Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.12, кандидат биологических наук Лыков, Юрий Сергеевич

• Лыков, Юрий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лыков, Юрий Сергеевич

Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Природный статус ксилотрофных базидиомицетов: современное состояние вопроса

1.2 Структура древесины и процесс её биодеградации

1.3 Трофические потребности ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры

Глава 2 Материал и методы исследований

2.1 Природо-климатические особенности района исследований

2.2 Объекты и методы исследования

Глава 3 Особенности развития видов и штаммов ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры

3.1 Культурально-морфологические особенности исследованных видов

3.2 Особенности развития штаммов с различными трофическими стратегиями на традиционных питательных средах

Глава 4 Использование комплексных источников целлюлозы и лигнина при культивировании штаммов ксилотрофных базидиомицетов

4.1 Влияние различных по структуре комплексных источников целлюлозы и лигнина на рост и развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов

4.2 Активность некоторых ферментов ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании

4.3 Влияние внесения источников целлюлозы и лигнина в агаризованные среды на рост и развитие культур ксилотрофных базидиомицетов

4.3.1 Влияние внесения источников целлюлозы и лигнина в агаризованные среды на дегидрогеназную активность культур

4.3.2 Использование парааминобензойной кислоты в качестве фактора, оптимизирующего развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов на субстратах, содержащих лигно-целлюлозные компоненты

Глава 5 Использование модельного лигнина и лигноцеллюлозных материалов при глубинном культивировании ксилотрофных базидиомицетов

5.1 Влияние продуктов перколяции лигнина Классона на накопление биомассы мицелия ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры

5.2 Влияние экстракта перколированного лигнина на процесс синтеза эргостерина штаммами изученных видов ксилотрофных базидиомицетов

5.3 Утилизация мицелием ксилотрофных базидиомицетов различных компонентов питательной среды в условиях глубинного культивирования

Глава б Влияние лигноцеллюлозных компонентов субстрата на процессы плодообразования у ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры

6.1 Влияние внесения метанолизных опилок в агаризованные среды на образование зачатков плодовых тел у некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов

6.2 Возможности включения метанолизных источников целлюлозы и лигнина в состав твердофазных органических субстратов для получения плодовых тел Ganoderma lucidum

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов»

В настоящее время активно проводятся исследования, касающиеся экологии и практического использования различных видов древоразрушающих грибов, в частности, ксилотрофных базидиомицетов (Дьяков и др., 2010; Псурцева, 2010). Однако практически нет сведений относительно изучения природных особенностей видов и штаммов различного происхождения, их трофических потребностей в культуре. Также невелик объем информации о возможностях модификации морфолого-культуральных и физиолого-биохимических характеристик штаммов различных видов под влиянием субстратных факторов на разных этапах развития. С этих позиций, актуальными представляются исследования коллекционных штаммов различных видов, разного эколого-географического происхождения, выделенных с разных древесных пород, отличающихся трофической специализацией (истинные паразиты, сапротрофы, факультативные виды). Естественные местообитания, представленные разнообразием экотопов, представляют собой природный резерват штаммов ксилотрофных базидиомицетов, которые могут обладать уникальными индивидуальными особенностями. Безусловно, экосистемы бо-реальных лесов в связи с обилием субстрата характеризуются высоким разнообразием древоразрушающих базидиомицетов. Биота ксилотрофных базидиомицетов в таежных микоценозах изучена достаточно полно, однако данных о ее состоянии в средней полосе России, в частности, в зоне лесостепи, недостаточно. Экотонные системы, расположенные в этой зоне, могут представлять особый интерес, поскольку в них отмечаются сложные сочетания природно-климатических и биотических факторов. Так, здесь проходят границы ареалов многих видов растений, что говорит о наличии для них песси-мальных условий и некоторой дестабилизации иммунных систем. Это определяет своеобразие видового состава ксилотрофных базидиомицетов и свидетельствует в пользу актуальности проведения исследований физиолого-биохимического потенциала местных штаммов.

