Влияние поверхностных консервативных аминокислот на активность антирестриктазы ArdB (R64) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Кудрявцева Анна Александровна

• Кудрявцева Анна Александровна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Кудрявцева Анна Александровна

Введение

Цели и задачи исследования

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Литературный обзор

Системы рестрикции-модификации

RM системы I типа

Транслокация ДНК

Ослабление рестрикции

Антирестрикция

Антирестрикционные и антимодификационные белки

Структура белков Ocr фага T7

Структура белков ArdA

Белки семейства ArdB

Экспериментальная часть

Материалы и методы

Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды

Среды и буферы

Конструирование плазмид

Измерение антирестрикционной активности белка ArdB

Идентификация белка ArdB в клетках E. coli

3-D визуализация и анализ поверхности белка

Афинная хроматография

Ионобменная хроматография

Масс-спектрометрия

Фиксация хромосомальной ДНК формальдегидом

Результаты

Биоинформатический анализ третичной структуры YfeB

Влияние поверхностных консервативных аминокислот на антирестрикционную активность ArdB

Снижение активности ArdB в УФ облучённых клетках

Взаимодействие ArdB с ДНК

Обсуждение

Заключение

Выводы:

Литература

Публикации аспиранта

Список сокращений и условных обозначений

EOP -efficiency of plating - эффективность посева фага;

GST - Глутатион S-трансфераза

IPTG - Изопропил-Р^-1-тиогалактопиранозид;

IS-элементы - insertion sequences - мигрирующие элементы, транспозоны; M - M-субъединица системы рестрикции-модификации I типа; OD -оптическая плотность

R - R-субъединица системы рестрикции-модификации I типа; RMI - системы рестрикции-модификации I типа;

RMSD - root-mean-square deviation of atomic positions - -среднеквадратичное отклонение смещений атомов

S - S-субъединица системы рестрикции-модификации I типа; SAM - S-аденозилметионин;

SDS-PAGE - электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли

TRD - target recognition domain - сайт узнавания системы рестрикции-модификации I типа;

X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-0-галактопиранозид; а.о. - аминокислотные остатки; АТФ - аденозинтрифосфат;

ВКПМ - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов; Дж -Джоуль

ДНК -дезоксирибонуклениновая кислота; М - метр

ПЦР - полимеразная цепная реакция; РНК - рибонуклениовая кислота; УФ - ультрафиолет; ЭМ - электронная микроскопия;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние поверхностных консервативных аминокислот на активность антирестриктазы ArdB (R64)»

Введение

Системы рестрикции-модификации широко распространены среди прокариот, и играют важную роль в жизни бактериальной клетки. Работа систем рестрикции-модификации основана на сопряженном действии эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы: ферменты систем рестрикции-модификации I, II, III типов узнают специфическую нуклеотидную последовательность, а нуклеазы рестрикции индуцируют двухцепочечные разрывы в ДНК. Рестрикционная активность направлена на защиту от чужеродной немодифицированной ДНК. Собственная же ДНК защищена от действия рестриктаз специфичным метилированием узнаваемых последовательностей, осуществляемым ДНК метилтрансферазами. Таким образом, системы рестрикции-модификации создают барьер, препятствующий горизонтальному переносу генов.

Горизонтальный перенос генов между бактериями в природе обычно осуществляется посредством конъюгативных плазмид и бактериофагов.

В процессе эволюции у плазмид и бактериофагов возникла способность к преодолению «рестрикционных барьеров». Это явление получило название "антирестрикции".

Антирестрикционные белки семейства ArdB специфически ингибируют рестрикционнную активность систем рестрикции-модификации типа I. Настоящая работа посвящена анализу влияния консервативных аминокислот на антирестрикционную активность ArdB. В качестве модельного гена используется ardB из трансмиссивной плазмидой R64 (группа несовместимости IncIl).

Цели и задачи исследования

Настоящая работа посвящена анализу влияния консервативных аминокислот на антирестрикционную активность ArdB.

Целью настоящей работы стало изучить влияние консервативных аминокислот на антирестрикционную активность ArdB. - Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования:

- клонирование гена ardB из плазмиды R64 (IncIl);

- биоинформатический анализ последовательности ardB генов и трехмерной структуры белка ArdB (R64) с целью поиска консервативных аминокислот, не влияющих на структуру белковой глобулы;

- клонирование мутантных вариантов ardB, с заменами по консервативным аминокислотам, предположительно влияющим на активность;

- проверка антирестрикционной активности полученных мутантных форм ArdB (R64);

- выделение и очистка ArdB из клеток Escherichia coli методами аффинной и ионообменной хроматографии с целью поиска «вторичного мессенджера» в процессе антирестрикции;

- выделение и очистка ArdB из R64 в различных условиях с целью поиска «вторичного мессенджера» в процессе антирестрикции.

Научная новизна работы

Анализ полученных в ходе работы мутантных форм ArdB впервые показал, наличие консервативных аминокислот на поверхности белковой глобулы существенных для антирестрикционной активности. Исследуемые поверхностные аминокислоты отобраны с помощью биоинформатического анализа, как не влияющие на трёхмерную структуру белка.

Показана ключевая роль С-концевого аспартата (D141) для проявления антирестрикционной активности ArdB. Отсутствие этой заряженной аминокислоты полностью снимает активность.

Впервые показано, что при выделении методами аффинной и ионообменной хроматографии с нативным белком ArdB совыделяется c ДНК. Показано также, что при выделении мутантного варианта (AD141) совыделения с ДНК не происходит. Полученные данные позволили выдвинуть гипотезу о механизме работы антирестриктазы ArdB, связанную с блокированием транслокации ДНК через R субъединицу комплекса рестрикции модификации I типа.

Теоретическая и практическая значимость работы

За последние 15 лет достигнут значительный прогресс в понимании механизмов явления антирестрикции конъюгативных плазмид и бактериофагов. Показано, что антирестриктазы типа ArdA работают как ДНК мимикрирующие белки, и ингибируют рестриктазы/метилазы I типа в результате конкурентного ингибирования. Подобный механизм показан и для фагового белка Ocr. Известна структура белка ArdA коньюгативной плазмиды рКМ101 (IncN), подтверждающая данный механизм действия.

