Влияние ингибиторов цитоскелета на водный обмен корней озимой пшеницы при последствии водного стресса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Волобуева, Ольга Васильевна

• Волобуева, Ольга Васильевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Волобуева, Ольга Васильевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Влияние водного дефицита на водный обмен растений

1.1.1 Изменение состояния воды и ее компартментализации

1.1.2 Системы межклеточного транспорта воды

1.2 Строение и функции цитоскелета растений

1.2.1 Общая характеристика

1.2.2 Микротрубочки

1.2.3 Микрофиламенты

1.3 Водный стресс и цитоскелет растений

1.4 Влияние цитоскелета на состояние и транспорт, воды

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, СХЕМА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Условия выращивания растений и схема опытов

2.2 Характеристика и механизм действия ингибиторов полимеризации цитоскелетных белков

2.3 Определение водоудерживающей способности

2.4 Измерения биофизических показателей водного обмена импульсным методом ЯМР

2.5 Определение суммарной активности дегидрогеназ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1.Методический подход к изучению самодиффузии воды

внутри вакуолярного и цитоплазматического симпластов

3.2 Влияние ингибиторов полимеризации белков цитоскелета на водный обмен корней разных по устойчивости генотипов озимой

пшеницы

3.2.1 Временная динамика действия колхицина и винбластина на биофизические показатели водного обмена растений - Т2 и Вэ фф

3.2.2 Влияние колхицина на физиологические и биофизические

показатели водного обмена корней разных по устойчивости сортов озимой пшеницы при последействии нарастающего водного стресса

3.2.2.1 Изменение ВС

3.2.2.2 Изменение Т2 и Д,фф

3.2.2.3 Интерпретация зависимости между Тг и Афф

3.2.3 Влияние цитохалазина Б на физиологические и биофизические

показатели водного обмена корней разных по устойчивости сортов озимой пшеницы при последействии нарастающего водного стресса

3.2.3.1 Изменение ВС

3.2.3.2 Изменение Т2 и Афф

3.2.3.3 Радиальная самодиффузия воды в корне у различных по устойчивости сортов озимой пшеницы при восстановлении

оводненности в присутствии цитохалазина Б

3.3 Активность дегидрогеназ как тест на жизнеспособность корней, обработанных цитоскелетмодифицирующими веществами после действия

водного стресса разной силы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Сокращения

ВМЧ - внутримембранные частицы

ВС - водоудерживающая способность

МТ - микротрубочки

МФ - микрофиламенты

ПФ - промежуточные филаменты

МАРб - микротрубочко-ассоциированные белки

МТОЦ - микротрубочко-организующий центр

ОДА - осмотически действующий агент

КСД - коэффициент самодиффузии

Т2 - времена спин-спиновой релаксации протонов воды

ТТХ - хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий

Афф - эффективный коэффициент самодиффузии воды

рй - диффузионная проницаемость мембран для воды

розт - осмотическая проницаемость мембран для воды

V}/ - водный потенциал

\|/я - осмотический потенциал

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние ингибиторов цитоскелета на водный обмен корней озимой пшеницы при последствии водного стресса»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность В настоящее время около одной трети пахотных земель в мире недостаточно или неравномерно обеспечиваются влагой вследствие частых и длительных засух, которые в отдельные годы вызывают резкое снижение продуктивности зерновых культур. На территории нашей страны за последние пять столетий засухи отмечались в среднем один раз в 10 лет, однако проявляется тенденция к их более частому повторению. Несмотря на достигнутые успехи в познании природы засухоустойчивости растений и разработку приемов и методов борьбы с засухой, эта проблема продолжает оставаться одной из самых трудных и важных.

Исследования водного обмена и засухоустойчивости растений охватывают много аспектов и направлений, что нашло отражение в книге A.M. Алексеева «Водный режим растений и влияние на него засухи» (1948). Современные представления о роли воды в жизнедеятельности растений и об их реакции на водный дефицит изложены в ряде фундаментальных работ (Самуилов, 1972; Петинов, 1972; Гусев, 1974; Шмать-ко, Шведова 1977; Генкель, 1982; Зялалов, 1985; Шматько и др., 1989; Жолкевич и др., 1997; Кузнецов и др., 1997). В этих работах получило развитие, главным образом, физиолого-биохимическое направление. В последние годы большое внимание уделяется выяснению молекулярных ответов растительных клеток на водный стресс (Кузнецов и др., 1992; Rascio et al., 1992; Hans et al., 1995; Shinozaki, Yamaguchi, 1996; Maeda, 1996).

Был достигнут определенный прогресс в плане разработки методических подходов к изучению водного обмена растений, и особенно к исследованию биофизичкских аспектов транспорта воды, благодаря использованию импульсного метода ЯМР, который при малом возмущающем воздействии позволяет получить информацию на молекулярном уровне в интактных клетках и тканях (Федотов и др., 1969; Велика-

нов, 1977; Анисимов, 1977; Аксенов, 1987; Анисимов, Раткович, 1992; Ионенко с сотр., 1998).

Особая роль в координации внутриклеточных процессов и в реакциях клеток на изменяющиеся условия внешней среды принадлежит системе цитоскелета (Cerr, Carter, 1990; Beese, 1991; Lloyd, 1991; Chowdhury et al., 1992; Goddard et al., 1994; Pihakasky-Maunsbach, Puhakainen, 1995; Bokros et al., 1996; Nick, 1998). Вопрос о влиянии микротрубочек и микрофила-ментов на водный статус клеток является малоизученным, и в основном эти исследования проводились на животных тканях (Clegg, 1984; Сниги-ревская, 1990; Комиссарчик, 1996). Такого рода информация для растительных клеток содержится в единичных работах (Wayne, Tazawa, 1988; Жолкевич, Чугунова, 1987; 1995; Хохлова с сотр., 1997). В настоящее время совершенно открытым остается вопрос о роли цитоскелета в во-обмене растительных клеток в условиях водного дефицита.

Цель работы: Установить зависимость водного обмена корней от направленной модификации цитоскелета при последействии нарастающего обезвоживания у отличающихся по устойчивости генотипов озимой пшеницы.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методический подход к выявлению участия цитоскелета в процессах водообмена корней проростков с использованием ингибиторов полимеризации актиновых и тубулиновых белков в условиях последействия водного стресса разной силы (слабого, среднего, сильного).

2. Соотнести коэффициенты самодиффузии (КСД) воды, полученные на основе компьтерного разложения мультиэкспоненциального диффузионного затухания намагниченности стимулированного эха с различными по подвижности фракциями воды в клетках корней.

3. Изучить временную динамику действия антимитотических веществ -колхицина и винбластина на трансмембранный перенос воды в корнях.

4. Исследовать влияние модификаторов цитоскелета - колхицина и ци-тохалазина Б на физиологические и биофизические показатели (водоудерживающую способность - ВС, времена спин-спиновой релаксации - Т2 и эффективный коэффициент самодиффузии - Афф) водного обмена корней разных по устойчивости сортов озимой пшеницы.

5. Изучить радиальную самодиффузию воды в корнях и оценить пути межклеточного транспорта воды на уровне плазмодесм и плазмалем-мы в норме и при восстановлении оводненности после обезвоживания в присутствии цитохалазина Б.

Научная новизна. Впервые установлена зависимость водного обмена корней проростков озимой пшеницы от ингибиторов полимеризации белков цитоскелета в условиях последействия водного стресса. Показано, что направленность и степень проявления этой зависимости геноти-пически детерминированы и определяются уровнем обезвоживания тканей. Разработан принципиально новый подход к изучению водопрово-димости плазмодесм, основанный на компьютерном анализе мульти-компонентного диффузионного затухания намагниченности стимулированного эха в тканях корня. Была объяснена природа трех коэффициентов самодиффузии (КСД), характеризующих разные по подвижности фракции воды. Выдвинуто новое представление о регуляции межклеточного транспорта воды по плазмодесмам, согласно которому нарастающее обезвоживание вызывает компенсаторное перераспределение диффузионных потоков воды между цитоплазматическим и вакуолярным симпластами в направлении усиления по первому пути, а также притока воды в апопласт вследствие повышения проницаемости плазмалеммы. Деполимеризация актиновых белков под влиянием цитохалазина Б, индуцируя деструкцию акто-миозиновых сфинктеров плазмодесм, усиливает эффект умеренного обезвоживания (5-10%), а после значительной

потери воды (20%), блокирует цитоплазматическое русло и увеличивает локализацию воды в апопласте. Механизмы регуляции межклеточного переноса воды на уровне плазмодесм являются более чувствительными в корнях устойчивых растений по сравнению с малоустойчивыми. Теоретическая и практическая значимость работы. На основе разработанных новых подходов к выяснению физиологической роли цитоскеле-та в процессах водообмена (ингибиторный анализ, регистрация ВС, Тг, Афф) и к изучению водопроводимости плазмодесм (анализ мультиком-понентного диффузионного затухания намагниченности, регистрация трех КСД) в корнях проростков разных по устойчивости сортов озимой пшеницы при последействии нарастающего обезвоживания выявлены осмоадаптивные характеристики термодинамического состояния воды и ее межклеточного транспорта. Эти характеристики, более выраженные у устойчивых сортов, могут быть использованы в качестве чувствительных диагностических критериев при отборе и создании более засухоустойчивых сортов пшеницы.

Компьютерный анализ неэкспоненциального диффузионного затухания намагниченности при больших временах наблюдения в корнях рекомендуется включить в пакет программ при разработке автоматизированных систем для массовой экспресс-диагностики засухоустойчивости пшеницы на ранних этапах селекционного процесса.

Целесообразно также использовать представленные в работе теоретические обобщения при чтении спецкурсов по водному обмену и по физиологии устойчивости растений.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Международном XXVII конгрессе Ампера («Magnetic resonanse and related phenomena» Kazan, August, 21-28, 1994); на Международной коферен-ции студентов и аспирантов «Ленинские горы-95» (Москва, 12-14 апреля, 1995); на ежегодном симпозиуме «Физико-химические основы физиологии растений (Пенза, 1996); на II Республиканской конференции молодых

ученых и специалистов (Казань, 28 июня-1 июля, 1996); на V Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, Мари-Эл, 22-26 июня, 1998), на Международном симпозиуме «The Plant Cytoskeleton: Molecular Keys for Botechnology» (Yalta, Crimea, Ukraine, September, 14-19, 1998), на Итоговых научных конференциях Казанского государственного университета 1995-1998 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, 1 находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, списка литературы, изложена на 186страницах, содержит 32 рисунка и 6 таблиц. Список литературы включает266наименова-ния, из которых! 35иностранных работ.

10

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние водного дефицита на водный обмен растений 1.1.1. Изменение состояния воды и ее компартментализации

A.M. Алексеев (1940, 1941, 1948) предложил новый термодинамический подход к изучению водного обмена растений, суть которого заключается в необходимости использования для характеристики водного режима не только факторов емкости, каковыми является общее содержание воды, но и факторов напряжения, которые определяют энергетическое состояние воды в клетках и тканях и, таким образом, дают качественную характеристику водного режима. По мнению A.M. Алексеева, с термодинамической точки зрения такими факторами являются парциальный химический потенциал находящейся в растении воды и ее активность, то есть способность воды участвовать в осмотических, поверхностных и химических процессах. В качестве обратного показателя активности воды A.M. Алексеев предлагает использовать сосущую силу клетки. Автор развивает мысль о том, что активность воды зависит от степени ее связанности, то есть от гидратации как растворенных веществ (осмотически связанная вода), так и гидрофильных коллоидов (коллоидно-связанная вода).

Многие авторы отмечали повышение содержания связанной и снижение свободной воды в растениях при уменьшении влажности почвы (Лебединцева, 1929; 1930; Васильева, 1955; 1957; Гусев, 1959; Петинов, 1959). Детальные исследования в этом направлении проведены A.M. Алексеевым (1948) на пшенице, установившим, что под влиянием засухи в листьях увеличивается содержание связанной воды за счет повышения количества осмотически связанной. Уровень коллоидно-связанной воды, наоборот, уменьшался и особенно значительно при расчете на сухой вес.

Увеличение содержания осмотически связанной воды A.M. Алексеев объясняет двумя причинами: повышением абсолютного количества осмотически связанной воды за счет новообразования в клеточном соке и протоплазме осмотически активных веществ и повышением относительного содержания осмотически связанной воды за счет потери листьями при транспирации свободной воды. Уменьшение коллоидно-связанной воды, по мнению A.M. Алексеева, может объясняться лишь потерей воды коллоидами протоплазмы, поскольку вероятность значительных изменений свойств целлюлозной оболочки при сравнительно слабом ее подсушивании очень мала. Потеря воды коллоидами протоплазмы может зависеть, во-первых, от уменьшения степени гидратации коллоидов вследствие потери части свободной воды в процессе транспирации и, во-вторых, от уменьшения числа гидратируемых частиц или степени дисперсности коллоидов протоплазмы.

Известно, что неблагоприятное действие стресс-фактора на растение зависит от его дозы, обусловленной степенью, глубиной и продолжительностью воздействия данного фактора. Г. Селье (1972; 1979) разделил весь адаптационный процесс живых организмов на три стадии. Реакция тревоги - это первоначальный ответ клеток, характеризуется активацией защитных сил организма. В ходе длительного воздействия любого повреждающего агента, способного вызвать эту реакцию, наступает вторая стадия - стадия адаптации или резистентности. После еще более длительного воздействия стрессора достигнутая адаптация снова теряется. Организм переходит в третью фазу - стадию истощения, симптомы которой напоминают реакцию тревоги.

Безусловно, применительно к растениям первая фаза стрессовой реакции не может быть названа фазой тревоги, так как у них нет ни нервной системы, ни тех гормонов, которые участвуют в стресс-реакциях у животных (Урманцев, Гудсков, 1986; Полевой, 1989). В фитофизиологии первый этап адаптационного синдрома получил самые разнообразные названия: реакция тревоги (Tietz, Tietz, 1982), фаза повреждения

(Удовенко, 1979), реакция защитного торможения метаболизма (Мелехов, 1985), деэнергизованное состояние (Пахомова, Гордон, 1984), первичная стрессовая реакция (Полевой, 1989), состояние физиологической депрессии (Пахомова, 1992), фаза шока (Пахомова, Пахомов, 1991), активное состояние (Гордон, 1992).

Вторая фаза адаптационного синдрома растений - фаза адаптации характеризуется снижением гидролитических и катаболических процессов, восстановлением исходных физиологических параметров и структур (мембран, органелл), включением шунтовых механизмов (увеличение числа изоферментов, повышение активности одних ферментов при снижении других), полной мобилизацией потенциальных возможностей различных реакций, компенсаторными изменениями сопряженных реакций (Гринева, 1975; Хохлова, 1976; Удовенко, 1979; Савич, 1989). Эта фаза получила также различные названия: состояние гетеростаза (Генкель, 1982), суперкомпенсация (Пахомова, Пахомов, 1992), энергизованное состояние (Пахомова, Гордон, 1984), состояние стабилизации (Пахомова и др., 1992), состояние покоя (Лыгин и др., 1990), состояние напряжения (Пахомова, 1992).

В этом аспекте можно рассмотреть целый ряд изменений, наблюдаемых в клетках, при действии на растения засухи. Прямопротивопо-ложные изменения получены при исследовании вязкости протоплазмы у разных культур при обезвоживании. Так, H.A. Максимов и Н.В. Васильева (1948) при завядании томатов обнаружили увеличение, а у капусты и бобов - уменьшение вязкости. Для клеток паренхимы листьев огурцов было показано, что ответная реакция протоплазмы носит явно выраженный двухфазный характер: в условиях непродолжительного и/или мягкого стресса вязкость падала, при нарастании же силы стресса -вязкость возрастала (Жолкевич, Григорьева, 1971). Для листьев пшеницы была показана более сложная зависисмость. При слабом обезвоживании происходило повышение вязкости цитоплазмы, по мере усиления

обезвоживания - уменьшение, а при сильном водном дефиците (30-32%) вязкость была ниже исходного уровня (Старцева, Шкляев, 1970).

