Влияние модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Свинарева, Людмила Владимировна

• Свинарева, Людмила Владимировна
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Свинарева, Людмила Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и функции теломер.

1.1.1. Лимит Хейфлика.

1.1.2. Проблема концевой недорепликации.

1.1.3. Строение теломер.

1.1.4. Шелтериновый комплекс.

1.2. Структура и функции теломеразы.

1.2.1. Строение фермента.

1.2.2. Принцип действия теломеразы.

1.2.3. Альтернативные способы удлинения теломер.

1.2.4. Роль теломеразы в иммортализации клеток.

1.3. Регуляция теломеразной активности.

1.3.1. Транскрипция гена ЬТЕЯТ.

1.3.2. Альтернативный сплайсинг мРНК ИТЕЯТ.

1.3.3. Регуляция на уровне посттранскрипционных изменений.

1.4. Активность теломеразы в нормальных и опухолевых клетках человека.

1.5. Ингибиторы теломеразной активности.

1.5.1. Низкомолекулярные ингибиторы теломеразы.

1.5.2. Антисенс-терапия.

1.5.3. Рибозимы.

1.5.4. Соединения, взаимодейстующие с теломерным в-квадруплексом

1.5.5. РНК-интерференция.

1.6. Внетеломерные функции теломеразы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Олигонуклеотиды.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Клинический материал.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение экстрактов из клеток опухолевых линий и тканей пациентов.

2.2.2. Анализ теломеразной активности.

2.2.3. Определение цитотоксической активности исследуемых олигонуклеотидов.

2.2.4. Исследование апоптоза и распределения клеток по фазам клеточного цикла с помощью проточной цитофлуориметрии.

2.2.5. Исследование препаратов клеток Ме1-10, содержащих БАМ-меченые олигонуклеотиды, методом конфокальной микроскопии.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ активности теломеразы в тканевых экстрактах пациентов с различными онкопатологиями.

3.2. Исследование влияния модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов на теломеразную активность in vitro.

3.3. Исследование динамики накопления модифицированных ДНК-олигонуклеотидов и их влияния на рост и выживаемость опухолевых клеток.

3.4. Исследование внутриклеточной локализации FAM-меченых фосфоротиоатных олигонуклеотидов посредством конфокальной микроскопии.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние модифицированных ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток»

Актуальность темы.

Одной из важных задач современной онкологии и фармакологии является разработка соединений, ингибирующих рост опухолей. Несмотря на большое количество проводимых исследований, остается открытым вопрос о поиске и применении эффективных противоопухолевых препаратов, способных избирательно воздействовать на раковые клетки и не оказывать негативного действия на организм.

Главными мишенями действия таких лекарственных средств должны являться специфические компоненты раковых клеток, необходимые для их существования и размножения. В нормальных соматических клетках существует механизм контроля пролиферации, обусловленный постепенным укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления. Раковые клетки обладают способностью обходить этот механизм и тем самым приобретать свойство иммортальности (неограниченного репликативного потенциала).

Приобретение иммортальности клетками опухолей напрямую связано с активацией фермента теломеразы, компенсирующей укорочение теломер, происходящее в процессе каждого деления клетки. Теломеразная* активность (ТА) обнаруживается почти во всех типах злокачественных опухолей человека, в то время как в большинстве нормальных тканей она практически не детектируется. Именно поэтому теломераза рассматривается как уникальный маркер опухолевого роста, а также как перспективная мишень для действия лекарственных препаратов.

Особую группу соединений, исследуемых в настоящее время в качестве потенциальных ингибиторов теломеразы, представляют антисмысловые олигонуклеотиды. В отличие от обычной стратегии, где антисмысловые олигонуклеотиды подавляют экспрессию определенного гена, ингибирование теломеразы основано на непосредственном блокировании функции фермента олигонуклеотидами, комплементарными его РНК-компоненту (hTR). Для защиты антисмысловых олигонуклеотидов от деградации, вызываемой действием нуклеаз, при введении в организм применяют методы их химической модификации. На протяжении последних десяти лет активно изучаются механизмы действия и степень влияния на теломеразу модифицированных РНК- и ДНК-олигонуклеотидов, в число которых входят фосфоротиоатные (PS), фосфорамидатные олигонуклеотиды (NP), пептиднонуклеиновые кислоты (PNA), а также 2'-0-алкилированные РНК-олигонуклеотиды.

Цель работы.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния модифицированных олигонуклеотидов, комплементарных матричному участку РНК-компонента теломеразы, а также олигонуклеотидов, состоящих из теломерных повторов, на теломеразную активность in vitro и оценке их возможного использования в качестве эффективных ингибиторов роста опухолевых клеток.