Для другого семейства антирестриктаз ArdB несмотря на разрешенную структуру до настоящего времени не известен механизм действия на систему рестрикции.

Антирестриктаза ArdB кодируется трансмиссивной плазмидой R64 (IncIl). Трансмиссивные плазмиды играют важную роль в распространении таких существенных свойств бактерий, как антибиотикорезистентность. Особенно значимым этот фактор становится в передаче антибиотикорезистентности между генетически далекими штаммами. Изучение механизмов работы антирестрикционных белков (таких как ArdB) позволит контролировать передачу антибиотикорезистентных свойств, что в свою очередь позволит повысить эффективность антимикробной терапии.

В настоящее время известно множество рамок считывания и функций различных белков, однако далеко не для всех из них описан механизм действия. На сегодняшний день GenBank содержит тысячи гомологов ArdB, гены которых расположены как на трансмиссивных плазмидах, так и в геномах бактерий различных видов и родов. Определение и описание механизма антирестрикционной активности белка ArdB позволит расширить метаболическую карту множества микроорганизмов.

Методология и методы исследования

В работе использовали бактериальные штаммы Escherichia coli AB1157 и BL21(DE3). Ген ardB из плазмиды R64 (коллекция "ГосНИИгенетика")

клонировали с использованием стандартных молекулярно-генетических методов. Эндонуклеолитическое расщепление, лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили согласно [Sambrook J. & Russell D.W. 2000.]. Одиночные мутации по высоконсервативным аминокислотам получали с использованием методов сайт-направленного мутагенеза. Полученные мутанты проверяли на наличие антирестрикционной активности с помощью фаговой методики [Delver et al., 1991]. Для проведения биоинформационного анализа конструкций использовали общедоступные online-сервисы Strum и RaptorX. Очистку целевого белка проводили с использованием ионообменной и афинной хроматоматогорафии.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации ardB гена кодирующие замены высококонсервативных аминокислот расположенных на поверхности белковой глобулы: E32A, S84L, E132A, N77A, D141T, D141N, D141E и AD141 влияют на антирестрикционную активность белка ArdB. С помощью биоинформатического анализа, показано, что указанные поверхностные аминокислоты не влияют на трёхмерную структуру белка.

2. В ходе работы было показано, что С-концевой остаток D141 - ключевой для проявления антирестрикционной активности белка ArdB. Отсутствие этой заряженной аминокислоты в ArdBAD141 полностью снимает антирестрикционную активность.

3. Отрицательный заряд на С-конце является важным условием для антирестрикционной активности ArdB. Замена на полярную, но не заряженную или на неполярную аминокислоту полностью снимает антирестрикционную активность. Замена на глутамат, являющийся отрицательной аминокислотой, но с удлиненным боковым радикалом снижает активность частично.

4. Аспарагин N77 стабилизирует аминокислотный остаток аспартата D141, мутация N77A приводит к потере двух порядков антирестрикционной активности.

5. ArdB взаимодействует с ДНК. При выделении методом аффинной, так и ионообменной хроматографией ArdB совыделяется с ДНК. Совыделения с ДНК не происходит при выделении мутантного варианта ArdB AD 141 или немутантного белка ArdB, но после ренатурации из агрегированного состояния.

6. При УФ облучении бактериальных клеток E. coli наблюдается снижение антирестрикционной активности ArdB. Данный эффект отсутствует при повышении экспрессии гена ardB в E. coli. Использование мутантного штамма E. coli recBC, в котором при УФ-облучении не образуется немодифицированная ДНК так же снимает влияние УФ облучения на антирестрикционную активность.

Литературный обзор Системы рестрикции-модификации

Системы рестрикции-модификации (ЯМ) широко распространены среди бактерий и других прокариот и обеспечивают защиту бактериальной клетки от чужеродной ДНК. Эндонуклеазная часть ЯМ системы индуцирует двойные разрывы в ДНК, модификационная составляющая осуществляет защиту собственной ДНК от действия эндонуклеаз. Ферменты I, II, III типа определяют специфическую последовательность в ДНК, и рестрикционная эндонуклеаза индуцирует в ДНК двойные разрывы. Гены, ответственные за рестрикцию и модификацию были найдены в бактериальных хромосомах, Я-плазмидах, умеренных фагах [Ьоепеп WA, е1 а1., 2014]. Изучать продукты этих генов начали в конце 1960х годов и продолжают до сих пор.

ЯМ системы классифицируют, исходя из их структуры, потребности кофакторов, природы «узнаваемого» и модифицируемого сайта, а также по относительному положению сайта разрезания ДНК. Основные характеристики типов систем рестрикции-модификации представлены в Таблице 1 [КоЬейБ Ш, е1 а1., 2003; Тоск МЯ, Бгуёеп БТ, 2005].

Таблица 1. Основные характеристики систем рестрикции-модификации

I тип II тип III тип IV тип

Характерный пример БсоЮ БсоШ БсоРП Мсг

Кофакторы рестрикции АТФ, БАМ, М§2+ Мв2+ АТФ, БАМ, М§2+ ГТФ, М§2+

Кофакторы метилировани я БАМ БАМ БАМ Нет метилирования

Структура белка Три субъединицы Б, М, Я Две субъединицы Я, М Две субъединицы шоё и геБ Два отдельных белка МсгВ МсгС

Активная форма Я2М2Б1 или М2Б1 Я2 или М1 шоё2гев2 МсгВ или МсгС

Сайт узнавания Несимметричный, прерывистый В большинстве случаев симметричный Несимметричны й Прерывистый, метилированный

Транслокация ДНК Есть Нет Есть Есть

Сайт рестрикции Нефиксированный , отстает от сайта узнавания на более чем 1000 н.п. Фиксированны й в месте узнавания или рядом Фиксированный, отстает от места узнавания на 2527 н.п. Между метилированным и основаниями в сайте узнавания

Анализируя таблицу 1 можно заметить RM системы I и II типов АТФ-зависимы, в отличие от II типа. Кроме того системы I типа принципиально отличаются от других зависимостью рестрикционной активности от S-аденозил метионина (SAM), в то время как в системах II и III типа SAM служит донором метильной группы. Помимо этого, из таблицы 1 видно, что наиболее неприхотливы и специфичны RM системы II типа, что послужило их широкому использованию в генно-инженерных целях.