Интегральным физиологическим показателем водного обмена является водоудерживающая способность клеток/тканей, которая определяется водным потенциалом или термодинамическим состоянием воды (Андреев, 1978). Обычно о ВС судят по количеству воды, выходящей из тканей в гипертонические растворы осмотически активных веществ. Основными составляющими водного потенциала и, значит, ВС является алгебраическая сумма четырех составляющих: осмотического потенциала, отражающего влияние на активность воды частиц растворенных веществ; потенциала давления, отражающего влияние на активность воды механического (гидростатического или тургорного давления); матричного потенциала, отражающего влияние на активность воды макромолекул полимеров; гравитационного потенциала, отражающего влияние на активность воды силы тяжести и заметно сказывающегося только при поднятии воды на относительно большую высоту (Гусев и др., 1989).

На рис.1 представлена схема, показывающая пути водного обмена растений в зависимости от уровня влагообеспеченности и при адаптации к засухе. Из схемы видно, что водный и осмотические потенциалы (у,^) высокие в нормальных условиях влагообеспечения, понижаются при водном стрессе. При этом свободная вода, первоначально большей частью локализованная в межклеточном пространстве и вакуоле и обладающая высокой активностью, при стрессовых воздействиях перераспределяется в межклеточное пространство, а в вакуоли - снижается, при этом активность ее уменьшается. Количество связанной воды, сравнительно низкое в бесстрессовых условиях в мембранах, матриксе, цитоплазме, значительно увеличивается после действия водного стресса.

Устойчивым к засухе растениям присущ гомеостаз водного обмена. У этих растений (при умеренном водном стрессе) меньше изменяется вод ный и осмотический потенциал, возрастает ВС листьев за счет усиления

Рис.1. Схема, отражающая пути изменения водного обмена растений в норме, при водном стрессе и при адаптации к засухе (Кушниренко, 1989)

синтеза легкорастворимых белков, белков-дегидринов, Сахаров, ионов и других осмотически активных веществ, увеличивающих гидратируемую поверхность и повышающих структурную стабильность протоплазмы, мало меняется тургор

и интенсивность транспирации (Шматько и др., 1989; Rascio et al., 1994; Кузнецов и др., 1997). При нарастании стресса резко снижается оводнен-ность, синтез белков, за счет распада сложных углеводов и потери воды, значительно снижается водный потенциал. Если в первом случае процессы репарации при регидратации протекают активно, то при усилении стресса происходит частичное восстановление, а иногда и необратимые изменения процессов (Кушниренко, 1989).

Свойства и устойчивость цитоплазмы к различным стрессорным воздействиям во многом определяются взаимодействиями основных ее компонентов - белков и воды (Алексеев, 1969; Vertucci, Leopold, 1987; Уоттерсон, 1991; Rascio et al., 1992; Шматько, Жук, 1993). Детально разработкой этого вопроса занимался A.M. Алексеев, который писал: «С точки зрения развиваемого нами представления о цитоплазме как целостной структурированной системе устойчивость, в частности, засухоустойчивость растений, должна определяться степенью сохранения структуры и состоянием всех ее компонентов и, в особенности, воды и белков. Несомненную роль в сохранении структуры цитоплазмы играет процесс гидратации белковых макромолекул ... путем создания через водородные связи большого соответствия и прочности структуры воды и белков в цитоплазме» (Алексеев, 1969, с.31). Молекулярную базу этому положению подвел Уоттерсон (1991), который являясь приверженцем кластер-но-доменной структуры белка, показал, что размеры и форма белков являются соответствующими водным кластерам. Молекулы белков и воды имеют размеры, которые позволяют им упаковываться друг с другом и строить высокоинтегрированный ансамбль белка и растворителя, образуя цитоплазматический гель.

При засухе в составе белков отмечено уменьшение количества сульфгидрильных групп и увеличение дисульфидных связей (Хохлова, 1969). Однако, как было установлено, увеличение дисульфидных связей при дегидратации не является фактором стабилизации третичной структуры белка. При помощи метода диэлектрической спектроскопии было показано, что засуха вызывает разрыхление макромолекул (снижение коэффициента упаковки) (Гусев, 1974). По-видимому, более важную роль в укреплении третичной структуры при обезвоживании играют гидрофобные связи, которые ослабляются при засухе вследствие усиления антагонистических или адгезионных связей белка с водой. При этом различные фракции белков цитоплазмы по-разному реагируют на обезвоживание. У белков фракций 0,2 и 0,7 под влиянием засухи увеличивается длина и степень асимметрии макромолекул, происходит разрыхление и увеличение их объема (Гусев, 1974). П.Л. Привалов (1958) и A.M. Алексеев (1965) отмечают, что для упорядочивающего действия макромолекул на воду имеет значение форма белковой макромолекулы, размер ее поверхности. Более асимметричные макромолекулы оказывают большее упорядочивающее действие на окружающую воду, чем менее асимметричные. Увеличивающееся упорядочивающее действие более вытянутых макромолекул Л.П. Привалов (1958) относит за счет образования дополнительных водородных связей, одной из причин которого может быть увеличение содержания углеводов в белковых комплексах (Хохлова, 1969).

Известно, что отношение отнятая/оставшаяся вода дает представление об изменении термодинамического состояния воды в клетках. Рефрактометрическим методом на листьях пшеницы установлено, что даже при слабой засухе это отношение сильно снижается (в 2-7 раз), при более сильной засухе это снижение еще более прогрессирует (Гусев, Швалева, 1971). Была отмечена тесная отрицательная корреляция между отношением отнятая/оставшаяся вода и сосущей силой клеток (г=-0,99), свидетельствующая о тесной сопряженности между этим отношением и

активностью воды. В свою очередь, на активность воды могут влиять тургорное давление, процессы гидратации высоко- и низкополимерных компонентов цитоплазмы, а также иммобилизация воды внутри белковых макромолекул и в межмолекулярных отсеках (Алексеев, 1969). Сходные результаты получены при анализе адсорбционных изотерм для листьев твердой пшеницы (Казсю е1 а1., 1994). В этих опытах получена тесная прямая корреляция между величиной водного потенциала и степенью связанности воды при водном стрессе (0,3 МР) для двух различающихся по засухоустойчивости сортов.

Но такая направленность описанных изменений проявляется лишь до тех пор, пока действие засухи не станет настолько сильным, чтобы нарушить регуляцию функций клетки. Под влиянием сильной засухи значительно снижалось как количество незамерзающей воды, так и содержание оставшейся воды, отнесенное к единице сухого веса (Гусев, 1974). При этом по сравнении с умеренной засухой резко изменялись свойства растворимых белков цитоплазмы: в три раза увеличивалось содержание углеводов в белковом комплексе (3,35-7,30% при сильной засухе против 1,22-2,44% - при умеренной), в среднем в шесть раз возрастало количество «открытых» сульфгидрильных групп (9,59-27,05 мМ/г против 0-6,5 мМ/г). Следовательно, произошло снижение прочности макромолекул и, вероятно, их частичная денатурация.

Как уже отмечалось, водоудерживающая способность играет важную роль в противодействии обезвоживающему действию засухи. При этом особую роль играет способность органелл к набуханию. Впервые изменение морфологии хлоропластов при действии на клетки водорослей, мха и высших растений слабых растворов ЫаС1 (1-4%) установил А.П. Пономарев (1915). Основываясь на своих наблюдениях, он выдвинул предположение, что разбухание хлоропластов и образование в них вакуолей - это осмотический процесс, а не следствие начала растворения хлоропластов, как это считалось ранее. Затем Н.Г. Васильевой и З.С.

Буркиной (1963) был сделан вывод о том, что хлоропласты менее подвержены временным нарушениям водного режима, чем остальные фракции клетки.

В настоящее время достаточно хорошо изучена водозапасающая функция хлоропластов при обезвоживании клеток (Рыбкина, Гусев, 1978; Гусев и др., 1980; Рыбкина, Биглова, 1981; Кушниренко, 1989). В частности, на большом числе растительных объектов из различных экологических групп было показано, что распределение воды в клетке неравномерно - оводненность пластид в норме значительно ниже оводнен-ности клетки в целом. Неравномерность в распределении воды между хлоропластами и клеткой в целом, существующая в бесстрессовых условиях, сохраняется и даже усиливается при обезвоживании, но реакция хлоропластов на потерю воды листом может быть различной (набухание, обезвоживание или отсутствие изменений). Она определяется ярусом и общим возрастом листа, исходной оводненностью листа и хлоропластов, величиной обезвоживания (Гусев и др., 1980).

Методом микрофотографии и морфометрического анализа было установлено, что относительная доля воды хлоропластов, незначительная в норме, затем по мере обезвоживания клетки увеличивается в 10-30 раз. Это увеличение определяется способностью хлоропластов набухать при потере клеткой как относительно небольших, так и значительных доз воды и резко различной скоростью и степенью потери воды хлоропластами и протопластом при далеко зашедшем обезвоживании (Рыбкина, Биглова, 1981), особенно у закаленных к засухе растений (Кушниренко, 1989). Эти результаты позволяют говорить о хлоропла-стах как о «запасном резервуаре» воды при слабом и умеренном обезвоживании и превращении их в практически основное вместилище внутриклеточной воды в условиях сильного водного стресса.

О водозапасающей роли митохондрий и ядер имеются единичные сведения. Так, для клеток верхнего эпидермиса чешуи лука показано, что при потере ими малых количеств воды доля воды ядер в общем запасе

воды цитоплазмы увеличивается в 2-3 раза (Рыбкина, Биглова, 1981), что свидетельствует о вполне определенных водозапасающих возможностях ядра в сильно вакуолизированных, крупноядерных, лишенных хлоро-пластов клетках. В работах по исследованию митохондрий в условиях водного дефицита также сообщается о возможности их набухания (Куркова, Андреева, 1966; Гусев, 1974). Кроме того, в листьях пшеницы по мере нарастания водного дефицита (19% и 53%) происходит увеличение содержания незамерзающей воды в ядрах и митохондриях почти в 5 раз при наличии только тенденции к некоторому увеличению количества незамерзающей воды в листьях (Сиянова, Неуструева, 1990). В условиях глубокого водного дефицита оводненность ядер и митохондрий поддерживается на более высоком уровне после их регидратации (Рыбкина, Биглова, 1981; Сиянова, Неуструева, 1990).

Оболочки растительных клеток содержат довольно большое количество воды (Крафтс и др., 1951; Фрей-Висслинг), что обусловлено высокой гидрофильностью полимеров, входящих в состав клеточной стенки. Способность клеточных оболочек прочно удерживать воду влияет на засухоустойчивость растений (ТеоЬ е1 а1., 1967). В накоплении воды в растениях значительную роль играют пектиновые вещества (Алексеев, 1948). Процесс поступления воды в оболочку рассматривается как следствие хемогидратации, поглощения воды осмотическим путем и иммобилизации воды. При рассмотрении водоудерживающих свойств клеточных стенок приводятся данные о высокой водоудерживающей способности изолированных клеточных стенок (Саляев, Швецова ,1969; Слейчер, 1970). При этом отмечается, что живые клеточные стенки способны удерживать значительно большие количества воды (Слейчер, 1970).Это возможно как за счет гидратации полимеров клеточной стенки, так и за счет поверхностного натяжения, действующего на границе раздела жидкость-воздух в межфибриллярных пространствах (Слейчер, 1970). Таким образом, роль клеточной стенки в водообмене растений объяснялась чисто физико-химическими явлениями. Однако данные по-

следних лет позволяют предполагать о более широкой роли клеточных стенок в водообмене. По-видимому, эту роль нельзя сводить только к удержанию воды, так как клеточная стенка принимает участие в регуляции проницаемости клеточных мембран для воды (Kuiper, 1972; Каримова, 1979; Даутова, 1997).

Существующее представление о механизмах формирования ВС в 80-е годы было несколько пересмотрено и дополнено. В частности, было установлено, что помимо состояния воды и ее перераспределения при стрессах во внутриклеточных структурах значительный вклад в величину ВС вносит проницаемость плазматической мембраны (Гусев, Белькович, 1987; Каримова и др., 1982).

Резюмируя сказанное, следует отметить, что ответ растительных клеток, включающий изменение термодинамического состояния внутриклеточной воды, на обезвоживание имеет двухфазный характер. Повышение способности клеток удерживать воду при слабом или непродолжительном воздействии обеспечивается увеличением количества связанной воды за счет синтеза осмотически активных веществ, изменения структуры белков, а также перераспределения воды и ее локализацией в органоидах цитоплазмы. При нарастании водного стресса на фоне снижения оводненности ткани происходит падение ВС за счет уменьшения синтеза белков и прочности их макромолекул.

1.1.2.Системы межклеточного транспорта воды

Согласно существующим представлениям, имеются два возможных пути транспорта веществ через плазматическую мембрану - «базальный» путь через липидную матрицу и факультативный транспорт через мембранные поры (Collander, 1954; Luttge, Higinbotham, 1979). Транспорт через липидный бислой является диффузионным по своей природе, и доминирующую роль в этом процессе играют размеры молекул (Stein,

1986). При этом возникает взаимодействие между транспортируемым веществом и водой во время прохождения через липидный бислой, которое характеризуется такими термодинамическими величинами, как коэффициент отражения и электроосмотический коэффициент (Kedem, Katchalsky, 1961; Dainty, Ginsburg, 1963). Согласно поровым моделям, вода и растворенные в ней молекулы других веществ транспортируются через мембранные поры, которые являются достаточно широкими.

В последующие годы дополнительным аргументом в пользу существования в плазматических мембранах заполненных водой пор явилось обнаружение несоответствия коэффициентов осмотической (posm) и диффузионной (pd) проницаемости мембран для воды. Коэффициент диффузионной проницаемости определяется в стационарных условиях при отсутствии градиента водного потенциала на мембране. Самым распространенным методом для его определения является изотопный метод с использованием таких меток, как D20, ТНО или DHO. При этом проницаемость pd определяется по формуле: J*=pda*, где]* - однонаправленный поток меченой воды, а* - начальная активность меченой воды, равная всему градиенту ее активности на мембране. В опытах, когда на мембране существует осмотический градиент, проницаемость posm определяется из соотношения: J*=p0sm(ara2X гДе Posm " осмотический поток воды, ai и аг - активность воды с двух сторон мембраны.

В первых экспериментах, где использовались оба этих подхода для определения проницаемости клеточных мембран для воды (Durbin et al., 1956; Villegas et al., 1958), было установлено, что posm>pd. Кроме того, было также показано, что поток меченой воды зависит от осмотического давления по обе стороны мембраны (Villegas et al., 1958). Другими словами, меченая вода при наложении осмотического градиента переносилась через мембрану быстрее, чем это возможно путем диффузии. В первых, вышеуказанных работах исследователи связала причину несоответствия Posm и Pd с существованием в липидной бислое клеточных мембран вод-

ных пор. Mauro (1960) и Ray (1960) независимо друг от друга создали первую теорию течения воды в порах мембран, объясняющую наблюдаемую феноменологию. По Mauro (1960) и Ray (1960), разность осмотического давления растворов по обе стороны мембраны превращается во внутримембранную (внутрипоровую) разность гидростатических давлений, которая и движет поток воды. В более строгой форме это положение позднее было доказано в работе Anderson, Malone (1974) при изучении осмотического потока воды в искусственных поровых мембранах. Solomon (1960) по экспериментально наблюдаемой величине соотношения posm/pd определил радиус пор в плазматической мембране исследуемых клеток.

