Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Капралова, Ирина Владимировна

• Капралова, Ирина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Капралова, Ирина Владимировна

Список сокращений.

Введение.

ГЛАВАI 9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы микроинъекции (МИ).

1. 2. Выживаемость зародышей животных и человека после МИ.

1.3. Ранний эмбриогенез мыши, стадия бластоцисты.

1. 4. Ростовые факторы и цитокины в раннем развитии зародышей.

1.5. Роль цитокина LIF в эмбриогенезе и имплантации.

1. 6. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши.

1. 7. Методы получения ЭСК.

1. 8. Химерные зародыши и животные.

ГЛАВА II

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2. 1. Биологический материал.

2. 2. Ранние зародыши мыши.

2.2.1. Выделение зародышей на стадии бластоцисты.

2.2.2. Культивирование бластоцист in vitro.

2.2.3. Выявление биологических эффектов цитокина LIF на стадии бластоцисты.

2. 3. Клеточные культуры.

2.3.1. Выделение первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши.

2.3.2. Культивирование клеток ПЭФ.

2.3.3. Приготовление митомицинового фидера ПЭФ.

2.3.4. Культивирование ЭСК мыши.

2.3.5. Культивирование и трансфекция клеток линии Cos-1.

2. 4. Микроинъекция (МИ).

2.4.1. Оборудования для проведения МИ.

2.4.1. МИ в бластоцисты растворов и целых клеток.

2. 5. Оценка жизнеспособности бластоцист мыши в условиях культуры in vitro.

2.5.1. Цитохимический тест на выявление эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ).

2.5.2. Иммуноцитохимическое определение фактора транскрипции плюрипотентных клеток - Nanog.

2. 6. Криоконсервация клеточных культур.

2.6.1. Замораживание и хранение ЭСК,

ПЭФ и Cos-1 в жидком азоте.

2.6.2. Режимы замораживания и размораживания клеточных культур.

2. 7. Состав сред и растворов, используемых для культивирования клеток и ранних зародышей.

2.7.1. Модифицированная среда Виттена (МСВ).

2.7.2. Фосфатно-солевой буфер PBS.

2.7.3. Раствор Версен-ЭДТА.

2.7.4. Трипсин-ЭДТА.

2. 8. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА III

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. МИ в полость бластоцисты среды Виттена и витальных красителей.

3.1.1. Морфофункциональные особенности бластоцист после МИ.

3.1.2. Развитие зародышей мыши со стадии бластоцисты in vitro.

3.1.3. Межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист после МИ.

3.1.4. Влияние цитохалазина Б на эффективность культивирования мышиных бластоцист.

3.1.5. Повышение эффективности культивирования бластоцист мышей в среде с цитокином LIF.

3.1.6. МИ цитокина LIF в полость бластоцисты.

3. 2. Получение химерных бластоцист мыши.

3.2.1. Распределение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в полости бластоцисты после МИ.

3.2.2. МИ в полость бластоцисты трансфицированных клеток линии Cos-1.

3.2.3. Оценка флуоресценции зеленого белка GFP в первичных эмбриональных фибробластах (ПЭФ) мыши после МИ в бластоцисту.

3.2.4. Эффективность развития химерных бластоцист мыши в культуре.

ГЛАВА IV 97 ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток»

Проблема терапевтического и репродуктивного клонирования стала одной из самых популярных проблем современной клеточной биологии и медицины (Kuhholzer, Prather, 2000; Solter, 2000; Kawase et al., 2000; Wolf ef al., 2001; Illmensee, 2002; Wakayama et al., 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, 2006). Одним из подходов для ее решения является микроинъекция (МИ) в ооциты или ранние зародыши чужеродных ядер, ДНК и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые обладают уникальной способностью встраиваться в развитие зародыша и передавать свои признаки по наследству (Bradley et al., 1984; Robertson, 1986; Perry et al., 1999; Baguishi et al., 1999; Nagy et al., 1987; Nagy, Rossant, 2001; Nagy et al., 2003).

В последние годы методы МИ нашли практическое применение в работах по лечению бесплодия человека с помощью экстракорпорального оплодотворения - ЭКО, когда отдельный сперматозоид водится в цитоплазму ооцита (Галат, 2000; Lundin et al., 2001; Yoshida, 2007; Jones et al., 2008). Другая область применения МИ связана с решением проблем клонирования ЭСК животных и человека с генетически измененными свойствами (Wakayama et al., 2001; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, Hwang et al, 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2006). После замены ядра ооцита на ядро таких клеток получают зародыши, генетический материал которых соответствует геному донора.

