Влияние рибосомальных компонентов и протеогликанов бактерий на микробные сообщества и механизмы противоинфекционной резистентности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Крестова, Екатерина Ивановна

• Крестова, Екатерина Ивановна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Крестова, Екатерина Ивановна

ВВЕДЕНИЕ................................................................................... 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................... 23

1.1. Основные возбудители бактериальных инфекций дыхательных путей... 23

1.2. Структурные и функциональные особенности внутриклеточного белкового комплекса бактерий.......................................................... 24

1.3. Реактивность буккальных эпителиоцитов и методы ее оценки............. 33

1.4. Кислород-зависимая биоцидность нейтрофилов и методы ее оценки..... 42

1.5. Структура и функции бактериальных биопленок.............................. 53

ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ РИБОСОМАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ HAEMOPHILUS INFLUENZAE, STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS PYOGENES, KLEBSIELLA PNEUMONIAE И ПРОТЕОГЛИКАНОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE НА РЕЦЕПТОРНУЮ АКТИВНОСТЬ БУККАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ В ОТНОШЕНИИ

CANDIDA ALBICANS..................................................................... 57

ГЛАВА 3. ДЕЙСТВИЕ РИБОСОМАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ HAEMOPHILUS INFLUENZAE, STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS PYOGENES, KLEBSIELLA PNEUMONIAE И ПРОТЕОГЛИКАНОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE НА АКТИВАЦИЮ И РЕГУЛЯЦИЮ КИСЛОРОД-ЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА

НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА............................................... 63

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА РИБОСОМАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ HAEMOPHILUS INFLUENZAE, STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS PYOGENES, KLEBSIELLA PNEUMONIAE И ПРОТЕОГЛИКАНОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE НА

БИОПЛЕНКУ PSEUDOMONAS AERUGINOSA.................................... 70

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АНТИТЕЛ К РИБОСОМАЛЬНЫМ КОМПОНЕНТАМ HAEMOPHILUS INFLUENZAE,

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS PYOGENES, KLEBSIELLA PNEUMONIAE И ПРОТЕОГЛИКАНАМ KLEBSIELLA PNEUMONIAE В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ И

БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ПАТОЛОГИЯМИ.................................. 75

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................. 82

ВЫВОДЫ.................................................................................... 90

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ................................................ 91

ПЕРСПЕКТИВЫ НАПРАВЛЕНИЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ 91

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................... 92

БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................... 93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................. 94

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние рибосомальных компонентов и протеогликанов бактерий на микробные сообщества и механизмы противоинфекционной резистентности»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Заболеваемость бактериальными инфекциями верхних дыхательных путей в человеческой популяции имеет стабильно высокий уровень [32, 74]. Микробный спектр возбудителей таких инфекций разнообразен [21, 37] и включает патогены, способные к персистенции [8]. Постоянная циркуляция бактерий, вызывающих инфекции респираторного тракта, поддерживается различными факторами микробной патогенности, такими как капсулообразование (для S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae и др.), высокая инвазивность (S. pyogenes) и пр. При этом множественность серотипов, антигенная мимикрия и Т-независимость капсульных антигенов у бактерий препятствуют формированию продолжительного иммунитета [53] и способствуют реинфекции, что особенно выражено у детей. Известно, что при контакте с возбудителями инфекций, в первую очередь, вырабатываются антитела к поверхностным/протективным антигенам [125], которые наиболее изучены [107, 171, 180]. В то же время, при длительных и постоянных контактах с патогенами в организме человека начинают появляться антитела и к внутренним антигенам микроорганизмов (качественная сероконверсия) [36, 89, 101, 112], которые также могут быть инициаторами иммунного ответа. Поэтому исследование влияния внутриклеточных рибосомных компонентов и мембранных протеогликанов бактерий, часто колонизирующих респираторный тракт, на функциональную активность различных эффекторов противоинфекционной резистентности представляет научный интерес.

Степень разработанности темы исследования

Одна из первых отечественных работ, в которых были описаны свойства рибосомальных компонентов бактерий (в частности белков), принадлежит Маянскому А.Н. (1976) [49]. Также над изучением внутренних

компонентов бактерий (рибосомных белков и пр.), работали такие исследователи, как Исхакова С.Х., Вершинина В.И., Лукашков В.М. [13, 25, 39]. Существует ряд публикаций зарубежных авторов, посвященных данной проблеме [111, 128, 177]. Однако в вышеуказанных работах внимание было акцентировано на функциях рибосомальных протеинов и их значении для микроорганизма. Последние работы, посвященные бактериальным рибосомным белкам, отражают важность их использования в диагностике инфекционных заболеваний [185, 212].

Существует также большой ряд работ, в которых внутренние компоненты бактерий рассматривают с точки зрения их иммуномодулирующих свойств. Так, на основе бактериальных рибосом и протеогликанов бактерий, вызывающих респираторные инфекции -Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes и Haemophilus influezae - был сконструирован препарат «Рибомунил». Имеется значительное число работ, указывающих на иммуномодулирующее действие данного препарата по результатам клинических исследований [7, 26, 129, 160, 161, 167, 184, 202]. Также существуют единичные публикации по изучению воздействия внутренних компонентов бактерий на различные звенья иммунитета in vitro: дендритные клетки [114, 147, 168, 174], индукцию синтеза цитокинов [139, 173] и пр. [110, 137, 179]. Однако, в вышеуказанных работах рибосомальные компоненты и протеогликаны бактерий, вызывающих инфекции респираторного тракта, рассматриваются исключительно как иммуномодуляторы, при этом игнорируется возможность их участия в патогенезе заболевания. Так, до сих пор не проводилось комплексного исследования механизмов взаимодействия внутренних компонентов бактерий, наиболее часто инфицирующих дыхательные пути, с факторами «первой линии» противоинфекционной защиты организма, такими как эпителий слизистых оболочек, нормальная микрофлора, фагоциты, а также их способности индуцировать синтез протективных

антител. Таким образом, в современной микробиологии имеется пробел, касающийся вопроса роли внутренних (рибосомных и мембранных) компонентов бактерий в патогенезе респираторных инфекций, которые вызываются часто встречаемыми возбудителями, например, такими как S. pyogenes, S.pneumoniae, H. influezae и K. pneumoniae [21, 91].

Цель исследования: Цель исследования: оценить реактивность эпителиоцитов и нейтрофилов человека, жизнеспособность микробных сообществ, а также образование специфических антител у людей после контакта с комплексом рибосомальных компонентов Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae и протеогликанами мембраны Klebsiella pneumoniae.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние бактериальных рибосомальных компонентов и протеогликанов на рецепторную активность буккальных эпителиоцитов в отношении грибов Candida albicans in vitro.

2. Изучить воздействие рибосомальных компонентов и протеогликанов на кислород-зависимую реактивность нейтрофилов крови человека.

3. Исследовать влияние рибосомальных компонентов и протеогликанов бактерий на формирование и структурную целостность биопленки, образованной Pseudomonas aeruginosa.

4. Определить антителостимулирующие свойства рибосомальных компонентов Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae и протеогликанов Klebsiella pneumoniae у здоровых людей и больных детей с различными хроническими патологиями.

Научная новизна исследования

Впервые обнаружено, что рибосомные компоненты и протеогликаны бактерий снижают адгезию C. albicans к эпителиоцитам через подавление работы адгезивного аппарата буккальных клеток и выделение ими метаболитов, снижающих адгезию кандид.

Установлен прямой и комплемент-зависимый механизм активации кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов крови рибосомальными компонентами и протеогликанами.

Впервые исследовано взаимодействие рибосомных компонентов S. pyogenes, S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae и протеогликанов K. pneumoniae, а также метаболитов S. aureus и S. epidermidis со структурированным микробным сообществом, образованным P. aeruginosa in vitro. Показано, что метаболиты S.aureus подавляют формирование и нарушают целостность биопленки P. aeruginosa.

