. 55. № 408. P. 2589-2597.

135. Musetti R., di Toppi LS., Martinin M., Ferrini'F., Loschi A., Favali MA., et al. «Hydrogen peroxide localization and antioxidant status in the recovery of apricot plants from European Stone Fruit Yellows» // European Journal of Plant Pathology. 2005. V. 112. P. 53-61.

136. Neary J.T., Davidson B., Armstrong A., Strout H. V., Maloof F. «Solubilization of thyroid peroxidase by nonionic detergents» // J. Biol Chem. 1976. V. 251. № 8. P. 2525 - 2529.

137. Nurmi K., Ossipov V., Haukioja E., Pihlaja K. «Variation of total phenolic content and individual low-molecular-weight phenolics in foliage of mountain birch trees» Journal of Chemical Ecology. 1996.' V. 22. P. 2023 - 2040.

138. Onsa G., Saari N., et al. «Histochemical Localization of Polyphenol Oxidase and Peroxidase from Metroxylon sagu» // Asia Pacific Journal Biotechnol. 2007. Vol. 15. №2. P. 91-98.

139. Orozco-Cârdenas M.L., Nârvaez-Vâsquez J., Ryan C.A. «Hydrogen peroxide acts as a second messenger for the induction of defence genes in tomato plants in response to wounding, systemin and methyl jasmonate» // Plant Cell. 2001. V. 13 P. 179-191.

140. Passardi F. C., Cosío C., Penel C., Dunand. «Peroxidases have more functions than a Swiss army knife» // Plant Cell Rep. 2005. V. 24. P. 255 - 265.

141. Patoczka J., Pulliam G. «Biodégradation and secondary effluent toxicity of ethoxylated surfactants» // Water Researc. 1990. V. 24. P. 965 - 972.

142. Pellinen RI, Korhonen M-S, Tauriainen AA, Palva ET, Kangasjârvi J. Hydrogen peroxide activates cell death and defence gene expression in birch. Plant Physiology 2002. V. 130 P. 549-560.

143. Pieterse A.H., Murphy K.J. «Aquatic Weeds The Ecology and Management of Nuisance Aquatic Vegetation». Oxford University Press, 1993. 450 p.

144. Pignocchi C., Kiddle G., Hernández I., et al. «Ascorbate Oxidase-Dependent Changes in the Redox State of the Apoplast Modulate Gene Transcript Accumulation Leading to Modified Hormone Signaling and Orchestration of Defense Processes in Tobacco» // Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 423 - 435.

145. Przymusinski R., Rucinska R., Gwozdz E.A. «The stress stimulated 16 kDa polypeptide from lupin roots has properties of cytosolic Cu/Zn-superoxide dismutase» // Environ. Exp. Bot. 1995. V.35. P.485 - 495.

146. Roberts D.E., Church A.G., Cummins S.P. «Invasion of E. densa into the Hawkesbury-Nepean River, Australia» // Journal of Aquatic Plant Management. 1999. V. 37. P. 31-34.

147. Smirnoff N. «Ascorbic acid: metabolism and functions of a multi-facetted molecule» // Current Opinion in Plant Biology. 2000. V. 3. P. 229 - 235.

148. Subramanian M., Sheshadri B.S., Venkatappa M.P. «Interaction of proteins with detergents: Binding of cationic detergents with lysozyme» // J. Biosciences. 1986. V. 10. № 3. P. 359 - 371.

149. Tscharntke T., Thiessen S., Dolch R., Boland W. «Herbivory, induced resistance and interplant signal transfer in Alnus glutinosa» // Biochemical Systematics and Ecology. 2001. V. 29 P. 1025 -1047.

150. Veitch N.C. «Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme» // Phytochemistry. 2004. V. 65. № 3. P. 249 - 259.

151. Wallace G., Fry S.C. «Action of diverse peroxidases and laccases on six wall-related phenolic compounds II» // Phytochemistry. 1999. V.52. № 5. P.769 -773.

152. Welinder KG. «Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases» // Curr. Opin. Struct. Biol. 1992. V. 2 P. 388 - 393.

153. Yamane Y., Kashino Y., Koike H., Satoh K. «Effect of high temperatures on the photosynthetic systems in spinach: Oxygen-evolution activity, fluorescence characteristics and the denaturation process» // Photosynthesis Research. 1998. V. 57. P. 51-59.

154. Yu B. «Cellular defenses against damage from reactive oxygen species» // Physiol. Rev. 1994. V. 74. P. 139 - 162.