Влияние микробных и немикробных факторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат медицинских наук Рыжкова, Анна Ивановна

• Рыжкова, Анна Ивановна
• кандидат медицинских наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Рыжкова, Анна Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I Нейтрофилы, как одно из звеньев врожденного иммунитета (обзор литературы).

1.1 Нейтрофилы и их функции.

1.2 Нейтрофильные внеклеточные ловушки.

1.3 Влияние иммуностимуляторов на функциональный ответ нейтрофилов.

ГЛАВА II Материалы и методы исследования.

2.1 Характеристика обследованных лиц.

2.2 Получение сыворотки и плазмы крови.

2.3 Истощение сыворотки и плазмы крови по комплементу.

2.4 Истощение сыворотки и плазмы крови по специфическим иммуноглобулинам.

2.5 Получение лейкоцитарной взвеси.

2.6 Выделение нейтрофилов из периферической крови.

2.7 Методы исследования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

2.7.1 Активация нейтрофилов микроорганизмами.

2.7.2 Активация нейтрофилов иммуностимуляторами.

2.7.3 Изучение влияния сыворотки и плазмы крови на формирование НВЛ.

2.7.4 Изучение влияния комплемента на формирование НВЛ.

2.7.5 Изучение влияния специфических иммуноглобулинов на формирование НВЛ.

2.8 Обнаружение нейтрофильных внеклеточных ловушек при окраске акридиновым оранжевым, Sytox green и по Романовскому-Гимзе.

2.9 Метод статистической обработки результатов.

ГЛАВА III Влияние некоторых представителей микробной флоры (лактобактерий, бифидобактерий, кишечной палочки, стафилококка и грибов рода Candida) на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, лейковзвеси и нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.

ГЛАВА IV Влияние комплемента и специфических иммуноглобулинов сыворотки и плазмы крови на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.

ГЛАВА V Влияние иммуномодуляторов «Пирогенал», «Солкотриховак», «Интерферон» и «Циклоферон» на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние микробных и немикробных факторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови»

Нейтрофилы - клетки, представляющие одну из первых линий защиты против внедрения микробов [Kanthack A, Hardy W.B., 1895; Nathan, 2006], одни из главных клеток врожденного иммунитета и самый многочисленный вид лейкоцитов.

Более века исследователи всего мира с интересом изучают строение, физиологию нейтрофилов, биохимический состав их гранул, структуры синтезируемых ими метаболитов и роль этих клеток в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза [Бережная Н.М., 1988; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Третьякова И.Е., 2003; Федотова Г.Г., 2007; Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007; Virchow R., 1897; Lehrer R.I. et al., 1988; Pabst M.J., 1994; SmolenJ.E., 1995].

Нейтрофилы являются преобладающими клетками в остром или хроническом воспалении [Lehrer R.I. et al., 1988; Venge P. et al., 1991; Mtins G. et al., 1995]. Еще в конце XIX века было установлено, что одним из наиболее ранних проявлений процесса острого воспаления на микроскопическом уровне является феномен прилипания гранулоцитов к васкулярному эндотелию в области очага воспаления [Virchow R. 1897].

В 1908 году русский ученый И.И.Мечников получил Нобелевскую премию за открытие центральной роли фагоцитирующих клеток в неспецифической защите организма и указал на их бактерицидные свойства и способность продуцировать «секретины» [Мечников И.И., 1947].

Реализация функций фагоцитирующих клеток заключается в способности к хемотаксису, адгезии, фагоцитозу, дегрануляции, киллингу и перевариванию поглощенных частиц [Дуглас С.Д., Куи П.Г., 1983; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995; Теплова С.Н. и др., 1996; Шиффман Ф. Дж., 2000; Тотолян А.А.,

Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Теплова С.Н., Алексеев Д.А., 2002; Bainton D.F., 1995].

Нейтрофилы обладают способностью захватывать бактерии и другие частицы с помощью специфических рецепторов или без их участия, убивать захваченные микроорганизмы с использованием кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов и переваривать захваченные объекты фагоцитоза [Фрейдлин И.С., 1998]. В составе специфических гранул и лизосом нейтрофилы содержат богатый набор ферментов и факторов бактерицидности, среди которых многие могут вызывать повреждение собственных клеток и тканей организма [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001]. Инфильтрация очага иммунного воспаления нейтрофилами ведет к повреждению тканей их ферментами [Lopez A. et al., 1992; Fuchs Т.А. et al., 2007].

В дополнение к бактерицидной активности нейтрофилы способны осуществлять ряд других важных функций, таких как ограничение роста облигатных внутриклеточных патогенов, продукция многих биологически активных молекул, необходимых для регуляции различных функций клеток (компоненты комплемента, простагландины, цитокины и другие), удаление дефектных клеток и так далее [Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Андреева Ю.С., 2005].

В последнее десятилетие стала известна еще одна функция нейтрофилов. Были обоснованы представления о важной роли бактерицидных продуктов, выделяемых нейтрофилами наружу, в противомикробной защите [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001]. Кроме того, оказалось, что гранулоциты в ответ на микробные и немикробные стимулы активно выбрасывают во внеклеточное пространство сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов - нейтрофильные внеклеточные ловушки (Neutrophil Extracellular Traps, NETs, HBJI), способные задерживать и убивать микроорганизмы [Долгушин И.И., Андреева Ю.С., 2008; Brinkmann V., Reichard U., et al., 2004].

Эта кислородзависимая клеточная гибель была названа термином «NETosis» [Steinberg В.Е., Grinstein S., 2007; Von Kockritz-Blickwede M. et al., 2008].

Формирование нейтрофилами внеклеточных ловушек - важный механизм врожденного иммунного ответа, когда, погибая, нейтрофил защищает организм от инфекционных патогенов [Wartha F., Henriques-Normark В., 2008; Fuchs Т.А. et al., 2007].

Многие исследователи пристально изучают это явление, однако до сих пор четких представлений о формировании нейтрофилами внеклеточных ловушек нет.

Цель исследования

Оценить влияние представителей нормальной и условно патогенной микрофлоры слизистых оболочек гениталий и кишечника человека (Bifidobacterium bifldum, Lactobacillus spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans) и иммуномодуляторов различной природы (пирогенал, солкотриховак, циклоферон, интерферон), а также гуморальных факторов (комплемента и специфических Ig) на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови.

Задачи исследования

1. Определить влияние Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus spp., E. coli, S. aureus и С. albicans на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами в цельной гепаринизированной крови, в лейковзвеси и нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина.

2. Оценить роль плазмы, сыворотки и их компонентов (комплемента и специфических Ig) в секреции внеклеточной ДНК нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина, в системе in vitro.

3. Изучить воздействие пирогенала, солкотриховака, циклоферона и интерферона на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина.

Научная новизна

Впервые было проведено исследование образования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, лейковзвеси. При этом использовались различные методы обнаружения внеклеточно расположенной нейтрофильной ДНК: фиксированные мазки цельной крови, окрашенные по Романовскому-Гимзе, оценивались при световой иммерсионной микроскопии; фиксированные препараты выделенных нейтрофилов окрашивались раствором акридинового оранжевого или Sytox green и подвергались люминесцентной микроскопии; образцы, содержащие сывороку или плазму крови, исследовались в нативном состоянии при люминесцентной микроскопии и окраске акридиновым оранжевым. Все эти методы позволили произвести количественную оценку HBJI по отношению к другим морфологическим формам нейтрофилов (с сегментированным и с недифференцированным ядром).

На основании количественной оценки установлен дозозависимый эффект влияния различных видов микроорганизмов и биологически активных веществ на образование HBJI. Представители нормальной и условно патогенной микрофлоры слизистых оболочек гениталий и кишечника человека стимулируют образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина, но не оказывают влияния на нейтрофилы цельной гепаринизированной крови, лейкоцитарной взвеси и нейтрофилы в присутствии сыворотки или плазмы крови, независимо от концентрации микроорганизмов. При сравнительном анализе установлено, что наиболее выраженный стимулирующий эффект на формирование HBJI оказывают Candida albicans и Lactobacillus spp.

Сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в ней специфических иммуноглобулинов и комплемента, оказывают ингибирующее действие на внеклеточный выброс ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.

Иммуностимуляторы различной природы (пирогенал, солкотриховак, интерферон и циклоферон) оказывают активирующее влияние на секрецию хроматина нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Однако различные дозы иммуностимуляторов по-разному влияют на формирование НВЛ. Интерферон в высоких концентрациях ингибирует образование нейтрофильных внеклеточных ловушек Пирогенал, солкотриховак и циклоферон активнее стимулировали внеклеточный выброс нейтрофильной ДНК в концентрациях, эквивалентных разовой терапевтической дозе для каждого конкретного препарата.

На основании проведенного исследования был разработан метод оценки эффективности вакцины «Солкотриховак» [приоритетная справка «Способ оценки эффективности вакцин, участвующих в формировании мукозального иммунитета» № 2009102575 (003293) от 26.01.2009].

Практическая и теоретическая значимость

Проведенные исследования позволяют расширить представление о роли нейтрофилов, в частности их способности к образованию внеклеточных ДНК-овых сетей, в антимикробной защите организма.

Полученные результаты дают возможность оценить дозозависимый эффект и селективность секреции хроматина во внеклеточное пространство нейтрофильными гранулоцитами в ответ на стимуляцию факторами микробной и немикробной природы и обосновывают возможность использования метода определения HBJ1 для оценки иммунотропной активности различных препаратов.

Основные положения, г.ыносимые на защиту

1. Под действием представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры активируется секреция хроматина во внеклеточное пространство нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.

2. Иммуномодуляторы оказывают стимулирующий однонаправленный дозозависимый эффект на образование нейтрофилами внеклеточных ловушек, при этом максимальное влияние оказывает терапевтическая доза препаратов.