Впервые определены титры сывороточных антител к комплексу рибосом S. pyogenes, S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae и протеогликанам K. pneumoniae у здоровых людей разного возраста и больных детей с хроническими воспалительными заболеваниями толстого кишечника, хроническим энтеритом и целиакией, муковисцидозом, бронхиальной астмой, хроническим гастродуоденитом, атопическим дерматитом и хроническими вирусными гепатитами.

Теоретическая и практическая значимость работы

Изучено действие комплекса рибосомных компонентов S. pyogenes, S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae и протеогликанов K. pneumoniae на биопленку P. aeruginosa, что расширяет знания о влиянии внутренних компонентов бактерий, колонизирующих респираторный тракт на процессы, протекающие в микробных сообществах. Получены новые данные о механизмах взаимодействия бактериальных рибосомальных структур и

протеогликанов мембраны с факторами «первой линии» противоинфекционной защиты, такими как мукозальные эпителиоциты и нейтрофильные гранулоциты.

Была разработана оригинальная тест-система на основе ИФА, с помощью которой был проведен мониторинг содержания уровня сывороточных иммуноглобулинов IgG и IgM к внутренним компонентам S. pyogenes, S. pneumoniae, H. influenzae и K. pneumoniae у здоровых доноров и детей с различными хроническими патологиями.

Разработанные методы используются в работе лаборатории клинической иммунологии и молекулярной диагностики ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России (г. Нижний Новгород) (акт о внедрении от 13 января 2016 года), а также в учебном процессе - на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВО НижГМА Минздрава России (г. Нижний Новгород) (акт о внедрении от 3 декабря 2015 года).

Методология исследования

Предметом исследования стали взаимоотношения рибосомных компонентов и мембранных протеогликанов бактерий с микробной биопленкой и отдельными эффекторами противоинфекционной защиты. Планирование и выполнение исследований, направленных на решение поставленных задач, проводилось на основе общенаучных и специфических методов. Основными объектами исследования явились бактерии видов Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, микромицеты Candida albicans, рибосомальные компоненты Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae и протеогликаны Klebsiella pneumoniae, буккальные эпителиоциты, сыворотка крови человека, цельная кровь, нейтрофилы крови. Работа выполнена с применением современного поверенного оборудования,

использовались бактериологические, иммунохимические методы, методы с использованием выделения клеток, а также статистический анализ.

Материалы исследования

В работе применяли рибосомальные компоненты Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae и протеогликаны мембраны Klebsiella pneumoniae, получаемые из коммерческого препарата «Рибомунил» (Pierre Fabre Medicament Production, Франция), содержащего бактериальные рибосомы, включая рибосомы K. pneumoniae (3.5 доли), S. pneumoniae (3.0 доли), S. pyogenes (3.0 доли), H. influenzae (0.5 доли), титрованные до 70% РНК - 750 мкг, протеогликаны мембранной части K. pneumoniae (15 долей) - 1,125 мг, вспомогательные вещества: кремний коллоидный гидрофобный (1,5 мг), магния стеарат (6 мг), сорбитол (до 294 мг). Рибомунил разтворяли карбонат-бикарбонатном буфером (pH 9,5), забуференным физиологическим раствором (ЗФР) или раствором Хенкса без индикатора (1 мг/мл) и ресуспендировали ультразвуком (УЗДН-2Т, Россия; 2 мин, 22 кГц) [88]. Полученную суспензию освобождали от корпускулярных добавок (кремний, магния стеарат), применяющихся при создании лекарственной формы, путем центрифугирования (3000g, 10 мин), в дальнейшем использовали надосадочную жидкость. Контроль наличия активных веществ в пробе проводили путем определения РНК до и после обработки ультразвуком и центрифугирования с помощью метода количественного определения нуклеиновых кислот по Спирину [30], а также с помощью определения концентрации белка.

Для определения РНК в пробирку вносили 1,0 мл исследуемого раствора и доводили дистиллированной водой до 1,5 мл. Добавляли в каждую пробу по 1,5 мл раствора хлорной кислоты, закрывали пробирки капельницами и ставили на гидролиз в кипящую водяную баню на 20 мин.

Гидролизаты охлаждали. Определяли экстинкцию содержимого каждой

пробы на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при 270 и 290 нм.

Содержание РНК рассчитывали по формуле:

(Е270- Е290) ■ 10,5 х=-,

0,19

где х- концентрации РНК, мг/л;

Е270- экстинкция исследуемого гидролизата при 270 нм; Е290- экстинкция исследуемого гидролизата при 290 нм; 0,19 - удельная экстинкция фосфора нуклеиновых кислот в концентрации 1

мг/л;

10,5 - коэффициенты пересчета содержания фосфора на концентрацию нуклеиновых кислот исходя из теоретического содержания фосфора в РНК 9,5%.

В результате определения концентрация РНК в растворе до обработки ультразвуком составила 1 ± 0,05 мг/мл, после обработки - 1±0,07 мг/мл. В дальнейшем раствор доводили до рабочей концентрации (0,15 мг/мл, 0,02 мг/мл или 10 мкг/мл), в зависимости от задачи эксперимента.

Концентрацию белка и белковых фракций проводили с помощью анализатора акустического компьютеризированного АКБа-01-«БИ0М» (ЗАО Фирма «БИОМ», Россия) (рис.1). Принцип действия анализатора основан на измерении резонансных частот термостатируемых акустических ячеек залитых исследуемой жидкостью. Резонансные частоты измеряются встроенным частометром после завершения термостатируемых ячеек и автоматической настройки фазочувствительных схем под управлением микроконтроллера. Т.о., вещества в пробе распределяются в зависимости от молекулярной массы и заряда. Значения резонансных частот передаются в ПК для хранения и обработки специальным программным обеспечением.

Общее содержание белка в среднем составило: до обработки ультразвуком - 360,45±1,1 г/л, после обработки - 347,6±1,0 г/л.

Концентрация белковых фракций по молекулярной массе составила: от 160 кДа до 1000 кДа - 231,8±1,6 г/л, от 3000 кДа до 10000 кДа - 79,55±0,6 г/л, свыше 10000 кДа - 69,33±1,2 г/л до обработки и от 160 кДа до 1000 кДа -191,85±1,1 г/л, от 3000 кДа до 10000 кДа - 85,6±0,9 г/л, свыше 10000 кДа -81,45±1,6 г/л - после обработки.

Фракции белков

2 3 4 5 6

Рисунок 1 - Определение концентрации белка и белковых фракций в используемом растворе.

Примечание: 4 - белки с молекулярной массой от 160 кДа до 1000 кДа,

5 - белки с молекулярной массой от 3000 кДа до 10000 кДа,

6 - белки с молекулярной массой свыше 10000 кДа.

Были исследованы 302 образца сыворотки крови человека: 71 сыворотка здоровых взрослых доноров (Нижегородский областной центр крови им. Н.Я. Климовой, Н. Новгород,), 35 сывороток от здоровых детей 1114 лет (Научный центр здоровья детей РАМН, Москва), 171 сыворотка детей и подростков 4 мес.-17 лет с различными патологиями (ФГБУ ПФМИЦ Минздрава России, ГБУЗ НО «НОДКБ»), 25 сывороток пуповинной крови (Научный центр здоровья детей РАМН, Москва). В экспериментах также были использованы 18 образцов цельной гепаринизированной крови здоровых доноров.

Клетки буккального эпителия получали от 55 доноров (мужчин и женщин 18-30 лет), утром, натощак, с внутренней поверхности щеки, дважды отмывали (40g, 5 мин) ЗФР, готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл.

Взвесь лейкоцитов, содержащих 60-70% нейтрофилов, получали из крови с помощью декстрана Т-500 [100]. Кровь, стабилизированную гепарином, разводили в 2 раза физиологическим раствором, добавляли к раствору декстрана Т-500 (Sigma, США) (3,42%) в соотношении 2:1 и выдерживали 90-120 мин под углом 450 при 40 С. Надосадок (лейковзвесь) отбирали и дважды отмывали (320 g) в течение 5 мин. Концентрацию лейкоцитов доводили до 1х106 клеток/мл раствором Хенкса без фенолового красного.