Подавляющее большинство исследований с применением техники МИ выполнено на экспериментальных моделях, в качестве которых использовали лабораторных мышей. Из этих работ следует, что выживаемость мышиных ооцитов после замены ядер не превышает 1-2 % из-за низкой способности соматических и эмбриональных ядер к репрограмированию в цитоплазме зрелого ооцита (Illmensee, Норре, 1981; Wilmut et al., 1997; McLaren, 2000; Hochedlinger, Jaenisch, 2003; Hwang et al., 2004). По данным литературы более высокий процент выживаемости реконструированных зародышей достигается при инъекции ЭСК в полость бластоцисты, как источника чужеродного генетического материала (Bradley et al., 1984; Robertson, 1986; Nagy et al., 1987;

Nagy, Rossant, 2001; Rossant, 2001; Nagy et al., 2003). В этом случае из реконструированных бластоцист можно получить более 20 % генеративных химерных животных. Этот метод находит применение в различных трансгенных и ген-таргетированных технологиях с использованием в качестве векторных систем ЭСК.

В современной литературе господствуют представления о том, что способность инъецированных клеток встраиваться в развитие зародыша и его гаметогенез зависит от плюрипотентных свойств ЭСК (Robertson, 1986; Robertson et al, 1987; Bradley et al., 1992; Brown et al., 1992; Papaioannou, 1993; Yagi, 1993; Ueda et al., 1995; Longo et al., 1997; Rossant, Spence, 1998; Prelle et al, 1999; Rossant, 2001). При этом остаются в стороне и не рассматриваются вопросы влияния самой процедуры МИ на последующее развитие и выживаемость химерных зародышей и их способность продуцировать первичные колонии эмбриональных клеток в условиях in vitro.

Кроме того, недостаточно внимания уделяется вопросам влияния генома зародыша на свойства и межклеточные взаимодействия ЭСК на начальных этапах развития в составе бластоцисты, а также факторам, индуцирующим эти процессы in vitro. Плюрипотентные ЭСК мыши с одинаковой вероятностью включаются как в экстраэмбриональные ткани, так и в ткани самого зародыша. Выбор направления развития инъецированных клеток во многом носит случайный характер, и причины выбора остаются неизвестными. В связи с этим нам представлялось весьма интересным изучить характер распределения инъецированных клеток в составе бластоцисты и выяснить регуляторные возможности самих зародышей, оценить их способность к восстановлению морфологии и жизнеспособности после повреждений, вызванных МИ. Результаты таких исследований могут представлять большой интерес в медицинской практике.

Основной целью настоящей работы было получение с помощью метода МИ химерных бластоцист мыши и выявление характера распределения инъецированных эмбриональных и соматических клеток в химерном зародыше на начальных этапах его развития. Решали следующие задачи:

• Оценка жизнеспособности бластоцист различных линий мышей in vitro после МИ в полость растворов витальных красителей, среды культивирования, эмбриональных и соматических клеток.

• Исследование межлинейных различий в реакции бластоцист на МИ. Оценка характера повреждений бластоцист.

• Разработка методических приемов для повышения эффективности культивирования мышиных бластоцист in vitro.

• Оценка влияния цитокина LIF на развитие бластоцист в зависимости от способа его действия: опосредованно через среду культивирования или путем введения в полость бластоцисты.

• Подбор генетических маркеров и флуоресцентных красителей для идентификации инъецированных соматических и эмбриональных клеток в составе бластоцисты. Оценка характера их встраивания в бластоцисту.

• Получение химерных бластоцист и выявление различий в эффективности их культивирования в зависимости от генома инъецированных клеток.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Капралова, Ирина Владимировна

ГЛАВА IV ВЫВОДЫ

1. Показано, что после МИ в бластоцисты мышей среды Виттена и витальных красителей зародыши восстанавливают морфологию в течение 3 ч инкубирования in vitro. В результате прокола повреждается не более 4-5 %клеток, расположенных в области проникновения иглы. У поврежденных клеток нарушены барьерные свойства плазматических мембран, что является свидетельством нежизнеспособности. Через сутки культивирования такие клетки смещаются в направлении трофобласта, выходят в перивителлиновое пространство и не влияют на развитие зародыша после МИ.

2. Установлено, что МИ стимулирует выход бластоцист из zona pellucida и образование сложных по морфологии первичных колоний из клеток ВКМ и ТБ. Выявлена неоднородность клеток ВКМ по активности факторов плюрипотентности ЭЩФ и Nanog на этом этапе развития, что свидетельствует о ранней детерминации ВКМ в плюрипотентные клетки, либо в клетки ТБ.

3. Выявлены межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист в виде первичных колоний ЭК в зависимости от генотипа зародыша. После МИ различия между зародышами 129/Sv, NMRI и SHK нивелируют, что позволят использовать прием МИ для мышей линии NMRI и SHK с целью получения первичных колоний ЭК - источников ЭСК.

4. Установлено, что регуляторная способность цитокина LIF, направленная на стимулирование процессов развития in vitro, реализуется на стадии бластоцисты опосредованно через среду культивирования. LIF повышает эффективность выхода бластоцист из z. pellucida и адгезию, стимулирует пролиферативную активность клеток и рост первичных колоний. В этот период основными мишенями LIF являются клетки ТБ. После введения цитокина LIF в полость бластоцисты положительных эффектов не выявляется.