Проявление физиологической активности грибов-ксилотрофов в природных условиях сопряжено с целым комплексом внешних параметров: влиянием гидрологических, эдафических, климатических факторов, взаимодействием с другими организмами, в том числе, с растением-хозяином, видами-конкурентами и т.д. Существенный интерес представляет возможность влияния на ход развития гриба со стороны его природного субстрата: здоровой древесины, а также древесины на определенной стадии разложения. По мнению многих авторов, лигнин, как компонент этого субстрата, способен оказывать влияние на процессы развития и морфогенез культуры in situ (Фенгел, 1988). Среди биотехнологически перспективных видов значительную долю составляют грибы белой гнили, то есть группа грибов, осуществляющих процесс биодеградации лигнина. Молекула лигнина характеризуется нестереорегулярной структурой, в связи с чем его деструкция предполагает наличие у грибов эффективных полиэнзиматических комплексов, что подразумевает определенную многофункциональность ферментативной системы и разнообразие продуктов метаболизма. Логичной представляется связь между богатым биохимическим потенциалом грибов белой гнили и их биотехнологической ценностью. При этом по сей день остается открытым вопрос о том, является ли лигнин трофической субстанцией или, скорее, служит регуля-торным фактором метаболизма, или же его разрушение носит только сопутствующий потреблению целлюлозы характер?

Довольно сложно ex situ создать условия, максимально приближенные к природным. На этом фоне адекватное и достоверное изучение потенциала вида и штамма в чистой культуре нередко представляет собой определенную проблему. В то же время одной из проблем практического грибоводства является поиск оптимальных субстратов для культивирования, то есть таких субстратов, которые были бы способны обеспечить максимальную реализацию природного потенциала вида в условиях культуры. Основной и наиболее доступный субстрат, используемый при культивировании ксилотрофных ба-зидиомицетов, представляют собой опилки различных древесных пород. Однако известно, что использование таких материалов не всегда обеспечивает нормальное развитие культуры и ее высокую продуктивность. Кроме того, известно, что ксилотрофные базидиомицеты различаются по отношению к степени деструкции древесины, которую колонизируют (облигатные и факультативные паразиты, сапротрофы). В связи с этим актуальным представляется поиск путей подготовки субстрата для культивирования, с тем, чтобы оптимизировать развитие культур не только традиционных, но и вновь вводимых в искусственную культуру видов. Интерес представляет модификация питательных субстратов внесением нативного и дериватизированного лигно-целлюлозного материала, использование некоторых ростовых и регулятор-ных факторов.

Все вышеперечисленное свидетельствует об актуальности и перспективности проведения исследований по изучению трофики и особенностей развития на различных субстратах древоразрушающих базидиомицетов в культуре.

В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение влияния модификаций лигноцеллюлозного субстрата на процессы роста и развития видов ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре.

Для достижения поставленной цели необходимо решение задач:

- создать коллекцию видов ксилотрофных базидиомицетов, распространенных в районе исследований и отличающихся субстратной специализацией;

- изучить культурально-морфологические особенности развития видов на традиционных питательных средах;

- изучить возможности культивирования и особенности развития видов ксилотрофных базидиомицетов с различной субстратной специализацией в природе, а также вызывающих разные типы гнилей древесины на экстрагированных опилках и их метоксилированных дериватах;

- изучить влияние внесения в различные питательные среды различных по структуре источников целлюлозы и лигнина (нативных экстрагированных опилок и их метоксилированных дериватов) на процессы роста и развития культур;

- определить роль нативного и дериватизированного лигнина, как компонентов субстратов, в регуляции плодоношения у перспективных в биотехнологии видов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Процессы экстрагирования и метанолиза материала дубовых опилок обеспечивают получение лигноцеллюлозного субстрата, пригодного для культивирования ex situ видов ксилотрофных базидиомицетов независимо от их субстратной специфичности в природе.

2. Введение нативных и метоксилированных лигноцеллюлозных источников в рецептуру питательных сред интенсифицирует обменные процессы и стимулирует развитие культур ксилотрофных базидиомицетов.

3. Метоксильные группы лигнина стимулируют накопление биомассы мицелия большинства видов ксилотрофных базидиомицетов, а также интенсифицируют процесс синтеза эргостерина у грибов белой гнили.

4. Включение в состав субстратов метоксилированных лигноцеллюлозных компонентов стимулирует процессы образования примордиев (зачатков плодовых тел) у грибов белой гнили, а также способствует плодоношению при реализации интенсивной технологии культивирования.