Микробиологические методы

Штаммы бактерий

В исследованиях использовали штаммы Staphylococcus aureus 5983/2, 18А, 5663 и 5583, Staphylococcus epidermidis 178М, 3287/5, Pseudomonas aeruginosa 485, Serratia marcescens 514 а также Candida albicans штамм 601 из коллекции кафедры микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВО НижГМА Минздрава России.

Питательные среды

Для культивирования микроорганизмов использовали питательные среды: ТСБ (трипсинизированный соевый бульон) (Becton, Dickinson and Company, США), агар Сабуро (HiMedia, Индия), питательный агар (Биотехновация, Россия) и среда LB, приготовленная по методу Bertani: 10 г триптона (Difco laboratories, США), 5 г дрожжевого экстракта (Difco laboratories, США), 10 г NaCl, вода - до 1 л, pH доводили NaOH до 7.0 [72, 108]. Культивирование микроорганизмов проводили в течение 24-48 часов при температуре 370С в аэробных условиях.

Идентификация микроорганизмов по определению биохимической активности

Идентификацию видовой принадлежности микроорганизмов проводили, используя определение биохимической активности организмов с

помощью диагностических тест-систем STAPHYtest-24 (ERBA Lachema, Чехия), API-Staph, API 20 NE (BioMerieux, Франция), хромогенной среды Hi Chrome агар (Hi Media, Индия).

Идентификация бактерий по протеому бактериальной клетки

Идентификацию бактерий по протеому проводили при помощи масс-спектрометрии MALDI-TOF MS. Для этого использовали программный пакет Maldi Biotiper automatic, обеспечивающий исследование методом прямого профилирования на масс-спектрометре с азотным лазером 337 нм Microflex (Bruker Daltonics, Германия). Чистую культуру микроорганизмаов соединяли с 1 мкл матрицы (насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в смеси 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты), наносили непосредственно на мишень (планшет) и сушили на воздухе, затем мишень загружали в масс-спектрометр и проводили масс-спектрометрию. Анализ изученного масс-спектра и его сравнение с масс-спектрами референсной библиотеки осуществляли с помощью программ flexControl и flexAnalysis. Надежность идентификации отражала система баллов (scores), разработанная фирмой-производителем (Bruker Daltonics) на основе статистических алгоритмов. Значение score=2,300-3,000 соответствовало статистически значимой достоверности видовой идентификации.

Культивирование и приготовление взвеси дрожжеподобных грибов Candida albicans

Культивирование дрожжеподобных грибов Candida albicans проводили на среде Сабуро (HiMedia, Индия) в течение 24-часов при температуре 370С в обычной атмосфере. Выросшие колонии смывали, отмывали трижды и

п

ресуспендировали в растворе Хенкса, получая разведение 10 кл/мл.

Культивирование и получение метаболитов бактерий рода Staphylococcus

Бактерии видов S. aureus и S. epidermidis выращивали на среде ТСБ с 1% глюкозой в течение 24-часов при температуре 370С в обычной атмосфере.

Бульонные культуры стандартизовали по количеству бактериальных клеток (106 КОЕ) Супернатант готовили путем центрифугирования (2000g, 15мин) и пропускали через бактериальный фильтр, задерживающий частицы более 0,45 мкм в диаметре. Полученные фильтраты использовали в дальнейших опытах.

Культивирование и приготовление взвеси Serratia marcescens

Бактерии выращивали 24 часа при 370С на питательном агаре (Биотехновация, Россия) в обычной атмосфере, полученную биомассу взвешивали в физиологическом растворе (ОАО НПК «Эском», Россия), прогревали при 1000С на водяной бане (60 мин), дважды отмывали физиологическим раствором и взвешивали в концентрации 2х109 кл/мл с использованием оптического стандарта мутности (ГИСК им. Тарасевича, Россия).

Культивирование биопленки Pseudomonas aeruginosa

Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa культивировали в бульоне LB. Через 48 часов инкубации при 370С в обычной атмосфере осторожно удаляли питательную среду, в стерильных условиях трижды отмывали взвесь бактерий изотоническим раствором хлорида натрия (pH 7,0-7,2) и разводили бульоном LB до показателя мутности 0,7 на приборе DensiLaMeter II (ERBA Lachema, Чехия). Полученную бактериальную взвесь наносили на поверхность лунок 12-луночных планшетов (Costar, США), которая служила основой для закрепления биопленок, и инкубировали 48 часов при 370С. В ряде опытов препарат рибосомальных компонентов S. pyogenes, S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae и протеогликанов K. pneumoniae и фильтраты бактерий рода Staphylococcus вносили в среду непосредственно при посеве, выращивание проводили в тех же условиях.

Оценка интенсивности биопленкообразования

Зрелую биопленку Pseudomonas aeruginosa осторожно отмывали раствором Хенкса и добавляли к ней раствор рибосомальных компонентов

Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae и протеогликанов мембраны Klebsiella pneumoniae (0,15 мг/мл) и фильтраты штаммов стафилококка. В контроле добавляли раствор Хенкса или питательную среду ТСБ, а также использовали лунки, не засеянные P. aeruginosa. Инкубировали планшеты 2 ч при 370С. После этого среду осторожно удаляли, биопленку высушивали. Оценка интенсивности биопленкообразования проводилась методом определения количества красителя, связавшегося с биопленкой. Метод основан на окраске анилиновыми красителями биопленок, фиксированных в лунках планшета [97]. Данный метод позволяет отразить объем исследуемой биопленки. После инкубации и отмывания биопленки были окрашены 1%-ным раствором кристаллического фиолетового (4 мин при 250С), затем препараты десятикратно ополаскивали дистиллированной водой (по 4,5 мл). Краситель элюировали из биопленочной массы двумя порциями смеси этанол-изопропанол (1:1) по 4 мл. Об интенсивности биопленкообразования судили по степени окраски элюата, интенсивность которой (оптическую плотность образцов) оценивали на фотоэлектроколориметре (КФК-2-УХЛ 4.2, Россия) при 590 нм, результат выражали в относительных световых единицах (отн. свет. ед.).

Тесты с выделением клеток

Влияние рибосомальных белков бактерий на адгезивность буккальных эпителиоцитов

Влияние рибосомальных белков бактерий на адгезивность эпителиальных клеток слизистых оболочек проводили с помощью экспериментальной модели «искусственная колонизация C. albicans на эпителиоцитах in vitro» [46]. Инкубационную систему «буккальные эпителиоциты - кандиды» создавали, добавляя 0,5 мл взвеси клеток кандид к 0,5 мл взвеси буккальных клеток. В систему вносили 0,1 или 0,5 мл

препарата рибосомальных компонентов и протеогликанов бактерий (0,15 мг/мл), 0,1 мл супернатанта 24-часовой культуры S. aureus (штамм 5983/2), липополисахарид (ЛПС) E. coli, (серотип О127:В8, Sigma, США) (100 нг/мл, 100 мкг/мл), ЗФР или питательную среду в зависимости от опыта. Инкубировали 30 мин при 370С встряхивая каждые 5 мин.

В ряде опытов на буккальные клетки и кандиды стимуляторами действовали раздельно: смешивали эпителиальные клетки и активные субстанции или кандиды и активные субстанции, инкубировали 30 мин при 370С. На следующем этапе равные объемы (по 0,5 мл) взвеси эпителиоцитов и C.albicans совместно инкубировали (30 мин, 370С) в ЗФР, встряхивая каждые 5 мин. После инкубации эпителиоциты трехкратно отмывали ЗФР от неадгезированных кандид (40g, 5 мин). Из осадка клеток готовили мазок, который после фиксации смесью этанол-формалин окрашивали 0,25% раствором азура А (Sigma,США). Определяли индекс искусственной колонизации, т.е. среднее количество адгезированных кандид в пересчете на один эпителиоцит (микроскопировали 100 клеток).