5. С помощью метода МИ получены химерные бластоцисты мыши и показано, что ЭСК линии R1, также как и соматические клетки ПЭФ и Cos-1 на начальных этапах развития в составе зародыша встраиваются преимущественно в ТБ. Эффективность культивирования химерных бластоцист in vitro зависит от генома инъецированных клеток. Выявлена доминирующая роль клеток ТБ на этапе формирования химерных колоний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Капралова, Ирина Владимировна, 2009 год

1. Березовская О.П., Межевикина Л.М., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования ранних эмбрионов линейных мышей. // Онтогенез, 1986, т. 17, №5, с. 553-55.

2. Боголюбова И.О., Парфенов В.Н. Динамика организации ядра двухклеточных эмбрионов мышей; распределение факторов сплайсинга пре-мРНК и некоторых ядерных белков. // Цитология, 2000, № 1, с. 268

3. Галат В.В. Методы микроинъекции спермиев как инструмент вспомогательной репродукции и изучения биологии оплодотворения. Онтогенез, 2000, т. 31, №1, с. 5-13.

4. Гилберт С. // Биология развития, т. 1, Москва, Мир, 1993.

5. Глазко Т.Т., Межевикина JI.M., Бойко А.А., Фесенко Е.Е. Цепная кариотипическая эволюция эмбриональных стволовых клеток линии R1 in vitro. //Цитология, 2005, т. 47, № 12, с. 679-685.

6. Гланц С. Медико-биологическая статистика. // Москва, Практика, 1998, 464 с.

7. Гольдштейн Д.В.,. Погорелова В.Н, Погорелов А.Г. Изменение цитоплазматического Na+/K+ баланса у двухклеточного эмбриона мыши под действием цитохалазина Б. // Цитология, 2007, п. 49, № 8, с. 680-84.

8. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих.// Ленинград, Наука, 1988, 228 с.

9. Дыбан А.П., Секирина Г.Г. Изучение доимплантационного развития однояйцовых близнецов: опыты на зародышах мышей. // Онтогенез, 1981, т. 12, № 2, с. 130-39.

10. Евсиков А.В., Соломко А.П. Уровни и характер транскрипции у доимплантационных зародышей мыши с подавленным цитокинезом. // Онтогенез, 1999, т. 30, № 2, с. 103-109.

11. Капралова И.В., Межевикина JI.M. Функциональное значение трофобласта для получения колоний плюрипотентных эмбриональных клеток из бластоцист мыши. // Цитология, 2006, т. 48, № 9, с. 766-67.

12. Капралова И.В., Серышева В.В., Межевикина JI.M. Особенности LIF— регуляции при действии на эмбриональные стволовые клетки и доимплантационные зародыши мыши в культуре in vitro. И Цитология, 2003, т. 45, №9, с. 882-83.

13. Лойд 3., Госсрау 3., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. // Москва, Мир, 1982, с. 64-67.

14. Максимовский Л.Ф., Микичур Н.И. Методы микроманипуляции и ультрамикроанализа в биологии и медицине. // Новосибирск, Наука, Сиб. отд., 1989, 239 с.

15. Манк М. Биология развития млекопитающих. Методы. // Москва, Мир, 1990, 406 с.

16. Межевикина Л.М., Федорова В.В., Капралова И.В., Фесенко Е.Е Повышение выживаемости доимплантационных зародышей мыши в среде с рекомбинантным цитокином LIF. // Онтогенез, 2006 а, том 37, № 1, с. 55— 62.

17. Межевикина Л.М., Капралова И.В., Фесенко Е.Е. Стимулирующее действие рекомбинантного цитокина LIF на бластоцисты мыши в период имплантации. Биомедицинская химия, 2006 б, том 52, № 1 (6), с. 620-26.

18. Миталипов Ш.М., Миталипова М.М., Иванов В.И. Влияние длительности культивирования на плюрипотентность эмбриональных стволовых (ES) клеток мыши in vitro и in vivo. II Онтогенез, 1994, т. 25, № 6, с. 19-27.

19. Никитин В.А. Микроинъекция. Введение веществ и органелл в клетку. // Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 2002.

20. Пенков Л.И., Платонов Е.С., Кондрахина М.С., Конюхов Б.В. Фактор ингибирования лейкемии (LIF) улучшает и пролонгирует развитие партеногенетических зародышей мыши. // Онтогенез, 2003, т. 34, № 4, с. 301-305.

21. Попов Л.С., Языков А.А. Трансгенные животные как модели изучения репродукции, эмбрионального развития и заболевания человека. // Успехи современной биологии, 1999, т. 119, № 1, с. 30-41.

22. Попов Л.С., Языков А.А. Трансгенные животные как модели опухолевых заболеваний человека. // Успехи современной биологии, 2000, т. 120, № 4, с. 329-39.

23. Репин B.C. Критические факторы химической регуляции развития. // Москва, Медицина, 1980.

24. Савченкова И.П., Фляйшманн З.М., Булла И., Брем Г. Использование плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток мыши для получения химерных животных. // Цитология, 1996, т. 38, № 10, с. 1118-23.

