Влияние многофункционального белка YB-1 на лекарственную устойчивость и метастатическую активность клеток рака молочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат наук Моисеева, Наталья Ивановна

• Моисеева, Наталья Ивановна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Моисеева, Наталья Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Структура белка и гена YB-1

1.2.Функции белка YB-1

1.2.1. Роль белка YB-1 в цитоплазме клетки

1.2.2. Механизмы и причины перехода YB-1 из цитоплазмы в ядро клетки

1.2.3. Функции YB-1 в ядре клетки

1.2.4. Функциональные модификации белка YB-1 в клетке

1.2.5. Секреция белка YB-1 клетками

1.3.Множественная лекарственная устойчивость и белок YB-1

1.3.1. Феномен множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток

1.3.2. Белок YB-1 и регуляция генов и белков МЛУ

1.4.Белок YB-1 в клинических исследованиях

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Используемые культуры клеток и их модификации

2.1.1. Культуры клеток

2.1.2. Трансфекция культуры клеток MCF-7

2.2. Характеристики исследованных образцов опухолей, полученных от больных раком молочной железы (РМЖ)

2.2.1. Пациенты

2.2.2. Характеристика образцов опухолевой ткани

2.3. Рекомбинантные белки, использованные в работе

2.4. Исследование характеристик культур клеток

2.4.1. Анализ пролиферации клеток

2.4.2. Анализ устойчивости клеток к химиопрепаратам (МТТ-тест)

2.4.3. Анализ подвижности клеток. Тест на зарастание «раны» in vitro

2.5. Исследование уровня экспрессии мРНК в клеточных линиях и образцах опухолей

2.5.1. Выделение мРНК из культивируемых клеток и фрагментов опухолей

2.5.2. Обратная транскрипция

2.5.3. Полуколичественная реакция ОТ-ПЦР и электрофорез

2.5.4. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)

2.5.5. Экспрессионные биочипы (RNA microarray)

2.6. Анализ количества и локализации белков

2.6.1. Иммунохимический анализ

2.6.2. Вестерн-блоттинг

2.7. Статистическая обработка результатов

2.8. Список растворов, сред и реактивов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 .Характеристики используемых в работе клеточных культур

3.1.1. Сравнение пролиферации трех клеточных культур

3.1.2.Чувствительность культур клеток к различным химиотерапевтическим препаратам

ЗЛ.З.Уровень экспрессии генов МЛУ и YB-1 в клетках линий MCF-7, ВТ-474 и HBL-100

3.1.4.Локализация белка YB-1 в клетках культур MCF-7, ВТ-474 и HBL-100

3.1.5.Резюм е

3.2.Влияние химиотерапевтических препаратов на локализацию белка YB-1 и его

экспрессию в линиях MCF-7, ВТ-474 и HBL-100

3.2.1.Транслокация белка YB-1 в клетках линий MCF-7, ВТ-474 и HBL-100 при инкубации с различными химиотерапевтическими препаратами

3.2.2.Исследование профиля экспрессии гена YB-1 и генов МЛУ в культурах

малигнизированных клеток молочной железы при добавлении доксорубицина и цисплатина

3.2.3.Исследования профиля экспрессии генов на биочипе HT-12 (RNA microarray) в линиях малигнизированных клеток молочной железы при воздействии доксорубицина и цисплатина

3.2.4.Резюм е

3.3.Влияние внеклеточного белка YB-1 на линии клеток MCF-7, ВТ-474 и HBL-100

3.3.¡.Перемещение белка N01:^3 в клетках линии МСР-7 под действием внеклеточного белка УВ-1

3.3.2.Исследование влияния рекомбинантного YB-1 (rYB-1) на пролиферацию малигнизированных клеток молочной железы

3.3.3.Исследование влияния rYB-1 на скорость закрытия раны, нанесенной на монослой

3.3.4.Исследование влияния rYB-1 на устойчивость опухолевых клеток к химиопрепаратам

3.3.5. Исследование влияния внеклеточного rYB-1 на экспрессию генов в клетках опухолей молочной железы (RNA microarray)

3.3.5.Резюме

3.4.исследование количества мРНК гена YB-1 и его внутриклеточной локализации в опухолях молочной железы

3.4.1. Содержание мРНК YB-1 и внутриклеточная локализация белка YB-1 в опухолях молочной железы

3.4.2.Сопоставление локализации и экспрессии YB-1 с известными клиническими и молекулярными характеристиками опухолей

3.4.3.Корреляция экспрессии гена YB-1 и локализации белка YB-1 в опухолевых клетках с прогрессией РМЖ

3.4.4.Резюм е

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Обсуждение результатов экспериментов по воздействию химиотерапевтических препаратов на локализацию и экспрессию белка YB-1

4.2. Обсуждение результатов экспериментов по влиянию внеклеточного белка

YB-1 hа малигнизированные клетки молочной железы

4.3. Обсуждение результатов исследования клинического материала, полученного от больных РМЖ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние многофункционального белка YB-1 на лекарственную устойчивость и метастатическую активность клеток рака молочной железы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Возможность прогнозировать прогрессию злокачественных новообразований на разных стадиях остается крайне важной задачей практической онкологии. Несмотря на широкие исследования, данное положение остается верным и для рака молочной железы (РМЖ), являющимся самым распространенным онкологическим заболеванием у женщин.

Одним из потенциальных маркеров агрессивного течения онкологических заболеваний является белок YB-1 (Y-box binding protein). Белок YB-1 входит в семейство ДНК/РНК-связывающих белков с эволюционно консервативным доменом холодового шока [1]. Белок YB-1 участвует как в регуляции трансляции, так и транскрипции широкого спектра белков. На уровне трансляции белок YB-1, мажорный белок рибонуклеопротеидиых частиц (РНП) цитоплазмы, может влиять на уровень общей синтетической активности в клетке [2]. В ядре в качестве фактора транскрипции YB-1 регулирует экспрессию генов, содержащие Y-бокс в промоторе. В эту группу входят некоторые гены, кодирующие белки-транспортеры ксенобиотиков, участвующие в возникновении множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). МЛУ - это невосприимчивость популяции клеток к целому ряду лекарственных препаратов с различным химическим строением. Данный феномен часто препятствует успешной терапии злокачественных опухолей.

Возникновение МЛУ связывают как с повышенным содержанием YB-1 в клетках опухоли, так и с его локализацией в ядрах клеток [3]. В некоторых работах было предложено рассматривать ядерную локализацию YB-1 как ранний маркер МЛУ [4]. Однако вопрос о том, экспрессия и/или локализация белка YB-1 являются более значимыми для лекарственной устойчивости и прогноза, остается открытым.

Недавно был обнаружен ещё один потенциальный механизм влияния белка YB-1 на опухолевую прогрессию. Было показано, что данный белок может

секретироваться мезаигиопролиферативными клетками почки и макрофагами, играя роль экстраклеточного митогена и влияя на подвижность клеток [5]. Воздействие на опухолевые клетки экстраклеточного белка УВ-1 ещё не изучено. Между тем, внеклеточный УВ-1 может быть одним из факторов опухолевой прогрессии.

Целыо данной работы является изучение возможных механизмов влияния белка УВ-1 на свойства опухолевых клеток, а также исследование связи экспрессии мРНК гена УВ-1 и внутриклеточной локализации белка УВ-1 со степенью агрессивности течения рака молочной железы человека (РМЖ)

Задачи работы:

1. Исследовать влияние химиотерапевтических препаратов на локализацию белка и экспрессию мРНК гена УВ-1 в различных культурах малигнизированных клеток молочной железы;

2. Исследовать влияние химиотерапевтических препаратов на экспрессию мРНК генов МЛУ в культурах малигнизированных клеток молочной железы;

3. Исследовать влияние химиотерапевтических препаратов на экспрессию большого количества генов с помощью биочипа НТ-12 в культурах малигнизированных клеток молочной железы;

4. Исследовать влияние внеклеточного белка УВ-1 на пролиферацию, миграцию и чувствительность к химиопрепаратам малигнизированных клеток молочной железы;

5. Исследовать экспрессию мРНК гена УВ-1 в образцах опухолей больных РМЖ и ее корреляцию с клинико-морфологическими характеристиками опухолей и прогнозом заболевания;

6. Исследовать внутриклеточную локализацию белка УВ-1 в образцах опухолей больных РМЖ и ее корреляцию с клинико-морфологическими характеристиками опухолей и прогнозом заболевания.