Задачи исследования:

1. Изучить эффективность ингибирования теломеразной активности г модифицированными ДНК- и РНК-олигонуклеотидами в экстрактах, полученных из клеток опухолевых линий, а также из клинического материала от пациентов с различными онкопатологиями.

2. Проанализировать влияние исследуемых ДНК- и РНК-олигонуклеотидов на рост и выживаемость опухолевых клеток in vitro.

3. Определить характер действия рассматриваемых олигонуклеотидов на стадии клеточного цикла и апоптоз.

4. Исследовать динамику ' накопления и локализацию модифицированных олигонуклеотидов внутри опухолевых клеток методом конфокальной микроскопии.

Научная новизна работы.

1. Впервые показана возможность применения фосфоротиоатпых олигонуклеотидов для ингибирования ТА в лизатах клеток трех типов онкопатологий (рак желудка, рак предстательной железы, рак щитовидной железы).

2. В результате проведенного исследования выявлены два соединения, способные подавлять рост опухолевых клеток с достаточно высокой эффективностью.

3. Методом конфокальной микроскопии впервые обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды, ингибирующие ТА, характеризуются различной компартментализацией внутри опухолевых клеток в зависимости от их нуклеотидного состава.

Практическая значимость исследования

Результаты работы совместно с литературными данными позволяют дополнить представления о важной роли теломеразы в онкогенезе таких новообразований как рак желудка, рак предстательной железы и щитовидной железы.

Фосфоротиоатные олигонуклеотиды, способные подавлять ТА и рост опухолевых клеток, могут использоваться в дальнейших исследованиях с целью создания противоопухолевых препаратов нового поколения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Теломераза играет ключевую роль в процессе онкогенеза злокачественных новообразований желудка, предстательной и щитовидной желез.

2. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды Р8-Те1Р5 (комплементарный матричному участку ЬТЯ) и Р8-ТМ0240 (имитирующий С-богатую цепь теломерной ДНК) специфически ингибируют теломеразу в лизатах опухолевых клеток линии МСР-7 и характеризуются 1С50, равными 10 нМ, в то время как 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид (Те1Р5-К) с последовательностью, комплементарной матричному участку ЬТЯ, не оказывает влияния на ТА.

3. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды Р8-Те1Р5 и Р8-ТМ0240 снижают выживаемость опухолевых клеток, способствуют их накоплению в 8-фазе клеточного цикла, стимулируют апоптоз, а также характеризуются различной локализацией после трансфекции в опухолевые клетки.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Свинарева, Людмила Владимировна

выводы

1. Показано, что большинство клинических образцов от пациентов со злокачественными новообразованиями желудка, предстательной и щитовидной' желез характеризуются средним и высоким уровнем теломеразной активности, что указывает на важную роль теломеразы в процессе-онкогенезадри-данных типах опухолей.

2. Установлено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды PS-TelP5 (комплементарный матричному участку hTR) и PS-TM024G (имитирующий G-богатую цепь теломерной ДНК) специфически ингибируют теломеразу в лизатах опухолевых клеток линии MCF-7 и характеризуются IC50, равными 10 нМ.

3. Выявлено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды PS-TelP5 и PS-TM024G в концентрации 60 нМ полностью ингибируют ТА в экстрактах клинического материала пациентов с онкопатологиями желудка, простаты и щитовидной железы.

4: Доказано, что 2'-0-Ме-РНК-олигонуклеотид (TelP5-R), комплементарный матричному участку hTR, в отличие от гомологичного ДНК-олигонуклеотида (PS-TelP5) не оказывает влияния на активность теломеразы in vitro.

5. Обнаружено, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды PS-TelP5 и PS-TM024G снижают выживаемость опухолевых клеток, способствуют их накоплению в S-фазе клеточного цикла и стимулируют апоптоз.

6. Показано, что олигонуклеотиды PS-TelP5 и PS-SSG, через 24 ч после трансфекции, накапливаются преимущественно в ядре, где ассоциируются с зонами хроматина, в то время как PS-TM024G активно выводится частью клеток, накапливается в цитоплазме и значительно в меньшей степени проникает в ядра клеток, где локализуется в дискретных сферических структурах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Свинарева, Людмила Владимировна, 2010 год

1. HayflickL., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains//Exp. Cell Res. 1961. 25. P. 585-621.

2. Counter C.M., Gupta I., Harley C.B., Leber В., Bacchetti S. Telomerase activity in normal leucocytes and in hematologic malignancies // Blood. 1995. 85. P. 2315-2320" ~ ~ "

3. Hiyama K., Hirai Y., Kyoizumi S., Alciyama M., Hiyama E., Piatyszek M., Shay J.W. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells // J. Immunol. 1995. 155. P. 3711-3715.