Определение жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток определяли с помощью трипанового теста. Для этого смешивали 0,01 мл взвеси клеток (буккальные эпителиоциты в концентрации 106 в 1 мл) с 0,2 мл 2% раствора трипанового синего. Инкубировали 5-10 мин и подсчитывали процент окрашенных (нежизнеспособных) клеток в камере Горяева.

Люминол-зависимая хемилюминесценция

Для детекции люминол-опосредованной хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов, использовали 96-луночные микропланшеты White Cliniplate 96 well (Thermo Scientific, Швеция), в которые вносили по 100 мкл лейковзвеси

-5 А

и раствора люминола (10- M) (Sigma, США). После инкубации (5 мин, 37°С) добавляли 50 мкл раствора рибосомальных компонентов и протеогликанов (0,15 мг/мл) или зимозан, опсонизированный сывороткой человека (ОЗ) (10

мг/мл), в растворе бесцветного Хенкса). Инкубацию и замеры уровня ХЛ проводили каждые 5 мин в течение 60 мин с использованием хемилюминометра Luminoscan Ascent (Швеция). Результаты выражали в относительных световых миллиединицах (отн. свет. мед., mRLU).

В ряде экспериментов после экспозиции лейковзвеси с люминолом проводили предынкубацию (35 мин) лейковзвеси со следующими факторами: раствор рибосомальных компонентов и протеогликанов в дозировке ниже его стимулирующего действия (0,02 мг/мл) или ЛПС E.coli серотип О127:В8 (Sigma, США) (100 мкг/мл). После этого добавляли ОЗ и анализировали показатели ХЛ в течение 30 мин с интервалом 5 мин. Негативным контролем служили пробы с раствором Хенкса без индикатора, позитивным - пробы с ЛПС кишечной палочки (100 мкг/мл) (серотип О127:В8, Sigma, США).

Приготовление люминола и ОЗ проводили согласно стандартной методике [22]:

- приготовление люминола: 17,8 мг люминола (5-амино-2,3-дегидро-1,4-фталазидон) (Sigma, США) разводили в 1,0 мл димексида

-5

(Татхимфармпрепараты, Россия) и доводили до концентрации 10-3 М, добавляя 99 мл физиологического раствора. Хранили при температуре -10 -200 С;

- приготовление опсонизированного зимозана: 10 мг зимозана (Sigma, США) взвешивали в 1 мл физиологического раствора (из расчета одна порция на 1 мл сыворотки). Взвесь инкубировали на кипящей водяной бане (1000С) 15 мин, затем отмывали дистиллированной водой 3 раза по 10 мин (1000 g). Отмытый зимозан вносили в пул сыворотки (10 мг на 1 мл сыворотки). Инкубировали 30 мин при 370С. Далее зимозан отмывали большими объемами физиологического раствора 3 раза по 10 мин при 3000 об/мин. К осадку добавляли 1 мл 2 М раствора NaCl (11,6 г NaCl на 100 мл дистиллированной воды). Инкубировали на кипящей водяной бане 15 мин. Затем зимозан отмывали большими объемами физиологического раствора 3

раза по 10 мин (1000 g). Опсонизированный зимозан взвешивали в физиологическом растворе в концентрации 10 мг на 1 мл, разливали по ампулам и хранили при -200С.

Иммунохимические методы

НСТ-тест

Для постановки НСТ-теста применяли стандартный метод [15, 102]. К гепаринизированной крови добавляли стимулятор и нитросиний тетразолий (4 мкг/мл) (Sigma, США). В качестве стимуляторов использовали препарат рибосомальных компонентов Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae и протеогликанов мембраны Klebsiella pneumoniae (0,15 мг/мл), S. marcescens (2х109 кл/мл) и неопсонизированный зимозан (10 мг/мл). Негативным контролем служила кровь, в которую вносили 0,1 М изотонический фосфатный буфер (рН=7,2). Проводили инкубацию в течение 30 мин при 370С, готовили мазки, фиксировали их смесью спирт-формалин, окрашивали 2% метиловым зеленым. В мазках подсчитывали процент нейтрофилов с восстановленными гранулами нитросинего тетразолия. В ряде опытов реакцию проводили в присутствии 0,01 М ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), который подавлял активацию комплемента по классическому и альтернативному путям, или в присутствии 0,01 М ЭГТА (этиленгликольтетраацетат) и 0,01 М MgCl2 - для избирательного подавления классического каскада.

Для приготовления 0,1 М изотонического фосфатного буфера (рН=7,2) готовили два раствора. Раствор А: 13,509 г KH2PO4 или 13,801 г NaH2PO4H2O растворяли в 1 л физиологического раствора (ОАО НПК «Эском», Россия). Раствор В: 17,8 г Na2HPO42H2O или 35,82 г Na2HPO412H2O растворяли в 1 л физиологического раствора. Смешивали 13 частей раствора А и 37 частей раствора В. Хранили при температуре +40С.

Определение антител к рибосомальным компонентам Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae и протеогликанов мембраны Klebsiella pneumoniae

Уровень сывороточных антител к рибосомальным компонентам и протеогликанам бактерий определяли методом иммуноферментного анализа. Был проведен подбор разведения конъюгата, которое составило 1:40000. Использовали 96-луночные полистироловые планшеты (НИИ «Медполимер», Москва). Раствор рибосомальных компонентов и протеогликанов и в концентрации 10 мкг/мл, разведенный карбонат-бикарбонатным буфером, сорбировали в планшетах (1 ч, 370С). После инкубации планшеты отмывали фосфатно-солевым раствором с твином (ФСР-Т). В качестве контроля использовали препарат нормального иммуноглобулина человека (Областной центр крови им. Н.Я. Климовой, Н.Новгород). Контрольный образец и сыворотки вносили, титруя образцы от 1:200 до 1:1600 в первой серии экспериментов и от 1:10 до 1:1280 в дальнейшем. Планшеты инкубировали 30 мин при 370С. После отмывания ФСР-Т вносили конъюгаты для выявления IgM («Medac», Германия) или IgG (ООО «Сорбент», Подольск). Планшеты инкубировали повторно (30 мин, 370С). Несвязавшиеся реагенты удаляли отмыванием, после чего вносили субстратный раствор с хромогеном, затем инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте. Реакцию останавливали внесением 2 М серной кислоты. Для подтверждения специфичности реакций проводили «истощение» иммуноглобулина препаратом рибосомальных компонентов и протеогликанов мембраны (негативный контроль), добавляя одну часть препарата к двум частям неразведенного иммуноглобулина (60 мин, 370С).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Крестова, Екатерина Ивановна, 2017 год

- 43 с.

98. Чеботарь, И.В. Лабораторная диагностика клинически значимых биопленочных процессов / Чеботарь, И.В., Гурьев, Е.Л. // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2015. - Т. 4. - № 14. - С. 15-20.

99. Чеботарь, И.В. Современная классификация патогенных для человека бактерий: методическое пособие / И.В. Чеботарь, Е.В. Салина. - Н. Новгород: Издательство НижГМА, 2010. - 84 с.

100. Шабунина, Е.И. Общий флогогенный потенциал при воспалительных заболеваниях органов пищеварения у детей / Шабунина, Е.И., Маянская, И.В., Ашкинази, В.И., Толкачева, Н.И., Талаева, Е.Б., Потехин, П.П., Жукова, Е.А., Романова, С.В., Видманова, Т.А., Успенская, И.Д., Каплина, Н.А., Федулова, Э.Н., Тутина, О.А., Глушкова, О.А., Коркоташвили, Л.В., Колесов, С.А., Богомолов, А.Р., Назарова, Е.В., Широкова, Н.Ю. - Н.Новгород: Изд-во Волго-Вятской академии гос. службы, 2010. - 110 с.

101. Шахгильдян, И.В. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика) / И.В. Шахгильдян, М.И. Михайлов, Г.Г. Онищенко. - М: ГОУ ВУНЦ МЗ РФ, 2003. - 384 с.

102. Щербаков, В.И. Применение НСТ-теста для оценки чувствительности нейтрофилов к стимуляторам. / Щербаков, В.И. // Лаб. дело. - 1989. -№1. - С. 30-33.