Заключение диссертации по теме «Микология», Лыков, Юрий Сергеевич

Заключение

Сформулированное Л.Г. Буровой (1986) положение о том, что только экологические исследования, проводимые в природных условиях и параллельно в лабораторных, способны дать ключ для объективного решения целого ряда проблем и внести определенный вклад в теорию, на наш взгляд, бесспорно. В настоящей работе сделана попытка выяснения связи между экологическими особенностями видов в природе и характером их развития в условиях культуры. Установлена тенденция связи между широтой субстратной приуроченности вида в природе (по отношению к породам деревьев и степени разложения древесного субстрата) и разнообразием культурально-морфологических характеристик в культуре. Однако для установления более четких закономерностей необходимо расширение подобных исследований с привлечением большего количества штаммов. При этом привязанность вида в большей степени к древесине на ранней, или, напротив, на поздней стадии разложения, оказывает достоверное влияние на его характер развития и трофические потребности в культуре.

С другой стороны, опираясь на значительный объем современной информации об исключительных свойствах ксилотрофных базидиомицетов в качестве продуцентов биологически активных веществ, актуальной проблемой следует считать исследование роли лигноцеллюлозного субстрата как трофического и регуляторного факторы при культивировании ex situ. Основной и наиболее доступный субстрат, используемый при культивировании грибов этой трофической группы, представляют собой опилки различных древесных пород. Однако использование таких материалов не всегда обеспечивает нормальное развитие культуры и ее высокую продуктивность. Кроме того, известно, что ксилотрофные базидиомицеты различаются по отношению к степени деструкции древесины, которую колонизируют (облигатные и факультативные паразиты, сапротрофы). В связи с этим актуальным представляется поиск путей подготовки субстрата для культивирования, с тем, чтобы оптимизировать развитие культур не только традиционных, но и вновь вводимых в искусственную культуру видов.

В ходе настоящей работы установлено, что процессы экстрагирования и метанолиза дубовых опилок обеспечивают получение линоцеллюлозного субстрата, пригодного для культивирования ex situ видов ксилотрофных ба-зидиомицетов независимо от их субстратной специфичности в природе. Однако высокая концентрация фенольных соединений в метанолизном субстрате замедляет развитие видов, в природе колонизирующих субстрат на ранней стадии разложения (виды с облигатной или факультативной паразитической стратерией развития). Показано, что введение нативных и метоксилирован-ных лигноцеллюлозных источников в количестве 2% от массы среды в рецептуру агаризованных питательных сред (где возникает эффект разбавления) интенсифицирует обменные процессы и стимулирует развитие культур исследованных видов ксилотрофных базидиомицетов.

Изучено влияние метанолизного лигноцеллюлозного субстрата в сравнении с нативным материалом, не подвергнутым процессу метанолиза, на ферментативную активность мицелия культур. Установлено, что метанолиз-ный субстрат ингибирует оксидазную активность большинства видов с паразитной специализацией в природе и стимулирует таковую у большинства са-протрофных видов; он стимулирует пероксидазную активность у некоторых видов - представителей белой гнили; виды — представители бурой гнили на нативном субстрате в культуре интенсивнее разрушают целлюлозу, чем представители белой; на метанолизном субстрате эта закономерность сохраняется. Метанолизный лигноцеллюлозный субстрат обеспечивает увеличение целлюлазной активности большинства изученных видов.

В качестве исслюстрации интенсификации обменных процессов в мицелии присутствием в среде источников целлюлозы и лигнина исследована активность дегидрогеназ. Установлено повышение активности дегидрогеназ под влиянием названных компонентов. Полученные результаты указывают на то, что, кроме Сахаров, входящих в состав агаризованной питательной среды, источником углерода в опытных вариантах служит и материал опилок. Обнаруженный факт наиболее активной работы дегидгрогеназ в варианте с метанолизными опилками обусловлен именно состоянием лигнина и большей доступностью целлюлозы в материале, подготовленном таким образом.

В ходе исследований изучено влияние предшественника фолиевой кислоты - парааминобензойной кислоты на развитие мицелия изученных видов в контроле и в присутствии лигноцеллюлозных источников. Установленные факты стимуляции роста у некоторых видов косвенно свидетельствуют в пользу утверждения, что исследованная группа организмов утилизирует ПАБК для синтеза фолиевой кислоты de novo, а также в пользу предположения о том, что синтезированная фолиевая кислота как кофактор участвует в переносе одноуглеродных соединений, вовлекаемых в метаболические превращения. Причем в роли доноров таких соединений могут выступать компоненты лигноцеллюлозных субстратов. Однако для более конкретных заключений потребуется комплекс допонительных исследований.