В конце 1970х годов были показаны существенные различия между RM системами I и II типов: в системах II типа EcoRI и EcoKI транслокация ДНК происходит с участием АТФ [Rosamond J, et al., 1979; Yuan R, et al., 1980]. Вирусы и другие мобильные генетические элементы разработали множество различных путей обхождения рестрикции: модификация хозяйской метилазой, синтез собственных метилаз, гипер-модификация ДНК включением нестандартных оснований, синтез антирестрикционных белков, мимикрирующих ДНК, отсутствие сайтов узнавания [Warren RA, et al. 1980;Kruger DH, et al., 1983]. Все вышеперечисленные процессы позволяют бактериофагам успешно обходить системы рестрикции, поэтому бактериальные клетки вынуждены периодически менять специфичность систем рестрикции. В системах I типа узнающая субъединица (S) одновременно взаимодействует как с рестрикционной (R), так и с модификационной (M) субъедницами.

RM системы I типа

RM системы I типа кодируются тремя hsd генами (host specificity determinant): hsdR определяет субъединицу рестрикции (R), hsdM определяет модификационную субъединицу (M), hsdS - узнающую субъединицу (S). Гены hsdM и hsdS транскрибируются с одного промотора, hsdR транскрибируется с собственного промотора.

RM-системы I типа - пентамерные белковые комплексы, образованные комбинацией из 2R+2M+S субъединиц (Рисунок 1). Для активности комплекса и проявления рестриктазной и метилтрансферазной активности необходим АТФ, Mg2+ и S-аденозилметионин. Для проявления метилтрансферазной активности достаточно комплекса M2S1 [Kennaway et al., 2009]. RM-системы I типа специфически узнают последовательность не являющуюся палиндромом. Как правило, сайт узнавания состоит из двух плечей по 3-4 узнаваемых нуклеотида, которые разделёны 6-9 любыми нуклеотидами (сайт узнавания EcoKI -AACNNNNNNGTGC). Узнающая субъединица S имеет два узнающих домена (TRD), которые определяют специфичность как рестрикционной, так и модификационной активности комплекса. При этом один домен узнает одну половину последовательности, а второй домен - вторую половину. Рекомбинация между TRD доменами дает новые варианты специфичности.

Модификационная субъединица HsdM имеет сайт связывания с SAM и активный сайт для метилирования ДНК. Метилтрансферазной активностью обладает как пентамер R2M2S, так и тример M2S. Обычно метилируется один аденин из каждой узнаваемой полупоследовательности в m6A (№-метиладенин).

Субъединица рестрикции R имеет два активных сайта для гидролиза АТФ и другие структуры, необходимые для транслокации ДНК и эндонуклеазной активности. R-субъединица содержит N-концевой эндонуклеазный домен, соединенный с так называемым "моторным" доменом, найденным во многих других ДНК и РНК - процессирующих ферментах с транслокационной или

хеликазной активностью [Вау1еБ ОР, е1 а1., 1999]. Я - субъединица взаимодействует с М2Б комплексом за счет М-субъединиц. Если ни одна из половин узнаваемой последовательности не метилирована, Я - субъединица транслоцирует ДНК и разрезает ее на неопределенном расстоянии от сайта узнавания - примерно посередине между двумя сайтами узнавания [НогшсЫ К, 7тёег N0, 1972; БШ&ег FW, ВапёуораёИуау РК., 1988]. Расщепление нити происходит тогда, когда комплекс блокируется и транслокация не может продолжаться, например, когда два комплекса сталкиваются [1ашсак Р., е1 а1., 1999]. При транслокации фермент остается прикреплённым к сайту узнавания (Рисунок 1).

Транслокация Закрытая форма RM-комплекса

Рисунок 1. Принципиальная схема сборки и работы RMI комплекса [Liu Y., et al., 2017].

Такой механизм порождает петли ДНК, видимые с помощью методов электронной и атомно-силовой микроскопии [Rosamond J., et al., 1979; Neaves KJ., et al., 2009]. Показано, что мутации в эндонуклеазном домене могут влиять на разрушение ДНК, при сохранении транслокационной способности [Davies GP, et al., 1999].

Транслокация ДНК

Транслокацию ДНК в процессе рестрикции впервые показали для EcoBI

EcoKI в электронно-микроскопических (ЭМ) исследованиях, которые демонстрировали выпетливание ДНК [Rosamond J, et al., 1979; Yuan R, et al., 1980]. Исследования с фагом X и с релаксированной, и c суперскрученной кольцевой ДНК показали, что EcoKI двигает (транслоцирует) ДНК через себя с большими конформационными изменениями фермента, при этом образуются большие двунаправленные петли ДНК, которые различимы с помощью ЭМ. Более поздние исследования подтвердили, что при связывании с ДНК фермент сильно меняется: от раскрытой формы к компактной [Dryden DT et al., 2001; Kennaway CK et al., 2009; Kennaway CK et al., 2009].

Атомно-силовые микроскопические исследования одиночных молекул совместно с биохимическими и биофизическими методами внесли ясность в работу EcoKI и EcoR124 систем (Рисунок 2) и выявили несколько неожиданных деталей о димеризации ферментов и выпетливании ДНК: когда молекула ДНК имеет два сайта узнавания, имеет место димеризация комплексов EcoKI [Neaves KJ., et al., 2009].