Научная новизна

Впервые исследовано воздействие химиопрепаратов с различным механизмом действия, используемых при лечении РМЖ, на локализацию и экспрессию УВ-1 в нескольких линиях малигнизированных клеток молочной железы. Впервые исследовано, как влияют химиотерапевтические препараты доксорубицин и цисплатин на экспрессию широкого круга генов в малигнизированных клетках молочной железы. Впервые обнаружено, что внеклеточный белок УВ-1 усиливает пролиферацию и подвижность различных малигнизированных клеток молочной железы. Впервые показано, что внеклеточный белок УВ-1 не влияет на чувствительность к химиопрепаратам малигнизированных клеток молочной железы. Впервые показано, что количество мРНК гена УВ-1 является более достоверным маркером течения заболевания, нежели ядерная локализация белка УВ-1. Важным результатом данной работы является выявленная положительная корреляция между неоадъювантной (предоперационной) терапией и ядерной локализацией белка УВ-1 в опухолях молочной железы.

Научно-нрактичсская значимость

В данной работе выявлены новые молекулярные механизмы влияния химиотерапевтических препаратов на опухолевую прогрессию. Результаты данного исследования показывают, что содержание мРНК гена /^-Уявляется более перспективным маркером опухолевой прогрессии при РМЖ, нежели его локализация в ядре клеток. Выделена группа больных ранними стадиями РМЖ, у которых повышенное количество мРНК УВ-1 может служить фактором неблагоприятного прогноза. Получены данные, свидетельствующие в пользу того, что в образцах опухолей от больных РМЖ, получавших неоадъювантную терапию, происходит перемещение белка УВ-1 в ядра опухолевых клеток. Эту

группу больных следует расширить, чтобы окончательно решить вопрос о прогностическом значении ядерной локализации белка YB-1 в ядрах опухолевых клеток РМЖ.

В нашей работе продемонстрировано влияние внеклеточного белка YB-1 на свойства опухолевых клеток и на экспрессию различных генов. Это делает необходимым дальнейшее изучение механизмов воздействия внеклеточного белка YB-1 на опухолевую клетку на уровне сигнальных путей. Также ставится вопрос

06 исследовании уровня белка YB-1 в крови пациентов с РМЖ и связи этого показателя с прогнозом заболевания.

Методология и методы исследования

В работе использовали клетки рака молочной железы человека линий MCF-

7 и ВТ-474, а также туморогенные клетки линии HBL-100, которые являются трансформированными in vitro клетками. Были получены клетки MCF-7, трансфецированные геном N-TM/S0551112 , геном GFP, геном YB-1-GFP. Также в работе использовали рекомбинантные белки YB-1 и РАВР.

В работе исследовали опухолевый материал, полученный от 91 больного с диагнозом «инфильтрирующий протоковый рак молочной железы I-III стадии», оценивали экспрессию мРНК и локализацию белка YB-1.

Методы исследования: анализ динамики пролиферации клеток, метод оценки чувствительности клеток к химиопрепаратам - колориметрический метод (МТТ), анализ подвижности клеток (тест на «зарастание раны» in vitro). Исследование уровня экспрессии мРНК генов проводилось с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, экспрессионных биочипы (RNA microarray). Для исследования уровня экспрессии и локализации белков использовались иммуноцитохимический метод, иммупогистохимический метод, иммуноблоттинг. Полученные экспериментальные и клинические данные обрабатывались различными статистическими методами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Перемещение белка УВ-1 в ядра малигнизированных культивируемых клеток молочной железы зависит от химиопрепарата. Агенты, повреждающие ДНК (доксорубицин, цисплатин) приводят к транслокации УВ-1 в ядра опухолевых клеток. Транслокация УВ-1 зависит также от особенностей клеток.

2. Использование экспрессионных микрочипов, позволяющих исследовать активность 35 ООО генов, показало, что воздействие доксорубицина и цисплатина на экспрессию генов в клетках культур РМЖ разнонаправленно. Оно может приводить как к повышению, но и к снижению экспрессии АВС-транспортеров.

3. Внеклеточный белок УВ-1 усиливает пролиферацию и миграцию малигнизированных клеток молочной железы, но не влияет на устойчивость клеток к химиопрепаратам.

4. Внутриклеточная локализация белка УВ-1 и степень экспрессии мРНК гена УВ-1, обнаруживаемые в опухолевых образцах после мастэктомии, являются независимыми прогностическими признаками для больных РМЖ. Повышенная экспрессия мРНК гена УВ-1 в опухолевом материале достоверно коррелирует с увеличением частоты появления отдаленных метастазов (р=0.04).

5. В группе больных, которые получали неоадъювантную терапию, ядерная локализация белка УВ-1 обнаруживается достоверно чаще (/?=0.05), что свидетельствует о том, что неоадъювантная химиотерапия приводит к перемещению УВ-1 в ядра опухолевых клеток.

Степень достоверности и апробация результатов

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 16 октября 2012 года на совместной научной конференции лаборатории генетики опухолевых клеток, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лаборатории молекулярной эндокринологии НИН Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Белок YB-1 является мультифункциональным ДНК/РНК-связывающим белком, который участвует во многих процессах в клетке, происходящих как в ядре, так и в цитоплазме. Также он секретируется некоторыми видами клеток во внешнюю среду.cYB-1 регулирует уровень многих белков, связанных с пролиферацией клеток, ответом клеток на стресс; белков, связанных с лекарственной устойчивостью и подвижностью клеток. В норме белок YB-1 обеспечивает защиту клетки от различных агрессивных воздействий окружающей среды. В популяциях малигнизированных клеток его протективные функции защищают опухоль от лечебных воздействий. В данном обзоре будет освещаться многообразие функций белка YB-1, его участия в опухолевой прогрессии и возможное клиническое использование.

1.1. Структура белка и гена YB-1

Белок YB-1 (Y-box binding protein) относится к суперсемейству ДНК/РНК-связывающих белков с консервативным доменом холодового шока. Белок имеет массу около 35 кДа, 324 а.о. [1], в его структуру входят 3 домена, обуславливающие различные функции белка, как в ядре, так и в цитоплазме (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Доменная организация белка YB-l(no [1], с. 4)

Обозначения: А/Р - N-коицевой домен, богатый аланином и пролином; CSD -домен холодового шока; С-концевой домен, содержащий чередующиеся заряженные участки (обозначены ++ и—)

Первый, N-концевой домен, богатый аланином и пролином (А/Р-домен), отвечает за связывание YB-1 с актином [6] и белком р53 [7].

Второй, и по сути, определяющий большинство функций домен - это домен холодового шока (CSD). Белки, содержащие данную консервативную последовательность (70 а.о), обнаружены практически у всех живых существ, начиная от бактерий и растений и заканчивая млекопитающими [1]. Рентгеноструктурный анализ показал, что CSD представляет из себя ß-баррель -это укладка из 5 антипараллельных ß-тяжей, на поверхности которых находятся гидрофобные ароматические аминокислотные остатки [8]. Именно за счет этих остатков происходит специфичное и неспецифичное связывание с ДНК и РНК [1]. Специфично происходит связывание инвертированной последовательности ССААТ, или Y-бокса [9], по названию которого и получил имя белок. Стоит отметить, что белок YB-1 обладает особым сродством к одноцепочечной ДНК [10], за счет чего происходит ингибирование транскрипции некоторых генов [1]. Также важным свойством CSD-домена является его способность взаимодействовать с киназой Akt [11].

Третий домен - С-концевой, гидрофильный, содержит чередующиеся остатки положительно и отрицательно заряженных аминокислот, называемых заряженными зипперами [12]. Этот участок отвечает за неспецифическое связывание РНК и гомоолигомеризацию YB-1 [13]. Также было показано прямое взаимодействие С-концевого домена с белком PCNA, являющегося вспомогательным фактором репарационной ДНК-полимеразы дельта [14].

Человеческий ген белка YB-1 содержит приблизительно 19 kbp геномной ДНК, включает 8 экзонов, локализованных на хромосоме 1, сайт 1р34 [8]. Вопрос о регуляции транскрипции гена YB-1 не решен, в промоторе гена отсутствуют наиболее характерные регуляторные последовательности TATA и ССААТ. Вместо этого, в промоторе YB-1 обнаружены несколько E-боксов, а в начале первого экзона содержится много CG-повторов, а также GATA-мотивы, и этот участок первого экзона необходим для транскрипции гена [1].