3. Аутологичная сыворотка и плазма крови блокируют выброс нитей ДНК нейтрофилами во внеклеточное пространство. Участия специфических IgG в данном процессе не выявлено. Аутологичный комплемент в присутствии сыворотки и плазмы крови не оказывает влияния на формирование HBJI, однако комплемент морской свинки дозозависимо стимулирует секрецию ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, при этом учтен эффект влияния гетерологичного белка.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований внедрены в .лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава и в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на XIII Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции» (г. Санкт-Петербург, 2009), VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург 2009), VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2009). По теме диссертации опубликовано 14 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего работы 91 отечественных и 128 иностранных авторов. Диссертация изложена на 143 страницах компьютерного текста, включает 31 таблицу и 8 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Рыжкова, Анна Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Нейтрофилы, выделенные из периферической крови человека на двойном градиенте фиколла-верографина и активированные in vitro взвесью микроорганизмов (Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans), секретируют во внеклеточное пространство ДНК. При этом самым сильным индуктором образования ловушек из изученных микроорганизмов является Candida albicans.

2. Нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, после добавления к ним гомологичной или аутологичной сыворотки (плазмы) утрачивают способность образовывать внеклеточные ловушки в ответ на стимуляцию взвесью бактерий. Нейтрофилы цельной крови и лейкоцитарной взвеси также не отвечают усилением внеклеточной секреции ДНК после инкубации со взвесью микроорганизмов.

3. Добавление к взвеси нейтрофилов прогретой при 56°С в течение 30 минут (с целью инактивации комплемента) аутологичной сыворотки или плазмы крови несколько снижает способность клеток к образованию индуцированных бактериями внеклеточных ловушек. Добавление к взвеси нейтрофилов сыворотки крови морской свинки (в качестве источника комплемента) оказывает дозозависимое стимулирующее действие на секрецию ДНК. Такая стимуляция снижается после термической денатурации комплемента.

4. Специфические IgG к С. albicans, содержащиеся в аутологичной сыворотке или плазме крови, не влияют на способность грибов стимулировать образование экстрацеллюлярных сетей нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. В то же время, опсонизация С. albicans специфическими

IgG стимулирует фагоцитарную функцию нейтрофилов по отношению к этим микроорганизмам.

5. Количество эффективных внеклеточных ловушек достоверно ниже уровня активных фагоцитов в общей популяции нейтрофилов, активированных микроорганизмами (18,41 ± 1,25 % и 23,92 ± 0,79 %, соответственно). Однако количество микроорганизмов, захваченных нейтрофильными внеклеточными ловушками, значительно выше количества микроорганизмов, поглощенных при фагоцитозе, как в перерасчете на один фагоцит или ловушку (4,15 ± 0,21 у.е. и 17,73 ± 1,22 у.е., соответственно), так и на 100 нейтрофилов (97,75 ± 3,66 у.е. и 315,58 ± 19,37 у.е., соответственно).

6. Иммуномодуляторы «Интерферон», «Циклоферон», «Пирогенал» и «Солкотриховак» стимулируют секрецию хроматина во внеклеточное пространство нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Выявлен выраженный дозозависимый эффект стимулирующего действия и концентрации препаратов.

7. Проведенное исследование позволяет предположить, что одним из механизмов действия препаратов «Интерферон», «Циклоферон», «Пирогенал» и «Солкотриховак» может являться активация врожденного иммунитета, в частности, образование нейтрофилами внеклеточных ловушек.

123

Заключение

Изучение строения, физиологии нейтрофилов, биохимического состава их гранул, структуры синтезируемых ими метаболитов и роли этих клеток в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза является одной из наиболее актуальных проблем современной иммунологии [Бережная Н.М., 1988; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Третьякова И.Е., 2003; Федотова Г.Г., 2007; Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007; Virchow R., 1897; Lehrer R.I. et al., 1988; Pabst M.J., 1994; Smolen J.E., 1995].

Нейтрофилы традиционно относят к тканевым фагоцитирующим клеткам [Пигаревский В.Е., 1982, 1992; Бережная Н.М., 1988; Бакуев М.М., 1992; Воробьев А.А., Медуницин Н.В.,1995; Маянский Д.Н. и др., 1996; Ройт А. и др., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001]. Реализация функций фагоцитирующих клеток заключается в способности к хемотаксису, адгезии, фагоцитозу, дегрануляции, киллингу и перевариванию поглощенных частиц [Дуглас С.Д., Куи П.Г., 1983; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1995; Теплова С.Н. и др., 1996; Шиффман Ф. Дж., 2000; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Теплова С.Н., Алексеев Д.А., 2002; Bainton D.F., 1995].

В последнее время показано, что на поверхности слизистых оболочек также встречается огромное количество жизнеспособных и функционально активных нейтрофилов [Долгушина В.Ф., 1991; Телешева Л.Ф. 2000, Савочкина А.Ю. 2006]. Встречаясь с представителями микробной флоры, нейтрофилы способны поглощать и разрушать микроорганизмы внутриклеточно или секретировать биологически активные вещества и уничтожать микроорганизмы во внеклеточном пространстве [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Андреева Ю.С., 2005].

Особое внимание уделяется изучению биологически активных продуктов нейтрофилов, содержащихся в их гранулах, регуляторному влиянию нейтрофилов и их медиаторов на систему мононуклеарных фагоцитов, воспалительно-репаративные ответы тканей, эритропоэз, противоопухолевую устойчивость, нейрогуморальные механизмы регуляции, стресс-резистентность организма животных и человека [Власов А.В., 1991; Зурочка А.В., 1991; Третьякова И.В., 1991; Чукичев А.В. 1996; Симбирцев А.С., 1998; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С.; 1999; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Третьякова И.В., 2003].

Нейтрофил оснащен богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды [Hoffmann J.A., Kafatos F.C. et al., 1999; Hoffmann J.A. et al., 2003; Ковальчук JI.B., Харева З.Ф., 2005; Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007]. Связывание рецепторов нейтрофила с бактериальными компонентами приводит к активации клетки. Активированный нейтрофил решает эффекторные задачи одним из двух способов: с помощью фагоцитоза или путем секреции биологически активных веществ [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].

После реализации биологической программы нейтрофилы погибают либо в очаге воспаления, либо в нормальной ткани, либо после их выделения на поверхность слизистых оболочек. Различают два варианта гибели Нф — некроз и апоптоз, которые принципиально отличаются друг от друга не только морфологически, но и влиянием продуктов, образующихся в результате этих явлений.

Недавно расшифрован еще один механизм активной гибели нейтрофилов, участвующий в их антимикробной активности. Оказалось, что нейтрофильные гранулоциты в ответ на микробные и немикробные стимулы активно выбрасывают во внеклеточное пространство сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов — нейтрофильные внеклеточные ловушки (Neutrophil Extracellular Traps, NETs, НВЛ), способные задерживать и убивать микроорганизмы [Жуков Б., 2007; Brinkmann V., Reichard U., et al., 2004]. Механизм образования HBJI схематично представлен в рисунке 2.

Первоначально нейтрофилы уплощаются и образуют многочисленные вакуоли. В этот момент ядерная мембрана начинает растворяться, но морфология органелл остается неповрежденной. (1) Позднее оболочка ядра разрушается и хроматин занимает всю клетку, гранулы растворяются, и компоненты будущей ловушки распределяются по всему объему клетки. (2) Далее клетка сокращается до тех пор, пока ее мембрана не лопнет, и быстро выбрасывает высокоактивную смесь наружу, нейтрофил погибает. (3) Попав во внеклеточное пространство, содержимое клетки формирует своеобразную сеть. (4)

Рисунок 7. Схема образования НВЛ

Активаторами для нейтрофила являются не только микробные, но и немикробные агенты (цитокины, компоненты комплемента, гистамин, различные иммуностимуляторы и другие). Возможно, нейтрофилы способны образовывать внеклеточные ловушки под воздействием немикробных факторов. Данное предположение и определило цель работы — оценить влияние представителей нормофлоры (Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans) и иммуномодуляторов различной природы (пирогенал, солкотриховак, циклоферон, интерферон), а также гуморальных факторов (комплемента и специфических Ig) на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови.

Для достижения поставленной цели было проведено исследование нейтрофильных гранулоцитов периферической крови 122 здоровых женщин 18 - 35 лет, находившихся в первой фазе менструального цикла. Группы формировались в зависимости от задачи исследования: опытная проба (цельная кровь, лейкоцитарная взвесь или нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, в присутствии активатора) и контрольная проба (цельная кровь, лейковзвесь или нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, соответственно, без активатора в присутствии физиологического раствора натрия хлорида).

Как уже упоминалось ранее, формирование HBJI индуцируется микроорганизмами. В связи с этим одной из задач нашего исследования было определить влияние Bifidobacterium bifldum, Lactobacillus spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Candida albicans на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами в цельной гепаринизированной крови, в лейковзвеси и нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина.

Прежде всего, было изучено действие различных концентраций микроорганизмов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Результаты эксперимента оценивались в сравнении с контрольными образцами неактивированных нейтрофилов. Были получены данные, что Е. coli (штамм М-17) и Lactobacillus spp. как в низких, так и в высоких концентрациях, способны стимулировать образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. При этом отмечено, что в большей концентрации микроорганизмы активнее стимулируют образование HBJI, однако значимых отличий влияния концентраций микроорганизмов 1х109/мл, 1х108/мл и 1х107/мл нами не обнаружено.