25. Adamson E.D. Activities of growth factors in preimplantation embryos. // J. Cell. Biochem., 1993, v. 53, p. 280-87.

26. Bhatnagar P., Pappaioannou V.E., Biggers J.D. CSF-1 and mouse preimplantation development in vitro. II Development, 1995, v. 121, p. 1333-39.

27. Bhatt H., Brunet L.J., Stewart C.L. Uterine expression of leukemia inhibitory factor coincides with the onset of blastocyst implantation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, v. 88, n. 24, p. 11408-12.

28. Bradley A. Production and analysis of chimeric mice. // Teratocarcinoma and embryonic stem cells: a practical approach / Ad. Robertson E.J., 1987, Oxford, Washington, DS: IRL Press, p. 113-52.

29. Bradley A., Hasty P., Davis A., Ramirez-Solis R. Modifying the mouse: design and desire. //BioTechnology, 1992, v. 10, p. 534-39.

30. Brandon E.P., Idzerda R.L., McKnight G.S. Targeting the mouse genome: a compendium of knoc-knouts. // Curr. Biol., 1995, v. 5, p. 625-34.

31. Brison D.R., Schultz R.M. Apoptosis during mouse blastocyst formation: evidence for a role for survival factors including transforming growth factor alpha. // Biol. Reprod., 1997, v. 56, n. 5, p. 1088-96.

32. Brook F.A., Gardner R.L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 5709-12.

33. Brown D.G., Willington M.A., Findlay I., Muggleton-Harris A.L. Criteria, that optimize the potential of murine embryonic stem cells for in vitro and in vivo developmental studies. // In vitro Cell Dev. Biol., 1992, v. 28, p. 773-78.

34. Burruel V.R., Yanagimachi R., Whitten W.K. Normal mice develop from oocytes injected with spermatozoa with grossly misshapen heads. // Biol. Reprod., 1996, v. 55, n. 3, p. 709-14.

35. Carson D.D., Bagchi I., Dey S.K., Enders A.C., Fazleabas A.T., Lessey B.A., Yoshinaga K. Embryo implantation. // Dev. Biol., 2000, v. 223, p. 217-37.

36. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. // Cell, 2003, v. 113, p. 643-55.

37. Chang I.K., Jeong D.K., Hong Y.H., Park T.S., Moon Y.K., Ohno Т., Han J.Y. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. // Cell Biol. Int., 1997, v. 21, p. 495-99.

38. Chazaud С., Ymanaka Y., Rossant T. Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in muse blastocyst through the Crb2-MAPK pathway. // Dev. Cell, 2006, v. 10, n. 5, p. 615-24.

39. Chung Y., Klimanskaya I., Becker S., Marh J., Lu S.-J., Johnos J, Meisner L., Lanza R. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. //Nature, 2006, v. 439, p. 216-19.

40. Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J., Veress В., Nilsson E., Karlstrom H., Lendahl U., Frisen J. Generalized potential of adult neural stem cells. // Science, 2000, v. 288, p. 16060-63.

41. Cohen P.E., Pollard J.W. Cytokines and growth factors in reproduction. // In: Reproductive Immunology / Ads. Bronson R.A., Alexander N.J., Anderson D., Branch D.W., Kutteh W.H, Oxford, Blackwell Science, 1996, p. 52-104.

42. Cross J.C., Werb Z., Fisher S.J. Implantation and the placenta: Key pieces of the developmental puzzle. // Science, 1994, v. 266, p. 1508-18.

43. Cummins J.M. Controversies in science; ICSI may foster birth defects. // J. NIH Res., 1997, v. 9, p. 36-40.

44. Davidson E.H. Haw embryos work: a comparative view of diverse models of cell fate specification. //Development, 1990, v. 108, p. 365-89.

45. Delhaise F., Bralion V., Schuurbiers, Dessy F. Establishment of an embryonic stem cell line from 8-cell stage mouse embryos. // Eur. J. Morph., 1996, v. 34, n. 4, p. 237-43.

46. DeVos A. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI). // Hum. Reprod., 2000, v. 15, n. 4, p. 59-64.

47. Dieddrich K., Fauser B.C.J.M., Devroey P., Griesinger G. The role of the endometrium and embryo in human implantation. // Hum. Reprod., 2007, v. 4, p. 1-13.

48. Dimitriadis E., White C.A., Jones R.L., Salamonsen L.A. Cytokines, chemokines and growth factors in endometrium related to implantation. // Hum. Reprod. Update, 2005, v. 11, n. 6, p. 613-30.

49. Doetchmann T. Gene transfer in embryonic stem cells. // Trans. Anim. technol., 1994, p. 115-46.

50. Doetschmann Т., Eistetter H., Katz M., Schmidt W., Kemler R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood, islands and myocardium. // J. Embryol. Exp. Morphol., 1985, v. 87, p. 27-45.

51. Escary J.L., Perreau J., Dumenil D., Ezine S., Brulet P. Leukemia inhibitory factor is necessary for maintenance of haematopoietic stem cells and thymocyte stimulation. //Nature, 1993, v. 363, n. 6427, p. 361-64.

52. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. //Nature, 1981, v. 292, p. 154-58.

53. Evans M.J., Kaufman M.H. Pluripotential cells grown directly from normal mouse embryos. // Cancer Surveys, 1983, v. 2, n. 1, p. 185-207.

54. Evsikov S.V., Morozova L.M., Solomko A.P. The role of the nucleocytoplasmic ratio in development regulation of the early mouse embryo. // Development, 1990, v. 109, n. 2, p. 323-28.

55. Fedorov L.M., Haegel-Kronenberger H., Hirchenhain J. A comparison of the germline potential of differently aged ES cell lines and their transfected descendans. //Trans. Res., 1997, v. 6, p.223-31.

56. Fischbach G.D., Fischbach R.L. Stem cells: science, policy, and ethics. // J. Clin. Invest. 2004. v. 114. n. 10. p. 1364-70.

57. Fouladin—Nashta A.A., Andreu C.V., Nijjar N., Heath J.K., Kimber S.J. Role of leukemia inhibitory factor (LIF) in decasualization of murine stromal cells. // J. Endocrinology, 2004, v. 181, p. 477-92.

58. Fry R.C. The effect of Leukemia inhibitory factor (LIF) on embryogenesis. // Reprod. Fertil. Dev., 1992, v. 4, n. 4, p. 449-58.

59. Fujii J.T., Martin G.R. Incorporation of teratocarcinoma stem cells into the blastocyst by aggregation with cleavage stage mouse embryos. // Dev. Biol., 1980, v. 74, p. 239-44.

60. Hambartsoumian E. Endometrial leukemia inhibitory factor (LIF) as a possible cause of unexplained infertility and multiple failures of implantation. // Am. J. Reprod. Immunol., 1998, v. 39, n. 2, p. 137-43.

61. Hanaoka K., Kato Y., Noguchi T. Comparative study of the ability of various teratocarcinomas to form chimeric mouse embryos. // Dev. Growth Differ., 1986, v. 28, n. 3, p. 223-31.

62. Hewitson L., Takahashi D., Dominko Т., Simerly C., Schatten G. Fertilization and embryo development to blastocysts after intracytoplasmic sperm injection in the rhesus monkey. // Human Reprod., 1998, v. 13, n. 12, p. 3449-55.

63. Hochedlinger K., Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature В and T donor cells. //Nature, 2002, v. 415, p. 1035-38.

64. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy. // N. Engl. J. Medicine, 2003, v. 349, p. 275-86.

65. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear reprogramming and pluripotency. // Nature, 2006, v. 441, p. 1061-67.

66. Hogan B.L., Blessing M., Winnier G.E., Suzuki N., Jones C.M. Growth factors in development: the role of TGF-beta related polypeptide signaling molecules in embryogenesis. // Development, 1994, Suppl., p. 53-60.

67. Hsu L.W., Heath J.K. Identification of two elements involved in regulating expression of murine leukemia inhibitory factor gene. // Biochem. J., 1994, v. 302, p. 103-10.

68. Ни X., Shang K. Establishment and characterization of Six ES cell lines from mouse 129/ter strain. // Acta Scient. Nat., 1996, v. 32, n. 2, 248-53.

69. Gardner R.L. Clonally analysis of growth of the polar trophectoderm in the mouse. // Hum. Reprod., 1996, v. 11, n. 9, p. 1979-84.

70. Gardner R.L. Contribution of blastocyst micromanipulation to the study of mammalian development. // BioEssays, 1998, v. 20, p. 168-80.

71. Gardner R.L. The relationship between cell lineage and differentiation in the early mouse embryo. // Genetic mosaics and cell differentiation. / Ed. W.J. Gehring. Berlin, 1978, p. 205^12.

72. Gearing D.P., Gough N.M., King J.A., Hilton D.J., Nikola N.A., Simpson R.J., Nice E.C., Kelso A., Metcalf D. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukemia inhibitory factor (LIF). // EMBO J., 1987, v. 6, p. 3995-4002.

73. Geiger H., Sick S., Bonifer C., Muller A.M. Globin gene expression is reprogrammed in chimeras generated by injecting adult hematopoietic stem cells into mouse blastocysts. // Cell, 1998, v. 93, p. 1055-65.

74. Giles J.L., Yang X., et al. Production of chimeric rabbit fetuses using cultured rabbit ICM cells. // Biol. Reprod., 1992, v. 46, n. 51, p. 161-64.

75. Gossler A., Doetschman Т., Korn R., Serfling E., Kemler R. Transgenesis by mean of blastocyst—derived embiyonic stem cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, v. 83, n. 23, p. 9065-69.

76. Greco В., Low H.P., Johnson E.C., Salmosen R.A., Gallant J., Jones S., Ross A.H., Recht L.D. Differentiation prevents assessment of neural stem cell pluripotency after blastocyst injection. // Stem cells, 2004, v. 22, p. 600-608.