Уже по одной организации белка YB-1 можно предполагать многообразие функций, которые он выполняет, и субстратов, с которыми он взаимодействует.

1.2. Функции белка YB-1

Белок YB-1 участвует в большинстве процессов, связанных с ДНК и РНК. Прежде всего, он является фактором транскрипции различных генов, отвечающих за пролиферацию клеток, репарацию и репликацию ДНК, генов МЛУ, генов, потенциально связанных с метастазированием. Белок YB-1 может как активировать экспрессию генов, так и ингибировать её. YB-1 непосредственно взаимодействует с некоторыми другими факторами транскрипции, например, р53 и АР-2, влияя и на их мишени [15, 16].

Белок YB-1 является мажорным белком цитоплазматических рибонуклеопротеиновых (РНП) частиц, стабилизирует мРНК, регулирует скорость ее трансляции, а также участвует в процессинге мРНК.

Таким образом, YB-1 регулирует экспрессию широкого спектра белков и на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне. Эти процессы происходят в разных компартментах клетки. Механизмы функционирования YB-1 и мишени его регуляции будут детально обсуждаться далее.

1.2.1. Роль белка YB-1 в цитоплазме клетки

Белок YB-1 является мажорным белком цитоплазматических РНП-частиц в различных клетках [2]. Это обуславливается его высоким сродством к мРНК, связывание с которой происходит, в основном, неспецифично. Хотя в последних работах было показано, что YB-1 обладает повышенной аффинностью к мРНК, содержащие большое количество GC-nap [17]. Связывание мРНК происходит при участии CSD и С-концевого доменов [1]. Белок YB-1 обнаруживается как в трапеляционно неактивных РНП, так и в активных РНП, но в последних количества белка па количество мРНК в 2 раза меньше [18]. Было показано, что YB-1 ингибирует или стимулирует трансляцию в зависимости от соотношения

YB-1/мРНК в РНП. В опытах in vitro увеличение концентрации YB-1 приводило к ингибированию инициации трансляции, а гиперэкспрессия в клетках вызывала репрессию трансляции in vivo. Отмечено, что YB-1 проявляет свой эффект на уровне инициации трансляции, а не на уровне элонгации или терминации полипептидного синтеза. Этот белок может играть роль в транспорте, заякоривании и локализации мРНК на актиновых филаментах в клетке через N-конец, при этом транспортируются только активные РНП, что может быть началом дифференцировки клеток [19].

Высокое содержание белка YB-1 в комплексе с мРНК приводит не только к выключению последней из трансляции, но и к стабилизации кэпированной мРНК [20]. Скорее всего, это происходит за счет защиты концом мРНК белком YB-1 от эндонуклеаз [19]. Стоит отметить, что стабилизация мРНК носит независимый от последовательности характер.

Из вышесказанного можно заключить, что YB-1 играет заметную роль регуляции уровня синтетической активности клетки. Кроме того, она может быть разнонаправленной: если в ооцитах гомолог YB-1 подавляет синтез белка [21], то в опухолевых клетках [22], наоборот, стимулирует его.

1.2.2. Механизмы и причины перехода YB-1 из цитоплазмы в ядро

клетки

Как было сказано выше, белок YB-1 выступает не только как регулятор трансляции, но и как фактор транскрипции, а также участвует в репарации ДНК. Соответственно, есть механизмы и условия транслокации YB-1 в ядро клетки.

Существует несколько механизмов перехода YB-1 в ядро. Прежде всего, в его молекуле в районе 186-205 а.о. был обнаружен сигнал ядерной локализации [23]. Этот сигнал находится в середине С-концевого домена, т.е. в маскированном состоянии. Под действием различных факторов, например, тромбина, часть концевого домена отщепляется протеазой, и белок переходит в ядро [24].

Еще один механизм транслокации белка УВ-1 в ядро - это фосфорилирование по 102 сериновому остатку. Именно фосфорилирование УВ-1 необходимо для транскрипции гена рецептора эпидермального фактора роста ЕОБК, который отвечает за пролиферацию эпидермальных клеток [25].

Замена фенилаланинового и тирозинового остатков в определенном месте С80-домена УВ-1 приводит к сильному понижению сродства белка к РНК и вызывает переход мутированного белка из цитоплазмы в клеточное ядро [26]. Эти данные свидетельствуют о том, что локализация СБО-белков во многом определяется их взаимодействием с мРНК в цитоплазме.

Переход белка УВ-1 связан с разными сторонами жизни клетки, например, с подготовкой к митозу, или ответом на стрессовые факторы, которые ведут к повреждению ДНК.

В клетках НеЬа переход УВ-1 из цитоплазмы в ядро наблюдался в конце 01 начале 8 фазы. Накопление УВ-1 в ядре в этот достаточно короткий интервал времени коррелирует с запуском синтеза циклинов, гены которых также содержат в промоторах участки У-боксы и активируются под действием белка УВ-1 [23].

Белок УВ-1 участвует в реакции клетки на стрессовые воздействия, например, УФ-облучение, химиопрепараты, гипертермия [27, 28, 29]. Его эффекты в ядре включают активацию генов, участвующих в синтезе и репарации ДНК, а также маркирование нарушений вторичной структуры ДНК и других повреждений [19]. Например, было показано значительное сродство УВ-1 к апуринизированной (т.е. к поврежденной) ДНК [10], а также ускорение ренатурации ДНК для гомолога УВ-1 р50. Можно заключить, что белок УВ-1 участвует в процессах репарации также на разных уровнях.

1.2.3. Функции УВ-1 в ядре клетки

В этом разделе будут подробно рассмотрены функции, которые выполняет белок УВ-1 в ядре, и возможное влияние через эти процессы на развитие, пролиферацию и лекарственную устойчивость опухолевых клеток.

Репарация ДНК.

На примере повреждения ДНК цисплатином (алкилирующий агент), было показано участие YB-1 в процессах репарации ДНК. Он вовлечен в активацию генов, участвующих в синтезе ДНК, таких как: ДНК-полимераза а, PCNA/циклин, тимидин киназа, топоизомераза II. Было показано, что YB-1 и PCNA взаимодействуют напрямую, участвуя в репарации ДНК при повреждении ее цисплатином [30]. Также продемонстрировано, что YB-1 проявляет 3-5' экзонуклеазную активность [31]. Еще один механизм, по которому YB-1 усиливает репарационные процессы в клетке: увеличение активности эндонуклеазы III путем блокирования ее аутоингибирующего домена [32]. Участие YB-1 в репарационных процессах может играть роль в защите опухолевых клеток от химиопрепаратов.

Транскрипция генов.

Существует ряд работ, где была продемонстрирована способность белка YB-1 усиливать или подавлять транскрипцию различных генов самостоятельно или через взаимодействие с другими транскрипционными факторами.

Например, комплекс белков AP-2/YB-1 участвует в регуляции экспрессии гена желатиназы А (металл-протеиназы 2), продукт которого играет важную роль в процессе инвазии и метастазирования (Jezierska А. et al, 2009). Комплекс AP-2/YB-1 связывается с энхансером гена, приводя к образованию протяженного одноцепочечного участка ДНК и стабилизации этой конформации. Такое взаимодействие вело к синергическому усилению транскрипции этими факторами гена желатиназы А. Есть данные, свидетельствующие в пользу того, что YB-1 может конкурировать с р53 за связывание сайта АР-2, который также оказывает синергический эффект совместно с АР-2 на активацию энхансерной последовательности гена желатиназы А [15, 16]. С другой стороны, супрессор

опухолевых метастазов Nm-23 бета может блокировать активацию транскрипции гена желатиназы А, опосредованную YB-1 [33]. Эта недавно выявленная роль YB-1 в процессе метастазирования обращает на себя большое внимание в связи с темой данной работы.

YB-1 является репрессором транскрипции гена fas (CD95 ассоциированного с клеточной смертью) и уменьшает уровень его базальной экспрессии [34]. С другой стороны, YB-1 подавляет усиление транскрипции гена grp78 (Са2+ связывающий белка, который участвует в предотвращении апоптоза [35]) в клетках, подвергшихся стрессовому воздействию [36]. Таким образом, YB-1 может играть важную роль в контроле клеточного выживания.

Это далеко неполный список генов, фактором транскрипции которых является YB-1. Приведенные примеры свидетельствуют об участии этого белка в процессах, которые могут играть роль в отмене клеточной гибели опухолевых клеток и дальнейшей опухолевой прогрессии. Помимо этого, показано воздействие YB-1 на пролиферацию клеток.