4. Альтшулер M.JI., Северин C.E., Глухов А.И. Теломераза в свете современных представлений о злокачественной трансформации клетки // Биохимия. 2003. 68(12). С. 1587-1596.

5. Оловников A.M. Принципы маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов // Докл. АН СССР. 1971. 201. С. 1496-1499.

6. Lingner J., Cooper J.P., Cech T.R. Telomerase and DNA end replication: no longer a laggingstrand problem? // Science. 1995. 269. P. 15331534.

7. McClintock B. The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays // Genetics. 1941. 26. P. 234-282.

8. Mueller H.J. The remaking of chromosome // The Colleting Net-Woods Hole. 1938. 13. P. 181-198.

9. Скулачев В.П. Старение организма — особая биологическая функция, а не результат поломки сложной живой системы: биохимическое обоснование гипотезы Вейсмана//Биохимия. 1997. 62(11). С. 1394-1399.

10. Levy M.Z., Allsopp R.C., Futcher А.В., Greider C.W., Harley СВ.

11. Telomere end-replication problem and cell aging // J. Mol. Biol. 1992. 225. P. 951-960.

12. Watson J.D. Origin of concatemeric T7 DNA // Nature New Biol. 1972. 239. P. 197-201.

13. Rowley P.T. Telomerase: putting an end to DNA // Cancer Investigation. 1998. 16(3). P. 170-174.

14. Prescott J., Blackburn E. H. Functionally interacting telomerase RNAs in the yeast telomerase complex// Genes Dev. 1997. 11. P. 2790-2800.

15. Hemann M.T., Rudolph K.L., Strong M.A., DePinho R.A., Chin L., Greider C.W. Telomere dysfunction triggers developmentally regulated germ cell apoptosis // Mol. Biol. Cell. 2001. 12. P. 2023-2030.

16. Blackburn E.H., Gall J.G. A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena //J. Mol. Biol. 1978. 120. P. 33-53.

17. Cooke IT. J., Smith B.A. Variability at the telomeres of the human X/Y pseudoautosomal region// Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986. 51(1). P. 213-219.

18. Brown W.R.A., MacKinnon P.J., Villasante A., Spurr N., Bukle V.J., Dobson M.J. Structure and polymorphism of human telomere-associated DNA // Cell. 1990. 63. P. 119-132.

19. Ijdo J.W., Baldini A., Ward D.C., Reeders S.T., Wells R.A. Origin of human chromosome 2: an ancestral telomere-telomere fusion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. 88. P. 9051-9055.

20. De Lange T. Shelterin: The protein complex that shapes and safeguards human telomeres // Genes Dev. 2005. 19. P. 2100-2110.

21. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A, Moss H., de Lange T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop // Cell. 1999. 97. 4. P. 503-514.

22. Stansel R.M., De Lange T., Griffith J. T-loop assembly in vitro involves binding of trf2 near the 30 telomeric overhang. EMBO J. // 2001. 20. P. 5532-5540.

23. Amiard S., Doudeau M., Pinte S.,Poulet A., Lenain C., Faivre-Moslcalenko C., Angelov D. A topological mechanism for trf2-enhanced strand invasion //Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. 14. P 147-154.

24. Hockemeyer D., Sfeir A., Shay J., Wright W.E., De Lange T. Potl protects telomeres from a transient DNA damage response and determines how human chromosomes end// EMBO J. 2005. 24. P. 2667-2678.

25. Hockemeyer D., Daniels J., Talcai H., De Lange T. Recent expansion of the telomeric complexin rodents. Two distinct potl proteins protect mouse telomeres//Cell. 2006. 126. P. 63-77.

26. Wu L., Multani A., He H., Cosme-Blanco W., Deng Y., Deng J.M., Bachilo O., Pathak S. Potl deficiency initiates DNA damage checkpoint91activation and aberrant homologous recombination at telomeres // Cell. 2006. 126. P. 49-62.

27. Li B., Oestreich S., De Lange T. Identification of human rapl: Implications for telomere evolution // Cell. 2000. 101. P. 471-483.

28. Smogorzewska A., De Lange T. Regulation of telomerase by telomeric proteins//Ann. Rev. Biochem. 2004. 73. P. 177-208.

29. Morin G.B. The human telomere terminal transferase enzyme is ribonucleoprotein that synthesize TTAGGG repeats // Cell. 1989. 59(3). P. 521-529.

30. Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews W.H., Harley C.B., Lingner J. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human // Science. 1997. 277(5328). P. 955-959.