После инкубации с Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp. в о концентрации 1x10 /мл уровень нейтрофилов с сегментированным ядром достоверно снижался, а нейтрофильных внеклеточных ловушек - увеличивался. Количество нейтрофилов с недифференцированным ядром значимо не изменялось. Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209) и Candida albicans (штамм 601) значительно усиливали образование нейтрофильных внеклеточных ловушек по сравнению с контрольными образцами. При этом достоверно снижался процент нейтрофилов с сегментированным и недифференцированным ядром. Максимальное, достоверно значимое образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, происходило под влиянием Candida albicans (штамм 601).

При этом было отмечено, что процент эффективных внеклеточных ловушек превосходил процент активных фагоцитов, а количество микроорганизмов, захваченных в НВЛ, выше количества микроорганизмов, поглощенных при фагоцитозе. Таким образом, нейтрофильные внеклеточные ловушки являются более мощным антимикробным механизмом в сравнении с фагоцитозом.

Для образования НВЛ происходит подготовка к развертыванию хроматина в сеть, включающая в себя конкретные глобальные модификации гистонов, которые задерживают активацию генов и расслабляют высоко организованные структуры. Чтобы деконденсировать хроматин, необходимо ослабить взаимодействие гистонов и ДНК. Деиминация гистонов пептидиларгининдеиминазой-4 представляет собой одну из посттрансляционных модификаций, которая приводит к изменению взаимодействия гистонов с ДНК, поскольку происходит восстановление положительно заряженного аргинина до незаряженного цитруллина [Neeli I. et al., 2008]. Деиминация гистонов начинается до разрушения плазмалеммы и прекращается после освобождения ДНК.

Функции нейтрофилов регулируются агентами различной природы через мембранные рецепторы. Многообразие типов рецепторов на мембране составляет основу функциональной пластичности нейтрофилов. Полученные данные о стимулирующем влиянии представителей нормальной и условно патогенной флоры слизистых оболочек гениталий и кишечника человека на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, позволили предположить взаимосвязь механизма секреции нейтрофильной ДНК во внеклеточное пространство с активацией То11-подобных рецепторов. С эволюционной точки зрения эти рецепторы являются наиболее древними и играют центральную роль в инициации врожденного иммунного ответа на патоген. Это предположение поддерживают также существующие на сегодняшний день литературные данные об участии То11-подобных рецепторов в формировании нейтрофильных внеклеточных ловушек [Oehmcke S. et al., 2009; Ribes S. et al., 2009].

Кроме того, имеются данные, что MAC-1 -интегрин занимает центральное место в процессе преобразования цитоскелета, необходимого для релиза НВЛ [Neeli I. et al., 2009]. Интегрины являются рецепторами клеточной поверхности, которые занимают цитоплазматические области актинового цитоскелета. МАС-1-интегрин — взаимодействие и передача через цитохезин-1-путь играют центральную роль в воспалительном ответе нейтрофилов, в регуляции деиминации гистонов и освобождении нейтрофильных внеклеточных ловушек. MAC-1-интегрин имеет большое значение в распознавании объекта фагоцитоза [Ross G.D., 2000]. Таким образом, одни и те же рецепторы определяют функциональный ответ нейтрофилов — фагоцитоз или освобождение внеклеточных ловушек, исходя из этого, можно заключить, что образование НВЛ является альтернативой фагоцитозу. Будет ли нейтрофил участвовать в том или ином механизме защиты, зависит от степени его функциональной специализации. Гуаниновые факторы обмена, такие как цитохезин-1, регулируют выбор альтернативных ответов на инфекцию [Neeli I. et al., 2009].

Масштабные изменения морфологии клеток почти всегда сопровождаются участием цитоскелета. Необходимо скоординированное взаимодействие между микротрубочками и актиновыми филаментами для обеспечения надлежащего временного и пространственного контролируемого рецепторным аппаратом клетки развертывания НВЛ. Микротрубочки определяют экзоцитоз нейтрофилов [Tapper Н. et al., 2002], то есть цитоскелет контролирует выпуск хроматина. Актиновый цитоскелет участвует в разрыве ядерных и цитоплазматических мембран. HBJI релиз зависит от конкретного взаимодействия с клеточной поверхностью и сети могут быть выброшены по направлению к источнику раздражения.

Связывание рецепторов нейтрофилов с растворимыми лигандами или с поверхностью частиц приводит к развитию метаболических реакций, типичными чертами которых является быстрое увеличение потребления кислорода и утилизации глюкозы, повышение активности глюкозомонофосфатного шунта, движение протонов через мембрану, эмиссия света (хемилюминесценция), выделение тепла, усиление метаболизма липидов, белков, карбогидраз [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001]. При этом образуются первичные (супероксиданион, перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород) и вторичные (гипохлорная кислота, хлорамины, продукты перекисного окисления липидов) активные формы кислорода. АФК продуцируются в респираторном взрыве, инициируемом активацией NADPH оксидазы, который сопровождается усилением потребления молекулярного кислорода и повышенной утилизацией глюкозы [Babior В.М., 2000; Segal A.W., 2005]. Многолетние исследования метаболических процессов, лежащих в основе респираторного взрыва, показали ключевую роль NADPH-оксидазы, которая осуществляет транспорт электронов от NADPH-цитозоля к молекулярному кислороду [Densen P. et al., 1995]

Исследования ряда авторов показали, что формирование НВЛ зависит от образования активных форм кислорода (АФК) с участием NADPH-оксидазы фагосомальной мембраны [Fang F.C., 2004; Segal A.W., 2005; Fuchs Т.А. et al., 2007; Ermert D. et al., 2009], без этого фермента нейтрофилы не способны выделять хроматин из ядер. Респираторный взрыв находится под строгим контролем клеточных сигнальных систем, потому что избыточная продукция АФК является повреждающим фактором для клеток организма-хозяина. NADPH-оксидаза активируется как посредством рецептор-зависимого механизма, так и рецептор-независимого. Активация NADPH-оксидазы требует фосфорилирование белков и транслокации цитозольных компонентов к плазматической мембране [El-Benna J. et al., 2005].

Следующим этапом нашего исследования стало изучение образования внеклеточных ловушек нейтрофильными гранулоцитами цельной гепаринизированной венозной крови и лейкоцитарной взвеси под влиянием представителей нормальной и условно патогенной микрофлоры слизистых оболочек гениталий и кишечника человека. Для опыта 1 мл цельной гепаринизированной крови инкубировался с 0,1 мл взвеси Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Candida albicans (штамм 601) в различных концентрациях и их смеси в течение 30 минут при 37°С. Для контроля использовали гепаринизированную кровь, инкубированную при тех же условиях, но без активатора. Затем готовились гематологические мазки, высушивались, фиксировались 96% этиловым спиртом и окрашивались по методу Романовского-Гимзе. Учет проводили при иммерсионной световой микроскопии х100х10х2. При этом уровень нейтрофилов с сегментированным ядром, недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек в опытных пробах, активированных микроорганизмами, не отличался от уровня морфологических форм нейтрофилов контрольных образцов.

Изучение влияния микроорганизмов на секрецию хроматина нейтрофильными гранулоцитами лейкоцитарной взвеси проводили по отношению к Candida albicans (штамм 601), как представителю микрофлоры, максимально активирующему формирование НВЛ. В опыте мы использовали различные концентрации микроорганизма: 1х109/мл, 1х108/мл и 1х107/мл. В 1 мл лейковзвеси вносили по 0,1 мл взвеси микробных клеток в каждой концентрации, для контроля — лейковзвесь без активатора. После 30-ти минутной инкубации при 37 С препараты окрашивались 0,04% раствором акридинового оранжевого и оценивались при люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. Соотношение морфологических форм нейтрофилов достоверно не отличалось ни в одной пробе, независимо от концентрации С. albicans (штамм 601).

Таким образом, Candida albicans (штамм 601), S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм M-17), Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp., независимо от концентрации, не влияли на секрецию хроматина нейтрофильными гранулоцитами цельной гепаринизированной крови и лейкоцитарной взвеси.

Это позволило предположить, что имеются гуморальные факторы, блокирующие образование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Поэтому следующим этапом нашей работы стало изучение роли плазмы, сыворотки и их компонентов (комплемента и специфических Ig) в секреции внеклеточной ДНК нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина, в системе in vitro.

Для постановки опыта нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, активировали взвесью Candida albicans (штамм 601) в присутствии сыворотки или плазмы крови. В ряде опытов нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, активировали взвесью Candida albicans (штамм 601) в присутствии прогретой при 56°С в течение 30 минут (для инактивации естественного комплемента) сыворотки или плазмы аутологичной крови. Для оценки влияния специфических иммуноглобулинов сыворотки и плазмы, использовали кровь лиц с подтвержденным повышенным содержанием антител класса IgG к С. albicans, которое устанавливалось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (Кандида-^О-ИФА-БЕСТ, г.Новосибирск-117). Истощенную по специфическим иммуноглобулинам аутологичную сыворотку или плазму крови добавляли к взвеси нейтрофилов и в присутствии С. albicans инкубировали 30 минут при 37°С. Мы использовали несколько контролей: нейтрофилы в присутствии физиологического раствора, нейтрофилы в присутствии Candida albicans (штамм 601) и нейтрофилы в присутствии сыворотки или плазмы крови, в соответствии с исследованием. Все пробы инкубировали в одинаковых условиях - при 37°С в течение 30 минут. Затем нативные препараты окрашивали 0,04% раствором акридинового оранжевого в течение 5 минут и производили оценку в люминесцентном микроскопе, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм.