Список некоторых генов, играющих роль в опухолевой прогрессии и в регуляции которых принимают участие белок YB-1 и его гомологи, представлен в таблице 1.

Таблица 1 - Гены, экспрессия которых регулируется при участии белка УВ-1 и его гомологов.

Регулируемый ген Влияние на транскрипцию Литература

р53 (супрессор опухолей) ингибирование [37]

УЕОР (фактор роста эндотелия сосудов) ингибирование [19]

РОвР (тромбоцитарный фактор роста) активация [38]

ЕвРЯ (рецептор эпидермалышого фактора роста) активация [39]

Продолжение таблицы 1

Регулируемый ген Влияние на транскрипцию Литература

MDR1 (АВС-транспортер, участвующий в МЛУ) активация [40]

Fas (участие в апоптозе) ингибирование [34]

Желатиназа А (матриксная металлопротеиназа) активация [16]

Циклин А (клеточный цикл) активация [23]

ЦиклинВ! (клеточный цикл) активация [23]

Влияние количества YB-1 в клетках на биологические процессы

Действие YB-1 на трансляцию зависит от соотношения YB-1/мРНК. При высоких соотношениях YB-1 ингибирует трансляцию, а при низких, наоборот, активирует [1].

Высокая экспрессия YB-1 наблюдается в ранних эмбрионах курицы [41] и крысы [42], затем экспрессии YB-1 неуклонно снижается в процессе развития. Исключение составляют активно пролиферирующие ткани взрослого организма, таких как эпителий желез кишечника [43] и регенирирующая печень (после химически индуцированного повреждения или гепатоэктомии), где in vivo обнаруживается высокий уровень YB-1.

YB-1 не экспрессируется в нормальном миокарде, по обнаруживается во время регенерации миокарда после инфаркта [44]. Быстрая индукция YB-1 сопровождается инициацией клеточной пролиферации в месте инфаркта и коррелирует с экспрессией пролиферативного маркера PCNA. Места локализации YB-1 и другого пролиферативного маркера Ki-67 при инфаркте совпадают.

Введение в клетки гена YB-1 приводило к гиперэкспрессии мРНК и белка рецептора эпидермальиого фактора роста EGFR [39]. Более того, EGFR в этих клетках был конститутивно фосфорилирован в отсутствии лиганда. Эти данные свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия YB-1 может приводить к независимости от ростового фактора EGF клеток эпителия молочной железы человека путем активации сигнального пути, вовлекающего EGFR. Повышенная экспрессия YB-1 часто обнаруживается в различных опухолях человека, включая рак молочной железы, рак яичников, рак щитовидной железы, рак прямой кишки, остеосаркому и саркому мягких тканей [45].

Конститутивная гиперэкспрессия белка YB-1 в линии HBL-100 коррелировала с увеличением уровня экспрессии мРНК и белка циклина А и циклина В1. В свою очередь, это приводило к пролиферации клеток независимо от прикрепления к субстрату [23].

Ингибирование YB-1 при помощи антисмысловых конструкций или siRNA приводило к снижению экспрессии ДНК-полимеразы а и значительно ингибировало пролиферацию клеток [46].

Существуют другие работы по ингибированию YB-1 антисмысловыми конструкциями, среди них - работа Lee С., которая представляется наиболее значимой в контексте темы данного исследования. В работе продемонстрировано, что введение siPIIK к YB-1 привело к апоптозу в 6 из 7 клеточных линиях рака молочной железы, в которых гиперэкспрессировался HER-2/neu, или же которые были негативны по трем основным рецепторам РМЖ (рецепторы эстрогенов, прогестерона, HER-2/neu) [47].

1.2.4. Функциональные модификации белка YB-1 в клетке

Воздействие различных внешних сигналов приводит к модификациям белка YB-1 в клетке, влияющим на его функционирование. К таким модификациям относится фосфорилирование белка в различных сайтах, частичный и полный

протеолиз, убиквитинилирование, а также, по некоторым сведениям, ацетилирование.

Существует несколько крупных исследований, посвященных идентификации сайтов фосфорилирования для всей совокупности белков [48; 49; 50]. Анализ полученных баз данных и отдельных работ позволило обнаружить 6-9 сайтов фосфорилирования белка УВ-1: по аминокислотным остаткам в положении 8ег102, 8ег157, 8ег165 и/или 8ег167, 8ег174 и/или 8ег176, 8ег313 и/или 8ег314 и Туг162 (Таблица 2). Интересно отметить, что только один сайт, но наиболее изученный и привлекающий к себе внимания, находится в домене холодового шока - 8ег102 [51]. Остальные аминокислотные остатки, по которым происходит фосфорилирование, сосредоточены на С-конце белка в области заряженных зипперов. А одни из сайтов (БегЗ 13 и/или 8ег314) присутствует только в белке, которые не подвергался частичному протеолизу в положении 01и219 (см. ниже).

В работе на клетках НеЬа по изучению профиля фосфорилирования белков в зависимости от фазы клеточного цикла (С1 и митоз) было показано фосфорилирование 7 сайтов белка УВ-1, расположенных на С-конце. При этом только один сайт (8ег157) был фосфорилирован исключительно в митозе, все остальные сайты были модифицированы как в в 1-фазе, так и в митозе [50]. К сожалению, киназы, которые отвечают за фосфорилирования С-конца белка УВ-1, на данный момент неизвестны и исследования в этом аспекте ещё затруднительны, т.к. не созданы коммерческие антитела к фосфорилированным формам УВ-1 в этих положениях.

Домен холодового шока фосфорилируется по аминокислотному остатку 8ег102, что имеет, скорее всего, другие последствия по сравнению с фосфорилированием С-конца белка. Впервые активация белка УВ-1 в положении 8ег102 была показана па линии клеток МСР-7. При замене 8ег102 на А1а102 фосфорилирование киназой АМ белка УВ-1 не происходило, а также снижалась способность роста опухолевых клеток в монослое и в жидком агаре [11]. Далее

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Моисеева, Наталья Ивановна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Скабкин, М.А. Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов / М.А. Скабкин, О.В. Скабкина, Л.П. Овчинников // Успехи биологической химии. - 2004. - Т. 44. - С. 3 - 52.

2. Ovchinnikov, L.P. Major mRNP proteins in the structural organization and function of mRNA in eukaryotic cells / L.P. Ovchinnikov, M. Skabkin, P.V. Ruzanov, V.M. Evdokimova // Molecular biology (Mosk). - 2001. - Vol. 35. - P. 548 - 558.

3. Гене, Г.П. Внутриклеточная локализация белка YB-1 и химиотерапия опухолей молочной железы / Г.П. Гене, Н.И. Моисеева, Е.Ю. Рыбалкина, Т.П. Стромская, А.В. Вайман, Л.П. Овчинников, А.А. Ставровская // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 4. - С. 77-84.

4. Kuwano, М. The role of nuclear У-box binding protein 1 as a global marker in drug resistance / M. Kuwano, У. Oda, H. Izumi, SJ. Yang, T. Uchiumi, Y. Iwamoto, M. Toi, T. Fujii, H. Yamana, H. Kinoshita, T. Kamura, M. Tsuneyoshi, K. Yasumoto, K. Kohno // Molecular cancer therapeutics. - 2004. - Vol. 11. - P. 1485-1492.

5. Frye, B.C. Y-box protein-1 is actively secreted through a non-classical pathway and acts as an extracellular mitogen / B.C. Frye, S. Halfter, S. Djudjaj, P. Muehlenberg,

5. Weber, U. Raffetseder, A. En-Nia, H. Knott, J.M. Baron, S. Dooley, J. Bernhagen, P.R. Mertens // The EMBO Journal. - 2009. - Vol. 10. - P. 783 - 789.

6. Ruzanov, P.V. Interaction of the universal mRNA-binding protein, p50, with actin: a possible link between mRNA and microfilaments. P.V. Ruzanov, V.M. Evdokimova, N.L. Korneeva, J.W. Hershey, L.P. Ovchinnikov // Journal of cell science. - 1999.-Vol. 112.-P. 3487-3496.

7. Okamoto, T. Direct interaction of p53 with the Y-box binding protein, YB-1: a mechanism for regulation of human gene expression / T. Okamoto, PI. Izumi, T. Imamura, H. Takano, T. Ise, T. Uchiumi, M. Kuwano, K. Kohno // Oncogene. - 2000. -Vol. 54.-P. 6194-6202.