Недостатком теоретических построений Mauro (1960) и Ray (1960) является то, что вода в поре мембраны рассматривалась как непрерывная сплошная среда. Их теория может быть применена к биологическим мембранам лишь при условии наличия в них более широких по сравнению с размером молекул воды водных пор. Поэтому одновременно с этой теорией была высказана идея о том, что вода пересекает мембрану по длинным узким порам, диаметр которых лишь немного превышает диаметр молекул воды - однорядный транспорт (Harris, 1960). Автор исходил из формального сходства законов осмоса и законов газового состояния и предположил, что объемный поток через поры управляется разностями в молекулярных бомбардировках с двух концов поры, чем и объяснил наблюдаемое несоответствие осмотического и диффузионного потоков. Величина отношения posm/pd в свете идеи однорядного транспорта воды несет информацию о количестве молекул воды в узкой поре.

Таким образом, существует альтернатива: одни исследователи (Mauro, 1960; Ray, 1960; Solomon, 1960) считают, что экспериментально наблюдаемая величина зависимости posm и pd для исследуемой мембраны характеризует эквивалентный радиус ее широких водных пор, другие исследователи (Harris, 1960) считают, что эта величина несет информацию о

количестве молекул воды в узких однорядных порах исследуемой мембраны. Последующими исследованиями эта альтернатива была разрешена в пользу однорядных пор белковой природы (аквапоринов) (Verkman, 1992; Chrispeels, Maurel, 1994). Сходные с ионными каналами эти транспортные белки участвуют в пассивном обмене воды между изолированными клетками и средой и между протопластом и апопластом в растительных клетках (Finkelstein, 1987; Verkman, 1992). В настоящее время известна их биохимия и молекулярная биология. В целом транспорт воды посредством аквапоринов лучше изучен в животных, чем в растительных тканях. Экспрессия генов, кодирующих аквапоринные белки в ооцитах лягушки, приводила к образованию водных пор в плазматической мембране растительных клеток (Kammerloher et al., 1994).

Есть данные о том, что в плазматической мембране листьев шпината аквапорины могут составлять до 20% от всех интегральных белков (Johansson et al., 1996) и могут обслуживать значительную часть трансмембранных потоков воды (Carvajal et al., 1996). Продемонстрировано, что функциональными единицами водных каналов-аквапоринов являются белки с молекулярной массой около 30 кОа, которые «прошивают» мембрану шесть раз в форме однорядных пор (рис.2).

Однорядные поры аквапорина считаются высокоспециализированными для пассивного переноса воды через мембрану по градиенту ее активности, поскольку ингибирование водных каналов при помощи сульфгидрильного реагента (HgCl2) не влияло на потоки растворенных веществ - ионов и электролитов (Preston et al., 1992; Maurel et al., 1993; Chrispeels, Agre, 1994). Однако по данным других исследователей, водные каналы-аквапорины, хотя и являются селективными для воды, но не являются идеальными фильтрами для низкомолекулярных полярных растворенных веществ и характеризуются

значительным несоответствием коэффициентов осмотической и диффузионной проницаемости (Steudle, Henzler, 1995). По-видимому, селектив-

ность аквапоринов растительных клеток более соответствует изложенным выше представлениям об однорядных водных порах.

Рис.2. Топология аквапорина (по Johansson et al., 1996).

Принципиально новым в исследованиях последнего времени явилось то, что аквапорины растительных клеток, вероятно, могут фосфо-рилироваться как in vitro, так и in vivo (Maurel et al., 1995) и даже в ответ на действие Са2+ и изменения водного потенциала апопласта (Johansson et al, 1996).

Известно, что радиальный транспорт веществ по апопласту встречает барьер в виде суберенизированных водонепроницаемых поясков Каспари в стенках клеток эндодермы (рис.3). Поэтому вода и растворенные вещества на пути из внешней среды в сосуды ксилемы дважды вынуждены пересекать клеточные мембраны - на входе в симпласт (в

nh2

клетках эпидермиса или коры) и на выходе из симпласта (в стели корня -в клетках перицикла). В этой связи простейший вариант радиального транспорта через корень может быть описан на основе двухмембранной (трехкомпартментной) модели корня (рис.ЗА)(Лялин, 1989; Великанов, 1997).

Эпидермис

1 1

-1 - — _

Коргпекс КсилемЯ

/ , , , У /

I г~П

Ьбькусмь

Клеточка я стен ка.

4-

— — - - — — А —

I • — ) ! тг ■ЬгЗ Г, —Г

%

I \ I , , ч

Подски Каспар /

1

Т^ 2.

-из

I г

V

\

А

Б

Ч

Рис.3. Возможные пути радиального транспорта воды и растворенных веществ в корне (А): 1 - апопластный; 2 - симпластный; 3 - трансклеточный. Б - двумембранная (трехкомпартменная) модель корня (Великанов, 1997).

Основные приближения двухмембранной модели корня вытекают из симпластической теории Апсг (1956), согласно которой перемещение веществ через корни в значительной степени происходит по плазмодес-мам через цитоплазматический континуум, т.е. по симпласту. Однако мобильная доменная организация внутренней и внешней по отношению

к цитоплазме транспортных сетей делает актуальной выделение сетевого (надклеточного) уровня структуры растений (Гамалей, 1997).

Плазматические мембраны соседних клеток способны образовывать зоны смыкания - щелевые контакты (gap junction). Такие щелевые контакты животных клеток представляются довольно стандартными структурами - это организованные группы белковых частиц с гидрофильными порами диаметром 1 нм. Эти белковые структуры мобильны, они многократно возникают и распадаются в ходе клеточного развития (Конев, 1987). Плазматические мембраны соседних клеток в тканях растений разделены толстыми полисахаридными клеточными стенками, поэтому межклеточные контакты растений - плазмодесмы - являются структурно более сложными и более лабильными. Структура плазмодесм разрешается в электронном микроскопе недостаточно четко, вследствие чего существовали разногласия в интерпретации картин, наблюдаемых на снимках. На рис.4 показана наиболее приемлемая модель плазмодесм (Гамалей, 1985; 1996).

Цитоскелетный сфинктер в цито-плазматическом кольце

Трубка эндоплазма-тической сети

Рис.4. Структурная модель плазмодесм (Ю.В. Гамалей, 1996).

По этой схеме плазмодесмы представляют собой сквозные межклеточные каналы, выстланные плазматической мембраной, непрерывно переходящей из клетки в клетку. Средний диаметр канала 40-60 нм при длине 0,5-1мкм. На концах канала имеются шейные сужения. В центре канала проходит стержень - десмотубула, состоящая из мембран эдо-плазматического ретикулума. Первоначально десмотубулу рассматривали как полую трубочку с наружным диаметром около 20 нм. В 1982 году появились сразу несколько работ, выполненных с применением новых препаративных методик, отвергающих такое мнение: десмотубулу стали рассматривать как стержень, не имеющий внутри транспортного канала (Гамалей, 1985). В последние годы споры о стержневом или трубчатом строении эндоплазматической сети внутри плазмодесм сменились, наконец, осознанием возможности обратимых переходов из одного структурного состояния в другое (Гамалей, 1997). При этом по внутреннему кольцу сечения плазмодесм осуществляется вакуолярная связь клеток, а по наружнему - цитоплазматическая. Этот факт позволил ввести понятия о вакуолярном и цитоплазматическом симпласте растительных клеток.

A.JI. Курсановым (1976) было высказано предположение о наличии внутри плазмодесм сфинктерного механизма, контролирующего диаметр их транспортного канала. При этом регуляция пропускной способности симпластного пути транспорта воды может реализовываться, скорее всего, через изменение просвета шейных сужений (Olesen, 1979), а сами шейные сужения обусловлены, таким образом, наличием акто-миозиновых устройств на концах плазмодесм. Наличие актина внутри цитоплазматического кольца было подтверждено результатами иммуно-химического анализа (White et al., 1994). Одновременно появились факты о локализации миозина на мембранах эндоплазматической сети (Liebe, Quander, 1994). В области шейных сужений просвет канала, по-видимому, может быть очень маленьким и сравнимым с размером рас-

творенных ионов, так как на электронно-микроскопических снимках просвет между плазмалеммой в области шейного сужения и десмотубу-лой часто вообще не визуализируется (Owerall et al., 1982).

В свете таких представлений о структуре плазмодесм можно продолжить дальнейшее рассмотрение проблемы и, в частности, двухмем-бранной модели корня на основе симпластической теории Arisz. М.Т. Тугее (1970), проанализировав теорию Arisz на основе термодинамики необратимых процессов заключил, что плазмодесмы реализуют путь наименьшего сопротивления для диффузии малых молекул. Этот вывод позволил автору рассматривать симпласт по одну сторону от поясков Каспари как одну клетку (рис.3,Б).

Было установлено, что структурный переход трубки плазмодесм от открытого к закрытому состоянию обусловлен действием ряда факторов таких, как низкие положительные температуры, водный дефицит, механические повреждения, изменение концентрации цитоплазматического кальция и др. (Гамалей, 1997). В этом, по-видимому, заключается защитная функция плазмодесм.

Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о том, что для межклеточного переноса воды в корнях существуют три пути -через плазматическую мембрану клеток, по системе вакуолярного и цитоплазматического симпласта. Трансмембранный путь переноса воды большей частью проходит, согласно последним данным, преимущественно по однорядным узким порам белковой природы - аквапоринам.

1.2. Строение и функции цитоскелета растений 1.2.1. Общая характеристика

Цитоскелет является остовом цитоматрикса клеток всех эукариот. Он представляет собой трехмерную пространственную сеть из белковых

нитей или филаментов. В клетках высших растений обнаружены все основные элементы цитоскелета - тубулиновые микротрубочки (МТ), мик-рофиламенты (МФ), состоящие из актиновых белков, промежуточные филаменты (ПФ) и белки, связанные с МТ и МФ (Hawes, 1985; Lloyd, 1987; Дорогова, Шамина, 1994; Wang, Zhang, 1995).

Цитоскелет признается важной интегрирующей структурой, определяющей временную и пространственную организацию клеточных функций растений (Tiwary et al, 1984; Туркина, 1985). Установлена роль цитоскелетной сети во множестве биологических явлений и сохранении структурно-функциональной целостности живой клетки (Фултон, 1987). Известно, что цитоскелет участвует в осуществлении ряда универсальных для животных и растительных клеток функций - движении цитоплазмы и органелл, цитокинезе, внутриклеточном транспорте везикул и вакуолей, контактных взаимодействиях с органеллами и мембранами, секреции клеточных продуктов и т.д. Вместе с тем, филаменты цитоскелета в клетках растений выполняют и некоторые специфические функции такие, как ориентация целлюлозных микрофибрилл и формирование клеточной стенки, влияя тем самым на форму клетки и ее поверхностные свойства (Giddings et al, 1991), рост и дифференциация клеток (Traas, 1990), регуляция устьичных движений (Cleary, Hardham, 1989), фитохром-зависимое влияние света и темноты на подвижность хлоропластов, прикрепление пластид к плазмалемме (Schondohn, Meyer-Wegener, 1989), прорастание пыльцы (Speranza, Calzoni, 1989). Выделение из флоэмы листовых черешков Heracleum sosnovsky актина и миозина (Туркина, Куликова, 1982; Соколов и др., 1985) позволило предположить наличие контрак-тильного механизма, регулирующего транспорт ассимилятов во флоэме (Туркина, 1985). В настоящее время применительно к растениям наиболее интенсивно развиваемыми направлениями являются организация и динамика кортикального цитоскелета и его взаимодействия с плазма-леммой (Traas, 1990), идентификация и регуляция связанных с цитоске-

летом белков (Суг, 1991; Туркина, Акатова, 1994; Goddard et al., 1994), ак-томиозиновая система (Туркина, Куликова, 1982; Соколов и др., 1985; Куликова, 1992) и молекулярная фармакология тубулина (Morejohn, 1991).

В настоящее время данные по ПФ в растительных клетках противоречивы и ограниченны. Антитела против белков промежуточных фи-ламентов находят свои антигены в культивируемых in vitro растительных клетках (Ross et al., 1991; Fairbairn et al., 1994). Но в то же время, А.Е. Васильев на основе литературных данных сделал предположение о том, что субъединицы этих филаментов у растений не способны к полимеризации и находятся только в мономолекулярной (растворимой) или сла-бополимеризованной форме, а функцию этих структур в растительных клетках выполняет клеточная стенка.

1.2.2. Микротрубочки

Микротрубочки - это полые филаменты, около 24 нм в диаметре, которые собраны из гетеродимеров, содержащих а- и (3-тубулиновые полипептиды, молекулярная масса которых составляет около 50 кД. Тубу-линовые димеры построены в виде протофиламентов, которые соединены друг с другом в форме полого цилиндра. Большинство МТ содержит 13 протофиламентов, но в специфичных МТ их может быть больше или меньше (Goddard, 1994). По данным Silflow с сотр. (1987), растительные и животные тубулины на 79-87% идентичны. Растительный тубулин имму-нологически и фармакологически отличается от тубулина простейших и водорослей (Morejohn, Fosket, 1991), но вместе с тем тубулины из растений, простейших, водорослей и животных могут быть совместно поли-меризованы in vitro. Кроме того, отдельные антитела могут проявлять перекрестную реакционную способность к тубулинам широкого набора видов (Morejohn, 1991; Hugdahl, Morejohn, 1993; Morejohn, Fosket, 1991).

Тубулиновые димеры имеют две функциональные области: поли-меризующую и регуляторную. Полимеризационная область включает в себя большую часть массы димера и содержит места связвания АТР, участки димер-димерного связывания в пределах протофиламентов, а также между ними (Almos, 1991). Регуляторная область состоит из карбоксильного окончания как ос-, так и ß-субъединиц (Serrano et al, 1984; Sacket, Wolf, 1986). Волокнистые микротрубочко-ассоциированные белки (MAPs) связываются с регуляторной областью, способствуя полимеризации тубулина и стабилизируя МТ (Serrano et al, 1984; Wiche et al, 1991). На тубулинах млекопитающих показано, что полимеризационная область в норме может быть заингибирована от сборки регуляторной областью, связывание которой с Са2+ усиливает этот процесс. Таким образом, возможна регуляция полимеризации и стабильности МТ в клетках за счет MAPs и Са2+ (Суг, Palevitz, 1989).

В настоящее время применительно к растениям наиболее интенсивно развиваемым направлением является идентификация, регуляция и изучение роли связанных с цитоскелетом белков, в частности, белков, связанных с тубулином (Goddard et al, 1994). Существуют различные классы таких белков, два из которых наиболее изучены - это волокнистые MAPs, такие, как tau и МАР2, которые обеспечивают стабильность МТ и перекрестную связь последних с другими структурами, а также двигательные, такие, как динеин и кинезин, которые выполняют транспортные функции (Суг, Palevitz, 1989; Goddard et al, 1994). Присутствие MAPs-белков в клетке существенно снижает так называемую «критическую концентрацию» растворимого тубулина, необходимую для начала полимеризации МТ, путем стабилизации «затравок» новооб-разующихся МТ (Суг, Palevitz, 1989).