Рисунок 2. Схема транслокации ДНК, содержащей два сайта узнавания, ЕсоК1 комплексом. А) Линейная ДНК имеет два сайта узнавания. Фермент представляет собой М2Б1 ядро, в

окружении двух R-субъединиц. B) Связывание с ДНК ведет к конформационным изменениямЕсоК1 комплекса. С) В результате изменения конформации два EcoKI комплекса быстро образуют димер D) При добавлении АТФ начинается процесс транслокации, ведущий к разворачиванию или сжатию петель ДНК в комплексе Е) суперскручивание появляющихся петель ДНК или блок дальнейшей транслокации сжимающихся петель создает топологический барьер, который в конечном итоге останавливает транслокацию F) R-субъединица гидролизует ДНК в произвольном месте рядом с основанием транслоцированной петли. Стоит обратить внимание, что ферментный комплекс остается связанным с сайтом узнавания сайтами на протяжении всего процесса [Neaves KJ., et al., 2009].

Эксперименты с магнитными ножницами (микроманипуляции с заякоренной на магнитные шарики одиночной линейной молекулой ДНК с помощью градиента магнитного поля) выявили некоторые биофизические аспекты транслокации, такие как скорость транслокации ДНК молекулярными моторами - R-субъединицами, составляющая около 1 н.п./сек, с потреблением одной АТФ- за один шаг трансклокации [Seidel R et al., 2004; Seidel R et al., 2005; Seidel R et al., 2008; Stanley LK et al., 2006]. Эти исследования показали, что два мотора в комплексе могут работать независимо друг от друга и то, что фермент двигается вдоль шага спирали ДНК на торсионно ограниченных молекулах. Видимо, транслокация может останавливаться и перезапускаться за счет рассоединения и воссоединения комплекса. R-субъединица отсоединяется от ДНК примерно каждые 500 нуклеотидов, однако транслокация продолжается в течение примерно 2000 нуклеотидов. Транслокация может быть заблокирована столкновением с другой молекулой или же присутствием суперскрученной ДНК. В любом из этих случаев ДНК разрезается.

Более того, существуют in vitro доказательства того, что ДНК может быть гидролизована в репликационной вилке [Ishikawa К et al., 2009]. Хотя фермент остается прикрепленным к ДНК он может быть смещен другими транслокационными машинами, например, такими как RecBCD [Bianco PR, Hurley EM, 2005].

Ослабление рестрикции в УФ облучённых клетках.

Деградация ДНК под действием ультрафиолетового излучения, 2-

аминопуринов, налидиксовой кислоты может ингибировать работу систем

рестрикции-модификации I типа. Это явление получило название «ослабление рестрикции» [Thoms B. and Wackernagel W., 1984]. Клеточные популяции, которые обычно показывали EOP фага порядка 10-5, после повреждения ДНК ослабляли свою рестрикционную активность до EOP 10-1. Предполагается, что этот механизм должен защищать клеточную ДНК после повреждения во время репарации или гомологичной рекомбинации [Blakely GW, Murray NE., 2006]. Так как во время этого процесса могут образовываться неметилированные участки ДНК в хозяйской хромосоме, и ослабление рестрикции защищает немодифицированные участки хозяйской ДНК от расщепления.

Помимо этого показано ослабление рестрикции (но не модификации) во время переноса генов RM в клетку другого хозяина, то есть деградация ДНК нового хозяина ограничена так называемым «эффектом Прокаша» [Prakash-Cheng A, Ryu J., 1993; Prakash-Cheng A, et al, 1993]. Эти исследования показали, что рестрикционная активность проявляется с задержкой после внедрения EcoKI hsdR, hsdM, hsdS генов. Эту задержку признали генетически детерминированной и назвали HsdC. Позднее другими исследователями было показано, что задержка обусловлена работой ClpX - шапероном и его протеолитической формой ClpXP комплексом [Makovets S, et al., 1998].

Антирестрикция

В ходе эволюции способность к преодолению действия рестриктаз возникла

как у плазмид, так и у бактериофагов: Это явление получило название "антирестрикции".

Изучение антирестрикционных механизмов в конъюгативных плазмидах показало, что решающую роль в процессе антирестрикции играют гены ard. Впервые гены ardA и ardB были найдены в плазмидах групп несовместимости N и I (pKM101, ColIbP9), затем в плазмидах других групп. Известно, что гены ard необходимы в «жизненном цикле» конъюгативных плазмид для преодоления рестрикционных барьеров при передаче ДНК между бактериями [Kotova VY, et al., 1988; Althorpe NJ, et al., 1999].

Плазмиды называются конъюгативными, если они способны автономно реплицироваться в бактериальной клетке и могут передаваться от одной клетки другой с помощью конъюгации. В настоящее время для энтеробактерий известно около 30 групп несовместимости плазмид: FI, FII, FIII, FIV, I1, I2, N, B, P, K и т.д. [Couturier M, et al., 1988]. Гены, необходимые для конъюгативных плазмид включают в себя две группы: rep гены определяют репликацию и tra гены отвечают за конъюгативный перенос генетического материала. Эти гены обычно занимают более 50% длины плазмиды [Pansegrau W, et al., 1994]. Оставшаяся часть включает в себя «случайные» элементы (IS-элементы, транспозоны, содержащие гены, ответственные за резистентность к антибиотикам или тяжелым металлам, гены вирулентности и т.д.) и «несущественные» гены. В отличие от «случайных» элементов, способных свободно мигрировать из одного генома в другой, «несущественные» гены сохраняют свою локализацию в плазмиде и имеют консервативную последовательность. Однако при внесении нарушающих активность мутаций в "несущественные" гены, конъюгативные плазмиды продолжают нормально реплицироваться в клетке и конъюгировать в другие клетки. Именно поэтому эта группа генов и получила название "несущественных" генов.

В конъюгативных плазмидах «несущественные» гены расположены в так называемом «лидерном» участке, примыкающем к oriT сайту, поэтому эти гены первыми проникают в клетку во время конъюгативного переноса. OriT - сайт начала репликации, который расположен между tra опероном и остальной плазмидой (Рисунок 3).

Рисунок 3. Схема лидерного участка плазмиды ColIb [Bates S et al., 1999].