103. Юдина, Н.А. Контроль биопленки в современной стратегии профилактики и лечения стоматологических заболеваний / Юдина Н.А., Курочкина, А.Ю. // Стоматология. - 2009. - № 3. - С. 77-81.

104. Ahmer, OR. The effect of cigarette smoke on adherence of respiratory pathogens to buccal epithelial cells / Ahmer, OR., Essery, SD., Saadi, AT., Raza, M.W., Ogilvi,e M.M., Weir, D.M., Blackwell, C.C. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1999. - V. 23 (1). - P. 27-36.

105. Alkawash, M.A., Soothill, J.S., Schiller, N.L. Alginate lyase enhances antibiotic killing of mucoid Pseudomonas aeruginosa in biofilms / Alkawash,

M.A., Soothill, J.S., Schiller, N.L. // APMIS. - 2006. - V. 114 (2). - P. 131138.

106. Ambruso, D. Assembly and activation of the NADPH: O2 oxidoreductase in human neutrophils after stimulation with phorbol myristate acetate / Ambruso, D., Bolscher, B., Stokmaa, P. Verhoeven, A.J., Roos, D. // J. Biol. Chem. - 1990. - V. 265. - P. 924-930.

107. Attarpour-Yazdi, M.M. Identification of the serotypes of bacterial meningitis agents; implication for vaccine usage / Attarpour-Yazdi, M.M., Ghamarian, A., Mousaviehzadeh, M., Davoudi, N. // Iran J. Microbiol. - 2014. - № 6 (4). - P. 211-8.

108. Bertani, G. Studtes on lysogenesis. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli / Bertani, G. // J. Bactertol. - 1951. - № 62. - P. 293-300.

109. Bisgaard, H. Childhood asthma after bacterial colonization of the airway in neonates / Bisgaard, H., Hermansen, M.N., Buchvald, F., Loland, L., Halkjaer, L.B., B0nnelykke, K., Brasholt, M., Heltberg, A., Vissing, N.H., Thorsen, S.V., Stage, M., Pipper, C.B. // N. Engl. J. Med. - 2007. - V. 357. -P. 1487-95.

110. Caliot E. Translocation of ribosomal immunostimulant through ai in vitro-reconstituted digestive barrier containing M-like cells / Caliot E., Libon C., Kerneis S., Pringault E. // Scand. J. Immunol. - 2000. V. 52. - P. 588-594.

111. Castro, D. Proteomic analysis of Chromobacterium violaceum and its adaptability to stress / Castro, D., Cordeiro, I.B., Taquita, P., Eberlin, M.N., Garcia, J.S., Souza, G.H., Arruda, M.A., Andrade, E.V., Filho, S.A., Crainey, J.L., Lozano, L.L., Nogueira, P.A., Orlandi, P.P. // BMC Microbiol. - 2015. -№1 (15). - P. 272.

112. Claman, P. The presence of serum antibody to the chlamydial heat shock protein (chsp60) as a diagnostic test for tubal factor infertility / Claman, P.,

Jessamine, P., Honey, L., Toye, B., Peeling, R.W. // International Journal Of Gynecology & Obstetrics. - 1997. - V. 57. - № 3. - P. 340.

113. Clark, R.A. Studies on the mechanism of antibody-dependent polymorphonuclear leukocyte-mediated cytotoxicity / Clark, R.A., Klebanoff, S.J. // J. Immunol. - 1977. - V. 119. - P. 1413-1422.

114. Cloosen S. Surface Mucin-1 does not play a role in dendritic cell migration / Cloosen S., Caberg J.H., Huls M.B., Vanderlocht J., Senden-Gijsbers B.L., Roncarati P., Hubert P., Delvenne P., Germeraad W.T., Bos G.M. // Mol. Immunol. - 2009. - V. 46 (4). - P. 738-42.

115. Colgan, S.P. Lipid mediators in epithelial cell-cell interactions / Colgan, S.P. // Cell. Mol. Life Sci. - 2002. - V. 59. - P. 754-760.

116. Cooke, E. The role of C-kinase in the physiological activation of the neutrophil oxidase. Evidence from using pharmacological manipulation of C-kinase activity in intact cells / Cooke, E., Hallet, M.B. // Biochem. J. - 1985. - V. 232. - P. 323-327.

117. Cox, F. Adherence of Candida albicans to buccal epithelial cells in children and adults / Cox, F. // J. Lab. Clin. Med. - 1983. - V. 102. - P. 960-972.

118. Darwazeh, A.M. Systemic fluconazole therapy and in vitro adhesion of Candida albicans to human buccal epithelial cells / Darwazeh, A.M., Lamey, P.J., Lewis, M.A., Samaranayake, L.P. // J. Oral. Pathol. Med. - 1991. - V. 20. - P. 17-19.

119. Davies, D.G. A fatty acid messenger is responsible for including dispersion in microbial biofilms / Davies, D.G., Marques, C.N. // J. Bacteriol. - 2009. - V. 191 (5). - P. 1393-1403.

120. Davis, G. Accessible sialic acid content of oral epithelial cells from healthy and gingivitis subjects / Davis, G., Gibbons, R.G. // J. Periodontal Res. -1990. - V. 25. - P. 250-253.

121. De Klevit, T.R. Quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilms / De Klevit, T.R. // Environ. Microbiol. - 2009. - V. 11. - № 2. - P. 279-88.

122. Domachowske, J.B. Gene expression in epithelial cells in response to pneumovirus infection / Domachowske, J.B., Bonville, C.A., Rosenberg, H.F. // Respir. Res. - 2001. - V. 2. - P. 225-33.

123. Eberhard, J. Leucotriene A(4)-hydrolase expression and leucotriene B(4) levels in chronic inflammation of bacterial origin: immunohistochemistry and reverse-phase high-performance liquid chromatography analysis of oral mucosal epithelium / Eberhard, J., Jepsen, S., Tiemann, M., Rouabhia, M. // Virchows Arch. - 2002. - V. 440. - P. 627-634.

124. Ellmerich, S. Production of cytokines by monocytes, epithelial and endothelial cells activated by Streptococcus bovis / Ellmerich, S., Djouder, N., Scholler, M., Klein, J.P. // Cytokine. - 2000. - V. 12. - P. 26-31.

125. Esposito, S. Serum concentrations of pneumococcal anticapsular antibodies in children with pneumonia associated with Streptococcus pneumonia infection / Esposito, S., Droghetti, R., Faelli, N., Lastrico, A., Tagliabue, C., Cesati, L., Bianchi, C., Principi, N. // Clin. Infect. Dis. - 2003. - V. 37 (9). - P. 1261-4.

126. Faden, H. Whole blood luminal-dependent chemiluminescence / Faden, H., Maciejewski, N. // J. Reticuloendothel. - Soc. - 1981. - V. 30. - P. 219-226.

127. Farmer, I. Expression of adhesion and activation molecules in human buccal spithelial cell lines and normal human buccal epithelium in situ / Farmer, I., Freysdottir, J., Dalghous, A.M., Fortune, F.J. // Oral. Pathol. Med. - 2001. -V. 30. - P. 113-120.

128. Fiedler, S. J Tigecycline resistance in clinical isolates of Enterococcus faecium is mediated by an upregulation of plasmid-encoded tetracycline determinants tet (L) and tet (M) [Электронный ресурс] / Fiedler, S., Bender, J.K., Klare, I., Halbedel, S., Grohmann, E., Szewzyk, U., Werner, G.. // Antimicrob. Chemother. - pii: dkv420. - 2015. - Режим доступа: http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed.

129. Fiocchi A. Efficacy and safety of ribosome-component immune modulator for preventing recurrent respiratory infections in socialized children / Fiocchi A.,

Omboni S., Mora R., Macchi A., Nespoli L., Arrigoni S., Guastini L., Castelnuovo P., Graziani D., Marcassa S. // Allergy Asthma Proc. - 2012. -V. 33 (2). - P. 197-204.