Во многих растительных клетках найдены белки, способные «сшивать» отдельные элементы цитоскелета не только между собой, но также и с мембранными структурами, образуя единый мембрано-

цитоскелетный комплекс клетки (Заварзин и др., 1992; Wang, Zhang, 1995). Семейство белков, ассоциированных с МТ, обладает способностью связываться как с МФ, так и с ПФ. Например, анкирин может взаимодействовать с МТ и одновременно через спектрин, который связывается с анкирином, способен в свою очередь прикрепляться к мембранным белкам. С помощью иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии спектрин-подобные белки, не отделимые от цитоскелета, обнаружены и на внутренней поверхности плазмалеммы замыкающих клеток устьиц (Wang, Zhang, 1995). В растительных клетках, в частности, в неочищенном экстракте из культуры клеток табака, был выявлен полипептид с М.м. 65 кД, который обладал способностью связываться с МТ и образовывать поперечные мостики между ними (Cyr, Palevitz, 1989). В пыльцевых трубках табака обнаружен также гомолог животного кинезина, относящегося к классу энерготрансдуктирующих MAPs (Tiezzi et al., 1992).

Ассоциированные с МТ белки выполняют важнейшие функции, способствующие устойчивости клеток к неблагоприятным воздействиям. Job с сотр. (1982) выделили из мозга белки, повышающие устойчивость МТ к охлаждению in vitro. По-видимому, такие белки должны существовать и в клетках растений. На это указывает тот факт, что растительные МТ, собранные in vitro, нередко проявляют высокую чувствительность к холоду, в то время как в неповрежденных растительных клетках обнаруживают устойчивость. Например, как следует из работы Akashi с сотр. (1990), кортикальные МТ в клетках табака были холодоустойчивы, однако МТ этих же клеток, собранные in vitro, легко деполи-меризовались при охлаждении. Это говорит о том, что в клетках растений неустойчивые тубулиновые структуры должны быть защищены особыми белками и другими защитными веществами. Такие белки действительно существуют. Так, Суг и Palevitz (1989) выделили из клеток морко-

ви белки, которые вызывали сборку МТ, образование их пучков in vitro и тем самым повышали их холодостойкость. Недавно выделен из клеток табака полипептид 65 кД, который образовывал перекрестные мостики между отдельными МТ (Jiang, Sonobe, 1993). Вполне возможно, что выделенные белки относятся к MAPs-белкам, ассоциированным с МТ.

В целом же растительные MAPs являются малоисследованными в отношении их идентификации, изучении свойств и определении их генов (Goddarg et al, 1994).

Процессы полимеризации МТ в животных клетках хорошо изучены в настоящее время. Их сборка обычно происходит в специфических местах - микротрубочко-организующих центрах (МТОЦ), которые, в отличие от актинового кортекса, где одновременно работают несколько центров полимеризации, строго централизованы и присутствуют по 1-2 центра полимеризации на клетку (Васильев, 1996). Минус-конец каждой МТ ассоциируется с МТОЦ. Наиболее распространенный вариант МТОЦ - центриоли, базальные тельца и кинетохоры митотических хромосом. Возможно, что образование МТ может происходить и на других структурах, поскольку в клетках высших растений нет центриолей, а ци-топлазматические МТ выражены очень хорошо (Ченцов, 1995). Gunning и Hardham (1982) предположили, основываясь на электронно-микроскопических исследованиях, что МТ в растительных клетках в основном полимеризуются в клеточном кортексе. Позднее, однако, было выявлено, что МТ полимеризуются на поверхности ядра (Lloyd, 1987). Затем Laporte с сотр. (1993) вновь выдвинули гипотезу о возможности полимеризации кортикальных МТ из пула мембрано-ассоциированного тубулина. На свободных плюс-концах некоторые МТ подвержены быстрой разборке, тогда как другие продолжают собираться. Этот процесс обусловлен динамической нестабильностью. Время жизни отдельной МТ может быть порядка от нескольких секунд до минут (Hush et al, 1994). Считается, что это лабильные структуры, находящиеся в динамическом

равновесии с пулом свободных молекул тубулина (Гудвин, Мерсер, 1986). Механизм, регулирующий сборку/разборку МТ в растительных клетках, пока не известен, но были предложены модели, которые включали колеблющуюся GTF-тубулиновую «шапку» (Chen, Hill, 1985) и латеральную GTF-тубулиновую «шапку» (Bayley, 1990). Также было установлено, что деполимеризация МТ чаще всего происходит посредством укорочения и/или внутреннего разрушения МТ.

В растительных клетках выделяют 4 основных построения МТ, которые последовательно сменяют друг друга в процессе митоза клеток и характерны для интерфазы, препрофазы, метафазы и цитокинеза. Все эти формирования универсальны в растительных клетках. В период интерфазы в клетках, имеющих клеточную стенку, тубулиновые МТ выстилают примембранный слой цитоплазмы, располагаясь параллельно целлюлозным фибриллам клеточной стенки (Williamson, 1993). Hush с сотр. (1994) показали, что при переориентации МТ происходит изменение полярности клетки. В клетках, лишенных клеточной стенки, (эндосперме, материнских клетках пыльцы), МТ располагаются радиально от ядра к кортикальному слою цитоплазмы. В препрофазе МТ, образуя препро-фазный пучок, располагаются в виде кольца, окружающего ядро и влияют на местоположение зарождающейся клеточной пластинки, а также «метят» место, в котором клеточная пластинка будет сливаться с родительской клеточной стенкой (Wick, Dunier, 1983). В метафазе МТ образуют пучки кинетохорных МТ, связывающих хромосомы в области экватора. Во время цитокинезиса фрагмопластные образования МТ вовлекаются в транспорт везикул, содержащих материал для синтеза новых клеточных пластинок (Vantard et al., 1990; Yashuhara, 1993).

Привлекает внимание такая особенность цитоскелета растительных клеток, как большое разнообразие по численности генного семейства тубулиновых белков в отличие от животных клеток (Goddard et al., 1994). Например, маленький геном Arabidopsis содержит 15 тубулиновых

генов - 6 генов а-тубулина и 9 - ß-тубулина. Еще больше тубулиновых генов содержат геномы кукурузы и сои. Значение большого разнообразия генного семейства рассматривается как условие, обеспечивающее периодическую экспрессию тех или иных генов, необходимую не только для процессов деления и дифференциации растительных клеток, но и для изменений в морфологии клеток при адаптации к изменяющимся условиям существования (Goddard et al, 1994).

В растягивающихся и дифференцирующихся клетках МТ, расположенные около внутренней поверхности плазматической мембраны, по-видимому, участвуют в образовании клеточной оболочки, контролируя упаковку целлюлозных микрофибрилл, которые откладываются цитоплазмой на растущую клеточную оболочку (Lloyd et al, 1987; Seagull, 1992). Предполагаются два механизма воздействия МТ на ориентацию микрофибрилл целлюлозы. Цитоплазматический домен целлюлозосин-тетазного комплекса может быть прямо или косвенно связан с МТ, лежащими в кортикальном слое (Preston, 1988). Согласно другой гипотезе, МТ направляют движение синтазных комплексов параллельно задаваемой или оси. В данном случае интенсивность синтеза не зависит от состояния МТ, они лишь ограничивают те участки плазмалеммы, где может продвигаться комплекс ферментов (Албертс и др., 1994).

Помимо контроля за ориентацией фибрилл целлюлозы и увеличения прочности клетки МТ-скелет интерфазных клеток растений, вероятно, может выполнять и некоторые другие функции. Так, например, глубинные МТ часто контактируют с ядром, иногда с пластидами. Получены данные о том, что они могут генерировать независимое движение или обеспечивать фиксированное положение этих органелл в движущейся цитоплазме (Lloyd et al, 1987). В особых случаях МТ могут участвовать в поддержании полярного распределения органелл в георецепторных клетках (статоцитах) корневого чехлика, участвовать в фото- и грави-тропических реакциях (Nick et al, 1990).

Таким образом, МТ играют важную роль в росте и развитии растений за счет регуляции субклеточной организации, клеточного деления и полярности, в конечном итоге участвуя в морфогенезе ткани и органа, а также процессах адаптации.

1.2.3. Микрофиламенты

У высших растений микрофиламенты (МФ) начали изучать сравнительно недавно, после того, как были преодолены методические трудности их выявления под световым и электронным микроскопами. К настоящему времени они обнаружены в различных органах и самых разнообразных типах клеток довольно большого числа видов растений (White, Sack, 1990; Васильев, 1996).

МФ состоят из сократительного белка актина и имеют одинаковое строение в клетках всех эукариот. Как установлено в результате электронно-микроскопического изучения изолированных и негативно окрашенных МФ, они представляют собой еще более тонкие (чаще всего 5-7 нм), чем МТ, гибкие сплошные нити или стержни неопределенной длины спиральных, правозакрученных относительно друг друга тяжей из повторяющихся субъединиц длиной 38 нм каждая и включающих 13 молекул актина (Schliwa, 1986; Steiger, Schliwa, 1987). МФ состоят из Ф-актина (фибриллярного актина) в отличие от глобулярного Г-актина (Kabch, Vandekerckove, 1992), каждая молекула которого связана с остатком АТФ и ионом Са2+. Изолированный Г-актин является термолабильным белком, при добавлении солей он превращается в Ф-актин (Heackock et al., 1982).

Клетки животных и растений имеют много общего в локализации и архитектуре филаментов актинового цитоскелета. При помощи дот-блот-анализа с использованием в качестве маркера Ф-актина фаллои-дин-коллоидного золота в клетках кончика корня озимой пшеницы вы-

явлены следующие конфигурации Ф-актинсодержащих структур цито-скелета: толстые цепи МФ, проходящие внутри клетки; цитоплазматиче-ская микрофиламентная сеть, которая, вероятно, окружает и поверхность органелл; сеть тонких филаментов субкортикального слоя; внут-ривезикулярные Ф-актинсодержащие структуры (Грингауз и др, 1998). В животных клетках МФ также представлены несколькими типами. Первый тип - стресс-фибриллы или пучки параллельно ориентированных нитей, пронизывающих всю клетку насквозь и соединяющих места взаимодействия поверхности клеток с субстратом или другими клетками, а также с противоположными участками клеточной мембраны. Второй тип - сеть актиновых филаментов с треугольными отверситями, ориентированная вокруг ядра. В точках соединения пучков МФ образуются «узлы» или «фокусы» сети, расстояние между которыми около 3,7 нм. Третий тип - довольно длинные актиновые волокна, локализующиеся на различных полюсах клетки и составляющие периферийную примем-бранную сеть МФ, разрушающуюся цитохалазином (Браун, Моженок, 1987).

С генетической точки зрения растительный актин проявляет значительно большее разнообразие (изовариантность), чем актин животных (Hightower, Meagher, 1986). Гены растительных актинов объединяют в несколько функциональных субклассов. По аналогии с животными актинами были охарактеризованы три субкласса таких генов, которые по-разному экспрессируются в разных органах и тканях: ц-актин - в основном в фотосинтезирующих органах и тканях; Х- актин - в протодерме корня; к-актин - в других тканях корня (за исключением меристем) (Hightower, Meagher, 1986).

В клетке МФ всегда находятся в динамическом равновесии с Г-актином, растворенном в цитозоле, причем их регулируемая самосборка на одном конце, называемом «плюс»-концом, идет быстрее, чем на другом, «минус»-конце. Сборка актина в двойную спираль происходит с за-

тратой АТФ в присутствии Mg2+ (Васильев, 1996). Полимеризация и деполимеризация молекул регулируется разными актин-связывающими белками. Точная локализация актин-связывающих белков не известна, а их функции изучены в основном in vitro. В настоящее время установлено, что цитоскелет эукариот содержит 75-150 различных актин-связывающих белков (Соколов и др., 1998). По-видимому, многие актин-связывающие белки могут регулировать процесс полимеризации локально, то есть контролировать отдельные стадии полимеризации или определять свойства полимера, связывать их с мембранами, обеспечивая их взаимодействие, стабильность, распределение и специфику функционирования (Schellenbaum et al., 1992; Mills, Mandel, 1994). Некоторые из таких белков присоединяются к одному концу нити, блокируя на этом конце полимеризацию и деполимеризацию, тогда рост и укорочение микрофиламента идет лишь на другом конце, не закрытом блокирующим белком. Некоторые специальные белки соединяют несколько мономеров в зачаток нити, вызывают нуклеацию нового МФ. В дальнейшем такие нити растут в одну сторону, обычно в сторону «плюс»-конца. Определенные белки могут присоединяться к бокам нескольких МФ, при этом одни белки связывают МФ в сети, другие - в пучки (Васильев, 1996).

Периферические МФ обычно не образуют крупных агрегатов, сеть их очень тонкая. Часть одиночных МФ располагается в промежутке между кортикальными МТ, параллельно им, и связываясь с этими МТ параллельными мостиками (Steiger, Schliwa, 1987; Eleftheriou, Palevitz, 1992). Часть кортикальных МФ связана с плазмалеммой «плюс»-концом и отходят от нее под разными углами (Ryu et al., 1995). В результате система периферических МФ оказывается заякоренной на плазмалемме, а через МФ-связывающие белки - на оболочке (Williamson, 1993). Из белков, осуществляющих контакт с мембраной, наиболее хорошо изучен спек-трин, впервые выделенный вместе с актином из теней эритроцитов, а затем и из растительных клеток (Медведев, Маркова, 1998). К сопутст-

вующим спектрину белкам относят анкирин (М.м. 200000) и белки с М.м. 80000. В процессе связывания актина с плазматической мембраной определенная роль принадлежит также и некоторым белкам, которые идентичны по функциям и организации спектрину эритроцитов. К этим белкам относятся а-анкирин, фимбрин, винкулин и талин (Wang, Zhang, 1995). Эти белки сконцентрированы в тех областях клетки, в которых оканчиваются пучки МФ, то есть в местах актин-мембранных контактов.

В последнее время широко принятой является концепция мембра-но-цитоскелетного комплекса, в которой учитывается взаимодействие плазмалеммы, эндомембран и компонентов цитоскелета. Семейство белков, ассоциированных с МТ обладает способностью ассоциироваться как с МФ, так и с ПФ. По-видимому, коаксиальные кортикальные МФ контролируют ориентацию МТ или стабилизируют их (Ding et al, 1991; Медведев, Маркова, 1998). Однако, Palevitz (1987) считает, что, напротив, МФ организуются МТ-скелетом.

В последнее время интенсивно исследуются возможные функции актин-связывающих белков. Так, было установлено, что для прохождения отдельных этапов морфогенеза необходимо благоприятное соотношение между Ф-актином и различными актин-связывающими белками (Туркина, Куликова, 1982). М.В. Туркиной с сотр. (1995) получены данные о наличии в клетках растений тропомиозина и кальдесмона - термостабильных актинсвязывающих белков, которые, совместно с кальмоду-лином осуществляют регуляцию взаимодействия актина и миозина в гладких мышцах.

Актомиозиновая система принимает участие в движении протоплазмы, в клеточном делении, в секреторных процессах, в подвижности хлоропластов и других органелл и компонентов мембран, во внутриклеточном, межклеточном и флоэмном транспорте ассимилятов (Соколов и др, 1986). Благодаря взаимодействию актиновых волокон и молекул

миозина создается «натяжение» цитоскелета, что играет важную роль в восприятии гравитации (Sievers et al., 1994).

В последнее время значительное внимание исследователей сосредоточено на взаимодействии белок-синтезирующего аппарата с цитоскеле-том. Было установлено, что определенные актин-связывающие белки являются частью белок-синтезирующей «машины», принимая участие в связывании мРНК с МФ, которые определяют «стационарное» распределение матриц вслед за «трансмагистральным» их перемещением из ядра с участие МТ. Существует предположение, что именно специфическое расположение актин-связывающих белков и обуславливает определенную внутриклеточную локализацию матриц (Sundell, Singer, 1991). Кроме того, обнаружена ассоциация белка-фактора элонгации eEFl-a с ци-тоскелетом, который содержит два актин-связывающих домена и может участвовать в формировании пучков актина, связываясь с актином фи-ламентов в отношении 1:1. Относительно функциональной роли связи этого белка с цитоскелетом высказываются разные предположения, среди которых и участие eEFl-a в модификации организации цитоскелета для адаптации к потребностям белок-синтезирующей системы, и участие eEFl-a в передаче экстраклеточных сигналов на белок-синтезирующую систему, а также вероятность выполнения дополнительных функций, не связанных с трансляцией (Edmonds et al., 1995).