Лидерный участок содержит 8-10 открытых рамок считывания (ORF). Однако только четыре гена были описаны фенотипически: ard, psiB, flm (hok-sok), ssb. Остальные рамки считывания пока не описаны.

Ген psiB кодирует маленький кислый белок, который ингибирует RecA -ключевой белок в регуляции SOS-ответа [Bagdasarian MM, et al., 1992]. Поскольку плазмидная ДНК заходит в одноцепочечной форме, предполагается, что инактивация RecA посредством PsiB снижает эффективность SOS-ответа клетки.

В настоящее время обнаружено несколько разновидностей гена ard (ardA, ardB, ardC, ardD), которые кодируют небольшие (140-170 а.о.) белки с характерным суммарным зарядом (-10 - -25), и, как показано в ряде работ, являются ингибиторами клеточных R -M систем 1-го типа [Delver EP., et al., 1991; Belogurov AA., et al., 1992; Belogurov AA, et al., 1993; Chilley P, Wilkins B, 1995; Belogurov AA, et al., 2000; Balabanov VP, et al., 2012].

Белки семейства Ard ингибируют ферменты рестрикции-модификации I типа, кодируемые генами hsdRMS, которые обычно расположены в бактериальной хромосоме (в отличие от систем II и III типов, обычно кодируемых генами в плазмидах).

Выравнивания аминокислотных последовательностей белков ArdA, ArdB, ArdC не выявили гомологий, кроме маленького участка в девять аминокислот,

названного «антирестрикционным мотивом» [Belogurov A.A., et al. 1993; Belogurov A.A., Delver E.P. 1995].

В Таблице 2 показаны антирестрикционные мотивы для нескольких белков семейства Ard, а также для других белков-ингибиторов рестрикционных эндонуклеаз. Антирестрикционный мотив характеризуется строго определенной последовательностью отрицательно заряженных аминокислот (D/E аспарагиновой и глутаминовой кислот), а также расположением в начале и в середине гидрофобных аминокислот. Похожий мотив был найден в ArsR белках, репрессирующих репрессоры ars-оперонов, определяющих резистетность клеток к ионам мышьяка.

Таблица 2. Антирестрикционный мотив

Белок Источник Последовательность Ссылка

ArdA ColIb-P9 130-LLADVPETV DelverE.P. et al. 1991

ArdA R16 131 -LLADVPETV ChilleyP.M. et al. 1995

ArdA pKM101 (incN) 131-LLNEIPES V BelogurovA.A. et al 1992

ArdA Folac (incFV) 132-LLNEVPEPL ChilleyP.M. et al 1995

ArdB pKM101l 120-LLREYVNTL Belogurov A.A et al 1993

ArdC pSa (incW) 199- SRLDFSDRK Belogurov A.A. 2000

Ocr (0.3) фаг T7 101-LLNEYLEE V Dunn J.J. et al 1981

DarA Фаг F l 542-LQAEVGEIT IidaS. et al 1998

ArsR R64 (incI 1) 24-LLREMGELC Rastorguev S.M., 1999

Антирестрикционные и антимодификационные белки

Структура белков Осг фага Т7

Антирестрикционные белки типа Осг, АгёА, АгёВ в природе встречаются в разных мобильных генетических элементах. Белок Осг характерен для фагов, в частности для Т7 фагов [Оейег М, et а1., 1966]. В фагах Т7 белок кодируется геном 0.3 - первым геном, проникающим в клетку Е.свИ во время инфицирования. За первые две минуты инфицирования Осг нарабатывается в больших количествах -

на это время проникновение оставшейся части ДНК фага Т7 прерывается [Moffatt BA, Studier FW., 1988]. Когда нарабатывается достаточное количество белка Ocr для полного ингибирования RM-I системы, выработка белка прекращается, и оставшаяся часть генома фага может беспрепятственно войти в клетку. Показано что in vitro Ocr может связываться с РНК-полимеразой, однако, работает ли такой механизм in vivo - неизвестно [Ratner D., 1974].

Белок Ocr - классический пример ДНК-мимикрирующих белков. Это гомодимер, состоящих из двух субъединиц в 116 аминокислотных остатков [Dunn J.J., et al., 1981].

Рисунок 4. Структура белка Осг [Wa1kiпshaw М.Б. е1 а1., 2002], pdb: 1Б77.

Из рисунка 4 видно, что белок имеет банановидную форму, структура длиной около 7.5нм, шириной от 2нм до 2.5 нм. В 2009 году была получена структура метилтрансферазной части ЯМ-1 комплекса М2Б1, связанной с Осг [Kennaway е1 а1., 2009].

Структура белков ЛгйЛ

Так же, как и Осг, белок АМА геометрически и электоростатически мимикрирует В-форму ДНК (Рисунок 5).

Белки АМА ингибируют как рестрикционную, так и модификационную активность всех четырех семейств ферментов рестрикции-модификации I типа. Пространственная структура белков АМА сходна со структурой двухцепочечной ДНК в В-форме, следовательно, АМА можно отнести к семейству ДНК-мимикрирующих белков (рго1ет ттюгу о!"" DNA) [МсМа^п БА, е1 а1., 2009].

ArdA образует прочный комплекс с ферментом рестрикции-модификации типа I (R2M2S), что значительно снижает вероятность образования комплекса с ДНК (механизм конкурентного ингибирования).

Если ген ardA клонирован в мультикопийный вектор под сильным промотором, то его продукт ArdA защищает ДНК немодифицированного фага в клетке действуя in trans. Это обеспечивает полную защиту ДНК от действия систем рестрикции-модификации I типа. Например, для систем EcoK (в E. coli K12) в отсутствие гена ardA титр фага снижается на четыре порядка, при наличии же ardA практически не наблюдается расщепление ДНК.

Рисунок 5. Структура АМА [МсМаИоп Б.А., et а1., 2009], pdb:2W82.