31. Feng J., Funk W.D., Wang S.S., Weinrich S.L., Avilion A.A., Chiu C.P., Adams R.R. The RNA component of human telomerase // Science. 1995. 269. P. 1236-1241.

32. Cong Y.-S., Wright W.E., Shay J.W. Humal telomerase and its regulation//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. 66(3). P. 407-425.

33. Lingner J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V.,92

34. Cech T.R. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase // Science. 1997. 276. P. 561-567.

35. Counter C.M., Meyerson M., Eaton E.N., Weinberg R.A. The catalytic subunit of yeast telomerase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. 94. P. 92029207.

36. Weinrich S.L., Pruzan R., Ma L., Ouellette M., Tesmer V.M., Holt S.E., Bodnar A.G., et al. Reconstituton of human telomerase with the template RNA component hTRT and the catalytic protein subunit hTRT // Nature Genetics. 1997. 17. P. 498-502.

37. Cong Y.S., Wen J., Bacchetti S. The human telomerase catalytic subunit hTERT: organization of the gene and characterization of the promoter // Hum. Mol. Genet. 1999. 8. P. 137-142.

38. Shay J.W., Wright W.E. Implications of mapping the human telomerase gene (hTERT) as the most distal gene on chromosome 5p // Neoplasia. 2000. 2(3). P. 195-196.

39. Meyerson M., Counter C.M., Eaton E.N., Ellisen L.W., Steiner P., Caddie S.D., Ziaugra L. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization // Cell. 1997. 90. P. 785-795.

40. Wick M., Zubov D., Hagen G. Genomic organization and promoter characterization of the gene encoding the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) // Gene. 1999. 232(1). P. 97-106.

41. Robart A.R., Collins К. Investigation of human telomerase holoenzyme assembly, activity, and processivity using disease-linked subunit variants // J. Biol. Chem. 2010. 285(7). P. 4375-4386.

42. Meyerson M. Telomerase enzyme activation and human cell immortalization//Toxicol. Lett. 1998. 102-103. P. 41-45.

43. Fajkus J., Simickova M., Malaska J. Tiptoeing to chromosome tips: facts, promises and perils of today's human telomere biology // Royal society. 2001. 12. P. 545-562.

44. Collins K., Kobayashi R., Greider C.W. Purification of Tetrahymena telomerase and cloning of genes encoding the two protein components of the enzyme // Cell. 1995. 81. P. 677-686.

45. Rowley P.T. Telomerase: putting an end to DNA. Cancer In vest. 1998. 16(3). P. 170-174.

46. Глухов А.И., Гордеев C.A., Апрятин C.A., Северин С.Е. Теломераза: клеточное старение, иммортализация и онкогенез // Вестник научно-исследовательского института молекулярной медицины. 2006. 6. С. 33-56.

47. Егоров Е.Е. Теломеры, теломерная ДНК, хромосомы // Биологические мембраны. 2001. 3. С. 249-256.

48. Bryan Т.М., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., Reddel R.R. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity //EMBO J. 1995. 14. P. 4240-4248.

49. Grobelny J.V., Kulp-McEliece M., Broccoli D. Effects of reconstitution of telomerase activity on telomere maintenance by the alternative lengthening of telomeres (ALT) pathway // Hum. Mol. Genet. 2001. 10. P.1953-1961.

50. Henson J.D., Neumann A.A., Yeager T.R., Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells // Oncogene. 2002. 21. P. 598-610.

51. Tokutake Y., Matsumoto T., Watanabe T., Maeda S., Tahara H., Sakamoto S., Niida H., et. al. Extrachromosome telomere repeat DNA in telomerase-negative immortalized cell lines // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 247. P. 765-772.

52. Lundblad V., Blackburn E.H. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues estl- senescence // Cell. 1993. 73. P. 347-360.

53. Cerone M.A., Autexier C., Londono-Vallejo J.A., Bacchetti S. A human cell line that maintains telomeres in the absence of telomerase and of key markers of ALT // Oncogene. 2005. 24. P. 7893-78101.

54. Dunham M.A., Neumann A.A., Fasching C.L., Reddel R.R. Telomere maintenance by recombination in human cells // Nat. Genet. 2000. 26. P. 447450.

55. Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres, telomerase, and cancer//Cancer Lett. 2003. 194. P. 155-162.

56. Harley C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? // Mutat. Res. 1991. 256. P. 271-282.

57. Reddel R.E. A reassessment of the telomere hypothesis of senescence //BioEssays. 1998. 20. P. 977-984.

58. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. 131. P. 861-872.

59. Stadtfeld M., Maherali N., Breault D.T., Hochedlinger K. Definingmolecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse Cell Stem Cell. 2008. 2(3) P. 230-240.