В отличие от микротрубочкового МФ-цитоскелет, как правило, пронизывает всю цитоплазму, образуя прерывистую или непрерывную сеть. Частота и архитектоника МФ-сети варьирует в зависимости от типа и фазы развития клетки, от таксономической принадлежности растения (Васильев, 1996). Наиболее крупные тяжи в удлиненных клетках располагаются по направлению тока цитоплазмы, что рассматривается как свидетельство участия актиновых филаментов в генерировании этого процесса (Steiger, Schliwa, 1987).

41

1 KKW»W?

В настоящее время совершенно определенно доказана' брано-цитоскелетного комплекса в формировании и поддержании клеточной полярности (Медведев, Маркова, 1998) - процесса, имеющего важное значение при делении клетки, определяющего направление растяжения закончившей деление клетки, в процессе прорастания пыльцевого зерна, а также в гравитропизмах.

При анализе ассоциации МФ с органеллами многие авторы обычно отмечают более высокую концентрацию МФ в зоне около ядра, вокруг которого образуется «футляр» из МФ, контактирующих с ядерной оболочкой. Помимо ядра обнаружены тесные контакты МФ с секреторными пузырьками (Ding et al, 1991), диктиосомами, элементами эндо-плазматического ретикулума (Lichtscheid et al, 1990), пластидами (Nagai, 1993), митохондриями (Lichtscheid et al, 1990). В клетках высших растений МФ, по-видимому, в первую очередь ответственны за характерное распределение органелл, за генерирование общего движения цитоплазмы и движения органелл. Эти два движения, очевидно, следует различать. При первом, наблюдаемом, например, у элодеи (Miyake, Nakamura, 1993) все хлоропласты в клетке движутся в одном направлении с одинаковой скоростью, при втором (Nagai, 1993) - скорость и направление движения органелл различны. Наличие, как правило, только кортикальных МТ делает их участие в генерировании движения и контроле за распределением органелл маловероятным. МФ же, располагающиеся по всей цитоплазме, контактируют со всеми органеллами; их тяжи часто ориентируются по оси движения цитоплазмы (Partharathy et al, 1985) и хлоропластов (Nagai, 1993). Ингибирование МФ вызывает остановку и нарушение распределения элементов эндоплазматического ретикулума (Quander, 1990), а также ядра (Palevitz, 1980), предотвращает изменение положения хлоропластов в ответ на изменение освещенности (Allen, Allen, 1978). И в то же время разрушение МТ не вызывает остановки дви-

жения цитоплазмы даже в корневых волосках, в которых имеются глубинные МТ (Lloyd, 1987).

Не исключается возможность участия МФ в делении пластид, при этом на месте перетяжки образуется сократительное кольцо (иногда спираль) из МФ, связанных поперечными мостиками с наружной мембраной пластидной оболочки (Hasezawa et al., 1988).

Система МФ может иметь непосредственное отношение к регуляции активности ионных каналов растительной клетки. Обработка фал-лоидином, стабилизирующим актиновые МФ и цитохалазином Д, разрушающим их, оказала противоположное действие на организацию МФ, устьичные движения и активность К+-каналов в Commelina communis. Фаллоидин ингибировал АБК-зависимое закрывание и светоиндуциро-ванное открывание устьиц, а цитохалазин Д, нарушая радиальное расположение МФ в замыкающих клектах устьиц, вызывал частичное открывание устьиц в темноте (Lee et al., 1995). Открывание устьиц под действием цитохалазина Д авторы связывают с изменением активности К+-каналов и аккумуляцией К+ в замыкающих клетках.

Еще одной специфической функцией МФ в растениях является их участие в гравитропизмах. Установлено механическое взаимодействие между сетью МФ и статолитами в корнях Lepidium sativum (Sievers et al., 1994). White и Sack (1990) в гравичувствительных клетках Zea mays и Hor-deum vulgare обнаружили МФ около проксимальной стороны амилопла-стов, причем хорошо прослеживались актиновые филаменты, контактирующие с индивидуальными амилопластами. Наиболее удачной попыткой объяснить механизм трансдукции гравитационных воздействий считается гипотеза Pickard (1992, 1994), согласно которой трансформация

механических сигналов в электрохимические процессы связана с функционированием так называемого «контрольного центра плазмалеммы». Важнейшее место в нем занимает взаимодействие механочувствитель-ных Са2+-каналов плазмалеммы с элементами клеточной стенки и цито-

скелетом. Предполагается, что механочувствительные каналы соединены не только с различными регуляторными белками плазмалеммы и цитоплазмы, но и с помощью специальных «линкеров» связаны с клеточной стенкой и цитоскелетом. В качестве «линкеров» используется набор ак-тин-связывающих белков-анкиринов.

1.3. Водный стресс и цитоскелет растений

Актин и тубулин - мультифункциональные белки, требуемые для широкого разнообразия клеточных процессов, включая ответы на специфические сигналы окружающей среды (Chowdhury et al., 1992). В последнее время в связи с этим возрос интерес к изучению роли цитоскеле-та при передаче информации и транспорте веществ по растению. Так, переход цитоскелетного белка 45кД в ядерную фракцию при стрессе может служить сигналом о наступлении неблагоприятных условий (Войников, Иванова, 1988).

В современной литературе крайне недостаточно освещен вопрос о влиянии дегидратации на структурное и функциональное состояние ци-тоскелета растительных клеток. Показано, что водный стресс, в том числе возникающий и при замораживании клеток, вызывает деполимеризацию МТ (Beese, 1987; Bartolo, Carter, 1991; Artlip, 1993). Основываясь на сравнении результатов Х-лучевой дифракции и электронной микроскопии, Beese с сотр. (1991) смоделировали изменение структуры МТ при дегидратации. В присутствии сахарозы происходила такая реорганизация внутренней структуры МТ, в результате которой их наружная поверхность становилась более рыхлой, а внутренняя, напротив, - более плотной. При этом во внутренней полости МТ образовались выступы, которые взаимодействовали друг с другом. Однако в этой работе была исключена роль MAPs, которые были невидимыми при электронной

микроскопии и считались деструктурированными, и поэтому их ролью пренебрегли.

Клеткам необходимы достаточно длинные МТ, чтобы поддерживать плазматическую мембрану интактной и отвечать на осмотические изменения. При стрессовых условиях, вызванных гипертонической обработкой, МТ могут служить опорой для плазматической мембраны (Kerr, Carter, 1990; Pihakasky-Maunsbach, Puhakainen, 1995). При действии низкотемпературного стресса МТ начинали «разбираться» до определенной критической точки, когда клетки уже не могли выживать с укороченными МТ (Pihakasky-Maunsbach, Puhakainen, 1995).

Немного известно и об ответной реакции МТ in vivo. Дегидратация, подобно низкой температуре, может иметь как прямой, так и непрямой эффекты на стабильность МТ in vivo. Что касается прямого эффекта, то незначительные осмотические отклонения вызывают изменения ориентации МТ в удлиняющихся растительных клетках (Roberts et al, 1985) и их деполимеризацию (Artlip, 1993). По мнению Bartolo и Carter (1991), дегидратация не прямо влияет на МТ, вызывая их деструкцию (разборку), а косвенным путем - через изменение концентрации свободного Са2+ в цитозоле. Показано, что концентрация цитозольного Са2+ увеличивается при стрессовых воздействиях (Woods et al, 1984; Lynch et al, 1989). МТ очень чувствительны даже к микромолярным концентрациях Са2+ (Dawson, Lloyd, 1987; Bokros et al, 1996). Их полимерное и структурное состояние, разборка и сборка, фрагментация, связывание в пучки, взаимодействие с мембранами полностью регулируются ионами Са2+ в комплексе с кальмодулином. Эта регуляция осуществляется посредством изменения конформации ассоциированных с МТ белков через их фосфорилирование. Авторы допускают, что обезвоживание сопровождается высвобождением конфискованного Са2+ в цитозоль из ЭПР, вакуоли и митохондрий. Именно повышение концентрации Са2+ предположительно является непосредственной причиной деполимеризации МТ

при замораживании (Bartolo, Carter, 1991), которое, как известно, всегда сопровождается дегидратацией.

Развитие неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы связывается с «коллоидными реакциями», среди которых преобладающей является полимеризация актина (Браун, Моженок, 1987). Физиологическое значение желатинирования при стрессовых воздействиях состоит в следующем: во-первых, превращение цитоплазмы в гель может служить для фиксации состояния клетки или выключения большинства биохимических процессов с тем, чтобы после превращения цитоплазмы в золь клетка была способна перейти в новое метаболическое состояние; во-вторых, образование трехмерной сети должно привести к значительному повышению упорядоченности структуры цитоплазмы, что дает возможность обеспечить мгнрвенную передачу сигналов по образовавшейся системе связи; в-третьих, создание в клетке дополнительных фибриллярных структур может дать временное увеличение ориентированных поверхностей для локализации временных ферментных комплексов, т.е. могут быть включены дополнительные энергетические резервы клетки для неспецифического ее ответа на внешние воздействия (Подгорная, Пинаев, 1981).

М.В. Туркиной с сотр. (1982) было установлено, что полимеризация актиновых филаментов происходит в среде с высокой осмотично-стью. Наличие в ситовидных трубках сахарозы в высоких концентрациях (« 1М), по их мнению, создает весьма специфические условия для сборки и функционирования сети МФ. Так, показано, что в 1М растворе сахарозы полимеризация актина может происходить в несвязанной с АТФ форме.

В клетках дрожжей была показана быстрая разборка и обратная адаптивная реполимеризация актинового цитоскелета при действии осмотического стресса (Chowdhury et al., 1992). Авторы предполагают, что физиологической функцией актинового цитоскелета при обезвоживании

клеток является координация двух различных процессов, необходимых для роста клеток - направленная передача макромолекул и вход воды, управляемый осмотическим градиентом. Если осмоляльность наружного раствора увеличивалась, например, при добавлении NaCl, осмотический градиент в дрожжах восстанавливался за счет накопления интрацеллю-лярного глицерола (Reed et al, 1987). Глицерол -вещество, которое стимулирует как образование МТ in vivo, так и стабилизацию изолированных МТ (Lee, Timasheff, 1977). Авторы показали, что в присутствии глицерола формирование МТ из очищенного тубулина мозга идет более активно, хотя механизм воздействия этого соединения на самосборку МТ пока не известен. Было высказано предположение о том, что глицерол побуждает тубулин принимать конформацию, которая имеет более высокую способность к полимеризаций и противодействовать ингибиторам полимеризации.

Таким образом, обобщая крайне скудно представленные в литературе данные по влиянию водного стресса на структурную целостность и состояние цитоскелета, можно заключить, что дегидратация приводит к разборке МТ, действуя либо непосредственно на их белки, либо опосредованно - на ионы Са2+, в то время как для полимеризации МФ необходима среда высокой осмотичности.

1.4. Влияние цитоскелета на состояние и транспорт воды

Механизмы, регулирующие транспорт воды в живых клетках, находятся под контролем их метаболизма. Об этом свидетельствуют многочисленные данные, полученные как на тканях животного (Наточин, Чапек, 1976; Parisi, Bourguet, 1985), так и растительного происхождения (Жолкевич, 1968; Гордон, 1976; Каримова и др., 1978; Шматько и др., 1989). Основной движущей силой является градиент активности воды в клетках (Алексеев, 1948). Активность воды в клетках зависит от темпера-

туры, давления (прежде всего тургорного) и взаимодействия воды с неводными компонентами (гидратация макромолекул и ионов, иммобилизация воды макромолекулами). В свою очередь, взаимодействие воды с неводными компонентами обуславливается их количеством, составом и конформационными изменениями. Все это связано с метаболизмом клетки, следовательно, с ним связана и величина градиента активности воды внутри и снаружи клетки, определяющая ее транспорт.

ВС клеток - один из важных параметров водообмена растений. Особое значение ВС приобретает в условиях засухи, повышенной и низкой температуры, так как этот показатель характеризует способность клеток противодействовать обезвоживающему действию данных факторов. Составляющие ВС подробно описаны в 1.1.1, а в настоящем разделе рассмотрим взаимодействия этих составляющих с элементами цито-скелета. Большая поверхность цитоскелета, взаимодействуя с водой, обуславливает значение воды в регуляции метаболизма (Гамалей, 1985).

Первое указание на участие цитоматрикса в процессах внутриклеточного водообмена имеется в работе A.M. Алексеева (1969), по мнению которого вода является одним из ингредиентов сложной, целостной и подвижной структуры цитоплазмы, и что состояние воды, степень ее связанности и активность определяется состоянием всей этой упорядоченной системы в целом. Не употребляя терминов «цитоматрикс» и «цитоскелет», A.M. Алексеев, тем не менее предсказал важность тонких взаимодействий молекул воды с белками цитоплазмы для поддержания ее структурированности.

Clegg (1984) и Снигиревская (1990) обобщили немногочисленные данные литературы о влиянии цитоскелета на состояние и транспорт воды в клетках животных тканей. По мнению Clegg (1984), состояние (степень связанности и растворяющие свойства) большей части внутриклеточной воды изменены за счет связей с ультраструктурой клетки, особенно с цитоматриксом. Porter с сотр. (1984) при характеристике ци-

топлазматического матрикса описывает картину микротрабекулярной решетки, представляющей собой сетчатую структуру, сильно разветвленную в цитоплазме, за счет чего обеспечивается большая поверхностная область контакта с водой. Увеличение или уменьшение поверхности цитоматрикса, вызванное сборкой или разборкой элементов цитоскеле-та, может приводить, соответственно, к уменьшению или увеличению связывания клеточной воды, что будет влиять на водоудерживающие силы клетки и растворяющие свойства клеточной воды. Однако может иметь место и обратное влияние, когда сборка и разборка цитоматрикса может зависеть от свойств клеточной воды. Такие механизмы, вероятно, важны для динамической обновляемое™ цитоматрикса. Таким образом, цитоматрикс может играть существенную роль в формировании свойств внутриклеточной воды, в то же время воды может иметь значение для механизма регуляции цитоматрикса, и оба этих фактора (вода и цито-скелет) соединяют большинство клеточных процессов. Поэтому вполне логично, что вода и цитоматрикс должны рассматриваться вместе, в контакте друг с другом (Clegg, 1984).

Существует тесная корреляция между модификациями цитоматрикса и изменением свойств воды, что обычно сопровождает клеточную трансформацию. Одним из первых экспериментальных доказательств предполагаемой связи между цитоматриксом и водой является работа Beal (1980), который на основании ЯМР-данных показал, что вода в ми-тотических клетках (на S-фазе) более подвижна, чем на других стадиях клеточного цикла, и что это связано с менее развитой ультраструктурной организацией цитоплазмы и, прежде всего, цитоскелета.

Структурные изменения плазматической мембраны растительных клеток тесно связаны с изменениями в цитоплазматическом матриксе (Lloyd, 1982; Porter, 1984; Tiwary et al, 1984; Schliwa et al, 1986; Фултон, 1987). Латеральное, а также концевое прикрепление филаментов цитоскелета к плазматической мембране наблюдалось в электронно-

микроскопических исследованиях и было подтверждено при помощи биохимических тестов (Gieder et al., 1984; Schliwa, 1986; Traas, 1990).