Следующим этапом нашего исследования стало изучение влияния комплемента, содержащегося в сыворотке крови морской свинки (она частично используется в качестве источника комплемента), на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Для этого мы использовали препарат сухой комплемент (ФГУП «НПО „Микроген"», г.Пермь). Дозу препарата подбирали, учитывая нормальные значения активности комплемента в организме человека, в перерасчете на 1 миллилитр клеточной взвеси. Для эксперимента 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, инкубировали в присутствии 1 мл комплемента в различных концентрациях при 37°С в течение 30 минут. Для контроля взвесь клеток инкубировали в тех же условиях, но без активатора. Затем материал наносили на предметное стекло, высушивали, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали рабочим раствором Sytox green. При люминесцентной микроскопии производили подсчет клеток с сегментированным ядром, с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек. Для подтверждения влияния комплемента на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, препарат инактивировали прогреванием на водяной бане при 56°С в течение 30 минут [Мирахмедов У.М., Резникова JI.C., 1975], а затем использовали в опыте в максимальной тестируемой концентрации. В качестве контроля клеточную взвесь инкубировали в тех же условиях (при 37°С в течение 30 минут) в присутствии непрогретого комплемента морских свинок и без активаторов.

В результате проведенных исследований, было установлено, что сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов и комплемента, ингибировали образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Однако установлено стимулирующее дозозависимое влияние чистого комплемента (ФГУП «НПО „Микроген"», г.Пермь) на секрецию нейтрофильной ДНК. Роли опсонизации микроорганизмов специфическими иммуноглобулинами в формировании НВЛ не выявлено, в то же время, очевидно стимулирующее влияние опсонинов на фагоцитарную активность нейтрофилов. Таким образом, рецепторы FcyR к Fc-фрагменту IgG и CR к компонентам комплемента, играющие ведущую роль в фагоцитозе [Маянский А.Н., Галлиулин А.Н., 1984; Фрейдлин И.С., 1998], оказывают, по-видимому, разное влияние на процесс секреции нейтрофильной ДНК во внеклеточное пространство. С другой стороны, комплемент является внеклеточным лигандом для МАС-1-интегрина [Ross G.D., 2000], участие которого в процессе перицеллюлярной экструзии нейтрофильной ДНК в настоящее время доказано [Neeli I. et al., 2009]. Возможно, именно на уровне рецеиторной передачи сигнала происходит модификация функционального поведения нейтрофилов.

Кроме того, установлено, что в сыворотке и плазме крови имеются факторы, блокирующие образование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Вероятно, в этом заключен огромный биологический смысл - образование нейтрофильных внеклеточных ловушек не должно происходить в кровяном русле. Это не противоречит данным других исследователей о формировании HBJI в печеночных синусах, но только в условиях выраженной эндотоксемии [Clark S.R. et al., 2007]. В тоже время, в литературе появляются данные, что HBJI могут инициировать развитие патологических состояний, таких как аутоиммунные заболевания [Zhong X.-Y. et al., 2007; Baker V.S. et al., 2008; Neeli I. et al., 2008; Margraf S. et al., 2008].

T. Logters и соавторы описали патогенез аутоиммунных, сердечнососудистых и других заболеваний с вовлечением HBJI [Logters Т. et al., 2009]. Инфекционное заболевание, сопровождающееся повреждением эндотелия, например, стрептококковая пневмония, приводит к активации тромбоцитов бактериями, а также миграции Нф к очагу инфекции. Затем происходит адгезия Нф к эндотелию и трансмиграция через эндотелиальный барьер. Патогены фагоцитируются, кроме того происходит дополнительная стимуляция Нф при контакте с активированными тромбоцитами через TLR-4. После этой гиперстимуляции происходит экструзия НВЛ в межклеточное пространство, в том числе и в просвет кровеносных сосудов, где захватываются не только микроорганизмы, но и клетки крови. Выделенные нейтрофилами нуклеиновые кислоты в сочетании с цитоплазматическими эффекторными белками усиливают провоспалительные сигналы и хемоаттрактацию к очагу инфекции. Увеличивающееся количество клеток крови в сетях приводит к последовательной акклюзии сосудов и, следовательно, к нарушению микроциркуляции в тканях. Кроме того, иммунокомпетентные клетки, такие как профессиональные антиген-презентирующие клетки (дендритные), Т- и В-лимфоциты вместе с тромбоцитами и эритроцитами оказываются плотно окутанными собственными антигенами и выделенными нейтрофильными протеинами, такими как эластаза, МПО и другие, которые локализованы на ДНК. В совокупности этот сценарий может функционировать как инкубатор иммунной презентации, когда В-лимфоциты стимулируются не только против патогенных антигенов, но и происходит перекрестная реакция с собственными антигенами против нуклеиновых кислот или цитоплазматических молекул.

В целом, понимание того, что НВЛ, с одной стороны, могут функционировать как эффективный антимикробный механизм, а с другой — приводить к гемодинамическим расстройствам при неполноценности противодействующих механизмов регуляции, открывает новое направление в исследовании нейтрофилов в норме и при патологии.

Следующей задачей стала оценка воздействия иммуномодуляторов различной природы (пирогенал, солкотриховак, циклоферон и интерферон) на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Для оценки влияния этих препаратов на формирование НВЛ in vitro, нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, инкубировали 30 минут при 37°С в присутствии различных концентраций тестируемых препаратов. Для контроля гранулоциты инкубировали в тех же условиях, но без активатора.

Интерферон человеческий лейкоцитарный (интерферон альфа) (ФГУП «НПО „Микроген"», г.Пермь) — препарат для местного применения на слизистые оболочки полости носа и рта, поэтому было невозможно точно произвести перерасчет разовой терапевтической дозы на 1 мл клеточной взвеси. Исходя из этого, препарат тестировался в широком диапазоне концентраций: 500 ME на 1 миллилитр взвеси нейтрофилов, 50 МЕ/мл, 5 МЕ/мл, 0,5 МЕ/мл, 0,05 МЕ/мл, 0,005 МЕ/мл и 0,0005 МЕ/мл. Выбранные нами иммуномодуляторы - «Циклоферон» (ООО «НТФФ „ПОЛИСАН"», г.Санкт

Петербург), «Пирогенал» (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи / Медгамал, Россия) и «Солкотриховак» (SOLCO BASEL AG, Швейцария), - имеют точную, описанную в инструкции по применению, дозировку для парентерального применения, поэтому тестируемые концентрации подбирались в соответствии с разовой терапевтической дозой для конкретного препарата, в перерасчете на 1 миллилитр взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина.

Полученные данные свидетельствовали об активирующем влиянии всех тестируемых иммуностимуляторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. При этом отмечалась выраженная зависимость биологического эффекта препарата от его используемой дозы. Это очень ярко было видно на результатах опыта с препаратом «Интерферон альфа» — в максимальной тестируемой концентрации данный иммуностимулятор оказывал ингибирующее действие на секрецию нейтрофильной ДНК, в то время как влияние средней исследуемой дозы препарата являлось стимулирующим на образование НВЛ. Подобный эффект наблюдался под влиянием «Пирогенала», «Солкотриховака» и «Циклоферона» — в концентрации, рассчитанной для каждого конкретного препарата эквивалентно разовой терапевтической дозе, препараты максимально стимулировали формирование НВЛ нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Рыжкова, Анна Ивановна, 2010 год

1. Азов, Н.А. Механизмы опосредованной реактивности нейтрофила пептидогликану Escherichia coli / Н.А.Азов, А.Н.Маянский // Журн. микробиологии, эпидемиологии, иммунологии. — 1985. — №10. — С. 66— 69.

2. Албертс, Б. Молекулярная биология клетки: в 3 т.: пер. с англ. / Б.Албертс, Д.Брей, Дж.Льюис и др. 2 изд. - М.: Мир, 1994.

3. Алексеев, Н.А. Клинические аспекты лейкопении, нейтропении и функциональных нарушений нейтрофилов / Н.А.Алексеев. СПб.: Фолиант, 2002.-416с.

4. Андреева, Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин: дис. канд. мед. наук /Ю.С.Андреева. Челябинск, 2005. — 150 с.

5. Бакуев, М.М. Особенности секреции миелопероксидазы и хемилюминесцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы / М.М.Баку ев, М.З.Саидов // Иммунология. 1991. - Вып. 1. - С. 15-18.

6. Барышников, А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин. М.: Эдиториал УРСС, 2002. - 318 с.

7. Бахов, Н.И. Концепция апоптоза / Н.И.Бахов, Ю.Ф.Майчук, А.В.Корнев // Иммунология. 1997. - №3. - С.62-64.

8. Белушкина, Н.Н. Молекулярные основы патологии апоптоза / Н.Н. Белушкина, С.Е.Северин // Архив патологии. 2001. - № 1. - С. 51-60.

9. Бережная, Н.М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз / Н.М. Бережная. Киев.: Наук, думка, 1988. - 189с.

10. П.Боровиков, В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов (+CD). / В.П. Боровиков. СПб.: Питер, 2003. - 688с.

11. Галкина, О.В. Клинико-иммунологическая эффективность местного применения циклоферон-линимента в терапии вагинальных инфекций / О.В.Галкина // Иммунология. 1998. - № 6. - С.37-38.

12. З.Гамалей, И.А. Перекись водорода как сигнальная молекула / И.А.Гамалей, И.В.Клюбин//Цитология. 1996. -Т.38, №12. - С.1233 - 1248.

13. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С.Гланц. М.: Практика, 1999.-450с.

14. Гублер, Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях / Е.В.Гублер, А.А.Генкин. М.: Медицина, 1973. - 141 с.

15. Добротина, Н.А. Лизоцим как модулятор иммунологических реакций / Н.А. Добротина, Ж.А. Казацкая, Г.А. Емельянова // Вопр. мед. химии. 1984. - Т. 33, Вып.4. - С. 66-69.

16. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин. -Екатеринбург: Изд-во УрОРАН, 2001. 256с.

17. Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина. М.: Издательство РАМН, 2009. - 208с.