8. Kloks, C. The solution structure and DNA-binding properties of the cold-shock domain of the human Y-box protein YB-1 / C. Kloks, C. Spronk, E. Lasonder, A. Hoffmann, G.W. Vuister, S. Grzesiek, C.W. Hilbers // Journal of Biomolecular NMR. -2002.-Vol. 316. -P. 317-326.

9. Didier, D. Characterization of the cDNA encoding a protein binding to the major histocompatibility complex class II Y box / D. Didier, J. Schiffenbauer, S. L. Woulfe, M. Zacheis, B.D. Schwartz // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.- 1988. - Vol. 85. - P. 7322 - 7326.

10. Hasegawa, S.L. DNA binding properties of YB-1 and dbpA: binding to double-stranded, single-stranded, and abasic site containing DNAs / S.L. Hasegawa, P.W. Doetsch, K.K. Hamilton, A.M. Martin, S.A. Okenquist, J. Lenz, J.M. Boss // Nucleic Acids Research. - 1991.-Vol. 18. - P.4915 - 4920.

11. Sutherland, B.W. Akt phosphorylates the Y-box binding protein 1 at Serl02 located in the cold shock domain and affects the anchorage-independent growth of breast cancer cells / B.W. Sutherland, J. Kucab, J. Wu, C. Lee, M.C. Cheang, E. Yorida, D. Turbin, S. Dedhar, C. Nelson, M. Pollak, H. Leighton Grimes, K. Miller, S. Badve, D. Huntsman, C. Blake-Gilks, M. Chen, C.J. Pallen, S.E. Dunn // Oncogene. - 2005. -Vol. 24.-P. 4281-4292.

12. Kloks, C. Resonance assignment and secondary structure of the cold shock domain of the human YB-1 protein / C. Kloks, A. Hoffmann, J. Omichinski, G.W. Vuister, C.W. Hilbers, S. Grzesiek // Journal of Biomolecular NMR. - 1998. - Vol. 12. -P. 463-464.

13. Zasedateleva, O.A. Specificity of mammalian Y-box binding protein p50 in interaction with ss and ds DNA analyzed with generic oligonucleotide microchip / O.A. Zasedateleva, A.S. Krylov, D.V. Prokopenko, M.A. Skabkin, L.P. Ovchinnikov, A. Kolchinsky, A.D. Mirzabekov // Molecular biology. - 2002. - Vol. 324. - P. 73 - 87.

14. Bravo, R. Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta / R. Bravo, R. Frank, P. Blundell, H. Macdonald-Bravo // Nature. - 1987. - Vol. 326. - P. 515-517.

15. Mertens, P. A synergistic interaction of transcription factors AP2 and YB-1 regulates gelatinase A enhancer-dependent transcription / P. Mertens, M. Alfonso-Jaume, K. Steinmann, D.H. Lovett // Journal of Biological Chemistry. - 1998. - Vol. 273.-P. 32957-32965.

16. Mertens, P. Glomerular mesangial cell-specific transactivation of matrix metalloproteinase 2 transcription is mediated by YB-1 / P. Mertens, S. Harendza, A. Pollock, D.H. Lovett // Journal of Biological Chemistry. - 1997. - Vol. 272. - P. 22905 -22912.

17. Dong, J. RNA-binding specificity of Y-box protein 1 / J. Dong, A. Akcakanat, D. N. Stivers, J. Zhang, D. Kim, F. Meric-Bernstam // RNA Biology. - 2009. - Vol. 6. -P. 59-64.

18. Skabkin, M.A. The major messenger ribonucleoprotein particle protein p50 (YB-1) promotes nucleic acid strand annealing / M. Skabkin, V. Evdokimova, A. Thomas, L.P. Ovchinnikov // Journal of Biological Chemistry. - 2001. - Vol. 276. - P. 44841 -44847.

19. Skabkin, M.A. Structural organization of mRNA complexes with major core mRNP protein YB-1 / M.A. Skabkin, O.I. Kiselyova, K.G. Chernov, A.V. Sorokin, E.V. Dubrovin, I.V. Yaminsky, V.D. Vasiliev, L.P. Ovchinnikov // Nucleic acids research. - 2004. - Vol. 32. - P. 5621 - 5635.

20. Evdokimova, V. The major mRNA-associated protein YB-1 is a potent 5' cap-dependent mRNA stabilizer / V. Evdokimova, P. Ruzanov, H. Imataka, B. Raught, Y. Svitkin, L.P. Ovchinnikov, N. Sonenberg // The EMBO Journal. - 2001. - Vol. 19. - P. 5491-502.

21. Yu, J. Expression of MSY2 in mouse oocytes and preimplantation embryos / J. Yu, N. Hecht, R. Schultz // Biology of reproduction. - 2001. - Vol. 65. - P. 1260 -1270.

22. Janz, M. Y-box factor YB-1 predicts drug resistance and patient outcome in breast cancer independent of clinically relevant tumor biologic factors HER2, uPA and PAI-1 / M. Janz, N. Harbeck, P. Dettmar, U. Berger, A. Schmidt, K. Jiirchott, M.

Schmitt, I-I.D. Royer // International Journal of Cancer - 2002. - Vol. 97. - P. 278 -282.

23. Jurchott, K. YB-1 as a cell cycle-regulated transcription factor facilitating cyclin A and cyclin B1 gene expression / K. Jurchott, S. Bergmann, U. Stein, W. Walther, M. Janz, I. Manni, G. Piaggio, E. Fietze, M. Dietel, H.D. Royer // The Journal of Biological Chemistry. - 2003. - Vol. 25. - P. 27988-27996.

24. Stenina, O. Thrombin induces the release of the Y-box protein dbpB from mRNA: a mechanism of transcriptional activation / O. Stenina, K. Shaneyfelt, P. DiCorleto // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol. 98. - P. 7277 - 7282.

25. Stratford, AL. Y-box binding protein-1 serine 102 is a downstream target of p90 ribosomal S6 kinase in basal-like breast cancer cells / A.L. Stratford, CJ. Fry, C. Desilets, A.H. Davies, Y.Y. Cho, Y. Li, Z. Dong, I.M. Berquin, P.P. Roux, S.E. Dunn. // Breast Cancer Research. - 2008. - Vol. 10. - P. 99-107.

26. Bader, A.G. Y box-binding protein 1 induces resistance to oncogenic transformation by the phosphatidylinositol 3-kinase pathway / A.G. Bader, K.A. Felts, N. Jiang, H.W. Chang, P.K. Vogt // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.- 2003. - Vol. 100.-P. 12384-12389.

27. Hu, Z. Transcriptional activation of the MDR1 gene by UV irradiation. Role of NF-Y and Spl / Z. Hu, S. Jin, K.W. Scotto // The Journal of Biological Chemistry. -2000. - Vol. 275. - P. 2979 - 2985.

28. Ohga, T. Direct involvement of the Y-box binding protein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene / T. Ohga, T. Uchiumi, Y. Makino, K. Koike, M. Wada, M. Kuwano, K. Kohno // Journal of Biological Chemistry. - 1998 - Vol. 273. - P. 5997 - 6000.

29. Stein, U. Hyperthermia-induced nuclear translocation of transcription factor YB-1 leads to enhanced expression of multidrug resistance-related ABC transporters / U. Stein, K. Jurchott, W. Walther, S. Bergmann, P.M. Schlag, H.D. Royer // Journal of Biological Chemistry. - 2001. - Vol. 276. - P. 28562 - 28569.

30. Huang, J. Y-box binding protein, YB-1, as a marker of tumor aggressiveness and response to adjuvant chemotherapy in breast cancer. J. Huang, P. Tan, K. Li, K. Matsumoto, M. Tsujimoto, B.H.Bay // International Journal Oncology - 2005. - Vol. 26. - P. 607-613.

31. Izumi, H. Y box-binding protein-1 binds preferentially to single-stranded nucleic acids and exhibits 3'—>5' exonuclease activity / H. Izumi, T. Imamura, G. Nagatani, T. Ise, T. Murakami, H. Uramoto, T. Torigoe, PI. Ishiguchi, Y. Yoshida, M. Nomoto, T. Okamoto, T. Uchiumi, M. Kuwano, K. Funa, K. Kohno // Nucleic Acids Research. -2001.-Vol. 29.-P. 1200- 1207.

32. Guay, D. The human endonuclease III enzyme is a relevant target to potentiate cisplatin cytotoxicity in Y-box-binding protein-1 overexpressing tumor cells / D. Guay, C. Garand, S. Reddy, C. Schmutte, M. Lebel // Cancer Science. - 2008. - Vol. 99. - P. 762 - 769.