Ген ardA, находящийся в векторе, неспособен защитить немодифицированную внедряемую в клетку плазмиду при трансформации, потому что при атаке немодифицированной ДНК рестрикционными эндонуклеазами, белок АМА не успевает наработаться в достаточных количествах. В случае же конъюгативного переноса плазмидная ДНК может быть защищена наличием гена ardA от клеточных систем рестрикции-модификации. Выход трансконъюгантов значительно выше, если в немодифицированной плазмиде Со11Ь-Р9 присутствует ген ardA, если же ген инактивирован или если эта плазмида (ЯР4, тсРа) не имеет в своем составе подобного гена, то эффективность образования трансконъюгантов примерно на два - три порядка ниже. Если же в клетку-реципиент совместно с ЯР4 ввести плазмиду с активным геном ardA, то образование трансконъюгантов с ЯР4 восстанавливается до уровня контрольного опыта, проводимого с модифицированной ДНК [А1ШогреМ1, et а1. 1999].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кудрявцева Анна Александровна, 2019 год

Литература

1. Adamczyk M, Jagura-Burdzy G. Spread and survival of promiscuous IncP-1 plasmids. Acta Biochimica Polonica. 2003;50:425-453.

2. Althorpe N.J., Chilley P.M., Thomas A.T., Brammar W.J., Willcins B.M. Transient transcriptional activation of the Incll plasmid anti- restriction gene (ardA) and SOS inhibition gene (psiB) early in conjugating recipient bacteria// 1999. Mol Microbiol 31:133-42.

3. Althorpe, N. J., Chilley, P. M., Thomas, A. T., Brammar, W. J. and Wilkins, B. M. Transient transcriptional activation of the IncIl plasmid anti-restriction gene (ardA) and SOS inhibition gene (psiB) early in conjugating recipient bacteria // 1999. Molecular Microbiology, 31: 133-142.

4. Bagdasarian MM, Ballone A, Angulo JF, Scholz P, Bagdasarian M, Devoret, R. PsiB, and anti-SOS protein, is transiently expressed by the F sex factor during its transmission to an Escherichia coli K-12 recipient // 1992. Mol. MicrobioL. 6: 885-893.

5. Balabanov V.P., Pustovoit K.S., Zavilgelsky G.B. Comparative analysis of antirestriction activity of R64 ArdA and ArdB proteins // 2012. Mol. Biol.(Moskow). 2012. 46, 269-75.

6. Balabanov VP, Kotova VY, Kholodii GY, Mindlin SZ, Zavilgelsky GB. A novel gene, ardD, determines antirestriction activity of the non-conjugative transposon Tn5053 and is located antisense within the tniA gene // 2012. FEMS Microbiol Lett. 337(1):55-60.

7. Bates S., Roscoe R.A., Althorpe N.J., Brammar W.J., and Wilkins B.M. Expression of leading region genes on Incll plasmid CoIIb-P9: genetic evidence for single-stranded DNA transcription// 1999. Microbiology 145:2655-62.

8. Belogurov A.A., Delver E.P. A motif conserved among the type 1 restriction-modification enzymes and antirestriction proteins: a possible basis for

mechanism of action of plasmidencoded antirestriction functions // 1995. Nucleic Acids Res 23:785-7.

9. Belogurov AA, Delver EP, Rodzevich OV. IncN plasmid pKM101 and IncI1 plasmid ColIb-P9 encode homologous antirestriction proteins in their leading regions // 1992. J Bacteriol. 174(15):5079-5085. doi:10.1128/jb.174.15.5079-5085.1992

10. Belogurov, A.A., Delver, E., and Rodzevich, O.,J. Bacteriol. Plasmid pKM101 encodes two nonhomologous antirestriction proteins (ArdA and ArdB) whose expression is controlled by homologous regulatory sequences // 1993. vol. 175, pp. 5079-5085

11. Belogurov, A.A., Delver, E.P., Agafonova, O.V., Belogurova, N.G., Lee, L.Y., and Kado, C.I.,J. Antirestriction protein ard (type C) encoded by IncW plasmid psa has a high similarity to the "protein transport" domain of TraCl primase of promiscuous plasmid RP4 // 2000. Mol. Biol. vol. 296, pp. 969977.

12. Bianco PR, Hurley EM. The type I restriction endonuclease EcoR124I, couples ATP hydrolysis to bidirectional DNA translocation. J. Mol. Biol. 2005;352:837-859.

13. Bickle TA, Kruger DH. Biology of DNA restriction // 1993. Microbiol. Rev. 57:434-450

14. Blakely GW, Murray NE. Control of the endonuclease activity of type I restriction-modification systems is required to maintain chromosome integrity following homologous recombination. Mol. Microbiol. 2006;60:883-893.

15. Burlage RS, Bemis LA, Layton AC, Sayler GS, Larimer F. Comparative genetic organization of incompatibility group P degradative plasmids. J. Bacteriol. 1990;172:6818-6825

16. Chilley P, Wilkins B. Distribution of the ardA family of antirestriction genes on conjugative plasmids // 1995. Microbiology. 141(9):2157-2164

17. Couturier M, Bex F, Bergquist PL, Maas WK. Identification and classification of bacterial plasmids // 1988. Microbiol Rev. 52(3):375-395.

18. Davies GP, Martin I, Sturrock SS, Cronshaw A, Murray NE, Dryden DT. On the structure and operation of type I DNA restriction enzymes. J. Mol. Biol. 1999;290:565-579.

19. Delver E.P., Kotova V.Yu., Zavilgelsky G.B., Belogurov A.A. Nucleotide sequence of the gene (ard) encoding the antirestriction protein of plasmid ColIb-P9 // 1991. J. Bacteriol. 173, 5887-5892.

20. Dryden DT, Murray NE, Rao DN. Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes, Nucleic Acids Res. , 2001, vol. 29 (pg. 3728-3741)

21. Dunn J.J., Elzings M., Mark K.K., Studier F.W. Amino acid sequence of the gene 0.3 protein of bacteriophage T7 and nucleotide sequence of its mRNA //1981. J. Biol. Chem. 256:2579-2585.