77. Guo J., Jauch A., Holtgreve-Grez H., Schoell В., Erz D., Schrank M., Janssen J.W.G. Multicolor karyotipe analyses of mouse embryonic stem cells. // In vitro Cell. Dev. Biol. Animal., 2005, v. 41, p. 278-83.

78. Johnson M.H., McConnell G., Van Blerkom J. Reprogrammed development in the mouse embryo. //j. Embryol. Exp. Morphol., 1984, v. 83, Suppl., p. 197— 231.

79. Keltz M.D., Attar E., Buradagunta S., Olive D.L., Kliman H.J., Arici A. Modulation of leukemia inhibitory factor gene expression and protein biosynthesis in the human fallopian tube. // Am. J. Obstet. Gynecol., 1996, v. 175, n. 6, p. 1611-19.

80. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. // Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1981, v. 78, p. 7634-38.

81. McLaren A. Mammalian chimaeras. // Cambridge, 1976, 180 p.

82. McLaren A. Sex determination in mammals. // Trends Genet., 1988, v. 4. p. 153-57.

83. McLaren A. The decade of the sheep. How a discredited technique led to the potential for creating new species. // Nature, 2000, v. 403, p. 479-80.

84. McMahon A.P., Bradley A. The Wnt- (int-1) protooncogene is required for development of a large region of the mouse brain. // Cell, 1990, v. 62, p. 107385.

85. Melton D.W. Gene targeting in the mouse. //Bioessays, 1994, v. 16, n. 9, p. 63338.

86. Menasche P. Embryonic stem cells pace the heart. // Nat. Biotech., 2004, v. 22, n. 10, p. 1237-38.

87. Mintz B. Gene control of mammalian differentiation. // Ann. Rev. Genet., 1974, v. 8, p. 411-70.

88. Munsie M.J., Michalska A.E., O'Brien C.M., Trounson A.O., Pera M.F., Mountford P.S. Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse somatic cell nuclei. // Curr. Biol., 2000, v. 10, p. 989-92.

89. Nachtigall M.J., Kliman H.J., Feinberg R.F., Olive D.L., Engin O., Arici A. The effect of leukemia inhibitory factor (LIF) on trophoblast differentiation: a potential role in human implantation. // J. Clin. Endocr. Metab., 1996, v. 81, n. 2, p. 801-6.

90. Nagy A., Paldi A., Dezso L., Varga L., Magyar A. Prenatal fate of parthenogenetic cells in mouse aggregation chimaeras. // Development, 1987, v. 101, p. 67-71.

91. Nagy A., Rossant J. Chimaeras and mosaics for dissecting complex mutant phenotypes. //Int. J. Dev. Biol., 2001, v. 45, p. 577-82.

92. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, p. 8424-28.

93. Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., Behringer R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. //Third edition. CSHL Press U.S., 2003.

94. Nagy A., Gocza E., Diaz E.M., Prideaux V.R., Ivanyi E., Markkula M., Rossant J. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. //Development, 1990, v. 110, p. 815-22.

95. Nichols J., Evans E.P. Smith A.G. Establishment of germ-line-competent embryonic stem (ES) cell using differentiation inhibiting activity. // Development, 1990, v. 110, n. 4, p. 1341-48.

96. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. // Cell, 1998, v. 95, n. 30, p. 379-91.

97. Nijs M., Vanderzwalmen P., Vandamme В., Segal-Bertin G., Lejeune В., Segal L., van Roosendaal E., Schoysman R. Fertilizing ability of immotilespermatozoa after intracytoplasmic sperm injection. // Hum. Reprod., 1996, v. 11, n. 10, p. 2180-85.

98. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. // Nat. Genet., 2000, v. 24, n. 4, p. 372-76.

99. Oback В., Wells D.N. Cloning cattle. // Cloning Stem Cells, 2003, v. 5, n. 4, p. 243-56.

100. Piedrahita J.A., Anderson G.B., Bon Durant R.H. On the isolation of embryonic stem cells: comparative behavior of murine, porcine and ovine embryos. // Theriogenology, 1990, v. 34, n. 5, p. 879-902.

101. Plachot M. Genetic risks associated with intracytoplasmic sperm injection. // Contracept. Fertil. Sex., 1996, v. 24, n. 7-8, p. 577-80.

102. Plachot M. The blastocyst. // Hum. Reprod., 2000, v. 15, suppl. 4, p. 49-58.

103. Pogorelov A.G., Goldshtein D.V., Pogorelova V.N. Effects of cytotoxins on intracellular Na/K balance in mouse embryonic cell. // Bull. Exp. Biol. Med., 2008, v. 145, n. 4, p. 531-34.

104. Prelle K., Vassiliev I.M., Vassilieva S.G., Wolf E., Wobus A.M. Establishment of pluripotent cell lines from vertebrate species — present status and future prospects. // Cells Tissues Organs, 1999, v. 165, n. 3-4, p. 220-36.

105. Ramirez-Solis R., Davis A.C., Bradley A. Gene targeting in embryonic stem cells. // Methods Enzymol., 1993, v. 225, p. 855-78.