60. Holt S.E., Shay J.W., Wright W.E. Refining the telomere-telomerase hypothesis of aging and cancer // Nature Biotech. 1996. 14. P. 834-837.

61. Baur J.A., Zou Y., Shay J.W., Wright W.E. Telomere position effect in human cells // Science. 2001. 292(5524). P. 2075-2077.

62. Colgin L.M., Reddel R.R. Telomere maintenance mechanisms and cellular immortalization // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. 99(1). P. 97-103.

63. Greider C.W., Blackburn E.H. Telomeres, telomerase and cancer // Scientific American. 1996. 274. P. 92-97.

64. Hahn W.C., Counter C.M., Lundberg A.S., Beijersbergen R.L., Brooks M.W., Weinberg, R.A. Creation of human tumor cells with defined genetic elements//Nature. 1999. 400(6743). P. 464-468.

65. Hahn W.C., Dessain S.K., Brooks M.W. Enumeration of the simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation // Mol. Cell. Biol. 2002. 22(10). P. 3562.

66. Duss S., André S., Nicoulaz A.L. Fiche M., Bonnefoi H., Brisken C., Iggo R.D. An oestrogen-dependent model of breast cancer created by transformation of normal human mammary epithelial cells // Breast Cancer Res. 2007. 9(3). R38.

67. Fusco A., Berlingieri M.T., Di Fiore P.P. One- and two-step transformations of rat thyroid epithelial cells by retroviral oncogenes // Mol. Cell. Biol. 1987. 7(9). P. 3365-3370.

68. Henderson S., Allsopp R., Spector D., Wang, S.-S., Harley C. In situ analysis of changes in telomere size during replicative aging and celltransformation // J. Cell Biol. 1996. 134. P. 1-12.

69. Counter C.M., Botelho F.M., Wang P., Harley C.B., Bacchetti S. Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes // J. Virol. 1994. 68(5). P. 3410-3414.

70. Horikawa I., Cable P.L., Afshari C., Barrett J.C. Cloning and characterization of the promoter region of human telomerase reverse transcriptase gene // Cancer Res. 1999. 59. P. 826-830.

71. Horikawa I., Barrett J.C. Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms // Carcinogenesis. 2003. 24(7). P. 1167-1176.

72. Shay J.W., Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer // Eur. J. Cancer 1997. 33. P. 787-791.

73. Kyo S., Takakura M., Taira IC., Kanaya T., Itoh H., Yutsudo M., Ariga H., Inoue M. Spl cooperates with c-Myc to activate transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT) // Nucleic Acids Res. 2000. 28(3). P. 669-677.

74. Wang J.L., Xie Y., Allan S., Beach D., Hannon G.J. Myc activates telomerase.//Genes Dev. 1998. 12. P. 1769-1774.

75. Misiti S., Nanni S., Fontemaggi G., Cong Y.S., Wen J., Hirte H.W., Piaggio G., et. al. Induction of hTERT expression and telomerase activity byestrogens in human ovary epithelium cells // Mol. Cell Biol. 2000. 20(11). P. 3764-3771.

76. Kyo S., Takakura M., ICanaya T., Zhuo W., Fujimoto K., Nishio Y., Orimo A., Inoue M. Estrogen activates telomerase // Cancer Res. 1999. 59. P. 5917-5921.

77. Oh S., Song Y.H., Yim J., Kim T.K. Identification of Mad as a repressor of the human telomerase (hTERT ) gene // Oncogene. 2000. 19. P. 1485-1490.

78. Xu D., Wang Q., Gruber A., Bjorkholm M., Chen Z., Zaid A., Selivanova G., et. al. Downregulation of telomerase reverse transcriptase mRNA expression by wild type p53 in human tumor cells // Oncogene 2000. 19. P. 5123-5133.

79. Nguyen D.C., Crowe D.L. Intact functional domains of the retinoblastoma gene product (pRb) are required for downregulation of telomerase activity // Biochim. Biophys. Acta. 1999. 1445(2). P. 207-215.

80. Mukhopadhyay T., Multani A.S., Roth J.A., Pathak S. Reduced telomeric signals and increased telomeric associations in human lung cancer cell lines undergoing p53-mediated apoptosis // Oncogene. 1998. 17. P. 901-906.

81. Ford L.P., Wright W.E., Shay J.W. A model for heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in telomere and telomerase regulation // Oncogene. 2002. 21 P. 580-583.

82. Horikawa I., Barrett J.C. Trancriptional regulation of the telomerasehTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms // Carcinogenesis. 2003. 24(7). P. 1167-1176.

83. Villa R., Porta C.D., Folini M., Daidone M.G., Zaffaroni N. Possible regulation of telomerase activity by transcription and alternative splicing of telomerase reverse transcriptase in human melanoma // J. Invest. Dermatology. 2001. 116. P. 867-873.