22. Gefter M, Hausmann R, Gold M, Hurwitz J. The enzymatic methylation of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid. X. Bacteriophage T3-induced S-adenosylmethionine cleavage. J. Biol. Chem. 1966;241:1995-2006.

23. Goryanin I.I., Kudryavtseva A.A., Balabanov V.P. et al. Antirestriction activities of KlcA (RP4) and ArdB (R64) proteins // 2018. FEMS Microbiol. Lett. 365, No.23. fny227.

24. Guan KL, Dixon JE (1991) Eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli: an improved thrombin cleavage and purification procedure of fusion protein with glutathione S-transferase. Anal Biochem 192:262-267

25. Harada KM, Aso Y, Hashimoto W, Mikami B, Murata K. Sequence and analysis of the 46.6-kb plasmid pA1 from Sphingomonas sp. A1 that corresponds to the typical IncP-1beta plasmid backbone without any accessory gene. Plasmid. 2006;56:11-23

26. Horiuchi K, Zinder ND. Cleavage of bacteriophage fl DNA by the restriction enzyme of Escherichia coli B. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 1972;69:3220-3224.

27. Ishikawa K, Handa N, Kobayashi I. Cleavage of a model DNA replication fork by a Type I restriction endonuclease. Nucleic Acids Res. 2009;37:3531-3544.

28. Ivancic-Bace I., Vlasic I., Cogelja-Cajo G. et al. Roles of PriA protein and double-strand DNA break repair functions in UV-induced restriction alleviation in Escherichia coli. Genetics. 2006. 174, 2137-49.

29. Kamachi K, Sota M, Tamai Y, Nagata N, Konda T, Inoue T, Top EM, Arakawa Y. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 2006;152:3477-3484.

30. Kelleher J.E., and Raleigh E.G. Response to UV damage by four Escherichia coli K-12 restriction systems. J. Bacteriol. 1994. 176, 5888-96.

31. Kennaway CK, Obarska-Kosinska A, White JH, Tuszynska I, Cooper LP, Bujnicki JM, Trinick J, Dryden DT. The structure of M.EcoKI Type I DNA methyltransferase with a DNA mimic antirestriction protein, Nucleic Acids Res. , 2009, vol. 37 (pg. 762-770)

32. Kennaway CK, Obarska-Kosinska A, White JH, Tuszynska I, Cooper LP, Bujnicki JM, Trinick J, Dryden DT. The structure of M.EcoKI Type I DNA methyltransferase with a DNA mimic antirestriction protein. Nucleic Acids Res. 2009;37:762-770.

33. Kotova, V.Y., Belogurov, A.A., and Zavilgelsky, G.B. Alleviation of type I restriction in the presence of plasmids of group inc I. General characteristics and molecular cloning of the ard gene // 1988. Mol. Biol., vol. 22, pp. 270276.

34. Kruger DH, Bickle TA. Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avoiding the deoxyribonucleic acid restriction systems of their hosts // 1983. Microbiol. Rev. 47:345-360

35. Larsen M.H., Figurski D.H. Structure, expression, and regulation of the kilC operon of promiscuous IncP alpha plasmids // 1994. J. Bacteriol. 176, 50225032.

36. lida S., Hiestand-Nauer R., Bandmeier H., Lehnherr H., Arber W. Accessory genes in the dar A Operon of bacteriophage PI affect antirestriction function

generalized transduction, head morphogenesis, and host all lysis. // 1998. Virology. 251:49-58

37. Liu Y., Qun T., Jie-zhong Z., Li-fei T., Pu G.Yan Structural basis underlying complex assembly and conformational transition of the type I R-M system. 2017. Vol. 114, № 42. P. 11151-11156.

38. Loenen WA, Dryden DT, Raleigh EA, Wilson GG. Type I restriction enzymes and their relatives // 2014. Nucleic Acids Res. 42(1):20-44.

39. M.D Walkinshaw, P Taylor, S.S Sturrock, C Atanasiu, T Berge, R.M Henderson, J.M Edwardson, D.T.F Dryden. Structure of Ocr from Bacteriophage T7, a Protein that Mimics B-Form DNA. Molecular Cell. 2002; 9-1:187-194.

40. McMahon S.A., Roberts G.A., Jhonson K.A., Cooper L.P., Liu H., White J.H., Carter L.G., Singhvi B., Oke M., Walkinshaw M.D., Blakely G.W., Naismith J.H., Dryden D.T.F. Extensive DNA mimuicry by the ArdA antirestriction protein and its role in the spread antibiotic resistance // 2009. Nucl. Acids Res. 37, 4887--4897.

41. Moffatt BA, Studier FW. Entry of bacteriophage T7 DNA into the cell and escape from host restriction. J. Bacteriol. 1988;170:2095-2105.

42. Murray, Noreen E. Type I Restriction Systems: Sophisticated Molecular Machines (a Legacy of Bertani and Weigle) // 2000. Microbiology and molecular biology reviews. 64(2):412-34.

43. Neaves KJ, Cooper LP, White JH, Carnally SM, Dryden DT, Edwardson JM, Henderson RM. Atomic force microscopy of the EcoKI Type I DNA restriction enzyme bound to DNA shows enzyme dimerization and DNA looping. Nucleic Acids Res. 2009;37:2053-2063.

44. Oke M., Carter L.G., Johnson K.A., Liu H., McMahon S.A., Yan X., Kerou M., Weikart N.D., Kadi N., Sheikh M.A., Schmelz S., Dorward M., Zawadzki M., Cozens C., Falconer H., Powers H., Overton I.M., van Niekerk C.A., Peng X., Patel P., Garrett R.A., Prangishvili D., Botting C.H., Coote P.J., Dryden D.T., Barton G.J., Schwarz-Linek U., Challis G.L., Taylor G.L.,

White M.F., Naismith J.H. The Scottish structural proteomics facility: targets, methods and outputs. // 2010. J. Struct. Funct. Genomics. 11, 167-180.