33. Cheng, S. Tumour metastasis suppressor, nm23-beta, inhibits gelatinase A transcription by interference with transactivator Y-box protein-1 (YB-1) / S. Cheng, M. Alfonso-Jaume, P.R. Mertens, D.H. Lovett // Biochemical Journal. - 2002. - Vol. 366. -P. 807-816.

34. Lasham, A. Regulation of the human fas promoter by YB-1, Puralpha and AP-1 transcription factors. A. Lasham, E. Lindridge, F. Rudert, R. Onrust, J. Watson // Gene. -2000.-Vol. 252.-P. 1 - 13.

35. Reddy, R. Endoplasmic reticulum chaperone protein GRP78 protects cells from apoptosis induced by topoisomerase inhibitors: role of ATP binding site in suppression of caspase-7 activation / R.K. Reddy, C. Mao, P. Baumeister, R.C. Austin, R.J. Kaufman, A.S. Lee. // Journal of Biological Chemistry. - 2003 - Vol. 278. - №23. - P. 5997-6000.

36. Li, W.W. Suppression of grp78 core promoter element-mediated stress induction by the dbpA and dbpB (YB-1) cold shock domain proteins / W.W. Li, Y. Hsiung, V. Wong, K. Galvin, Y. Zhou, Y. Shi, A.S. Lee // Molecular Cell Biology. - 1997. - Vol. 17.-P. 61-68.

37. Norman, J.T. The Y-box binding protein YB-1 suppresses collagen alpha 1(1) gene transcription via an evolutionarily conserved regulatory element in the proximal promoter / J.T. Norman, G.E. Lindahl, K. Shakib, A. En-Nia, E. Yilmaz, P.R. Mertens // The Journal of biological chemistry. - 2001. - Vol. 276. - P. 29880 - 29890.

38. Raffetseder, U. Extracellular YB-1 blockade in experimental nephritis upregulates Notch-3 receptor expression and signaling / U. Raffetseder, T. Rauen, P. Boor, T. Ostendorf, L. Hanssen, J. Floege, A. En-Nia, S. Djudjaj, B.C. Frye, P.R. Mertens // Nephron Exp Nephrol. - 2011. - Vol. 4. - P. el 00-108.

39. Berquin, I. Y-box-binding protein 1 confers EGF independence to human mammary epithelial cells 11. Berquin , B. Pang, M. Dziubinski, L.M. Scott, Y.Q. Chen, G.P. Nolan, S.P. Ethier // Oncogene. - 2005. - Vol. 24. - P. 3177 - 3186.

40. Bargou, R.C. Nuclear localization and increased levels of transcription factor YB-1 in primary human breast cancers are associated with intrinsic MDR1 gene expression / R.C. Bargou, K. Jurchott, C. Wagener, S. Bergmann, S. Metzner, K. Bommert, M.Y. Mapara, K.J. Winzer, M. Dietel, B. Dorken, H.D. Royer // Nature Medicine. - 1997. -Vol. 3.-P. 447-450.

41. Grant, C.E. Cloning and characterization of chicken YB-1: regulation of expression in the liver / C.E. Grant, R.G. Deeley, // Molecular Cell Biology. - 1993. -Vol. 13.-P. 4186-4196.

42. Ito, Y. Y-box binding protein expression in thyroid neoplasms: its linkage with anaplastic transformation. / Y. Ito, H. Yoshida, K. Shibahara, T. Uruno, K. Nakano, Y. Takamura, A. Miya, K. Kobayashi, T. Yokozawa, F. Matsuzuka, T. Uchimi, M. Kuwano, E. Miyoshi, N. Matsuura, K. Kuma, A. Miyauchi // Pathology International. -2003. - Vol. 53. - P. 429 - 433.

43. Shiota, M. Twist promotes tumor cell growth through YB-1 expression / M. Shiota, H. Izumi, T. Onitsuka, N. Miyamoto, E. Kashiwagi, A. Kidani, A. Yokomizo, S. Naito, K. Kohno // Cancer Research. - 2008. - Vol. 68. - P. 98 - 105.

44. Kamalov, G. Expression of the multifunctional Y-box protein, YB-1, in myofibroblasts of the infarcted rat heart / G. Kamalov, B.R. Varma, L. Lu, Y. Sun, K.T.

Weber, R.V. Guntaka // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005. - Vol. 334. P. 239 -244.

45. Kohno, K. The pleiotropic functions of the Y-box-binding protein, YB-1 / K. Kohno, H. Izumi, T. Uchiumi, M. Ashizuka, M. Kuwano // Bioessays. - 2003. - Vol. 25-P. 691 -698.

46. En-Nia, A. Transcription factor YB-1 mediates DNA polymerase alpha gene expression / A. En-Nia, E. Yilmaz, U. Klinge, D.H. Lovett, I. Stefanidis, P.R. Mertens // The Journal of Biological Chemistry. - 2005. - Vol. 280. - P. 7702 - 7711.

47. Lee, C. Targeting YB-1 in HER-2 overexpressing breast cancer cells induces apoptosis via the mTOR/STAT3 pathway and suppresses tumor growth in mice / Lee C, Dhillon J, Wang MY, Gao Y, Hu K, Park E, Astanehe A, Hung MC, Eirew P, Eaves CJ, Dunn SE//Cancer Research.-2008.-Vol. 21.-P. 8661-8666.

48. Olsen, JV. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks / JV. Olsen, B. Blagoev, F. Gnad, B. Macek, C. Kumar, P. Mortensen, M. Mann // Cell. - 2006. - Vol. 3. - P. 635-648.

49. Molina, H. Global proteomic profiling of phosphopeptides using electron transfer dissociation tandem mass spectrometry / H. Molina, DM. Horn, N. Tang, S. Mathivanan, A. Pandey // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. - 2007. - Vol. 7. - P. 2199-2204.

50. Dephoure, N. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. N. Dephoure, C. Zhou, J. Villen, S.A. Beausoleil, C.E. Bakalarski, S.J. Elledge, S.P. Gygi // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.- 2008. - Vol. 31. - P. 10762 -107627.

51. Wu, J. Disruption of the Y-box binding protein-1 results in suppression of the epidermal growth factor receptor and HER-2. J.Wu, C. Lee, D. Yokom, H. Jiang, MC. Cheang, E. Yorida, D. Turbin, IM. Berquin, PR. Mertens, T. Ifitner, CB. Gilks, SE. Dunn // Cancer Res. - 2006. - Vol. 9. - P. 4872-4879.

52. Romeo, Y. Regulation and function of the RSK family of protein kinases / Y. Romeo, X. Zhang, PP. Roux // The biochemical journal. - 2012. - Vol. 2. - P. 553-569.

53. Stratford, AL. Targeting p90 ribosomal S6 kinase eliminates tumor-initiating cells by inactivating Y-box binding protein-1 in triple-negative breast cancers / AL. Stratford, K. Reipas, K. Hu, A. Fotovati, R. Brough, J. Frankum, M. Takhar, P. Watson, A. Ashworth, CJ. Lord, A. Lasham, CG. Print, SE. Dunn // Stem Cells. - 2012. - Vol. 7.-P. 1338-1348.

54. Rauen, T. YB-1 acts as a ligand for Notch-3 receptors and modulates receptor activation / Rauen T, Raffetseder U, Frye ВС, Djudjaj S, Muhlenberg PJ, Eitner F, Lendahl U, Bernhagen J, Dooley S, Mertens PR // J Biol Chem. - 2009. - Vol. 39. - P. 26928-26940.

55. Sethi, N. Notch signalling in cancer progression and bone metastasis / N. Sethi, Y. Kang // Br J Cancer. - 2011. - Vol. 12. - P. 1805-1810.

56. Brandt, S. Cold shock Y-box protein-1 participates in signaling circuits with auto-regulatory activities / S. Brandt, U. Raffetseder, S. Djudjaj, A. Schreiter, B. Kadereit, M. Michele, M. Pabst M, C. Zhu, PR. Mertens // Eur J Cell Biol. - 2012. -Vol. 7.-P. 464-471.

57. Ставровская, A.A. Транспортные белки семейства ABC и множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток / А.А. Ставровская, Т.П. Стромская // Биохимия. - 2008. - Т. 5. - С. 735 - 750.