Обзор литературы последних 15 лет по этой теме обнаруживает сложность и изменчивость структуры мембрано-цитоскелетных взаимо-дейтствий в различных типах клеток и для различных филаментных систем. Исключение представляют лишь эритроциты, в которых установлен точный молекулярный механизм и регуляция мест «заякоривания» фи-ламентов на плазмалемме (Bennet, 1985), но совершенно открытым остается вопрос о молекулярной основе этих взаимодействий в высших растениях. Для животных клеток предложено три возможных механизма взаимодействия цитоскелета с мембраной (Браун, Моженок, 1987):

■ прямое взаимодействие с трансмембранными белковыми рецепторами, которые могут контактировать с экстрацеллюлярными белками. Такие белки могут передавать информацию от экстра-целлюлярного пространства в цитоскелет, таким образом влияя на клеточные функции;

■ прямое включение филаментных белков в липидный бислой;

■ ассоциация цитоскелета с периферическими белками, которые сами включены прямо в липидный бислой или взаимодействуют с интегральными белками, или же работают оба механизма.

Одной из первых работ по изучению взаимодействия МТ с плазма-леммой являются исследования Murray (1983, 1984), который, используя электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием, на одноклеточной водоросли Distigms proteus показал, что после Са2+-индуцированной деполимеризации МТ экзогенно добавленный тубулин индуцировал полимеризацию в присутствии мембран, и предположительные места связывания МТ с плазмалеммой первоначально были заняты эндогенным белком-рецептором. Затем Akashi с сотр.(1990) показали, что обработка протопластов табака хемотрипсином и протеазами приводит к отсоединению МТ от плазматической мембраны, на основа-

нии чего они предположили, что трансмембранные белки ответственны за цитоскелет-мембранное взаимодействие. При исследованиях, проведенных на животных клетках, была установлена как способность тубу-лина взаимодействовать с изолированными мембранами, так и присутствие в очищенной клеточной мембране прочносвязанных тубулино-подобных молекул (Bernier-Valentin et al, 1983). Такой прочносвязанный тубулин был идентифицирован не только в клеточной мембране, но и в мембранах митохондрий и секреторно-гранулярных мембранах, причем а-тубулиновая изоформа прочнее связывается с мембранами, чем ß-изоформа (Stephens, 1986). Laporte с сотр. (1993) на культуре клеток табака показали, что и в высших растениях плазматическая мембрана содержит значительные количества тубулина. При сравнении «мембранного» тубулина с растворимым тубулином цитоплазмы была установлена идентичность в молекулярной массе, пептидных картах, высокая способность связывать ингибиторы, кроссреактивность с антитубулиновыми антителами (Stephens, 1986). Принимая во внимание локализацию, а также физико-химических свойства мембранного тубулина было выдвинуто две гипотезы относительно его функций. Согласно одной из них, сам мебмранный тубулин может быть вовлечен во взаимодействие кортикальных МТ с плазмалеммой (Bernier-Valentin et al, 1983), согласно второй - мембраный тубулин представляет пул для полимеризации кортикальных МТ (Laporte et al, 1993).

Таким образом, многочисленные экспериментальные данные, связанные с установлением взаимодействия компонентов цитоскелета, заложили основу для исследований внутри- и межклеточного транспорта воды в клетках. Большинство экспериментальных данных по этому вопросу получены для клеток животных. Так, участие МТ в транспорте воды через эпителий мочевого пузыря жабы было продемонстрировано при использовании такого классического приема, как ингибиторный анализ с помощью антимитотических агентов - колхицина и винбласти-

на (Снигиревская, 1990). При увеличении осмотического потока воды через клетки мочевого пузыря амфибий под влиянием антидиуретического гормона (АДГ) происходит встраивание в апикальную мембрану клеток водных каналов (Снигиревская 1990). Их источником являются везикуло-тубулярные структуры цитоплазмы, так называемые агрефоры (Brown, 1989) или пул специализированных гранул (Комиссарчик, Снигиревская, 1990). Было установлено, что увеличение проницаемости клеток для воды связано с реорганизацией цитоскелета (Снигиревская, 1990; Комиссарчик и др., 1996). При ингибировании МТ колхицином отмечено уменьшение агрегатов ВМЧ на поверхности апикальной мембраны и мест слияния цитоплазматических мембранных структур с апикальной мембраной (Muller et al., 1980). Эти данные позволил автору прийти к выводу о важной роли МТ в переносе по цитоплазме агрефо-ров или гранул, участвующих в доставке в апикальную мембрану водных каналов. При сравнении ультраструктуры эпителиев с исходно низкой и стимулируемой АДГ водной проницаемостью получены прямые данные, указывающие на возрастание количества МТ в клетках, транспортирующих воду (Снигиревская, Комиссарчик, 1987). Существует также предположение, что МТ наряду с участием в транспортировке аг-рефоров или гранул к апикальной мембране играют существенную роль в переносе воды с помощью крупных вакуолей (Снигиревская и др., 1982; Снигиревская, 1983; Комиссарчик и др., 1985). Кроме того, Я.Ю. Комиссарчик с сотр. Показали, что в молекулярном механизме увеличения проницаемости для воды клеток эпителия обязательным компонентом является деполимеризация апикально локализованных нитей актина.

Такого рода информация для клеток высших растений содержится в единичных работах. Реагсе (1985) предложил гипотезу, согласно которой в растительных клетках повышение проницаемости плазмалеммы связано со структурными изменениями цитоскелета. Авторы считают, что перемещение ВМЧ происходит не в результате перехода липидного

бислоя в фазу геля, а вследствие освобождения ВМЧ от связей с цитоске-летом. Агрегация ВМЧ в плоскости плазмалеммы возможна и при сохранении связей с цитоскелетом, но при аккумуляции с филаментами актина. При этом ВМЧ могут втягиваться в цитоскелет (Саляев и др, 1987). Также показано, что антимитотические агенты приводят к уменьшению количества агрегатов ВМЧ в апикальных мембранах эпителия, через которые антидиуретическим гормоном стимулировался транспорт воды (Kachadorian et al, 1979; Muller et al, 1980).

Пионерской работой отечественных исследователей в этом направлении на растительных объектах считается работа В.Н. Жолкевича, Т.В. Чугунова (1987), которые установив, что нагнетательная деятельность корня (эксудация) чувствительна к блокаторам цитоскелетных белков - цитохалазину Б и колхицину, сделали вывод о зависимости активного нагнетания воды в сосуды корня проростков кукурузы от сократительного аппарата паренхимных клеток. Вероятные механизмы регуляции транспорта воды, связанные с участием белков цитоскелета уже неоднократно обсуждались (Жолкевич и др, 1979; Можаева, 1993). Приводились данные в пользу предположения, что именно контрактильные белки обуславливают ритмические микроколебания потенциала давления за счет изменения диаметра пор в плазмодесмах или даже симпласта в целом. Продолжая исследования в этом направлении, В.Н. Жолкевич и Т.В. Чугунова (1995) на корнях кукурузы установили, что ингибиторы полимеризации МТ и МФ тормозили эксудацию, а фитогормоны стимулировали ее. При совместном действии колхицина или цитохалазина Б стимулирующий эффект фитогормонов полностью снимался.

Б.Н. Исабековым и O.A. Красавцевым (1989) на изолированных протопластах паренхимы бузины красной обнаружено, что подстилающие плазмалемму кортикальные МТ усиливают упругие (механические) свойства плазматической мембраны, увеличивая сопротивляемость протопластов к сжатию при обезвоживании клеток, вызванного замораживанием. Зависимость ВС клеток/тканей от состояния основных компо-

нентов цитоскелета - МТ и МФ при действии на растения низких температур установлена в работах Л.П. Хохловой с сотр.(1997а,б). Экспериментальные данные, полученные на проростках озимой пшеницы, свидетельствуют о том, что дезорганизация актиновых и тубулиновых фила-ментов, индуцированная физико-химическими факторами (ингибиторами цитоскелета или температурным стрессом), снижает способность клеток удерживать воду предположительно вследствие дегид-ратационных процессов в результате сокращения общей гидратируемой поверхности цитоскелета и связанных с ними других макромолекуляр-ных структур. При этом допускается возможность нарушения барьерных функций плазматической мембраны и повышение ее водопроницаемости, что может привести к дополнительной водоотдаче клеток (Khokhlova etal., 1997).

Вклад МФ в водный статус растительных клеток также как и МТ, весьма существенен. . Wayne и Tazawa (1988), используя метод направленного трансцеллюлярного осмоса, суть которого заключается в помещении одного конца клетки (экзоосмотического) в гипертонический раствор, а другого (эндоосмотического) в воду, в гигантских клетках водорослей Chara corallina и Nitellopsis obtusa создавали направленный поток воды. Обработка цитохалазинами уменьшала гидравлическое сопротивление клеток на эндоосмотической стороне, на основании чего авторами было выдвинуто предположение о зависимости полярного транспорта воды в клетках междоузлий водорослей от кортикального актинового цитоскелета и участии МФ в регуляции транспорта воды. И.А. Аршав-ский с сотр. (1992) установили торможение или даже полное прекращение ростовых процессов при блокировании функцмй МФ цитохалази-ном Б. МФ, по мнению авторов, выступают в качестве таких клеточных структур, без активного функционирования которых поступление воды в клетки невозможно.

55

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Волобуева, Ольга Васильевна

160 выводы

1. Установлена зависимость физиологических и биофизических показателей (ВС, Тг, А>фф) водного обмена корней от ингибиторов полимеризации тубулиновых и актиновых белков при последействии водного стресса разной силы - слабого, среднего и сильного. Это свидетельствует о том, что водоудерживающая способность и межклеточный перенос воды в корнях находятся под контролем структурной целостности цитоскелета. Направленность и степень проявления этой зависимости генотипически детерминированы и определяются уровнем обезвоживания тканей.

2. Разработан принципиально новый подход к изучению водопроводи-мости плазмодесм, основанный на компьютерном анализе мультиэкс-поненциального диффузионного затухания намагниченности стимулированного эха при больших временах наблюдения в тканях корней, в результате чего были получены три коэффициента самодиффузии (КСД) воды-А,/)2, £>з.

3. Введены определения вакуолярного и цитоплазматического симгша-стов и объяснена природа КСД: В\ характеризует самодиффузию наименее подвижной фракции воды, £>2 - средней по подвижности фракции в системе цитоплазматического симпласта, £>з - наиболее подвижной фракции в системе вакуолярного симпласта и апопласта корня.

4. Регуляция межклеточного транспорта воды на уровне плазмодесм в корнях устойчивых сортов происходит на основе компенсаторных механизмов. При последействии умеренного обезвоживания диффузионные потоки воды увеличиваются по цитоплазматическому симгша-сту и уменьшаются - по вакуолярному. После сильного обезвоживания, наряду с продолжающимся повышением водопроводимости цитоплазматического симпласта, а также притока воды в апопласт вследствие увеличения проницаемости плазмалеммы происходит, вероятно, почти полное прекращение транспорта воды по вакуолярно-му пути. В корнях малоустойчивого сорта эти механизмы являются слабо выраженными или полностью отсутствуют.

5. Обнаружено аддитивное действие умеренного обезвоживания и цитохалазина Б на водопроводимость плазмодесм, проявившееся в большей мере у устойчивых сортов в отличие от малоустойчивого. После сильного водного стресса синергизм сохранялся частично, так как ингибитор, блокируя цитоплазматическое русло, вместе с тем усиливал эффект обезвоживания, повышая приток воды и ее локализацию в апопласте.

6. Механизмы регуляции межклеточного переноса воды по плазмодес-мам являются более чувствительными к воздействующим факторам (на примере водного стресса и цитохалазина Б) в корнях устойчивых растений по сравнению с малоустойчивыми.

7. Осмоадаптивные процессы водообмена в клетках корней являются сортоспецифичными и формируются более эффективно и ускоренными темпами у устойчивых сортов. Обнаружено адаптосупрессорное влияние цитоскелет-модифицирующих веществ на времена спин-спиновой релаксации и жизнеспособность корней высокоустойчивого сорта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы интенсивно разрабатывается концепция, согласно которой системе цитоскелета в растительных клетках отводится важная роль в координации внутриклеточных процессов и в реакциях клеток на воздействия различных факторов внешней среды. Имеются сообщения об участии этой системы и в водообмене растительных клеток. Однако такие исследования пока фрагментарны.

В данной диссертационной работе предпринято комплексное исследование по изучению регуляторного влияния системы тубулиновых микротрубочек и актиновых микрофиламентов на межклеточный водообмен через плазматические мембраны и по плазмодесмам, по изучению роли этих структур в формировании водоудерживающей способности клеток и в регуляции активности внутриклеточных ферментов (на примере дегидрогеназ). Исследование проведено на корнях трех сортов озимой пшеницы, отличающихся различной степенью устойчивости, в условиях последействия нарастающего водного стресса. При этом имеется в виду цель познания наиболее общих принципов участия и роли цитоскелета в реализации устойчивости растительного организма к неблагоприятным внешним воздействиям.

В работе использованы традиционные методы исследования водообмена растительных тканей - рефрактометрический для изучения водоудерживающей способности тканей и импульсный метод ЯМР для оценки водопроницаемости клеточных мембран и молекулярной динамики воды по радиусу корня путем регистрации коэффициентов самодиффузии (КСД) и времен спин-спиновой релаксации (Тг).

Однако наряду с использованием традиционных методов нам удалось осуществить и новый подход к изучению водопроницаемости плаз-модесм, основанный на компьютерном анализе неэкспоиенциального диффузионного затухания намагниченности стимулированного эха в корне при больших временах наблюдения. Экстраполяция методом плавающей линии медленных спадов экспонентой и последовательное вычитание экспонент из суммарной огибающей обеспечило удовлетворительное разделение затухания эха на три экспоненты. Это позволило получить три КСД - £>1, £>2, £>з . Принимая во внимание современные данные литературы о едином эндоплазматическом континууме растительного организма, а также учитывая трубчатое строение плазмодесм, которые, включая внутреннюю центральную трубку и внешнюю,-соединяют соответственно вакуоли и цитоплазмы соседних клеток, были введены определения вакуолярного и цитоплазматического симпластов растительных клеток. Вакуолярный симпласт - это эндоплазматическое пространство и вакуоли соседних клеток, связанных между собой центральной трубкой плазмодесм. Цитоплазматический симпласт - это совокупность цитоплазмы соседних клеток, объединенных через внешнюю труб ку плазмодесм. Это позволяет выделить в растительных тканях отделенные друг от друга мембранами пути для свободной диффузии воды: по апопласту и по вакуолярному и цитоплазматическому симпластам. Была объяснена природа полученных КСД, относящихся к разным по подвижности фракциям воды. Согласно предложенной гипотезе, £)3 характеризует самодиффузию воды в системе вакуолярного симпласта и апо-пласта корня, 1)г - в системе цитоплазматического симпласта и органел-лях цитоплазмы, П\ - самодиффузию части гидратиой и иммобилизованной воды.

Кроме того, для выяснения зависимости водного обмена от структурного состояния цитоскелета был разработан также новый подход, основанный на экспонировании предварительно подвергнутых водному стрессу разной силы интактных корней в растворах ингибиторов полимеризации тубулиновых и актиновых белков и последующем измерении физиологических и биофизических показателей водного обмена.

Одна из задач экспериментов состояла в изучении влияния последействия водного стресса разной силы (слабого, среднего, сильного) на водный статус корней, отличающихся но устойчивости сортов озимой пшеницы, не подвергавшихся действию модификаторов цитоскелета.