18. Долгушин, И.И. Регуляторные пептиды нейтрофилов (нейтрофилокины) / И.И.Долгушин, А.В.Зурочка, А.В.Чукичев // Иммунология. 1995. - № 4. -С. 40-45.

19. Долгушин, И.И. Способ обнаружения НВЛ: патент РФ на изобретение / И.И.Долгушин, Ю.С.Андреева. № 2384844 от 0.04.2008

20. Дубинина, Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состоянии окислительного стресса / Е.Е.Дубинина //Вопр. мед. химии. 2001. - Т.47, №6. - С.561-580

21. Дуглас, С.Д. Исследование фагоцитоза в клинической практике / С.Д. Дуглас, П.Г. Куи. -М.: Медицина, 1983. 112с.

22. Дьяконова, В. А. Оценка функциональной активности фагоцитарной системы человека в норме и при патологии / В.А.Дьяконова, В.Г. Пак, А.С. Будихина. М.: Изд-во Интел универсал, 2008. — 50с.

23. Егорова, А.Б. Повреждение цитоскелета и клеточных мембран при апоптозе / А.Б.Егорова, Ю.А.Успенская, С.В. Михуткина // Успехи соврем, биологии. -2001.-Т. 121, №5.-С. 502-510.

24. Егорова, И.Ф. Апоптоз и некроз: взаимоотношение явлений / И.Ф. Егорова, Р.А. Серов // Морфология. 2004. - Т. 126, № 6. - С.71-75.

25. Ермоленко, Д.К. Урогенитальный трихомониаз: пособие для врачей / Д.К.Ермоленко, В.А.Исаков, С.Б.Рыбалкин и др. СПб.; Великий Новгород: Б.и., 2007. - 96 с.

26. Ершов, Ф.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств) / Ф.И.Ершов, О.И.Киселев. М.: ГЭОТАР - Медиа, 2005. - 368с.

27. Жижина, Г.П. Роль апоптоза в нормальном онтогенезе, патогенезе и старении / Г.П. Жижина // Клинич. геронтология. 2002. - Т.8, № 4. - С. 310.

28. Жуков, Б. Система, которой не может быть / Б. Жуков // Что нового в науке и технике. 2007. - № 5. - С. 76-81.

29. Зеленин, А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой / А.В.Зеленин. М.: Наука, 1971. - 231с.

30. Иммунологические методы / под ред. Г.М.Фримеля. М.: Медицина, 1987. -472с.

31. Иммунологические методы исследования: учеб. пособие / под ред. Е.А. Олейникова, Л.Я. Эберта. Саранск: Мордовский гос. ун-т, 1981. - 92 с.

32. Исаков, В.А. Герпесвирусная инфекция. Эффективность циклоферона при различных клинических формах / В.А. Исаков, М.Г. Романцов //

33. Циклоферон от эксперимента в клинику. Применение лекарственных форм циклоферона: сб. - СПб., 2002. - С. 64-74.

34. Использование циклоферона в комплексной терапии хронических воспалительных заболеваний половой системы у мужчин: метод, пособие для врачей / под ред. И.И.Долгушина, О.Р.Зиганшина. Челябинск, 2004. -40с.

35. Кетлинский, С.А. Эндогенные иммуномодуляторы / С.А.Кетлинский, А.С. Симбирцев, А.А.Воробьев. СПб.: Гиппократ, 1992,- 256с.

36. Кира, Е.Ф. Бактериальный вагиноз / Е.Ф. Кира. СПб.: Нева-Люкс, 2001. -363с.

37. Кислюк, Н.С. Клетки крови у детей в норме и патологии / Н.С.Кислюк, Р.В.Ленская. М.: Медицина, 1978. - 256 с.

38. Клебанов, Г.И. Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов / Г.И.Клебанов, Ю.А.Владимиров // Успехи совр. биол. 1999. - ТЛ19, №5. -С.462- 475.

39. Ковальчук, Л.В. Врожденные компоненты иммунитета: То11-подобные рецепторы в норме и при иммунопатологии / Л.В. Ковальчук, М.В. Хорева,

40. A.С.Варивода // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. - № 4. - С. 96-104.

41. Ковальчук, Л.В. Роль оксида азота в иммунопатогенезе стафилококковых инфекций / Л.В. Ковальчук, З.Ф. Хараева // Иммунология. 2003. - № 3. — С. 186-189.

42. Кокряков, В.Н. Катионные противомикробные пептиды как молекулярные факторы иммунитета: мультифункциональность / В.Н. Кокряков, Л.В. Ковальчук, Г.М. Алешина и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - № 2. - С. 98 - 105.

43. Лазарева, Д.Н. Стимуляторы иммунитета / Д.Н.Лазарева, Е.К.Алехин. М.: Медицина, 1985. - 256с.

44. Линимент циклоферона в практической медицине: метод, рек. / под ред.

45. B.А.Исакова. СПб.: Б.и., 2003. - 40 с.

46. Лукьянова, Л. Д. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние / Л.Д.Лукьянова, Б.С.Балмуханов, А.Т.Уголев. -М.: Наука, 1982. С. 298.

47. Лызлова, С.Н. Лизосомальные белки нейтрофилов — факторы антимикробной защиты клеток / С.Н.Лызлова // Вопр. мед. химии. 1987. — Т.ЗЗ, Вып.5. - С.43-48.

48. Масычева, В.И. Создание средств стимуляции системы неспецифической резистентности / В.И. Масычева, Е.Д. Даниленко, Н.М. Пустошилова, В.А. Белявская //Вестник Рос. АМН. 1998. - № 4. - С. 13-17.

49. Маянский, А.Н. Апоптоз: начало будущего / А.Н. Маянский, Н.А. Маянский, М.А. Абаджидия и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. - № 2. - С. 88 -94.

50. Маянский, А.Н. НАДФН оксидаза нейтрофилов: активация и регуляция / А.Н. Маянский // Цитокины и воспаление. - 2007. - Т.6, № 3. - С. 3-13.

51. Маянский, А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск: Наука, 1989. - 254 с.

52. Маянский, А.Н. Реактивность нейтрофила / А.Н. Маянский, А.Н. Галиуллин. Казань: Изд-во Казан, ун-та, 1984. - 158 с.

53. Маянский, Д.Н. Об оценке функций нейтрофилов человека по их реакции на бактерийный стимул / Д.Н. Маянский, Э.Г. Щербакова // Антибиотики. — 1983. Т.28, № 7. - С. 521-526.

54. Мечников, И.И. Невосприимчивость в инфекционных болезнях / И.И. Мечников. М., Медицина, 1947. - 698 с.

55. Мирзабаева, А.К. Эффективность циклоферона при генитальном кандидозе / А.К. Мирзабаева, Ю.В. Долго-Сабурова // Циклоферон от эксперимента в клинику. Применение лекарственных форм циклоферона: сб. - СПб., 2002. -С.188-193.

56. Морозова, Ю.В. Циклоферон в терапии больных астраханской риккетсиозной лихорадкой / Ю.В.Морозова, Х.М.Галимзянов, А.Л.Коваленко и др. // Циклоферон от эксперимента в клинику. Применение лекарственных форм циклоферона: сб. - СПб., 2002. — С. 149153.

57. Нестеров, И.М. Иммунокорригирующая терапия инфекционно-воспалительных заболеваний женской половой сферы / И.М.Нестеров, А.А.Тотолян; под ред. Э.К.Айламазяна. СПб.: Б.и., 2007. - 56 с.

58. Никанкина, Л.В. Различия в активности НАДФ-оксидазы лейкоцитов новорожденных и взрослых доноров / Л.В. Никанкина, Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская и др. // Иммунология. 2001. - № 4. - С. 29-32.

59. Осипов, А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи биол. химии. 1990. - № 31.-С. 180-208.

60. Основы физиологии человека / под ред. Б.И.Ткаченко. М.: Литера, 1998. -Т.З. - 474с.

61. Пигаревский, В.Е. О секреторной активности полиморфноядерных лейкоцитов / В.Е.Пигаревский // Арх. патологии. 1982. - Т.44, № 5. - С.З-12.

62. Пинегин, Б.В. Нейтрофилы: структура и функция / Б.В. Пинегин, А.Н. Маянский // Иммунология. 2007. - Т. 28, № 6. - С. 374-382.

63. Плехова, Н.Г. Бактерицидная активность фагоцитов / Н.Г.Плехова // Журн. микробиологии, эпидемиологии, иммунологии. 2006. - №6. - С.89-96.

64. Постнова, Н.В. Оценка эффективности применения препарата линимента циклоферона в комплексной терапии пародонта: автореф. дис. . канд. мед. наук / Н.В. Постнова. М., 2007. - 22 с.

65. Роговин, В.В. Антимикробные белки и пептиды нейтрофильных лейкоцитов / В.В. Роговин, Р.А. Муравьев // Известия РАН. Сер. биол. 1992. - № 6. -С. 854-859.

66. Ройт, А. Иммунология: пер. с англ. / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000.-581с.

67. Рыбалкин, С.Б. Альтернативные подходы к терапии урогенитальных заболеваний с целью сохранения репродуктивного здоровья: метод, рек. для врачей-клиницистов / С.Б.Рыбалкин, А.К.Мирзобаева. СПб., 2000. - 45с.

68. Савочкина, А.Ю. Иммунологические показатели в диагностике хронического цервицита и при его сочетании с хроническим эндометритом: дис. . канд. мед. наук / А.Ю. Савочкина. Челябинск, 2006. - 148 с.

69. Семенов, Б.Ф. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов / Б.Ф.Семенов, В.В.Зверев // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. - № 4. - С. 93-100.