58. Scotto, К. W. Transcription of the multidrug resistance gene MDR1: a therapeutic target / K.W. Scotto, R.A. Johnson // Molecular interventions. - 2001. - Vol. 1. - P. 117 -1125.

59. Scotto, K.W. Transcriptional regulation of ABC drug transporters / K.W. Scotto // Oncogene. - 2003. - Vol. 22. - P. 7496 - 7511.

60. Ohga, T. Role of the human Y box-binding protein YB-1 in cellular sensitivity to the DNA-damaging agents cisplatin, mitomycin C, and ultraviolet light / T. Ohga, K. Koike, M. Ono, Y. Makino, Y. Itagaki, M. Tanimoto, M. Kuwano, K. Kohno // Cancer Research. - 1996. - Vol. 56. -P. 4224 - 4228.

61. Yahata, H. Increased nuclear localization of transcription factor YB-1 in acquired cisplatin-resistant ovarian cancer / H. Yahata, H. Kobayashi, T. Kamura, S. Amada, T.

Hirakawa, К. Kohno, M. Kuwano, H. Nakano // Journal of cancer research and clinical oncology.-2002.-Vol. 128.-P. 621 -626.

62. Вайман, А.В. Содержание и локализация белка YB-1 в опухолевых клетках с множественной лекарственной устойчивостью / А.В. Вайман, Т.П. Стромская, ЕЛО. Рыбалкина, А.В. Сорокин, С.Г. Гурьянов, Т.Н. Заботина, Е.Б. Мечетнер, Л.П. Овчинников, А.А. Ставровская // Биохимия. - 2006. - Т. 71. - С. 190 - 200.

63. Shibahara, К. Nuclear expression of the Y-box binding protein, YB-1, as a novel marker of disease progression in non-small cell lung cancer / K. Shibahara, K. Sugio, T. Osaki, T. Uchiumi, Y. Maehara, K. Kohno, K. Yasumoto, K. Sugimachi, M. Kuwano // Clinical Cancer Research. - 2001. - Vol. 7. - P. 3151 - 3155.

64. Gessner, C. Nuclear YB-1 expression as a negative prognostic marker in nonsmall cell lung cancer / C. Gessner, C. Woischwill, A. Schumacher, U. Liebers, H. Kuhn, P. Stiehl, K. Jurchott, HD. Royer, C. Witt, G. Wolff// Eur Respir J. - 2004. -Vol. l.-P. 14-19.

65. Yoshimatsu, T. Y-box-binding protein-1 expression is not correlated with p53 expression but with proliferating cell nuclear antigen expression in non-small cell lung cancer // T. Yoshimatsu, H. Uramoto, T. Oyama, Y. Yashima, C. Gu, M. Morita, K. Sugio, K. Kohno, K. Yasumoto // Anticancer research. - 2005. - Vol. 5. - P. 34373443.

66. Kashihara, M. Nuclear Y-box binding protein-1, a predictive marker of prognosis, is correlated with expression of PffiR2/ErbB2 and HER3/ErbB3 in non-small cell lung cancer / M. Kashihara, K. Azuma, A. Kawahara, Y. Basaki, S. Hattori, T. Yanagawa, Y. Terazaki, S. Takamori, K. Shirouzu, H. Aizawa, K. Nakano, M. Kage, M. Kuwano, M. Ono // Journal of thoracic oncology. - 2009. - Vol. 9. - P. 1066-1074.

67. Kamura, T. Is nuclear expression of Y box-binding protein-1 a new prognostic factor in ovarian serous adenocarcinoma? / T Kamura, PI Yahata, S Amada, S Ogawa, T Sonoda, H Kobayashi, M Mitsumoto, К Kohno, M Kuwano, H Nakano // Cancer. -1999. - Vol. 11. - P. 2450-2454.

68. Oda, Y. Prognostic implications of the nuclear localization of Y-box-binding protein-1 and CXCR4 expression in ovarian cancer: their correlation with activated Akt, LRP/MVP and P-glycoprotein expression / Y. Oda, Y. Ohishi, Y. Basaki, H. Kobayashi, T. Hirakawa, N. Wake, M. Ono, K. Nishio, M. Kuwano, M. Tsuneyoshi // Cancer Science. 2007. - Vol. 7. - V. 1020-1026.

69. Tarkowski, R. YB-1 protein expression in ovarian cancer / R. Tarkowski, G. Polak, A. Nowakowski, I. Wertel, J. Kotarski // Ginekol Pol. - 2006. - Vol. 6. - P. 458462.

70. Huang, X. Co-expression of Y box-binding protein-1 and P-glycoprotein as a prognostic marker for survival in epithelial ovarian cancer / X. Huang, K. Ushijima, K. Komai, Y. Takemoto, S. Motoshima, T. Kamura, K. Kohno // Gynecologic oncology. — 2004.- Vol. 2. - P. 287-291.

71. Shibao, K. Enhanced coexpression of YB-1 and DNA topoisomerase II alpha genes in human colorectal carcinomas / K. Shibao, H. Takano, Y. Nakayama, K. Okazaki, N. Nagata, H. Izumi, T. Uchiumi, M. Kuwano, K. Kohno, H. Itoh // International Journal of Cancer. - 1999. - Vol. 83. - P. 732 - 737.

72. Fogt, F. Expression of survivin, YB-1, and KI-67 in sporadic adenomas and dysplasia-associated lesions or masses in ulcerative colitis // F. Fogt, C. Poremba, K. Shibao, H. Itoh, K. Kohno, KR. Shroyer // Appl Immunohistochem Mol Morphol. -2001.-Vol. 2.-P. 143-149.

73. Klinge, U. Different matrix micro-environments in colon cancer and diverticular disease / U. Klinge, R. Rosch, K. Junge, CJ. Krones, M. Stumpf, P. Lynen-Jansen, PR. Mertens, V. Schumpelick // International journal of colorectal disease. - 2007. - Vol. 5. -P. 515-520.

74. Knôsel, T. Immunoproiïles of 11 biomarkers using tissue microarrays identify prognostic subgroups in colorectal cancer / T. Knôsel, A. Emde, K. Schluns, Y. Chen, K. Jùrchott, M. Krause, M. Dietel, I. Petersen // Neoplasia. - 2005. - Vol. 8. - P. 741747.

75. Oda, Y. Nuclear expression of YB-1 protein correlates with P-glycoprotein expression in human osteosarcoma / Y. Oda, A. Sakamoto, N. Shinohara, T. Ohga, T. Uchiumi, K. Kohno, M. Tsuneyoshi, M. Kuwano, Y. Iwamoto // Clinical Cancer Research. - 1998. - Vol. 4. - P. 2273 - 2277.

76. Saji, H. Nuclear expression of YB-1 protein correlates with P-glycoprotein expression in human breast carcinoma / H. Saji, M. Toi, S. Saji, M. Koike, K. Kohno, M. Kuwano//Cancer Letters.-2003.-Vol. 190.-P. 191-197.

77. Fujita, T. Increased nuclear localization of transcription factor Y-box binding protein 1 accompanied by up-regulation of P-glycoprotein in breast cancer pretreated with paclitaxel / T. Fujita, K. Ito, H. Izumi, M. Kimura, M. Sano, H. Nakagomi, K. Maeno, Y. Hama, K. Shingu, S. Tsuchiya, K. Kohno, M. Fujimori // Clinical Cancer Research. -2005.-Vol. 24. - P. 8837-44.

78. Soule, H.D. A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma / H.D. Soule, J. Vazguez , A. Long , S. Albert, M. Brennan // Journal of the National Cancer Institute. - 1973. - Vol. 51. - P. 1409 - 1416.

79. Lasfargues, E.Y. Isolation of two human tumor epithelial cell lines from solid breast carcinomas / E.Y. Lasfargues, W.G. Coutinho , E.S. Redfield // Journal of the National Cancer Institute. - 1978 - Vol. 61. - P. 967 - 978.

80. Gaffney, E.V. A cell line (HBL-100) established from human breast milk / E.V. Gaffney // Cell Tissue Research. - 1982. - Vol. 227. - P. 563 - 568.

81. Neve, R.M. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes / R.M. Neve, K. Chin, J. Fridlyand, et al. // Cancer Cell. — 2006.-Vol. 10.-P. 515-527.

82. Sheridan, C. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis / C. Sheridan, H. Kishimoto, R.K. Fuchs, S. Mehrotra, P. Bhat-Nakshatri, C.H. Turner, R.J. Goulet, S. Badve, H. Nakshatri // Breast Cancer Res. - 2006. - 8:R59.