Показано, что 6-часовое восстановление оводненности корней (что служило контролем для растений, обработанных колхицином) после предшествующей гипертонической обработки приводило к уменьшению ВС корней малоустойчивого сорта Безостая 1, причем пропорционально силе перенесенного воздействия (рис.19). В противоположность этому, у средне- и высокоустойчивых сортов (Мироновская 808 и Альбидум 114) была отмечена стабилизация ВС до уровня среднего стресса (рис.19). На основании этих данных предполагается наличие более эффективных механизмов регуляции термодинамического состояния водной фазы клеток у более устойчивых сортов. При этом в корнях «стрессированных» растений всех исследуемых сортов укорочение времен релаксации по мере усиления предшествующего обезвоживания сопровождалось увеличением Афф. Эти изменения сильнее происходили у Безостой 1 (рис.20,21). По-видимому, такая зависимость является результатом нарушения водопроницаемости плазматической мембраны, степень повышения которой зависит от величины осмотического воздействия и которая может быть вызвана как действием осмотических сил, так и обратным поступлением воды после снятия водного стресса.

При 30-минутном восстановлении оводненности (что служило контролем для растений, обработанных цитохалазином Б) установлено повышение ВС после действия слабого обезвоживания у Мироновской 808 и Альбидум 114, а также ее неизменность после среднего стресса по сравнению со слабым у Безостой 1 (рис.22). Предполагается, что в повышении ВС после стрессовых воздействий меньшей силы основная роль принадлежит уменьшению проницаемости плазматической мембраны, устранение наиболее эффективного порового пути транспорта воды через которую проявляется при меньших стрессовых воздействиях и более отчетливо у устойчивых сортов по сравнению с неустойчивым. На это же указывает и постоянство значений Афф в корнях этих сортов до уровня среднего стресса. Увеличение Оэфф у более устойчивых сортов начиналось лишь после сильного стресса, в то время как у малоустойчивого -после слабого (табл.3). У устойчивых сортов обнаружена фазность изменения Т2 в корнях, подвергнутых разной степени обезвоживания (рис.23), на основании чего обсуждается наличие более выраженных ос-моадаптивных процессов водообмена у более устойчивых сортов в отличие от менее устойчивого. Четко выраженная одновершинность хода кривых отмечена и в экспериментах по активности дегидрогеназ с максимумом при слабом и среднем стрессах в корнях высокоустойчивых растений (рис.31,32), свидетельствующая о вовлечении данных ферментативных систем в фазное развитие жизнеспособности растений.

Генотипически обусловленные ответы клеток на обезвоживание установлены и на уровне плазмодесм. Противоположно направленные изменения хода кривых коэффициентов Эг и £з у устойчивых сортов после слабого и среднего обезвоживания (рис.25,26) позволяют сделать предположение об уменьшении диффузионных потоков воды по вакуо-лярному симпласту и их усилении - по цитоплазматическому. В связи с этим увеличение водопроводимости цитоплазматического симпласта можно отнести к адаптивной реакции, обеспечивающей поддержание интенсивного межклеточного водообмена в растениях после перенесенного умеренного обезвоживания. Для малоустойчивого сорта такое перераспределение потоков воды по разным симпластам не предполагается, так как происходило параллельное возрастание £>2 и От при переходе от нормы к среднему стрессу (рис.24). Следовательно, сортоспецифич-ность при умеренном обезвоживании связана с особенностями механизма регуляции межклеточных связей по плазмодесмам.

При последействии сильного обезвоживания установлено генотипически обусловленное повышение межклеточных контактов по цитоплазматическому континууму в связи с увеличением устойчивости растений. Кроме того, на основании данных по увеличению Оз после сильного обезвоживания, особенно более значительному у устойчивых сортов (рис.24-26), сделано предположение об усилении притока воды в апо-пласт и ее временной локализации в «свободном пространстве» клетки.

Таким образом, можно полагать, что в условиях последействия сильного стресса и 30-минутной регидратации у растений устойчивых сортов регуляция межклеточного транспорта воды осуществляется с помощью компенсаторного механизма, направленного, с одной стороны, на усиление цигоплазменных связей и притока воды в апопласт, а с другой, - на резкое ограничение, и, возможно, даже полное прекращение потоков воды по вакуолярному симпласту.

Установлена положительная корреляция между ВС и Т?, с одной стороны, и активностью дегидрогеназ, с другой, причем более тесная для менее устойчивых сортов и для условий кратковременной (30 мин.) регидратации корней после стрессовых обезвоживаний (табл.5). Это свидетельствует о тесной зависимости жизнеспособности корней менее устойчивых растений от водного обмена при непродолжительном последействии водного стресса. Отсутствие тесной корреляции у более устойчивого сорта Альбидум 114, вероятно, можно объяснить подключением в клетках у этого сорта других «резервных» механизмов, обеспечивающих более высокий уровень жизнеспособности тканей.

Основная задача работы заключалась в изучении эффектов цито-скелет-модифицирующих веществ, являющихся ингибиторами полимеризации тубулиновых и актииовых белков, на физиологические и биофизические показатели водного обмена корней в норме и после предшествующего обезвоживания разного уровня.

Результаты экспериментов по противоположно направленной временной (24 ч) динамике биофизических показателей - прогрессирующему укорочению Т2 и увеличению Д,фф при экспозиции корней в растворах антимиготических веществ - колхицине и винбластине (рис. 15,16), а также данные литературы о присутствии тубулина в плазматической мембране клеток высших растений позволили заключить, что исследуемые ингибиторы полимеризации тубулиновых белков являются мембрано-тропами, воздействующими непосредственно на плазмалемму, нарушая ее структуру и увеличивая скорость транспорта воды. Следовательно, существенное влияние таких модификаторов цитоскелета на межклеточный водообмен осуществляется на уровне клеточных мембран.

Индуцированное колхицином падение ВС корней у всех исследуемых сортов в бесстрессовых условиях (рис.19) указывает на чувствительность водной фазы клеток к ингибитору цитоскелета и, значит, на зависимость ВС тканей от структурной целостности МТ. Колхицин в норме вызывал противоположные изменения Тг и Д>фф в корнях всех сортов (рис.20,21), что, по-видимому, является следствием увеличения скорости межклеточного транспорта воды в результате усиления ее переноса через плазматическую мембрану.

Повышение ВС, вызванное колхицином после действия слабого (у Мироновской 808 и Альбидум 114) и среднего (у Безостой 1) водного стресса (рис.19), по-видимому, связано со стабилизацией МТ и последующим усилением их контактных взаимодействий с водой, причем предполагаемая стабилизация тубулинового цитоскелета наступает раньше у более устойчивых сортов (после слабого обезвоживания), чем у менее устойчивого (после среднего). Стабилизирующее действие слабого обезвоживания проявилось и в отсутствии разницы между величинами Т2 и Афф у опытных растений высокоустойчивого сорта Альбидум 114, однако у средне- и малоустойчивого сортов такого эффекта обезвоживания не было обнаружено (рис.20,21). По-видимому, модификация структурного состояния тубулиновых МТ под действием колхицина вызывает более значительное усиление трансмембранного обмена воды в условиях последействия слабого стресса у малоустойчивого и среднеуе-тойчивого сортов. Отсутствие же влияния колхицина на биофизические показатели водного обмена корней Альбидум 114 после слабого стресса, возможно, является проявлением сортоспецифичности водообмена корней этого сорта и механизмов стабилизации МТ.

Прямо противоположный эффект колхицина на Афф - повышение у Безостой 1 и понижение у Мироновской 808 и Альбидум 114 после среднего стресса (рис.21) может свидетельствовать о включении осмоадап-тивных процессов в клетках более устойчивых сортов, затрагивающих гшазмодесмы и проявляющихся в частичном закрывании одного из путей переноса воды, например, вакуолярного, благодаря чему начинается некоторая «автономизация» клеток внутри симпласта и раньше всего у устойчивых растений.

После сильного обезвоживания корней обнаружена потеря восприимчивости ВС к колхицину (рис.19), а также отсутствие достоверной разницы между Т2 контрольного и опытного вариантов у более устойчивых сортов (рис.20). Это, вероятно, является следствием отсутствия «мишеней» для колхицина в результате полной деструкции МТ и дегидратации тубулиновых белков при сильном водном стрессе. Однако в отличие от более устойчивых сортов в этих условиях осталась некоторая чувствительность ВС к колхицину у Безостой 1 (рис. 19), что, возможно, является результатом замедленных адаптивных реакций у малоустойчивого сорта, отмеченных выше и отразившихся в индуцированном колхицином повышении ВС после среднего стресса, в то время как у двух других сортов такая реакция была отмечена лишь после действия слабого стресса.

Эффект цитохалазина Б у Альбидум 114, проявившийся в повышении ВС в нормальных условиях и возрастании его влияния при увеличении уровня обезвоживания (рис.22), по-видимому, связан с аддитивным влиянием цитохалазина Б и обезвоживания, механизм действия которых состоит в ограничении транспорта воды через водные каналы в нормальных условиях и усилении процессов полимеризации и гелификации МФ при осмотических воздействиях. Дополнительным аргументом в пользу подключения второго механизма по мере увеличения силы стресса являются данные по уменьшению подвижности наиболее медленной фракции воды корня (снижение Z),) у этого сорта (рис.26). На основании цитохалазин-индуцированной потери фа^ности изменений Т? выдвинуто предположение об адаптосупрессорном влиянии ингибитора на водный статус клеток.

В целом можно отметить, что актиновый цитоскелет, по-видимому, является более стабильной и устойчивой структурой, так как ингибитор полимеризации МФ - цитохалазин Б в меньшей степени оказывал воздействие на исследуемые параметры водного обмена после умеренного обезвоживания, чем исследуемый нами антитубулиновый агент. Кроме того, эффект цитохалазина Б сохранялся и после сильного стресса, в то время как действие колхицина после значительного обезвоживания вследствие предполагаемой деградации МТ почти не проявлялось.

Эффективность действия цитохалазина Б на £>2 и D3 в основном увеличивалась при последействии умеренного стресса (слабого и среднего) и более всего у устойчивых сортов (рис.24-26). Это указывает на аддитивное влияние двух факторов - умеренного обезвоживания и ингибитора на радиальный транспорт воды в клетках корней. Вполне возможно, что два механизма - падение тургора центральной трубки плазмо-десм и разрушение их акто-миозиновых сфинктеров оказывают более сильное взаимовлияние на функциональное состояние плазмодесм, чем каждый их них по отдельности.

На основании повышения Оз под действием ингибитора полимеризации актиновых филаментов у устойчивых сортов (рис.25,26), а также повышения £>Эфф (табл.3) сделано предположение о цитохалазин-индуцированном усилении притока воды в апопласт вследствие нарушения проницаемости плазмалеммы. В целом можно заключить, что механизмы регуляции транспорта воды по плазмодесмам в корнях устойчивых растений более чувствительны к воздействующим факторам (на примере водного стресса и цитохалазина Б) по сравнению с малоустойчивыми растениями.

КСД наиболее медленной фракции воды (/3|), как и ее населенность протонов, в корнях всех трех сортов характеризуется меньшей реактивностью на водный стресс и цитохалазин Б, чем величины £Ъ и £>з (рис.2429), относящиеся к средней и наиболее подвижной фракциям воды соответственно. Из этого следует, что гидратная и иммобилизованная вода, которая определяет матричную составляющую водного потенциала, отличаются меньшей чувствительностью к исследуемым стрессорам.

Сравнительный анализ обнаружил положительную корреляцию между показателями водообмена и активностью дегидрогеназ, причем более тесную для менее устойчивых сортов и для условий кратковременной регидратации корней после стрессовых обезвоживаний. Это свидетельствует о тесной зависимости корней менее устойчивых растений от водного обмена при непродолжительном последействии водного стресса. Судя по активности дегидрогеназ, ингибиторы цитоскелетных белков снижали жизнеспособность корней у мало- и среднеустойчивого сортов в основном до уровня среднего стресса (рис.31,32). Однако у высокоустойчивого сорта в нормальных условиях и после слабого стресса ингибиторы стимулировали активность ферментов. Значительное снижение у этого сорта под влиянием цитохалазина Б жизнеспособности корней и их восстановительных возможностей при последействии сильного стресса является основанием для предположения об адаптосупрессорной роли ингибитора МФ.

Таким образом, результаты проведенных исследований и их теоретическое обобщение позволили выдвинуть представление о генотипи-чески обусловленной зависимости термодинамического состояния воды в клетках корней и регуляции ее межклеточного транспорта на уровне плазматической мембраны, плазмодесм и гидратационных процессов от структурного состояния тубулинового и актинового цитоскелета. Направленность и степень реализации этой зависимости определяется уровнем обезвоживания тканей.

Осмоадаптивные механизмы водообмена в клетках корней являются сортоспецифичными и формируются более эффективно и ускоренными темпами у устойчивых сортов. Об этом свидетельствуют следующие факты: усиление проводимости цитоплазматического симпласта (повышение £>2) после сильного водного стресса, более раннее закрывание вакуолярного пути переноса воды, фазность динамики Т? при кратковременном восстановлении оводненности корней, стабилизирующее влияние умеренного обезвоживания на ВС, менее значительное колхи-цин-индуцированное снижение водоотдачи в «бесстрессовых» условиях и потеря ее чувствительности к ингибитору после сильного обезвоживания.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Волобуева, Ольга Васильевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аксенов С.И. Состояние воды и ее роль в динамике биологических структур. Автореф. дис. докт. физ.-мат. наук. М., 1979. -40с.

2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж, Мо-леклярная биология клетки. Т.З. М.: Мир, 1994. - 503с.

3. Алексеев A.M. К вопросу о показателях, могущих характеризовать состояние воды в растении // Тез. докл. Совещ. По физиологии растений 28 янв.-З февр. 1940 г. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1940. С.119-120.

4. Алексеев A.M. Вода в растении //Ученые записки Казанского государственного университета. - 1941. - Т.101,кн.1.

5. Алексеев A.M. Водный режим растений и влияние на него засухи. - Казань: Таткнигоиздат, 1948. -356 с.

6. Алексеев A.M. Значение структуры цитоплазмы для водного режима растительных клеток // Итоговая конференция Казанского государственного университета. Краткое содержание докладов. Казань: Изд-во Казан, ун-та, 1965.

7. Алексеев A.M. Водный режим клеток в связи с обменом веществ и структурированностью цитоплазмы. М.: Наука, 1969. -36с. (28-е Тимирязев, чтение).

8. Алексеев A.M., Пахомова Г.И. //Физиология и биохимия культурных растений. - 1969. - Т.1, №16. - С.

9. Андреев И.М. О значении термодинамического подхода при изучении водного режима растений // Научные труды высшей школы. Биологические науки. - 1978, №9. - С. 17-25.

10. Анисимов A.B., Мифтахутдинова Ф.Г. Распределение размеров клеток и внутриклеточных структур биосистем из измерений диффузии воды методом импульсного градиента спинового эха ЯМР // Биофизика. -1977. - Т.22. - С.866-871.

11. Анисимов A.B., Еварестов A.C., Самуилова И.Ф. Метод ЯМР в исследованиях межклеточного транспорта воды через гшазмалемму и по сим-пласту / Сб.: 1 Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов стендовых сообщений, Москва, 1982. - Т.З. - С.220.

12. Анисимов A.B., Самуилова И.Ф., Еварестов A.C., Гордон J1.X. Трансмембранный обменный механизм магнитной релаксации воды в клетках //Доклады АН СССР. - 1983. - Т.269. - С.482-285.

13. Анисимов A.B. Биофизические аспекты межклеточного транспорта воды в растениях. - Дисс. докт. физ.-мат. наук. - Казань, КИБ КФ РАН СССР. 1987.-315 с.