130. Fortis, A.A. Adherence of Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Candida albicans to human buccal epithelial cells, from healthy persons and HIV carriers, under the influence of Broncho Vaxom in vitro and ascorbinic acid in vivo / Fortis, A.A., Lianou, P.E., Papavassilliou, J.T.APMIS. - 1998. -V. 106. - P. 441-448.

131. Godaly, G. Neutrophil recruitment, chemokine receptors, and resistance to mucosal infection / Godaly, G., Bergsten, G., Hang, L., Fiscer, H., Frendeus, B., Lundstedt, A.-C., Samuelsson, M., Samuelsson, P., Svanborg, C. // J. Leukoc. Biol. - 2001. - V. 69. - P. 899-906.

132. Goldstein, I.M. Independent effects of IgG and complement upon human polymorphonuclear leukocyte function / Goldstein, I.M., Kaplan, H.B., Radin,

A. // J. Immunol. - 1976. - V. 117. - P. 1282-1287.

133. Gurung, J. Association of biofilm production with multidrug resistance among clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from intensive care unit / Gurung, J., Khyriem, A. B., Banik, A., Lyngdoh, W.V., Choudhury, B., Bhattacharyya, P. // Indian Journal of Critical Care Medicine. - 2013. - V .17. - Issue 4. - P. 214-218.

134. Hales, B.J. Antibacterial antibody responses assotiated with the development of asthma in house dust mite-sessitised and non-sensutised children / Hales,

B.J., Chai, L.Y., Elliot, C.E., Pearce, L.J., Zhang, G., Heinrich, T.K., Smith, W.A., Kusel, M.M., Holt, P.G., Sly, P.D., Thomas, W.R. // Thorax. - 2012. -V. 67 (4). - P. 321-7.

135. Hales, B.J. Differences in the antibody response to a mucosal bacterial antigen between allergic and non-allergic subjects smoke-free legislation reduces exposure in children / Hales, B.J., Pearce, L.J., Kusel, M.M. Holt, P.G.,Sly, P.D.,Thomas, W.R.. // Thorax. - 2008. - V. 63 (3). - P. 221-27.

136. Hammad, H. Dendritic cells and airway epithelial cells at the interface between innate and adaptive immune responses / Hammad, H., Lambrecht, B.H. // Allergy. - 2011. - V. 66. - P. 579-587.

137. Hbabi L. In vitro stimulation of polymorphonuclear cell adhesion by ribomunyl and antibiotic + ribomunyl combinations: effects on CD 18, CD35 and CD16 expression / Hbabi L., Roques C., Michel G., Perruchet A.M., Benoist H. // Int. J. Immunopharmacol. - 1993. - V. 15 (2). - P. 163-73.

138. Heyworth, P.G. Protein phosphorylation assotiated with the stimulation of neutrophils. Modulation of superoxide production by protein kinase C and calcium / Heyworth, P.G., Badwey, J.A.J. // Bioenerg. Biomembr. - 1990. V. - 22. - P. 1-26.

139. Herberhold S. Delivery with polycations extends the immunostimulant Ribomunyl into a potent antiviral Toll-like receptor 7/8 agonist / Herberhold S., Coch C., Zillinger T., Hommertgen B., Busch N., Schuberth C., Hartmann

E., Wimmenauer V., Hagmann C.A., Lüdenbach B., Schlee M., Bootz

F.,Hartmann G., Barchet W. // Antivir. Ther. - 2011. - V. 16 (5). - P. 751-8.

140. Hirsh, J.G. Degranulation of polymorphonuclear leukocytes following phagocytosis of microorganisms / Hirsh, J.G., Cohn, Z.A. // J. Exp. Med. -1960. - V. 112. - P. 1005-1016.

141. Holgate, S.T. The sentinel role of the airway epithelium in asthma pathogenesis / Holgate, S.T. // Immunological Reviews. - 2011. - V. 242. -P. 205-219.

142. Holgate, S.T. The bronchial epithelium as a key regulator of airway inflammation and remodeling in asthma / Holgate, S.T., Lackie, P.M., Davies, D.E., Roche, W.R., Wali, A.F. // Clin. Exp. Allergy. - 1999. - V. 29 (suppl. 2). - P. 90-95.

143. Hollams, E.M. Th2-associated immunity to bacteria in teenagers and susceptibility to asthma / Hollams, E.M., Hales, B.J., Bachert, C. Huvenne, W., Parsons, F., de Klerk, N.H., Serralha, M., Holt, B.J., Ahlstedt, S.,

Thomas, W.R., Sly, P.D., Holt, P.G. European Respiratory Journal. - 2010. -V. 36 (3). - P. 509-16.

144. Hurst, N. Molecular basis of activation and regulation of the phagocyte respiratory burst / Hurst, N. // Ann. Rheum. Dis. - 1987. - V. 46. - P. 265272.

145. Jackson, D. J. Wheezing rhinovirus illnesses in early life predictasthma development in high-risk children / Jackson, D. J., Gangnon, R.E., Evans, M.D., Roberg, K.A., Anderson, E.L., Pappas, T.E., Printz, M.C., Lee, W.M., Shult, P.A., Reisdorf, E., Carlson-Dakes, K.T., Salazar, L.P., DaSilva, D.F., Tisler, C.J., Gern, J.E., Lemanske, R.F.Jr. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -2008. - V. 178P. - 667-672.

146. Ji, S. Bacterial invasion and persistence: critical events in the pathogenesis of periodontitis /Ji, S., Choi, Y.S., Choi, Y. // J. Periodontal. Res. - 2015. -V. 50. - Issue 5. - P. 570-585.

147. Jongmans W. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails / Jongmans W., Tiemessen D.M., van Vlodrop I.J., Mulders P.F., Oosterwijk E. // J. Immunother. - 2005. - V. 28 (5). - P. 480-7.

148. Kagnoff, M.F. Epithelial cells as sensors for microbial infection / Kagnoff, M.F., Eckmann, L. // J.Clin. Ivest. - 1997. - V. l00. - P. 6-10.

149. Kaplan, A.P. A prealbumin activator of prekallikrein. III. Appearance of chemotactic activity for human neutrophils by the conversion of human prekallikrein to kallikrein / Kaplan, A.P., Kay, A.B., Austen, K.F. // J. Exp. Med. - 1972. - V. 135. - P. 81-96.

150. Kaplan, J. B. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses / Kaplan, J. B. // J. Dent. Res. - 2010. - V. 86 (3). -P. 205-218.

151. Kim, H.Y. The many paths to asthma: phenotype shaped by innate and adaptive immunity / Kim, H.Y., DeKruyff, R.H., Umetsu, D.T. // Nat. Immunol. - 2010. - V. 11. - P. 577-584.

152. Kolodkin-Gal, I. D-amino acids trigger biofilm disassembly / Kolodkin-Gal, I., Romero, D., Cao, S., Clardy, J., Kolter, R., Losick, R. // Science. - 2010. -V. 328 (5978). - P. 627-629.

153. Korppy, M. Bacterial infections and pediatric asthma. Immunol / Korppy, M. // Allergy Clin. N. Am. - 2010. - V. 30 (4). - P. 565-574.

154. Lee, B. Mucoid Pseudomonas aeruginosa isolates maintain the biofilm formation capacity and the gene expression profiles during the chronic lung infections of CF patients / Lee, B., Schjerling, C.K., Kirkby, N., Hoffmann, N., Borup, R., Molin, S., Hoiby, N., Ciofu, O. // APMIS. - 2011. - V. 119. -P. 263-74.

155. Macrotte, H. Oral microbial ecology and the role of salivary immunoglobulin A / Macrotte, H., Lavoie, M.C. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - V. 62. - P. 71-109.

156. Mannhardt, W. The interaction of mucosal epithelial cells with E.coli bacteria enhances the intraepithelial calcium flux and the release of prostaglandin E2 / Mannhardt, W., Beutel, K., Habermehl, P., Knuf, M., Zepp, F. // Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. - 1999. - V. 10. - P. 308-315.