Изучен характер глубинного роста культур изученных видов. При культивировании штаммов изученных видов в условиях погруженной культуры в присутствии перколятов лигнина с известной концентрацией меток-сильных групп установлено, что последние стимулируют накопление биомассы мицелия большинства видов ксилотрофных базидиомицетов, а также интенсифицируют процесс синтеза эргостерина у грибов белой гнили. Отсутствие прямой зависимости между процессами накопления биомассы мицелия и интенсивностью синтеза эргостерина в опыте и в контроле свидетельствует о том, что помимо затрат этого вещества на пластический обмен, культуры накапливают материал для синтеза на его основе веществ и образования структур на последующих стадиях развития. Возможно, это резерв для синтеза вторичных метаболитов, связанных с протеканием репродуктивных процессов. В этой связи установленные закономерности предполагают исследование влияния изученных компонентов лигнина на процессы образования репродуктивных структур.

В отдельном эксперименте изучены процессы утилизации глюкозы и компонентов лигноцеллюлозных субстратов из питательной среды при культивировании в глубинных условиях. Установлены отличия в темпах утилизации глюкозы у видов — представителей различных трофических стратегий (облигатные и факультативные паразиты, факультативные сапротрофы). Так, представители группировки с паразитической стратегией развития утилизируют глюкозу более интенсивно. Культуры грибов бурой гнили утилизировали глюкозу в среднем более интенсивно, чем культуры грибов белой гнили, но на поздних сроках глубинного роста в составе культуральной жидкости в опытных вариантах (с добавлением метанолизных опилок) обнаружены характерные колебания концентраций глюкозы. Такая «пульсация» представляет, на наш взгляд, определенный теоретический интерес. При этом в контрольном варианте происходил относительно равномерный спад концентраций глюкозы. Такие данные могут свидетельствовать об использовании культурой гриба бурой гнили целлюлозы из материала опилок, гидролиз которой приводит к появлению молекул глюкозы в культуральной жидкости.

При анализе культуральной жидкости на присутствие целлобиозы, ее довольно значительные концентрации были обнаружены у грибов белой гнили I. obliquus и G. lucidum. В культуральной жидкости прочих изученных видов в опытных вариантах были обнаружены следовые количества целлобиозы, а в контрольных вариантах этот углевод отсутствовал полностью. Появление в культуральной жидкости грибов белой гнили целлобиозы может объясняться только процессом гидролиза целлюлозы опилок. Этот факт, особенно с учетом относительно слабой утилизации грибами этой группы глюкозы, может свидетельствовать об особой трофической стратегии их в культуре в присутствии лигноцеллюлозных компонентов.

По истечению 13 суток глубинного культивирования отделенные от культуральной жидкости опилки были высушены до постоянной массы и проанализированы на остаточное содержание холоцеллюлозы и метоксиль-ных групп. Выявлены достоверные отличия в плане более интенсивной утилизации холоцеллюлозы грибами бурой гнили, что вполне согласуется с особенностями этой группы.

Концентрация метоксильных групп почти не изменилась у видов - паразитов. У прочих видов содержание метоксильных групп уменьшилось почти по сравнению с исходным, причем у типичных сапротрофных видов — почти вдвое. Утилизация метоксильных групп, как выяснилось, происходит с примерно одинаковой интенсивностью у грибов белой и бурой гнили. Опираясь на данные литературы, такия ситуация может объясняться тем, что грибы белой гнили утилизируют метоксилы для деградации лигнина, а бурой -для его вторичной модификации (Фенгел, 1988).

При исследовании влияния метоксилированных лигноцеллюлозных компонентов на процессы образования примордиев (зачатков плодовых тел) на мицелии изученных видов на стерильных питательных средах получены интарасные результаты. Установлено, что включение в состав субстратов названных компонентов стимулирует процессы плодообразования у грибов белой гнили. В частности, в вариантах с добавлением в агаризованные среды метанолизных опилок, активнее происходили процессы формирования и дифференцирования примордиев- у I. obliquus, F. fomentarius, G. applanaturn, G. lucidum, P. cinnabarinus.

Введение метанолизных опилок (10%) в органический субстрат на основе ржыной соломы также способствует плодоношению G. lucidum при реализации интенсивной технологии культивирования.

Таким образом, получены достоверные данные, свидетельствующие о целесообразности использования экстрагированных метанолизных источников целлюлозы и лигнина в практике культивирования видов ксилотрофных базидиомицетов.