45. Pansegrau, W., Lanka, E., Barth, P.T., Figurski, D.H., Guiney, D.G., Haas, D., Helinski, D.R., Schwab, H., Stanisich V.A., and Thomas, C.M. Complete nucleotide sequence of Birmingham IncP alpha plasmids. Compilation and comparative analysis // 1994. J. Mol. Biol. vol. 239, pp. 623-663.

46. Peng J, Xu J. RaptorX: exploiting structure information for protein alignment by statistical inference // 2011. Proteins.79 Suppl 10(Suppl 10): 161-171. doi:10.1002/prot.23175

47. Prakash-Cheng A, Ryu J. Delayed expression of in vivo restriction activity following conjugal transfer of Escherichia coli hsdK (restriction-modification) genes. J. Bacteriol. 1993;175:4905-4906.

48. Quan L, Lv Q, Zhang Y. STRUM: structure-based prediction of protein stability changes upon single-point mutation // 2016. Bioinformatics. 32(19):2936-2946. doi: 10.1093/bioinformatics/btw361

49. Rastorguev, S.M., Letuchaya, T.A., Kholodiy, G.Ya.,Mindlin, S.Z., Nikiforov, V.G., and Zavilgelsky, G.B.,Mol. Biol., 1999, vol. 33, pp. 354357.

50. Ratner D. The interaction bacterial and phage proteins with immobilized Escherichia coli RNA polymerase. J. Mol. Biol. 1974;88:373-383.

51. Riley M, Abe T, Arnaud MB, Berlyn MK, Blattner FR, Chaudhuri RR, Glasner JD, Horiuchi T, Keseler IM, Kosuge T, et al. Escherichia coli K-12: a cooperatively developed annotation snapshot-2005. Nucleic Acids Res. 2006;34:1-9

52. Roberts RJ, Belfort M, Bestor T, et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes // 2003. Nucleic Acids Res. 31(7):1805-1812.

53. Rosamond J, Endlich B, Linn S. Electron microscopic studies of the mechanism of action of the restriction endonuclease of Escherichia coli B. J. Mol. Biol. 1979;129:619-635.

54. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2000.

55. Sampel G., Furuga N., Tachibana K., Saitou Y., Suzuki T., Mizubichi K., Komano T. (2010) Complete genome sequence of the incoppatibility group I1 plasmid R64. Plasmid. 64, 92--103.

56. Seidel R, Bloom JG, Dekker C, Szczelkun MD. Motor step size and ATP coupling efficiency of the dsDNA translocase EcoR124I. EMBO J. 2008;27:1388-1398.

57. Seidel R, Bloom JG, van NJ, Dutta CF, Dekker NH, Firman K, Szczelkun MD, Dekker C. Dynamics of initiation, termination and reinitiation of DNA translocation by the motor protein EcoR124I. EMBO J. 2005;24:4188-4197.

58. Seidel R, van NJ, van der Scheer C, Bloom JG, Dekker NH, Dutta CF, Blundell A, Robinson T, Firman K, Dekker C. Real-time observation of DNA translocation by the type I restriction modification enzyme EcoR124I. Nat. Struct. Mol. Biol. 2004;11:838-843.

59. Serfiotis-Mitsa D., Herbert A.P., Roberts G.A., Soares D.C., White J.H., Blakely G.W., Uhrin D., Dryden D.T. The structure of the KlcA and ArdB proteins reveals a novel fold and antirestriction activity against type I DNA restriction systems in vivo but not in vitro. // 2010. Nucl. Acids Res. 38, 1723--1737.

60. Stanley LK, Seidel R, van der Scheer C, Dekker NH, Szczelkun MD, Dekker C. When a helicase is not a helicase: dsDNA tracking by the motor protein EcoR124I. EMBO J. 2006;25:2230-2239.

61. Studier FW, Bandyopadhyay PK. Model for how type I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 1988;85:4677-4681.

62. Thoms B, Wackernagel W. Genetic control of damage-inducible restriction alleviation in Escherichia coli K12: an SOS function not repressed by lexA. Mol. Gen. Genet. 1984;197:297-303.

63. Tock MR, Dryden DT. The biology of restriction and anti-restriction // 2005. Curr. Opin. Microbiol. 8:466-472.

64. Warren RA. Modified bases in bacteriophage DNAs // 1980. Annu. Rev. Microbiol. 34:137-158

65. Yuan R, Hamilton DL, Burckhardt J. DNA translocation by the restriction enzyme from E. coli K // 1980. Cell. 20(1):237-244.

Публикации аспиранта

1. Кудрявцева А.А., Осетрова М.С., Ливинюк В.Я., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. С-концевой остаток аспарагиновой кислоты (D141) необходим для антирестрикционной активности белка ArdB (R64). // 2017 Молекулярная биология. 51(5): 831-835. doi: 10.7868/S002689841705010X.

2. Goryanin I.I., Kudryavtseva A.A., Balabanov V.P. et al. Antirestriction activities of KlcA (RP4) and ArdB (R64) proteins. // 2018 FEMS Microbiol. Lett. 365(23). doi: 10.1093/femsle/fny227.

3. Balabanov, V.P., Kudryavtseva A.A., Melkina O.E., Pustovoit K.S., Khrulnova S.A., Zavilgelsky G.B. ArdB Protective Activity for Unmodified X Phage Against EcoKI Restriction Decreases in UV-Treated Escherichia Coli // 2019. Current Microbiology 76(11): 1374-78.

4. Кудрявцева А.А., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. Сайт-направленный мутагенез гена ardb из коньюгативной плазмиды R64. Антирестрикционная активность мутантов // VIII Научно-практическая конференция «Генетика — фундаментальная основа инноваций в медицине и селекции», Ростов-на-Дону, 26-29 сентября 2019.

5. Кудрявцева А.А., Осетрова М.С., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. С-концевой аспартат является ключевой аминокислотой для активности антирестриктазы ArdB коньюгативной плазмиды R64 // 59-я Всероссийская научная конференция МФТИ с международным участием, Долгопрудный, 21 -26 ноября 2016.