70. Сибиряк, С.В. Апоптоз и иммунная система / С.В. Сибиряк, О.М. Капулер, Н.Н. Курчатова // Мед. вестн. Башкортостана. 2006. - Т.1, № 1. — С. 127133.

71. Симбирцев, А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета / А.С. Симбирцев // Иммунология. 2005. - № 6. - С. 368-377.

72. Телешева, Л.Ф. Иммунологические факторы секретов репродуктивного тракта женщин: автореф. дис. . д-ра мед. наук / Л.Ф.Телешева. Челябинск, 2000.-41с.

73. Телешева, Л.Ф. Механизмы противоинфекционной защиты репродуктивного тракта женщин / Л.Ф. Телешева, В.Ф. Долгушина, И.И. Долгушин // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1998.-№4.-С. 85-90.

74. Теплова, С.Н. Новые технологии исследования фагоцитирующих клеток / С.Н. Теплова, Е.А. Чухарева, Л.И. Крюкова и др. // Новые технологии в медицине: тр. науч. конф. 13-17 мая 1996г. Трехгорный,1996. - С. 84-86.

75. Теплова, С.Н. Секреторный иммунитет / С.Н. Теплова, Д. А. Алексеев. -Челябинск, 2002. 200с.

76. Тотолян, А.А. Клетки иммунной системы / А.А.Тотолян, И.С.Фрейдлин. -М.: Наука, 2000.-231с.

77. Третьякова, И.Е. Регуляторная функция нейтрофилов в норме и в условиях механической травмы: дис. . канд. мед. наук / И.Е.Третьякова. Челябинск, 1991.-147с.

78. Третьякова, И.Е. Роль секреторных продуктов нейтрофилов в регуляции локальных реакций воспаления и иммунитета: дис. . д-ра мед. наук / И.Е. Третьякова. Челябинск, 2003. - 320 с.

79. Федотов, В.П. Дифференцированная иммунокоррекция с использованием препаратов циклоферона в терапии больных дерматозами и инфекциями, передающимися половым путем: метод, рек. / В.П.Федотов. — Днепропетровск: Б.и., 2001. 44с.

80. Федотова, Г.Г. Морфофункциональное исследование нейтрофилов в условиях эндотоксикоза: автореф. дис. . д-ра биол. наук / Г.Г. Федотова. — Саранск, 2007. 39с.

81. Фильченков, А.А. Апоптоз и рак / А.А. Фильченков, Р.С.Стойка. К.: Морион, 1999. - 184с.

82. Фрейдлин, И.С. Иммунная система и ее дефекты: руководство для врачей / И.С.Фрейдлин. СПб.: НТФФ «Полисан», 1998. - 113с.

83. Хаитов, P.M. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин // Иммунология. 1995.- № 4. С. 3-8.

84. Черний, В.И. Нарушения иммунитета при критических состояниях. Особенности диагностики Электронный ресурс. / В.И.Черний, А.Н.Нестеренко // Внутренняя медицина. 2007. - №3. - Режим доступа: http://internal.mif-ua.com/archive/issue-178/article-414/

85. Шиффман, Ф.Дж. Патофизиология крови / Ф.Дж.Шиффман. СПб.: Невский диалект, 2000. — 448с.

86. Якубович, А.И. Урогенитальный хламидиоз / А.И.Якубович, А.Р.Корепанов. Иркутск: Полиграфический центр «РИЭЛ», 2007. - 108 с.

87. Янковский, О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы / О.Ю. Янковский. СПб.: Игра, 2000. - 294 с.

88. Ярилин, А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах / А.А.Ярилин // Иммунология. 1996. - № 6. - С.10-23.

89. Anderson, D.C. The severe and moderate phenotypes of heritable Macl, LFA-1 deficiency: Their quantitative definition and relation to leukocyte dysfunction, and clinical features / D.C. Anderson // Infect, dis. 1985. - Vol.152. - P.668.

90. Arends, MJ. Apoptosis: Mechanisms and roles in patology / M.J.Arends, A.H. Wyllie //Int. Arch. Patol. 1992. - Vol.32. - P. 223-226.

91. Babior, B.M. Production, distribution and fate of neutrophils / B.M.Babior, D.W.Gold, B.M.Babior, D.W.Gold // Williams Hematology. 5th ed. - 1995. - P. 773-779.

92. Babior, B.M. Phagocytes and oxidative stress / B.M.Babior // Am. J. Med. -2000. Vol.109. - P.33-44.

93. Baggiolini, M. Exocytosis by neutrophils / M. Baggiolini, B. Dewald // Regulat. Leukocyte Funct. 1984. - Vol.64, № 5. - P. 959-966.

94. Bainton, D.F. Morphology of neutrophils, eosinophils and basophils / D.F. Bainton // Williams Hematology. 5th ed. - 1995. - P. 753-765.

95. Baker, V.S. Cytokine-associated neutrophil extracellular traps and antinuclear antibodies in Plasmodium falciparum infected children under six years of age / V.S.Baker, G.E.Imade, N.B.Molta et all. // Malar. J. 2008. - №7. - P.41.

96. Bals, R. Innate immunity in the lung: how epithelial cells fight against respiratory pathogens / R.Bals, P.S.Hiemstra // Eur. Resp. J. 2004. - Vol.23, №2. - P.327-333

97. Bauer, G. Reactive oxygen and nitrogen species: Efficient, selective, and interactive signals during intercellular induction of apoptosis / G.Bauer //Anticancer Res. -2000. Vol.20. - P. 4115-4139.

98. Beckman, J.S. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implication for endothelial injury from nitric oxide and superoxide / J.S.Beckman, T.W.Beckman, J.Chen, et al. // Proc. Natl Acad Sci USA. 1990. - Vol.87. -P. 1620-1624.

99. Beiter, K. An endonuclease allows Streptococcus pneumoniae to escape from neutrophil extracellular traps / K.Beiter, F.Wartha, B.Albiger et al. // Curr. Biol. 2006. - Vol.16. - P. 401-407.

100. Bevilacqua, M.P. Endothelial cell-leukocyte adhesion molecules / M.P. Bevilacqua // Annu. Rev. Immunol. 1993. - Vol. 11. - P. 767-773.

101. Bianchi, M. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis / M.Bianchi, A.Hakkim, V.Brinkmann et al. // Blood. 2009. -Vol.114, №13. - P.2619-2622.

102. Blasi, F. UPAR: a versatile signaling orchestrator / F.Blasi, P.Carmeliet // Natur Molecular Cell Biology. 2002. - Vol.3, №12. - P.932-943.

103. Borregaard, N. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte / N.Borregaard, J.Cowland // Blood. 1997. - Vol. 89, № 10. - P. 3503-3521.

104. Brinkmann, V. Beneficial suicide: why neutrophils die to, make NETs / V.Brinkmann, A.Zychlinsky // Nature Rev. 2007. - Vol. 5. - P. 577-582.

105. Brinkmann, V. Neutrophil extracelllulartraps kill bacteria / V. Brinkmann, U.Rechard, C.Goosmann et al. // Science. 2004. - Vol.303. - P. 1532-1535.

106. Brown, G.E. A novel assay system implicates Ptdlns (3, 4) P (2), Ptdlns (3) P, and PKC5 in intracellular production of reactive oxygen species by the NADPH-oxidase / G.E.Brown, M.Q.Stewart, H.Liu et al. // Mol Cell. 2003. -№11. - P.35-47

107. Buchanan, J.T. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps / J.T.Buchanan, A.J.Simpson, R.K.Aziz et al. // Curr. Biol. 2006. - Vol.16. - P.396-400.

108. Cassatella, M.A. The production of cytokines by polymorphonuclear neutrophils / M.A.Cassatella // Immunol Today. 1995. - Vol.16, №1. - P.21-26

109. Clark, S.R. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood / S.R.Clark, A.C.Ma, S.A.Tavener, et al. // Nat Med. 2007. - Vol.13, №4. - P.463-469.

110. Cohen, M.S. Fagocytes, 02 reduction and hydroxyl radical / M.S.Cohen, B.E. Britigan, D.J. Hasselt et al. // Rev. Infect. Dis. 1988. - Vol. 10. - P. 1088.

111. Densen, P. Granulocytic phagocytes / P.Densen, W.R.Clark, W.M. Nauseff // Infectious Diseases. 5 th ed. - 1995. - P.78 -101.

112. El-Benna, J. Phagocyte NADPH oxidase: a multicomponent enzyme essential for host defenses / J.El-Benna, P.M.Dang, M.A.Gougerot-Pocidalo, C. Elbim // Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2005. - Vol.53. - P. 199-206.

113. Ermert, D. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections / D. Ermert, C.F.Urban, B.Laube, C.Goosmannb, A.Zychlinsky, V.Brinkmann // J. Innate Immun. 2009. - №1. - P.l81-193

114. Fadeel, B. Babies born without safety NET / B.Fadeel // Blood. 2009. -Vol.l 13. - P.6270-6271.

115. Fadeel, B. Involvement of caspases in neutrophil apoptosis: regulation by reactive oxygen species / B.Fadeel, A.Ahlin, J.I.Henter et al. // Blood. 1998. -Vol.92.-P.4808-4818.

116. Fang, F.C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies / F.C.Fang // Nat. Rev. Microbiol. 2004. - Vol.2, №10. -P.820-832

117. Folkerts, G. Reactive nitrogen and oxygen species in airway inflammation / G.Folkerts, J.Klock, R.B.R.Muijsers, F.P.Nijkamp // Eur. J. Pharmacol. 2001. -Vol.429. - P.251-262

118. Fuchs, T.A. Novel cells death program leads to neutrophil extracelllular traps / T.A. Fuches, U. Abed, C. Goosmann et al. // J. Cell Biol. 2007. - Vol. 176, № 2. - P.231-241.