84. Nagao K., Katsumata K., Aizawa Y., Saito N., Hirata H., Sasaki H., Yamamoto S., et. al. Differential alternative splicing expressions of telomerase reverse transcriptase in gastrointestinal cell lines // Oncol, rep. 2004. 11. P. 127131.

85. Hisatomi H.5 Ohyashiki K., Ohyashiki J.H., Nagao K., Kanamaru T., Hirata H., Hibi N., Tsukada Y. Expression profile of a y-deletion variant of the human telomerase reverse transcriptase gene // Neoplasia. 2003. 5(3). P. 193197.

86. Yi X., White D.M., Aisner D.L., Baur J.A., Wright W.E., Shay J.W. An alternate splicing variant of the human telomerase catalytic subunit inhibits telomerase activity //Neoplasia. 2000. 2. P. 433-440.

87. Elentioba-Johnson K.S.J. Complex regulation of telomerase activity // Am. J. Pathol. 159(2). 2001. P. 405-410.

88. Harrington L., McPhail T., Mar V., Zhou W., Oulton R., Bass M. B., Arruda I., Robinson M. O. A mammalian telomerase-associated protein //

89. Science. 1997. 275. P. 973-977.

90. Haendeler J., Hoffman J., Rahman S., Zeiher A.M., Dimmeler S. Regulation of telomerase activity and anti-apoptotic functions by protein-protein interaction and phosphorylation // FEBS letters. 2003. 536. P.180-186.

91. Li H., Zhao L.L., Funder J.W., Liu J.P. Protein phosphatase 2A inhibits nuclear telomerase activity in human breast cancer cells // J. Biol. Chem. 1997. 272. 16729-16732.

92. Kang S.S., Kwon Т., Kwon D.Y., Do S.I. Akt protein kinase enhances human telomerase activity through phosphorylation of telomerase reverse transcriptase subunit//J. Biol. Chem. 1999. 274. P. 13085-13090.

93. Smith S., de Lange T. Tankyrase promotes telomere elongation in human cells // Curr. Biol. 2000. 10. P. 1299-12302.

94. Cook B.D., Dynek J.N., Chang W., Shostak G., Smith S. Role for the related poly(ADPRibose) polymerases tankyrase 1 and 2 at human telomeres // Mol. Cell. Biol. 2002. 22(1). P. 332-342.

95. Gomez M., Wu J., Schreiber V., Dunlap J., Dantzer F., Wang Y. PARP1 is a TRF2-associated poly(ADP-ribose)polymerase and protects eroded telomeres //Mol. Biol. Cell. 2006. 17. P. 1686-1696.

96. Counter C.M., Hirte H.W., Bacchetti S., Harley C.B. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91. P. 2900-2904.

97. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L.C., Coviello G.M., et. al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer // Science. 1994. 266. P. 2011-2015.

98. Микер A.K., Коффи Д.С. Теломераза: многообещающий маркер биологического бессмертия половых, стволовых и раковых клеток //100

99. Биохимия. 1997. 62(11). С. 1547-1557.

100. Жуликов Д.В. Предоперационная дифференциальная диагностика узловых образований щитовидной железы на основе анализа содержания теломеразы в ткани: дис. . канд. мед. наук// 2010. 121 С.

101. Hiyama Е., Gollahon L., Kataoka Т., Kuroi К., Yokoyama Т., Gazdar A.F., Hiyama К. Telomerase activity in human breast tumors // J. Natl. Cancer Inst. 1996. 88. P. 116-122.

102. Wright W.E., Piatyszek M.A., Rainey W.E., Byrd W., Shay J. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev.

103. Genet. 1996. 18. P. 173-179.

104. Chiu C.-P., Dragowska W., Kim N.W., Vaziri H., Yui J., Thomas Т.Е., Harley C.B., Lansdorp P.M. Differential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone marrow // Stem Cells. 1996. 14. P. 239-248.

105. Hiyama K., Hirai Y., Kyoizumi S., Alciyama M., Hiyama E., Piatyszek M.A., Shay J.W. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells // J. Immunol. 1995. 155(8). P. 3711-3715.

106. Kyo S., Takakura M., Kohama Т., Kohama Т., Inoue M. Telomerase activity in human endometrium. Cancer Res. 1997.57. P. 610-614.

107. Tahara H., Nalcanishi Т., Kitamoto M., Nakashio R., Shay J.W., Tahara E., Kajiyama G. Telomerase activity in human liver tissues: comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinomas // Cancer Res. 1995. 55. P. 2734-2736.