106. Rappolee D.A., Sturm K.S., Behrendtsen O., Schultz G.A., Pedersen R.A., Werb Z. Insulin-like growth factor II acts through an endogenous growth pathway regulated by imprinting in early mouse embryos. // Genes Dev., 1992, v. 6, n. 6, p. 939-52.

107. Rappolee D.A., Sturm K.S., Schultz G.A., Pedersen R.A., Werb Z. Early embryo development and paracrine relationships. // Eds. Heyner S., Wiley L., Liss A.R, NY, 1990, p. 11-25.

108. Rappolee D.A., Werb Z. The role of growth factors in the mammalian pregastrulation development. // Advances in Developmental Biology / Ed. P.M. Wassarman, Greenwich, JAI Press, 1994, v. 3, p. 41—71.

109. Reya Т., Morrison S.R., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. //Nature, 2001, v. 414, p. 105-11.

110. Reubinoff B.E., Pera M.F., Fong C.-Y., Trounson A., Bongso A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. II Nat. Biotech., 2000, v. 18, p. 399-404.

111. Roberts R.M., Ealy A.D., Alexenko A.P., Han C.S., Ezashi T. Trophoblast interferons. // Placenta, 1999, v. 20, n. 4, p. 259-64.

112. Robertson E.J. Pluripotent stem cell lines as a route into the mouse germ line. // Trends Genet., 1986, v.2, p. 9-13.

113. Robertson E.J. Teratocarcinoma and Embryo-Derived Stem Cells: A Practical Approach. // IRL Press, Oxford, 1987, p. 71-112.

114. Robertson J.A. Human embryonic stem cell research: ethical and legal issues. // Nat. Rev. Genet. 2001, v. 2, n. 1, p. 74-8.

115. Rosenberger R.F. The initiation of senescence and its relationship to embryonic cell differentiation. // Bioassays, 1995, v. 17, n. 3, p. 257-60.

116. Rossant J. Immortal germ cells? // Curr. Biol., 1993, v. 3, n. 1, p. 47-9.

117. Rossant J. Stem cells from the mammalian blastocyst. // Stem cells, 2001, v. 19, p. 477-82.

118. Rossant J., Spence A. Chimeras and mosaic in mouse mutant analysis. // Trends Genet., 1998, v. 14, n. 9, p. 358-63.

119. Salamonsen L.A., Young R.J., Garcia S., Findlay J.K. Mitogenic actions of endothelia and other growth factors in ovine endometrium. // J. Endocrinology, 1997, v. 152, p. 283-90.

120. Sawai K., Matsuzaki N., Okada Т., Shimoya K., Koyama M., Azuma C., Saji F., Murata Y. Human decidual cell biosynthesis of leukemia inhibitory factor: regulation by decidual cytokines and steroid hormones. // Biol. Reprod., 1997, v. 56, n. 5, p. 1274-80.

121. Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D, Wong G.G., Moreau J., Stahl M., Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. //Nature, 1988, v. 336, p. 688-90.

122. Smith A., Metcalf D., Nicola N.A. Differentiation inhibiting activity (DIA/LIF) and mouse development. // EMBO J, 1997, v. 16, p. 451-64.

123. Snow M.H. Gastrulation in the mouse: growth and regionalization of the epiblast. // J. Embryol. Exp. Morphol., 1977, v. 42, p. 293-303.

124. Snow M.H. Autonomous development of parts isolated from primitive-streak-stage mouse embryos. Is development clonal? // J. Embryol. Exp. Morphol., 1981, v. 65, p. 269-87.

125. Snow M.H.L. Aitken J., Anselt J.D. Role of the inner ell mass in controlling implantation in the mouse. // J. Reprod. Fertil., 1976, v. 48, p. 403-4.

126. Solter D. Mammalian cloning: advances and limitations. // Nature, 2000, v. 1, p. 199-207.

127. Soriano P. Abnormal kidney development and hematological disorders in PDGF beta-receptor mutant mice. // Genes Dev., 1994, v. 8, p. 1888-96.

128. Soriano P., Montgomery C., Geske R., Bradley A. Targeted disruption of the c-src proto-oncogene leads to osteopetrosis in mice. // Cell, 1991, v. 4, p. 693702.

129. Stewart C.L. Leukemia inhibitory factor and the regulation of pre-implantation development of the mammalian embryo. // Mol. Reprod. Devel., 1994, v. 39, p. 233-38.

130. Stewart C.L. Production of chimeras between embryonic stem cells and embryos. // Meth. Enzymol., 1993, v. 225, p. 823-55.

131. Stewart C.L., Cullinan E.B. Preimplantation development of the mammalian embryo and its regulation by growth factors. // Dev. Genet., 1997, v. 21, p. 91— 101.

132. Stewart C.L., Kaspar P., Brunet L J., Bhatt H., Gadi I., Kontgen F., Abbondanzo S.J. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukaemia inhibitory factor. //Nature, 1992, v. 359, n. 6390, p. 76-9.

133. Stewart C.L., Mintz B. Successive generations of mice produced from an established culture line of emploid teratocarcinoma cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 6314-18.