83. Liang, Y. Targeting mutant p53 protein and the tumor vasculature: an effective combination therapy for advanced breast tumors / Y. Liang, C. Besch-Williford , I.

Benakanakere , P.E. Thorpe, S.M. Hyder // Breast cancer research and treatment. -2011,-Vol. 125.-P. 407-420.

84. Stromskaya, T.P. Cell-specific effects of RAS oncogene and protein kinase C agonist TPA on P-glycoprotein function / T.P. Stromskaya, I.A. Grigorian, V.S. Ossovskaya, E.Y. Rybalkina, P.M. Chumakov, B.P. Kopnin // FEBSLetters. - 1995. -Vol. 368.-P. 373 -376.

85. Huang, D.W. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists / D.W. Huang, B.T. Sherman, R.A. Lempicki // Nucleic Acids Res. - 2009. - Vol. 37. - P. 1 - 13.

86. Huang, D.W. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources / D.W. Huang, B.T. Sherman, R.A. Lempicki // Nature Protoc. - 2009. - Vol. 4. - P. 44 - 57.

87. Evdokimova, V. Translational activation of snail 1 and other developmentally regulated transcription factors by YB-1 promotes an epithelial-mesenchymal transition / Evdokimova V, Tognon C, Ng T, Ruzanov P, Melnyk N, Fink D, Sorokin A, Ovchinnikov LP, Davicioni E, Triche TJ, Sorensen PH // Cancer Cell. - 2009. - Vol. 5. -P. 402-415.

88. Shen, H. Upregulation of mdrl gene is related to activation of the MAPK/ERK signal transduction pathway and YB-1 nuclear translocation in B-cell lymphoma / H. Shen, W. Xu, W. Luo, L. Zhou, W. Yong, F. Chen, C. Wu, Q. Chen, X. Han // Experimental Hematology - 2011. - Vol. 39. - P. 558 - 569.

89. Zhang, J. Multiple roles of chemokine (C-C motif) ligand 2 in promoting prostate cancer growth / J. Zhang, Y. Lu, K.J. Pienta // Journal of the National Cancer Institute. -2010.-Vol. 102.-P. 522-528.

90. Demont, Y. Pro-nerve growth factor induces autocrine stimulation of breast cancer cell invasion through tropomyosin-related kinase A (TrkA) and sortilin protein / Y. Demont, C. Corbet, A. Page, Y. Ataman-Onal, G. Choquet-Kastylevsky, I. Fliniaux, X. Le Bourhis, R.A. Toillon, R.A. Bradshaw, H. Hondermarck // The Journal of Biological Chemistry. - 2012. - Vol. 287. - P. 1923 - 1931.

91. Bellavia, D. Notch3: from subtle structural differences to functional diversity / D. Bellavia, S. Checquolo, A. F. Campese, M.P. Felli, A. Gulino, I. Screpanti // Oncogen. - 2008. - Vol. 27. - P. 5092 - 5098.

92. Yamaguchi, N. NOTCH3 signaling pathway plays crucial roles in the proliferation of ErbB2-negative human breast cancer cells / N. Yamaguchi, T. Oyama, E. Ito, H. Satoh, S. Azuma, M. Hayashi, K. Shimizu, R. Honma, Y. Yanagisawa, A. Nishikawa, M. Kawamura, J. Imai, S. Ohwada, K. Tatsuta, J. Inoue, K. Semba, S. Watanabe // Cancer Research. - 2008. - Vol. 6. - P. 1881-1888.

93. Matsumoto, S. Ribonucleoprotein Y-box-binding protein-1 regulates mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) protein expression after serum stimulation through binding to OXPHOS mRNA / S. Matsumoto, T. Uchiumi, H. Tanamachi, T. Saito, M. Yagi, S. Takazaki, T. Kanki, D. Kang // The biochemical journal. - 2012. - Vol. 443. - P. 573 - 584.

94. Tacke, F. Y-box protein-l/pl8 fragment identifies malignancies in patients with chronic liver disease / F. Tacke, N. Kanig, A. En-Nia, T. Kaehne, C.S. Eberhardt, V. Shpacovitch, C. Trautwein, P.R. Mertens // BMC Cancer. - 2011. - Vol. 11. - doi: 10.1186/1471-2407-11-185.

95. Xie, W. Expression of Y-Box-binding protein 1 in Chinese patients with breast cancer / W. Xie, J. Yang, Y. Cao, C. Peng, H. Ning, F. Zhang, J. You // Tumour biology.-2012.-Vol. 33.-P. 63-71.

96. Dahl, E. Nuclear detection of Y-box protein-1 (YB-1) closely associates with progesterone receptor negativity and is a strong adverse survival factor in human breast cancer / E. Dahl, A. En-Nia, F. Wiesmann, R. Krings, S. Djudjaj, E. Breuer, T. Fuchs, P.J. Wild, A. Hartmann, S.E. Dunn, P.R. Mertens // BMC Cancer. - 2009. - Vol. 24. -P. 401-410.

97. Fujii, T. Preclinical studies of molecular-targeting diagnostic and therapeutic strategies against breast cancer / T. Fujii, G. Yokoyama, H. Takahashi, R. Namoto, S. Nakagawa, U. Toh, M. Kage, K. Shirouzu, M. Kuwano // Breast Cancer. - 2008. - Vol. 15.-P. 73 -78.

98. Naccarato, A. Bio-morphological events in the development of the human female mammary gland from fetal age to puberty / A. Naccarato, P. Viacava, S. Vignati, G. Fanelli, A.G. Bonadio, G. Montruccoli, G. Bevilacqua // Virchows Archiv. — 2000. — Vol. 436.-P. 431 -438.

99. Skliris, G. Estrogen receptor alpha negative breast cancer patients: estrogen receptor beta as a therapeutic target / G. Skliris, E. Leygue, P. Watson, L. Murphy // The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. — 2008. - Vol. 109. - P. 1 -10.

100. Woolley, A.G. Prognostic association of YB-1 expression in breast cancers: a matter of antibody / A.G. Woolley, M. Algie, W. Samuel, R. Harfoot, A. Wiles, N.A. Hung, P.H. Tan, P. Hains, V.A. Valova, L. Huschtscha, J.A. Royds, D. Perez, H.S. Yoon, S.B. Cohen, P.J. Robinson, B.H. Bay, A. Lasham, A.W. Braithwaite // PLoS One. - 2011. - Vol. 6(6):e20603.

101. Habibi, G. Redefining prognostic factors for breast cancer: YB-1 is a stronger predictor of relapse and disease-specific survival than estrogen receptor or HER-2 across all tumor subtypes / G. Habibi, S. Leung, J.H. Law, K. Gelmon, H. Masoudi, D. Turbin, M. Pollak, T.O. Nielsen, D. Huntsman, S.E. Dunn // Breast Cancer Research. -2008.-Vol. 10.-P. 110-117.

102. Li, Y. High expression of Y-box-binding protein-1 is associated with poor survival in resectable esophageal squamous cell carcinoma / Y. Li, Z.S. Wen, H.X. Yang, R.Z. Luo, Y. Zhang, M.F. Zhang, X. Wang, W.H. Jia // Annals of surgical oncology. - 2011. - Vol. 18. - P. 3370 - 3376.

103. Szczuraszek, K. Elevated YB-1 expression is a new unfavorable prognostic factor in non-PIodgkin's lymphomas / K. Szczuraszek, A. Halon, V. Materna, G. Mazur, T. Wrobel, K. Kuliczkowski, P. Donizy, P.S. Holm, H. Lage, P. Surowiak // Anticancer Res. - 2011. - Vol. 31. - P. 2963 - 2970.

104. Kolk, A. Expression of Y-box-binding protein YB-1 allows stratification into long- and short-term survivors of head and neck cancer patients / A. Kolk, N. Jubitz, K.

Mengele, K. Mantwill, O. Bissinger, M. Schmitt, M. Kremer, P.S. Holm // British journal of cancer.- 2011. -Vol. 105.-P. 1864- 1873.

105. Wu, Y. Strong YB-1 expression is associated with liver metastasis progression and predicts shorter disease-free survival in advanced gastric cancer / Y. Wu, S. Yamada, H. Izumi, Z. Li, S. Shimajiri, K.Y. Wang, Y.P. Liu, K. Kohno, Y. Sasaguri // Journal of surgical oncology. - 2012. - Vol. 105. - P. 724 - 730.