108. Flores I., Cayuela M.L., Blasco M.A. Effects of telomerase and telomere length on epidermal stem cell behavior // Science. 2005. 309. P. 12531256.

109. Chadeneau C., Hay IC., Hirte H.W., Gallinger S., Bacchetti S. Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer // Cancer Res. 1995. 55. P. 2533-2536.

110. Taylor R.S., Ramirez R.D., Ogoshi M., Chaffms M., Piatyszek M;A., Shay J.W. Detection of telomerase activity in malignant and nonmalignant skin -conditions-//-J-InvestrDermatol-l 996-1 G6rP-759-765:---—

111. Hiyama E., Hiyama K., Tatsumoto N., Shay J.W., Yokoyama T. Telomerase activity in human intestine // Int. J. Oncol. 1996. 9. P. 453-458.

112. Gomez D.E., Tejera A.M., Olivero OA. Irreversible telomere shortening by 3'-azido-2',3-dideoxythymidine (AZT) treatment // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 246(1). P. 107-110.

113. Pai R.B., Pai S.B., Kukhanova M., Dutschman G.E., Guo X., Cheng Y. Telomerase from human leukemia cells: properties and its interaction with deoxynucleoside analogues//Cancer Res. 1998. 58. P. 1909-1913.

114. Strahl C., Blackburn Ii.H. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase in two immortalized human cell lines // Mol. Cell. Biol. 1996. 16(1). P. 53-65. ;

115. De Cian A., Lacroix L., Douarre C., Temime-Smaali N., Trentesaux C., Riou J.F., Mergny J.L. Targeting telomeres and telomerase // Biochimie. 2008. 90. P. 131-155.

116. Pendino F., Flexor M., Delhommeau F., Buet D., Lanotte M., Segal-Bendirdjian E. Retinoids down-regulate telomerase and telomere length in a pathway distinct from leukemia cell differentiation// Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. 98(12). P. 6662-6667.

117. Togashi K., Kakeya H;, Morishita M., Song Y., Osada H:. Inhibition of human telomerase activity by alterperylenol // Oncol. Res. 1998. 10. P. 449. • 102

118. Yamakuchi M., Nakata M., Kawahara K., Kitajima I., Maruyama I. New quinolones, ofloxacin and levofloxacin, inhibit telomerase activity in transitional cell carcinoma cell lines // Cancer Lett. 1997. 119(2). P. 213-219.

119. Huang P.R., Yeh Y.M., Wang T.C. Potent inhibition of human telomerase by helenalin // Cancer Lett. 2005. 227(2). P. 169-174.

120. Naasani I., Seimiya H., Tsuruo T. Telomerase inhibition, telomere shortening and senescence of cancer cells by tea catechins // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 249. P. 391-396.

121. Eder P.S., DeVine R.J., Dagle J.M., Walder J.A. Substrate specificity and kinetics of degradation of antisense oligonucleotides by a 3' exonuclease in plasma//Antisense Res. Dev. 1991. l.P. 141-151.

122. Feng J., Funk W.D., Wang S., Weinrich S.L., Avilion A.A., Chiu C., Adams R.R., et. al. The RNA component of human telomerase // Science. 1995. 269. P. 1236-1241.

123. Glukhov A.I., Zimnik O.V., Gordeev S.A., Severin S.E. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 248. P. 368-371.

124. Norton J.C., Piatyszek M.A., Wright W.E., Shay J.W., Corey D.R. Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids // Nat. Biotechnol. 1996. 14. P. 615-619.

125. Gryaznov S., Asai A., Oshima Y., Yamamoto Y., Pongracz K.,103

126. Pruzan R., Wunder E., et. al. Oligonucleotide N3' --> P5' thio-phosphoramidate telomerase template antagonists as potential anticancer agents // Nucleos. Nucleot. Nucl. Acids. 2003. 22. P. 577-581.

127. Wang E.S., Wu K., Chin A.C., Chen-Kiang S., Pongracz K. Gryaznov S., Moore M.A. Telomerase inhibition with an oligonucleotide "telomerase templatelmtagonistl in vitro andTn^vivcTstudies inmultipleTnyeloma and lymphoma//Blood. 2004. 103(1). P. 258-266.

128. Kondo S., Kondo Y., Li G., Silverman R.H., Cowell J.K. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA // Oncogene. 1998. 16(25). P. 3323-3330.

129. Kondo Y., Koga S., Komata T., Kondo S. Treatment of prostate cancer in vitro and in vivo with 2-5A-anti-telomerase RNA component // Oncogene. 2000. 19(18). P. 2205-2211.

130. Kraemer K., Fuessel S., Schmidt U., Kotzsch M., Schwenzer B., Wirth M.P., Meye A. Antisense-mediated hTERT inhibition specifically reduces the growth of human bladder cancer cells // Clin. Cancer Res. 2003. 9(10). P. 3794-3800.