119. Gold, D.W. Hormones that stimulate the growth of blood cells / D.W.Gold, J.C.Gasson // Sci. Am. 1988. - Vol.259. - P.62-66.

120. Gordon, S. Pattern recognition receptors: doubling up for the innate immune response / S. Gordon // Cell. 2002. - Vol.l 11. - P. 927-930.

121. Guimaraes-Costa, A.B. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps / A.B.Guimaraes-Costa, M.Nascimento, G.Froment, R.Soares et all. // PNAS. 2009. - Vol.106, №16. - P. 6748-6753

122. Gupta, A.K. Induction of neutrophil extracellular DNA lattices by placental microparticles and IL-8 and their presence in preeclampsia / A.K.Gupta, P.Hasler, W.Holzgreve, S.Gebhardt, S.Hahn. // Hum. Immunol. 2005. - Vol.66. -P.l 146-1154.

123. Hampton, M.B. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing / M.B.Hampton, A.J.Kettle, C.C.Winterbourn // Blood. 1998. - Vol. 92. - P.3007-3017.

124. Heine, H. Toll-like receptors and their function in innate and adaptive immunity / H. Heine, E. Lien // Int. Arch. Allergy Immunol. 2003. - Vol. 130, № 3. — P. 180-191.

125. Heinsbroek, S.E.M. Actin and Phosphoinositide Recruitment to Fully Formed Candida albicans Phagosomes in Mouse Macrophages / S.E.M. Heinsbroek, A.Lynn Kamen, R. Philip Taylor et al. // J. Innate Immun. 2009. -№1. - P.244-253

126. Hoffmann, J.A. Phylogenetic perspectives in innate immunity / J.A.Hoffmann, F.C.Kafatos, C.A.Janeway, R.A.B.Ezekowitz // Science. 1999. -Vol.284.-P.1313-1318

127. Hoffmann, JA. The immune response of Drosophila / JA.Hoffmann // Nature. 2003. - Vol.426. - P.33-38.

128. Hogg, N. Production of hydroxyl radicals from simultaneous generation of superoxide and nitric oxide / N.Hogg, V.M.Darley-Usman, M.T.Wilson, S.Moncada //Biochem. J. 1992. - 281( Pt. 2):. - P.419-424.

129. Jaillon, S. The humoral pattern recognition receptor PTX3 is stored in neutrophil granules and localizes in extracellular traps / SJaillon, G.Peri, Y.Delneste et al. // The Journal of Experimental Medicine. 2007. - Vol.204, №4.- P.793-804

130. Janeway, C.A. Innate immune recognition / C.A.Janeway, R.Medzhitov. // Annu. Rev. Immunol. 2002. - Vol.20. - P. 197-216

131. Jann, N.J. Neutrophil antimicrobial defense against Staphylococcus aureus is mediated by phagolysosomal but not extracellular trap-associated cathelicidin /

132. NJ.Jann, M.Schmaler, S.A.Kristian et al. // Journal of Leukocyte Biology. 2009.- Vol.86.-P.l 159-1169

133. Janssens, S. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition / S. Janssens, R.Beyaert // Clin. Microbiol. Rev. 2003 - Vol.16, № 4. - P. 637-646.

134. Kanthack, A. The morphology and distribution of the wandering cells of mammalian / A.Kanthack, W.B.Hardy // J Physiol. 1895.- Vol.17, №80. - P.l-119.

135. Kayshansky, K. Structure-function relationships of the hematopoietic growth factors / K. Kayshansky // Proteins. 1992. - Vol.12. - P. 1-9.

136. Kerr, J.F.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics / J.F.R.Kerr, A.H.Wyllie, A.R.Currie // Br. J. Cancer. 1972. - V.26. - P.239-257.

137. Kerr, J. Schrinkage necrosis: A distinct mode of cellular death"/ J. Kerr // J. Pathol. 1971. - Vol.105. - P.13-18.

138. Klebanoff, S J. Oxygen-dependent cytotoxic mechanisms of phagocytes / S J.Klebanoff // Adv. Host Defense Mech. 1982. - Vol.1. - P.l 11.

139. Lasky, L.A. The homing receptor (LECAM-l/L-selectin). Adhesion: Its Role in Inflamatory Disease / L.A. Lasky; eds. J. M. Harlan, D. Y. Liu W. H. Freeman. - New York, 1992.

140. Lauth, X. Ml Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition / Lauth X., von Kockritz-Blickwede M., McNamara C.W. et al. // J. Innate Immun. 2009. - №1.1. P.202-214

141. Lehrer, R.I. Neutrophils and host defense / R.I.Lehrer, T.Ganz, M.E.Selsted et al. // Ann Int Med. 1988. - Vol.109, №2. - P.127-142.

142. Levy, O. Antimicrobial proteins and peptides: anti-infective molecules of mammalian leukocytes // Journal of Leukocyte Biology. 2004. - Vol.76, №5. -P.909-925

143. Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated / K.Ley, C.Laudanna, M.I.Cybulsky, S.Nourshargh // Nat Rev Immunol.- 2007.-Vol.7,№9.- P.678-689.

144. Ley, K. Sequantial contribution of L- and P-selectin to leucocyte rolling in vivo / K. Ley, D.C. Bullard, M.L. Arbones et al. // J. Exp. Med. 1995. - Vol. 181, №2.-P. 669-675.

145. Liaudet, L. Biology of nitric oxide signaling / L. Liaudet, F.G. Soriano, C. Szabo // Crit. Care Med. 2000. - Vol. 28 (Suppl). - P. N37-N52.

146. Liu, С. Peptidoglycan recognition proteins: a novel family of four human innate immunity pattern recognition molecules / C.Liu, Z.Xu, D.Gupta, R.Dziarski //J. Biol. Chem. 2001. - Vol.276. - P.34686-34694.

147. Logters, T. The clinical value of neutrophil extracellular traps / T. Logters, S. Margraf, J. Altrichter, J. Cinatl, S. Mitzner, J. Windolf, M. Scholz // Med Microbiol Immunol. 2009. - Vol.l98. - P.211-219.

148. Lombosova, A.P. Immunotherapeutic effect of the SolcoTrichovac in trichomoniasis is not mediated by antibodiescross reacting with T. vaginalis / A.P.Lombosova, M.Valent // Genitourin. Med. 1986. - Vol.62. - P. 107-110.

149. Lopez, A. GM-CSF, IL-3, IL-5: cross -competition on human haemopoietic cells / A.Lopez, M.Elliot, J.Woodcock, M.Vadas // Immunology Today. 1992. -Vol.13. - P.495-501

150. Lundqvist-Gustafsson, H. Activation of the granule pool of the NADPH oxidase accelerates apoptosis in human neutrophils / H. Lundqvist-Gustafsson, T. Bengtsson // J. Leukoc. Biol. 1999. - Vol. 65. - P. 196-204.

151. Martinelli, S. Induction of genes mediating interferon-dependent extracellular trap formation during neutrophil differentiation / S.Martinelli, M.Urosevic, A.Daryadel et al. // J. Biol.Chem. 2004. - Vol.279. - P.44123-44132.

152. Medina, E. Beyond the NETs / E.Medina // J. Innate Immun. 2009. -№1. - P.175

153. Medina, E. Neutrophil Extracellular Traps: A Strategic Tactic to Defeat Pathogens with Potential Consequences for the Host / E.Medina // J. Innate Immun. 2009. - №1. - 176-180

154. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation / R.Medzhitov // Nature. 2008. - Vol.454. - P.428-435.

155. Medzhitov, R. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity / R.Medzhitov, P.Preston-Hurlburt, C.A. Janeway //Nature. 1997. - Vol.388, № 6640. - P. 394-397.

156. Miins, G. Phagocytosis and oxidative burst of granulocytes in the upper respiratory tract in chronic and acute inflammation / G.Miins, I.Rubinstein, P.Singer // J. Otolaryngol. 1995. - Vol.24, №2. - P.105-110.

157. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities / C.Nathan //Nat. Rev. Immunol. 2006. - №6. - P. 173-182.

158. Neeli, I. Regulation of Extracellular Chromatin Release from Neutrophils / I.Neeli, N.Dwivedi, S.Khan, M.Radic // J. Innate Immun. 2009. - №1. - P.194-201

159. Neeli I. Histone deimination as a response to inflammatory stimuli in neutrophils / I.Neeli, S.N.Khan, M.Radic // The Journal of Immunology. 2008. -Vol.180.-P. 1895-1902

160. Nimmerjahn, F. FcylV: A novel FcR with distingt IgG subclass specificity / F. Nimmerjahn, P. Bruhns, K. Horiuchi et al. // Immunity. 2005. - Vol.23. -P.41-51

161. O'Neill, L.A. Toll-Like receptors signal transduction and tailoring of innate immunity: a role for Mai / L.A. O'Neill // Trends Immunol. 2002. - Vol.23. -P.41-51.

162. Oehmcke, S. Activation of the Human Contact System on Neutrophil Extracellular Traps / S.Oehmcke, M.Morgelin, H.Herwald // J. Innate Immun. -2009.-№l.-P.225-230

163. O'Connor, B.H. A color Atlas and Instruction Manual of Peripheral Blood cell. Morphology / B.H.O'Connor. Baltimore, 1984. - 428p.

164. Pabst, M.J. Priming of neutrophils / M.J.Pabst // P.G.Hellewell Immunopharmacology of neutrophils / P.G.Hellewell; T.J.Williams (ed.). -London: Academic. Press., 1994. P. 195-221.

165. Pardi, R. Regulatory mechanisms in leukocyte adhesion: flexible receptors for sophisticated travellers / R.Pardi, L.Inverardi, J.R.Bender // Immunol. Today. 1992. - Vol.13. - P.224-230.

166. Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade / M.Phillipson, B.Heit, P.Colarusso et al. // J. Exp. Med. 2006. - Vol.203. -P.2569-2575.

167. Rabinovitch, M. Interferon-induced enhancement of Fc-receptormediated macrophage phagocytosis / M.Rabinovitch, S.I.Hamburg, H.B.Fleit // J. Reticul. Soc. 1980. - Vol.28. - P.27-28.

168. Radi, R. Peroxynitrite-induced luminol chemiluminescence / R.Radi, T.P.Cosgrove, J.S.Beckman, B.A.Freeman. // Biochem J. 1993. - Vol.290. -P.51-57.

169. Rahman, I. Oxidant and antioxidant balance in the airways and airway diseases / I.Rahman, S.K.Biswas, A.Kode // Eur. J. Pharmacol. 2006. - Vol.533. - P.222-229.

170. Rakita, R.M. Differential inactivation of Escherichia coli membrane dehydrogenases by a myeloperoxidase-mediate antimicrobial system / R.M. Rakita, B.R. Michel, H. Rosen // Biochemistry. 1990. - Vol.29. - P.1075-1080.

171. Ravetch, R.M. IgG Fc receptors / R.M.Ravetch, B.Bolland //Annu. Rev. Immunol. 2001. - Vol.19. - P.275-290.

172. Rhee, S.G. Intracellular messenger function of hydrogen peroxide and its regulation by peroxiredoxins / S.G. Rhee, S.W. Kang, W. Jeong et al. // Curr. Opin. Cell Biol. -2005. Vol.17. -P.183-189.

173. Ribes, S. Toll-Like Receptor Prestimulation Increases Phagocytosis of Escherichia coli DH5 and Escherichia coli K1 Strains by Murine Microglial Cells / S.Ribes, S.Ebert, D.Czesni et al. // Infection and Immunity. 2009. - Vol. 77, №1. - P.557-564

174. Ross, G.D. Regulation of the adhesion versus cytotoxic functions of the Mac-1/CR3/ M - 2-integrin glycoprotein / G.D. Ross // Crit. Rev. Immunol. -2000. - Vol.20. - P. 197-222.

175. Rosen, F.S. Oxidation of Escherichia coli iron centers by the myeloperoxidase-mediate microbial system / F.S. Rosen, S.J. Klebanoff// J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257. - P.13731-13735.

176. Sachs, L. The molecular of blood cell development / L.Sachs // Science. -1987. Vol.238. - P.677-681.

177. Schmidt, H.W. Formation and release of nitric oxide from human neutrophils and HL-60 cells induced by a chemotactic peptide, platelet activating factor and leukotriene B4. FEBS / H.W.Schmidt, R.Seifert, E.Bohme // Lett. -1989.-Vol.244.-357-360

178. Scott, C.C. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis / C.C.Scott, W.Dobson, RJ.Botelho et al // J. Cell Biol. 2005. - Vol.169. - P.139-149.

179. Segal, A.W. How neutrophils kill microbes / A.W. Segal // Annu. Rev. Immunol. 2005. - Vol. 23. - P. 197-223.

180. Smolen, J.E. Function of neutrophils / J.E. Smolen, L.A. Boxer // Williams Hematology. 5 th ed. - 1995. - P. 779-798.

181. Snyderman, R. Molecular and cellular mechnisms of leukocyte chemotaxis / R.Snyderman, E.J.Goetzl // Scince. 1981. - Vol.213. - P.830-837.

182. Springer, T.A. Adhesion receptors of the immune system / T.A Springer //.Nature. 1990. - Vol.346. - P. 425 -434.

183. Steinbeck, M.J. Intracellular singlet oxygen generation by phagocytosis neutrophils in respons to particle coated with chemical trap / M.J. Steinbeck, A.U. Khan, M.J. Karnovsky // J. Biol. Chem.1992. Vol. 267. - P. 13425-13433.

184. Steinberg, B.E. Unconventional roles of the NADPH oxidase: signaling, ion homeostasis, and cell death / B.E.Steinberg, S.Grinstein // Sci STKE. 2007. -Vol.379.-P.ll

185. Stewart, B.W. Mechanisms of apoptosis: integration of genetic, biochemical, and cellular indicators. / B.W.Stewart // J. Natl. Cancer Inst. 1994. -V.86. P.1286-1296.

186. Stolarek, R. Effect of various agonists on nitric oxide generation by human polymorphonuclear leukocytes / R.Stolarek, P.Kula, Z.Kurmanowska, D.Nowak // Int. J. Clin. Lab Res. 1998. - Vol.28, №2. - P. 104-109

187. Stossel, T.P. On the crawling of animal cells / T.P.Stossel // Science. 1993. -Vol.260. - P. 1086-1094.

188. Sumby, P. Extracellular deoxyribonuclease made by group A Streptococcus assists pathogenesis by enhancing evasion of the innate immune response / P.Sumby, K.D.Barbian, D J.Gardner et al. // Proc Natl Acad Sci USA. -2005. Vol.102. - P.1679-1684.

189. Swanson, J.A. A contractile activity that closes phagosomes in macrophages / J.A.Swanson, M.T Johnson, K.Beningo et al. // J. Cell. Sci. 1999. - Vol.112.-P.307-316.

190. Tapper, H. Localized exocytosis of primary (lysosomal) granules during phagocytosis: role of Ca 2+-dependent tyrosine phosphorylation and microtubules / H. Tapper, W. Furuya, S. Grinstein // J. Immunol. 2002. - Vol.168. - P.5287-5296.

191. Tomei L.D., Cope F.D. // Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death. Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1991.

192. Urban, C.F. How do microbes evade neutrophil killing? / C.F.Urban, S.Lourido, A.Zychlinsky // Cell Microbiol. 2006. - №8. - P.1687-1696.

193. Urban, C.F. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms / C.F. Urban, U. Reichard, V. Brinkmann et al. // Cell. Microbiol. 2006. - Vol. 8. - P. 668-676.

194. Vachier, I. Enhancement of reactive oxygen species formation in stable and unstable asthmatic patients / I.Vachier, P.Chanez, C.Le Douceu et al. // Eur Resp J. 1994. - №7. - P.1585-1592

195. Venge, P. Neutrophil function in chronic bronchitis / P.Venge, S.Rak, L.Steinholtz et al. // Eur Respir J. 1991. - №4. - P.536-543.

196. Virchow, R. Die Role der Gefasse und des Parenchyms in der Entzundung. / R.Virchow // Arch. Pathol. Anat. Physiol. Klin. Med. 1897. - Vol.149. -P.381-404.

197. Von Kockritz-Blickwede, M. Phagocytosis-independent antimicrobial activity of mast cells by means of extracellular trap formation / M. Von Kockritz-Blickwede, O.Goldmann, P.Thulin et al. // Blood. 2008. - Vol.111. - P.3070-3080.

198. Wang, Y. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation / Y.Wang, M.Li, S.Stadler et al. // The Journal of Cell Biology. 2009. - Vol.184, №2. - P.205-213

199. Wardini, A.B. Characterization of neutrophil extracellular traps in cats naturally infected with feline leukemia virus / A.B.Wardini, A.B.Guimaraes-Costa, M.Nascimento et al. // J. Gen Virol. 2010. - Vol.91. - P.259-264

200. Wartha, F. Neutrophil extracellular traps: casting the NET ov.er pathogenesis / F.Wartha, K.Beiter, S.Normark, B.Henriques-Normark // Curr. Opin Microbiol. 2007. - Vol.10, №1. - P.52-56.

201. Wartha, F. A Novel Cell Death Pathway / F.Wartha, B.Henriques-Normark, E.Tosis // Sci. Signal. 2008. - №1. - P.25

202. Watson, S.R. Neutrophil influx into an inflammatory site inhibited by soluble homing receptor-IgG chimaera / S.R. Watson, C. Fennie, L.A. Lasky //Nature. 1991. - Vol.349. - P. 164-167.

203. Weinrauch, Y. Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria / Y. Weinrauch, D. Drujan, S.D. Shapiro et al. // Nature. 2002. -Vol.417.-P. 91-94.

204. Wong, M. The identification of Fc and C3 receptors on human neutrophils / M.Wong, R.D.Wilson // J. Immunol. Method. 1975. - Vol.7. - P.69-76.

205. Yang, D. The role of mammalian antimicrobial peptides and proteins in awakening of innate host defenses and adaptive immunity / D. Yang, O. Chertov, J.J. Oppenheim // Cell. Mol. Life Sci. 2001. - Vol.58, № 7. - P.978-989.

206. Yost, C.C. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates / C.C.Yost, M J.Cody, E.S.Harris et al. // Blood. 2009. - Vol.113, №25. - P.6419-6427.

207. Yu, B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species / B.P. Yu // Physiol. Rev. 1994. - Vol.74. - P. 139-162.

208. Zakeri, Z. Cell death: programmed, apoptosis, necrosis, or other? / Z.Zakeri, W.Bursch, M.Tenniswood, R.A.Lockshin // Cell Death and Differentiation. 1995. - Vol.2, №2. - P. 87-96. 1

209. Zhao, X. Cathcart protein kinase С regulates p67phox phosphorilation in human monocytes / X.Zhao, B.Xu, A.Bhattacharjee et al. // J. Leukocyte Biol. -2005. Vol.77. - P.414-420.

210. Zhong, X.-Y. Increased Concentrations of Antibody-Bound Circulatory Cell-Free DNA in Rheumatoid Arthritis / X.-Y.Zhong, I. von Mtihlenen, Y.Li et all. // Clinical Chemistry. 2007. - Vol.53, №9. - P.1609-1614.