134. Sugawara A., Gato K., Satomaru Y., Sofuni Т., Ito T. Current status of chromosomal abnormalities in mouse embryonic stem cell lines used in Japan. // Сотр. Med., 2006, v. 56, n. 1, p. 33-36.

135. Suzuki O., Matsuda J., Takano K., Yamamoto Y., Asano Т., Naiki M., Kusanagi M. Effect of genetic background on establishment of mouse embryonic stem cells. // Exp. Anim., 1999, v. 48, n. 3, p. 213-16.

136. Tam P.P., Snow M.N.L. Proliferation and migration of primordial germ cell during compensatory growth in mouse embryos. // J. Embryol. Exp. Morphol., 1981, v. 64, p. 133-47.

137. Tam P.P., Zhou S.X. The allocation of epiblast cells to ectodermal and germ-line lineages are influenced by the position of the cells in the gastrulating mouse embryo. // Dev. Biol., 1996, v. 178, n. 1, p. 124-32.

138. Tanaka S., Kunath Т., Hadjantonakis A.K., Nagy A, Rossant J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. // Science, 1998, v. 282, n. 5396, p. 2072-75.

139. Tanos V., Schenker J.G. Is human cloning justified? // J. Assist. Reprod. Genet., 1998, v. 15, p. 1-9.

140. Tarkowsky В., Ben-Yair E. // Dev. Biol., 1991, v. 146, p. 345-52.

141. Tesar P.J. Derivation of germ-line-competent embryonic stem cell lines from preblastocyst mouse embryos. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, v. 102, n. 23, p. 8239-44.

142. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. // Science, 1998, v. 38, p. 133-65.

143. Thomson J.A., Marshall V.S. Primate embryonic stem cells. // Curr. Top. Dev. Biol., 1998, v. 38, p. 133-65.

144. Tomida M., Yamamoto-Yamaguchi Y., Hozumi M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemia Ml cells from conditioned of mouse fibroblast L929 cells. // J. Biol. Chem., 1984, v. 259, p. 10978-82.

145. Wells D.N., Misica P.M., Day A.M., Peterson A.J., Tervit H.R. Cloning sheep from cultured embryonic cells. //Reprod. Fertil. Dev., 1998, v. 10, p. 615-26.

146. Whitten W.K. // Advan. Biosc., 1971, v. 6, p. 129-41.

147. Williams R., Hilton D., Pease S., Willson Т., Stewart C., Gearing D., Wagner E., Metcalf D., Nicola N., Gough N. Mieloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potentional of embryonic stem cells. // Nature, 1988, v. 336, p. 684-87.

148. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. // Nature, 1997, v. 385, n. 6619, p. 810-13.

149. Winslow T. The embryonic stem cell. // Stem Cells. Scientific Progress and Future Research Direction, National Inst. Health, 2001, p. 5-10.

150. Wobus A.M. Potential of embryonic stem cells. // Mol. Aspects Med., 2001, v. 22, p. 149-64.

151. Wobus A.M., Boheler K.R. Embryonic Stem Cells: Prospects for Developmental Biology and Cell Therapy. // Physiol. Rev., 2005, v. 85, p. 63578.

152. Wobus A.M., Kiessling U., Strauss M., Holzhausen H., Schoneich J. DNA transformation of the pluripotent mouse embryonic stem cell line with a dominant selective marker. // Cell. Differ., 1984, v. 15, p. 93-97.

153. Wolf D.P., Mitalipov S., Norgen R.B. Nuclear transfer technology in mammalian cloning. // Med. Res., 2001, v. 32, p. 609-13.

154. Wood S.A., Allen N.D., Rossant J., Auerbach A., Nagy A. Non-injection methods for the production of embryonic stem cell-embryo chimaeras. // Nature, 1993, v. 365, p. 87-89.

155. В первую очередь хотелось бы поблагодарить моих научных руководителей:

156. Особую благодарность хотелось бы выразить:

157. Яшину Валерию Александровичу, Яшиной Александре Валериевне, а также Смирнову Андрею Александровичу за помощь при выполнении практической части диссертации;

158. Сотрудникам лаборатории механизмов рецепции Института биофизики клетки РАН за создание не только профессиональной научной, но и благоприятной моральной атмосферы в лаборатории.

159. Хотелось бы также сердечно поблагодарить моих родных и близких:

160. Маму, Капралову Алевтину Юрьевну и папу, Капралова Владимира Васильевича бабушку, Капралову Любовь Артемьеву и дедушку, Капралова Юрия Степановича мою сестру, Капралову Марину Владимировну и ее мужа,

161. Симонова Владимира Михайловича, а также близкого друга, Капралова Алексея Вячеславовича за их огромную моральную и финансовую поддержку, благодаря которой мне представилась возможность выполнения диссертационной работы.

162. Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ № 00-04-48 135а, № 0004-55017-и ЦКП, № 05-04-49521, а также научных школ № 1842.2003.4, № 2741.2008.4.1. Февраль, 2009 г.