131. Cao Y., Li H., Deb S., Liu J.P. TERT regulates cell survivalindependent of telomerase enzymatic activity // Oncogene. 2002. 21(20). P. 3130-3138.

132. Yokoyama Y., Takahashi Y., Shinohara A., Wan X., Takahashi S., Niwa K., Tamaya1 T. The 5'-end of hTERT mRNA is a good target for hammerhead ribozyme to suppress telomerase activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. 273(1). P. 316-321.

133. Ludwig A., Saretzki G., Holm P.S., Tiemann F., Lorenz M., Emrich T., Harley C.B., von Zglinicki T. Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizes breast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase // Cancer Res. 2001.61(7). P. 3053-306L.

134. Zahler A.M., Williamson J.R., Cech T.R., Prescott D.M. Inhibition of telomerase by G-quartet DNA structures //Nature. 1991. 350. P. 718-720.

135. Phatalc P., Burger A.M. Telomerase and its potential for therapeutic intervention // Br. J. Pharmacol. 2007. 152. P. 1003-1011.

136. Sun D., Thompson B., Cathers B.E. Inhibition of human telomerase by a G-quadruplexinteractive compound // J. Med. Chem. 1997. 40. P. 21132116.

137. Perry P.J., Gowan S.M., Reszka A.P., Polucci P., Jenkins T.C., Kelland L.R., Neidle S. 1,4-and 2,6-Disubstituted amidoanthracene-9,10-dione derivatives as^inhibitors^of^human telomerase V/ TrMedrChem^l 998r 4 lrPr 3253-3260.

138. Cairns D., Michalitsi E., Jenkins T., Maclcay S. Molecular modelling and cytotoxicity of substituted anthraquinones as inhibitors of human telomerase //Bioorg. Med. Chem. 2002. 10(3) 803-807.

139. Wheelhouse R.T., Sun D., Han H., Han F.X., Hurley L.H. Cationic porphyrins as telomerase inhibitors: the interaction of tetra-(N-methyl-4-pyridyl)porphine with quadruplex DNA // J. Amer. Chem. Soc. 1998. 120. P. 3261-3262.

140. Siddiqui-Jain A., Grand C.L., Bearss D.J., Hurley L. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99(18). P. 1 1593-11598.

141. Binz N., Shalaby T., Rivera P., Shin-yab IC., Grotzer M.A. Telomerase inhibition, telomere shortening, cell growth suppression and induction of apoptosis by telomestatin in childhood neuroblastoma cells // Eur. J. Cancer. 2005. 41(18). P. 2873-2881.

142. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. 391. P. 806-811.

143. Kosciolek B.A., Kalantidis K., Tabler M., Rowley P.T. Inhibition of telomerase activity in human cancer cells by RNA interference // Mol. Cancer Ther r2003r2 (3 )rP r 209-216r—-—---—

144. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth: 1983. 65. P. 55-63.

145. Hu X., Wu H., Zhang S., Yuan H., Cao L. Clinical Significance of Telomerase Activity in Gastric Carcinoma and Peritoneal Dissemination // J. Intern. Med. Res. 2009. 37(4). P. 1127-1138.

146. Scates D.K., Muir G.H., Venitt S., Carmichael P.L. Detection of telomerase activity in humane prostate: a diagnostic marker for prostatic cancer?

147. Br. J. Urol. 1997. 80(2). P. 263-268.

148. Orlando C., Gelmini S. Telomerase in endocrine and endocrine-dependent tumors // J. Steroid Biochem Mol Biol. 2001. 78(3). P. 201-214.

149. Zhan W., Ma J., Peng J. Gao J., Cai S, Wang J., Zheng Z., Wang L. Telomerase activity in gastric cancer // 1999. World J. Gastroenterol. 5(4). P. 316^319~ ~

150. Gatto B., Palumbo M., Sissi C. Nucleic acid aptamers based on the G-quadruplex structure: therapeutic and diagnostic potential // Curr. Med. Chem. 2009. 16(10). P. 1248-1265.

151. Heidenreich O., Kang S.-H., Xu X., Nerenberg M. Application of antisense technology to therapeutics // Molec. Med. Today. 1995. 1. P. 128-133.

152. Pitts A.E., Corey D.R. Inhibition of human telomerase by 2'-(9-methyl-RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. 95. P. 11549-11554.

153. Eller M.S., Puri N, Hadshiew I.M., Venna S.S., Gilchrest B.A. Induction of Apoptosis by Telomere 3' Overhang-Specific DNA // Exp. Cell Res. 2002. 276. P. 185-183.