157. Maridonneau-Parini, I. Identification of distinct activation pathways of the human neutrophil NADPH-oxidase / Maridonneau-Parini, I., Tringale, S., Tauber, A. // - J Immunol. - 1986. - V. 137. - P. 2925-2929.

158. Mattoli S. Allergen-induced generation of mediators in the mucosa / Mattoli S. // Environ Health Perspect. - 2001. - V. 109. - P. 553-557.

159. Mills, P. R. Airway epithelial cells, cytokines, and pollutants / Mills, P. R., Davies, R.J., Devalia, J.L. // Am. J. Resp. Crit. Care Med. - 1999. - V. l60 (5Pt2). - P. 38-43.

160. Moniuszko T. Effect of Ribomunyl therapy on production of selected cytokines by mononuclear peripheral blood cells in nonatopic bronchial asthma / Moniuszko T., Rutkowski R., Chyrek-Borowska S. // Pneumonol. Alergol. Pol. - 1995. - V. 63 - Suppl. 2. - P. 71-5.

161. Mora R. Ribosomal therapy in the prophylaxis of recurrent pharyngotonsillitis in children / Mora R., Dellepiane M., Crippa B., Salami A. // Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. - 2007. - V. 71 (2). - P. 257-61.

162. Murphy, D.M. Recent advances in pathophysiology of asthma / Murphy, D.M., O'Byrne, P.M. // CHEST. - 2010. - V. 137 (6). - P. 1417-1426.

163. Nair, R.G. The effect of oral commensal bacteria on candidal adhesion to human buccal epithelial cells in vitro / Nair, R.G., Samaranayake, L.P. // J. Med. Microbiol. - 1996. - V. 45. - P.179-185.

164. Newman S.L, Johnston R.B. Role of binding through C3b and IgG in polymorphonuclear neutrophil function studies with trypsin-generated C3b. J. Immunol. V. 123, 1979. P. 1893-1846.

165. Nolte, O. Immunogenisity of recombinant L7/L12 ribosomal protein of Neisseria meningitidis - high prevalence of specific antibodies in humans but limited immunogenesity for T cells / Nolte, O., Förch, C., Ehrhard, I., Sonntag, H.G. // Med. Microbiol. Immunol. - 2002. - V. 191 (1). - P. 41-7.

166. Nydegger, U.E. Polymorphonuclear leukocyte stimulatuio by immune complexes. Assessment by nitroblue tetrazolium dye reduction / Nydegger, U.E., Anner, R.M., Gerebtzoff, A., Lambert, P.H., Miescher, P.A. // Eur. J. Immunol. - 1973. - V. 3. - P. 465-470.

167. Olivieri D. Ribosome-component immune modulation of respiratory tract infections in adults [Электронный ресурс] / Olivieri D., Chiesa S., Tzani P., Marino P., Robberto E., Marcassa S. // Allergy Asthma Proc. - Suppl 1:S13-9. doi: 10.2500/aap.2009.30.3250. - 2009. - Режим доступа: http: //www.ncbi .nlm.nih.gov/pubmed.

168. Peng J.C. Generation and maturation of dendritic cells for clinical application under serum-free conditions / Peng J.C., Thomas R., Nielsen L.K. // J. Immunother. - 2005. - V. 28 (6). - P. 599-609.

169. Piatti, G.. Bacterial adherence in smokers and non-smokers / Piatti, G., Gazzola, Т., Allegra, L. // Pharmocol. Res. - 1997. - V. 36. - P. 481-484.

170. Polito, A.J. Epithelil cells as regulators of airway inflammation / Polito, A.J., Proud, D. // J. Allergy. Clin. Immunol. - 1998. - V. 102. - P.714-718.

171. Post, D.M. Comparative analyses of the lipooligosaccharides from nontypeable Haemophilus influenzae and Haemophilus haemolyticus show differences in sialic acid and phosphorylcholine modifications [Электронный ресурс] / Post, D.M., Ketterer, M.R., Coffin, J.E., Reinders, L.M., Munson, R.S.Jr., Bair, T., Murphy, T.F., Foster, E.D., Gibson, B.W., Apicella, M.A. // Infect Immun.- pii: IAI.01185-15. - 2016. - Режим доступа: http: //www.ncbi .nlm.nih.gov/pubmed.

172. Proud, D. Epithelial cells and airway diseases / Proud, D., Leigh, R. // Immunological reviews. - 2011. - V. 242. - P. 186-204.

173. Pujol J.L. Bacterial ribosomal immunostimulants prime alveolar macrophages in vivo to produce interleukin 1 in vitro / Pujol J.L., Klein B., Godard P., Dussourd d'Hinterland L., Michel F.B. // Chest. - 1991. - V. 100 (3). - P. 644-8.

174. Quillien V. Biodistribution of radiolabelled human dendritic cells injected by various routes / Quillien V., Moisan A., Carsin A., Lesimple T., Lefeuvre C., Adamski H., Bertho N., Devillers A., Leberre C., Toujas L. // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. - 2005. - V. 32 (7). - P. 731-41.

175. Quinn, М.О. Increased salivary exoglycosidase activity during critical illness / Quinn, М.О., Miller, V.E., Dal Nogare, A.R. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1994. - V. 150. - P.179-183.

176. Rastogi, D. Host-bacterial interactions in the initiations of inflammation / Rastogi, D., Rather, A.G, Prince, A. // Paediatr Respir Rev. - 2001. - V. 2. -P. 245-252.

177. Reid, P.J. Ribosomal protein differences in a strain of E. coli carrying a suppressor of an ochre mutation /Reid, P.J., Orias, E., Gartner, T.K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1965. - V. 21 (1). - P. 66-71.

178. Roos, D. Formation of reactive oxygen species by phagocytic cells: functions and dysfunctions / Roos, D., Boscher, B., Weening, R., Verhoeven, A. // Acta paedial. hung. - 1988 - 1989. - V. 29. - P. 83-91.

179. Roques C. Effect of an in vivo immunostimulant treatment on PMN functions: interaction with antibiotics in vitro / Roques C., Frayret M.N., Luc J., Michel G., Perruchet A.M., Cauquil J., Levy D. // Int. J. Immunopharmacol. - 1991. - V. 13 (8). - P. 1051-7.

180. Rossi, G.A. Naturally occurring immune response against bacteria commonly involved in upper respiratory tract infections: analysis of the antigen-specific salivary IgA levels / Rossi, G.A., Peri, C., Raynal, M.E., Defilipp,i A.C., Risso, F.M., Schenone, G., Pallestrini, E., Melioli, G. // Immunol Lett. -2003. - V.86 (1). - P. 85-91.

181. Rouabhia, M. Interleukin-18 and gamma interferon production by oral epithelial cells in response to exposure to Candida albicans or lipopolysaccaride stimulation / Rouabhia, M., Ross, G., Page, N., Chakir, J. // Infect. Immun. - 2002. - V. 70. - P. 7073-7080.

182. Ryan, R.P. Interspecies signaling via the Stenotrophomonas maltophilia diffusible signal factor influences biofilm formation and polymyxin tolerance in Pseudomonas aeruginosa / Ryan, R.P., Fouhy, Y., Garcia, B.F., Watt, S.A., Niehaus, K., Yang, L., Tolker-Nielsen, T., Dow, J.M. // Mol. Microbiol. - 2008. - V. 68 (1). - P. 75-86.

183. Schmalz, G. Release of prostaglandin E2, IL-6 and IL-8 from human oral epithelial culture models after exposure to compounds of dental materials /

Schmalz, G., Schweiki, H., Hiller, K.A. // Eur.J. Oral Sci. - 2000. - V. 108. -P.442-448.

184. Serrano E. Effectiveness of ribosomal fractions of Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae and the membrane fraction of Kp (Ribomunyl) in the prevention of clinical recurrences of infectious rhinitis. Results of a multicenter double-blind placebo-controlled study / Serrano E., Demanez J.P., Morgon A., Chastang C., Van Cauwenberge P. // Eur. Arch. Otorhinolaryngol. - 1997. - V. 254 (8).

- P. 372-5.

185. Slinger, B.L. 2015 Co-evolution of Bacterial Ribosomal Protein S15 with Diverse mRNA Regulatory Structures [Электронный ресурс] / Slinger, B.L., Newman, H., Lee, Y., Pei, S., Meyer, M.M. // PLoS Genet. doi: 10.1371/journal.pgen.1005720. - 2015. - V. 11(12). - Режим доступа: http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed.

186. Smith, J.K. Effect of interferon alpha on HLA-DR expression by human buccal epithelium / Smith, J.K., Chi, D.S., Krishnaswamy, G. Srikanth, S., Reynolds, S., Berk, S.L. // Arch Immunol Ther Exp (Warsz). - 1996. - V. 44.

- P.83-88.

187. Smith, J.K. Oral use of interferon-alpha stimulates ISG-15 transcription and production by human buccal epithelial cells / Smith, J.K., Siddiqui, A.A., Krishnaswamy, G.A., Dykes, R., Berk, S.L., Magee, M., Joine,r W., Cummins, J. // J. Interferon Cytokine Res. - 1999. - V. 19. - P. 923-928.

188. Stadnyk, A.W. Cytokine production by epithelial cells / Stadnyk, A.W. // FASEB J. - 1994. - V. 8. - P.1041-1047.

189. Svanborg, С. Cytokine responses during mucosal infections: role in disease pathogenesis and host defence / Svanborg, С., Godaly, G., Hedlund, M. // Curr Opin Microbiol. - 1999. - V. 2. - P. 99-105.

190. Takizawa, H. Airway epithelial cells as regulators of inflammation / Takizawa, H. // Int. J. Mol. Med. - 1998. - V. 1. - P. 367-78.

191. Tedesco, F. Stimulation of glucose oxidation in human polymorphonuclear leucocytes by C3-sepharose and soluble C567 / Tedesco, F., Trani, S., Soranzo, M.R. // FEBS Lett. - 1975. - V. 51. - P. 232-236.

192. Tetz, G.V. Effect of DNAase and antibiotics on biofilm characteristics / Tetz, G.V., Artemenko, N.K., Tetz, V.V. // Antimicrob. Agents Chemiother. -2009. - V. 53 (3). - P. 1204-1208.

193. Theaker, E.D. The possible influence of the menstrual cycle on the adherence of Candida albicans to human buccal epithelial cells in vitro / Theaker, E.D., Drucker, D.B., Gibbs, A.C. // Arch Oral Biol. - 1993. - V. 38. - P. 353-355.

194. Thompson, C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease / Thompson, C.B. // Science. - 1995. - V. 267. - P. 1495-1462.

195. Till G. Chemokinetic and chemotactic activity of various prostaglandins for neutrophil granulocytes / Till G., Kownatzki E., Seitz, M., Gemsa, D. // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1979. - V. 12. - P. 111-118.

196. Tono-Oka, T. Chemiluminescens of whole blood. A simple and rapid method for the estimation of phagocytic function of granulocytic and opsonic activity in whole blood / Tono-Oka T., Ueno N., Matsumoto T. // Clin. Immunol. Immunopatol. -1 983. - V. 26. - № 1. - P. 66-75.

197. Tsang, C.S. Factors affecting the adherence of Candida albicans to human buccal epithelial cells in human immunodeficiency virus infection / Tsang, C.S., Samaranayake, L.P. // J. Dermatol. - 1999. - V. 141. - P. 852-858.

198. Umazume, M. Reduced inhibition of Candida albicans adhesion by saliva from patients receiving oral cancer therapy / Umazume, M., Ueta, E., Osaki, T. // J. Clin. Microbiol. - 1995. - V. 33. - P. 432-439.

199. Umetsu, D.T. Current perspectives: focused commentary: key cells in asthma / Umetsu, D.T., DeKruyff, R.H. // J. Allergy Clin. Immunol. - 2010. - V. 125. - P. 975-979.

200. Vaahtoniemi, L.H. The age-dependence of bacterial presence on oral epithelial surfaces in vivo / Vaahtoniemi, L.H., Raisanen, S., Stenfors, L.E. // Oral Microbiol. Immunol. - 1992. - V. 7. - P. 263-266.

201. Van Epps, D.E., Suppression of human PMN bactericidal activity by human IgA paraproteins / Van Epps, D.E., Reed, K., Williams, R. // Cell. Immunol. -

1978. - V. 36. - P. 363-376.

202. Villa-Ambriz J. The increased expression of CD11c and CD103 molecules in the neutrophils of the peripheral blood treated with a formula of bacterial ribosomes and proteoglycans of Klebsiella pneumoniae / Villa-Ambriz J., Rodriguez-Orozco A. R., Bejar-Lozano C., Cortes-Rojo C. // Arch. Bronconeumol. - 2012. - V. 48 (9). - P. 316-9.

203. Walter, M.J. Interleukin 12 p40 production by barrier epithelial cells during airway inflammation / Walter, M.J., Kajiwara, N., Karanja, P., Castro, M., Holtzman, MJ. // J. Exp. Med. - 2001. - V. 193. - P. 339-351.

204. Wehkamp, J. Innate immunity and colonic inflammation: enhanced expression of epithelial alpha-defensins / Wehkamp, J., Schwind, B., Herrlinge,r K.R., Baxman, S., Schmidt, K., Duchrow, M., Wohlschlager, C., Feller, A.C., Stange, E.F., Fellermann, K. // Dig. Dis. Sci. - 2002. - V. 47. -P. 1349-1355.

205. Weinmeister, K.D. Buccal cell carbohydrates are altered during critical illness / Weinmeister, K.D., Dal Nogare, A.R. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -1994. - V. 150. - P. 131-134.

206. Weiss, S.J. The effect of oxidant stress on diamide - treated human granulocytes / Weiss, S.J., Sagone, A.L. // Biochemica et Biophysica Acta. -

1979. - V. 585. - P. 620-629.

207. Williams, D.W.. Adherence of Candida albicans to oral epithelial cells differentiated by Papanicolaou staining / Williams, D.W., Walker, R., Lewis, M., Allison, R.T., Potts, AJ. // J. Clin. Pathol. - 1999. - V. 52. - P. 529-531.

208. Woods D.E. Role of salivary protease activity in adherence of gram-negative bacilli to mammalian buccal epithelial cells in vivo / Woods D.E., Straus D.C., Johanson W.G., Bass J.A. // J. Clin. Invest. - 1981. - V. 68. - P. 14351440.

209. Wright, D.G., Gallin, J. I. Secretory responses of human neutrophils: exocytosis of specific (secondsry) granules by human neutrophils during adherence in vitro and during exudation in vitro / Wright, D.G., Gallin, J. I. // J. Immunol. - 1979. - V. 123. - P. 285-294.

210. Wu, S. Effects of systemic fluconazole therapy on in vitro adhesion of Candida albicans to buccal epithelial cells and changes of cell surface proteins of the epithelial cells / Wu, S., Guo, N., Hou, Y.// Chin. Med. Sci. J. - 1996. - V. 11. - P. 45-48.

211. Wysokinska, T. Immunogenicity of some staphylococcal antigens. Action of protein A, coagulase and ribosomal fraction / Wysokinska, T. // Med. dosw. Microbiol. - 1973. - V. 25. - P. 21-30.

212. Yamazaki, T. Evaluation of a Rapid Antigen Detection Kit argeting L7/L12 Ribosomal Protein for Mycoplasma pneumoniae / Yamazaki, T., Kuroki, H., Itagaki, T., Iwata, S., Tateda, K. // Kansenshogaku Zasshi. - 2015. - V. 89 (3). - P. 394-9.

213. Yanagita, M. IL-15 up-regulates iNOS expression and NO production by gingival epithelial cells / Yanagita, M., Shimabucuro, Y., Nozaki, T., Yoshimura, N., Watanabe, J., Koide, H., Terakura, M., Saho, T., Takedachi, M., Jang, M.H., Kiyono, H., Murakami, S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2002. - V. 297. - P. 329-34.