14. Анисимов A.B., Раткович С. Транспорт воды в растениях. Исследование импульсным методом ЯМР. - М.: Наука, 1992. - 144с.

15. Аршавский И.А., Калевич А.Е., Кефели В.И. К анализу роли цитоскелета зародышей растительных организмов в реализации процессов роста и развития // Биофизика. - 1992. - Т.37, вып.5. - С.983-992.

16. Балла Ю.И., Бакрадзе Н.Г., Шарименов Ю.Г. Выявление двух состояний воды в тканях растений методом протонной магнитной релаксации //Биофизика. - 1985. - Т.30, вып.З. - С.476-481.

17. Бондарь И.Г., Сулейманов И.Г., Хохлова JI.П., Стеценко В.П. Изучение электрофоретических свойств и активности малатдегидрогеназы в митохондриях озимой пшеницы. / Сб.: Сосотояние воды и энергетический обмен растений. - Казань: Изд-во Казанск. ун-та, 1975. - С.90-102.

18. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифиеский адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука, 1987. - 232с.

19. Васильев А.Е. Сравнительная структурно-функциональная характеристика цитоскелета животных и высших растений // Журнал общей биологии. - 1996. - Т.57, №3. - С.293-321.

20. Васильева Н.Г. О состоянии свободной и связанной воды в листьях растений в связи с их засухоустойчивостью // Физиология растений. -1955. -Т.2. - Вып.З. -С.138-156.

21. Васильева Н.Г. Влияние высокой температуры и влажности почвы на изменение физиологических показателей водного режима / Сб.: Биологические основы орошаемого земледелия. - М.: Издательство АН СССР, 1957. -156 с,

22. Васильева Н.Г., Буркина З.С. Водный режим органоидов клетки при обезвоживании /Сб.: Водный режим растений в связи с обменом веществ и продуктивностью. М.: Изд-во АН СССР, 1963. С.157-170.

23. Вахмистров Д.Б. Ионный режим растений: эволюция проблемы // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. С.214-230.

24. Великанов Г.А., Гордон Л.Х., Волков В.Я., Барышева Т.С. Изучение проницаемости клеточных мембран для воды методом ЯМР // Физиол. и биохим. культ, растений. - 1977. - Т.29, №2. - С Л 97-201.

25. Великанов Г.А. Водообмен и система переноса ионов у клеток в высших растениях . - Дисс. докт. биол. наук. - Казань, 1997. -333 с.

26. Водный обмен растений / В.Н. Жолкевич, H.A. Гусев, A.B. Капля и др. Под ред. И.А. Тарчевского, В.Н. Жолкевича. - М.: Наука, 1989. - 256 с.

27. Войников В.К., Иванова Г.Г. Физиологический стресс и регуляция активности генома клеток эукариотов // Успехи современной биологии. -1988. - Т.105, вып. 1. - 1988. - С.3-16.

28. Гамалей Ю.В. Плазмодесмы - межклеточные связи растений // Физиология растений. - 1985. -Т.32, вып.1. - С. 176-190.

29. Гамалей Ю.В. Отток фотоассимилятов в природных и экспериментальных условиях // Физология растений. - 1996. - Т.43, №3.- С.328-343.

30. Гамалей Ю.В. Надклеточная организация растений // Физиология растений. - 1997. -Т.44, №6. - С.819-846.

31. ГауровицФ. Химия функция белков. М.: Мир, 1965. -240с.

32. Генкель П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости растений. М.: Наука, 1982. -280 с.

33. Гордон Л.Х. Дыхание и водно-солевой обмен растительных тканей. -М.: Наука, 1976. -120с.

34. Гордон JI.X. Функциональная характеристика адаптивного старения отсеченных корней пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. - 1992. - Т.24, №2. - С. 128-133.

35. Грингауз O.K., Негрецкий В.А., Соколов О.И. Идентификация Ф-актина растений фаллоидин-коллоидным золотом. 2.Клетки и субклеточные препараты // Физиология растений. - 1998. - Т.45, №2. - С.235-240.

36. Гринева Г.М. Регуляция метаболизма у растений при недостатке кислорода. М.: Наука, 1975. -274с.

37. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир. - 1986. Т.1.С.63.

38. Гусев H.A. Влияние повышенной температуры на водный режим растений // Изв. АН СССР. Сер. Биол. - 1959. - №1. С.79-86.

39. Гусев H.A. Некоторые методы исследования водного режима растений. - Л.: Изд-во Всесоюзного ботанического общества, 1960. -61с.

40. Гусев H.A., Швалева Л.С. К вопросу о влиянии засухи на состояние воды в листьях растений / Сб.: Физиология водообмена и устойчивости растений/ Отв. Ред. H.A. Гусев, И.Г. Сулейманов. - Казань: Изд-во Казан. унта, 1971.-С.З-11.

41. Гусев H.A. Состояние воды в растении. М.: Наука. - 1974. - 134с.

42. Гусев H.A., Киваева Л.С. О физиологическом значении и современных методах исследования водообмена и состояния воды растений // Физиология и биохимия культурных растений. - 1978. - Т. 10, №1. - С.3-17.

43. Гусев H.A., Рыбкина Г.В., Киваева Л.С. Водообмен хлорогшастов /Сб.: Водообмен клеток и органоидов. - Казань: Изд-во Казанск. ун-та, 1980. С.90-143.

44. Гусев H.A., Белькович Т.М. Исследование водоудерживающей способности клеток листьев в связи с действием засухи / Сб.: Физиологические механизмы адаптивных реакций растений. - Казань. Изд-во Казанск. унта, 1987. С.3-56.

45. Гусев H.A., Самуилов Ф.Д., Пахомова Г.И., Жолкевич В.II. Состояние воды в растений / Сб.: Водный обмен растений. М.: Наука, 1989. - С.21-44.

46. Даутова Н.Р. Клеточная стенка и водообмен растенийю Исследование импульсным методом ЯМР: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Казань, 1997. - 19 с.

47. Дорогова Н.В., Шамина Н.В. Особенности цитокинеза в клетках высших растений // Цитология. - 1994. - Т.36, №9/10. - С.899-915.

48. Еварестов A.C. Исследование межклеточного водообмена растений импульсным методом ЯМР: Автореф. дис. ... канд. Биол. наук. - Казань, КИБ КФ АН СССР, 1983. - 21с.

49. Жолкевич В.Н. Энергетика дыхания высших растений в условиях водного дефицита. М.: Наука, 1968. - 230с.

50. Жолкевич В.Н., Григорьева М.Н. Двухфазный характер изменений вязкости протоплазмы растительных клеток в условиях водного дефицита//Доклады АН СССР. - 1971. - Т. 196, №4. - С.717-718.

51. Жолкевич В.Н., Синицина З.А., Пейсахзон Б.И. и др. О природе корневого давления // Физиология растений. - 1979. - Т.26, ;5. - С.978-993.

52. Жолкевич В.Н., Чугунова Т.В. Об участии паренхимных клеток в нагнетающей деятельности корня //Доклады АН СССР. - 1987. - Т.297, №3. - С.758-761.

53. Жолкевич В.Н., Чугунова Т.В. О взаимодействии белков цитоскелета, биомедиаторов и фитогормонов при регуляции транспорта воды в растении // Доклады АН. -1995. - Т.341, № 1. - С. 122-125.

54. Жолкевич В.Н., Зубкова Н.К., Маевская С.Н., Волков B.C., Ракитин В.Ю., Кузнецов Вл.В. Взаимодействие теплового шока и водного стресса у растений. 2. Осморегуляция в листьях хлопчатника при последовательном действии кратковременной гипертермии и почвенной засухи // Физиология растений. - 1997. - Т.44, №4. - С.613-623.

55. Жуковский П.М. Ботаника. 5-е изд. испр. и доп. ML: Колос. -1982. -380с.

56. Заварзин А.А., Харазова А.Д., Молитвин М.Н. Биология клетки: общая цитология. СПб.: Изд-во СПбГУ, 1992. - 319с.

57. Иванов И.Д., Молодова Г.А., Рахлеева Е.Е. Роль водородной связи в поддержании конформации и образовании энзимсубстратного комплекса а-амилазы Aspergillus oryzae // Изв. АН СССР. - Сер. биол. - 1965. -Вып.2. - С. 77-86.

58. Ионенко И.Ф., Голяндина J1.B., Анисимов А.В. ЯМР-исследование диффузии воды в тканях корня кукурузы при действии осмотического стресса и факторов, вызывающих деструкцию мембран / Сб. статей Структура и динамика молекулярных систем. 1998. Ч.З. Йошкар-Ола-Москва)Казань. - С.89-92.

59. Исабеков Б.Н., Красавцев О.А. Осмотические свойства морозостойких протопластов // Физиология растений. - 1989. - Т.36, №2. - С.372-381.

60. Каримова Ф.Г., Маркова М.Н., Гусев Н.А. Изменение выхода воды из растительных клеток под действием некоторых факторов // Физиология растений. - 1978 . - Т.25, №2. - С.328-333.

61. Каримова Ф.Г. Клеточная стенка растений и водообмен. 1979. -14с. Деп. ВИНИТИ, №2878-79.

62. Каримова Ф.Г., Ишманцева О.В., Чернышева JI.B. Поглощение о отдача воды растительной клеткой под действием вазопрессина // Некоторые характеристики мембран и водообмен клеток растений. Казань: Изд-во Казан, ун-та, 1982. С.45-51.

63. Клотц И. Горизонты биохимии. М.: Мир. - 1964. -С.399.

64. Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С., Романов В.И., Сабинин Г.В. Анализ ультраструктурных изменений апикальной мембраны гранулярных клеток мочевого пузыря жабы при стимулировании антидиуретическим гормоном осмотического потока воды // Биологические мембраны. - 1985. - Т.2, №2. - С.630-641.

65. Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С. Ультраструктурный анализ механизмов встраивания агрегатов внутримембранных частиц в апи-

кальную мембрану гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки // Биологические мембраны. - 1990. - Т.7, №6. - С.895-908.

66. Комиссарчик Я.Ю., Макаренкова Е.И., Снигиревская Е.С., Шахматова Е.И., Брудная М.С., Наточин Ю.В. Исследование ультраструктуры апикального цитоскелета клеток эпителия мочевого пузыря лягушки при АДГ-зависимом и АДГ-независимом увеличении осмотической проницаемости // Цитологияю - 1996. - Т.38, №9. - С.927-933.

67. Конев C.B. Структурная лабильность биологических мембран и регу-ляторные процессы. - Минск: Наука и техника, 1987. -240 с.

68. Крафтс А., Карриер X., Стокинг К. Вода и ее значение в жизни растений. М.: ИЛ. 1951.-388с.

69. Кузнецов И.В., Ракитин Ю.В., Опоку Л., Жолкевич В.Н. Взаимодействие теплового шока и водного стресса у растений. 1.Влияние теплового шока и последующей почвенной засухи на водный режим и устойчивость хлопчатника // Физиология растений. - 1997. - Т.44, №1. С.54-58,

70. Куликова А.Л. Некоторые свойства флоэмных белков из экссудата тыквы // Физиология растений. - 1992. - Т.39, вып.6. - С.1108-1115.

71. Курсанов А.Л. Транспорт ассимилятов в растении. М.: Наука. 1976. -647с.

72. Кушниренко М.Д. Водный обмен растений при разной влагообеспечен-ности в связи с засухоустойчивостью и продуктивностью //Водный режим сельскохозяйственных растений: Материалы I Республиканского симпозиума физиологов и биохимиков Молдавии. - Кишинев: Штиинца, 1989. -С.3-12.

73. Лебединцева Е.В. Опыт изучения водоудерживающей способности у растений в связи с их засухо- и морозоустойчивостью // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 1929-1930. - Т.23. Вып.2. С.47-62.

74. Лыгин A.B., Гордон Л.Х., Алексеева В.Я., Балашова Т.К. Изменение содержания стеринов и жирнокислотного состава фосфолипидов в про-

цессе адаптивного старения отсеченных корней пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. - 1990. - Т.22, №6. - С.581 -586.

75. Лялин О.О. К теории трансклеточного осмоса: обратноосмотическая модель корней экссудации // Физиология растений. - 1989. - Т.36, N93. -С.421-434.

76. Маклаков А.И., Скирда В.Д., Фаткуллин II.Ф. Самодиффузия в растворах и расплавах полимеров. Казань: Изд-во Казан, ун-та. - 1987. - 223 с.

77. Максимов H.A., Васильева Н.В. Влияние повторного завядания на коллоидно-химические свойства протоплазмы// Труды института физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН СССР. 1948. -Т.6, №2. ~ С.94-107.

78. Медведев С.С., Маркова И.В. Цитоскелет и полярность растений // Физиология растений. -1998. - Т.45, №2. - С. 185-197.

79. Мелехов Е.И. Принцип регуляции скорости повреждения клетки и реакция защитного торможения метаболизма // Журнал общей биологии. -1985. -Т.46, №2. - С,174-189.

80. Можаева Л.В. О процессе нагнетания воды корнями растений // Известия ТСХА. - 1993, №5. - С.69-81.

81.Наточин Ю.В., Чапек К. Методы исследования транспорта ионов и воды. Л.: Наука, 1976. - 219 с.

82. Пахомова В.М., Гордон Л.Х. Изменение физиологического состояния клеток корней пшеницы в процессе адаптивного старения // Физиология растений. - 1984. - Т.31, №6. - С. 1162-1169.

83. Пахомова В.М., Пахомов Д.В. Мембранный потенциал и физиологическое состояние клеток корней пшеницы при повреждающем воздействии // Физиология и биохимия культурных растений. - 1991. - Т.23, №2. -С.145-151.

84. Пахомова В.М. Об адаптивном значении увеличения проницаемости мембран при обратимой альтерации клеток отсеченных корней // Фи-

95. Романова Т.Д. Физико-химические свойства белков и активности дегидрогеназ в связи с состоянием воды в зимующих растениях. - Дисс. канд. биол. наук. - Казань, КИБ КФ РАН СССР. - 1970. -115с.

96. Рыбкина Г.В., Гусев H.A. О водообмене хлоропластов in vivo в условиях засухи // Сельскохозяйственная биология. -1978. - Т.13, №2. С.224-229.

97. Рыбкина Г.В., Биглова С.Г. К сравнительной оценке роли различных структурных компонентов клетки во внутриклеточном водообмене. Ядро. / Сб. науч. тр./ Вопросы водообмена и состояния воды в растениях. -Казань: Изд-во Казанск. ун-га, 1981. С.102-113.

98. Савич И.М. Пероксидазы - стрессовые белки растений // Успехи современной биологии. - 1989. - Т. 107, №3. - С.406-417.

99. Саляев Р.К., Швецова И.В. Адсорбционные свойства изолированных стенок растительных клеток // Физиология растений. - 1969. - Т. 16, №3. -С.447-451.

100. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1972. - 122с.

101. Селье Г. Стресс без дистресса. М.:Прогресс, 1979. -125с.

102. Сент-Дьерди. Биоэнергетика. М.: Физматгиз. - 1964. -215с.

103. Сиянова Н.С., Неуструева С.Н. Водообмен ядер и митохондрий в условиях засухи и после регидратации: Сб. науч. тр./ Регуляция адаптивных реакций растений. - Казань: Издательство Казанского университета. - 1990. -С.67-88.

104. Слейчер Р. Водный режим растений. М.: Мир. - 1970. -366с.

105. Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.10., Наточин Ю.В., Шахматова Е.И. Электронно-микроскопическое исследование вакуолярной системы гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки при действии антидиуретического гормона // Цитология. - 1982. - Т.24, №3. - С.252-256.

106. Снигиревская Е.С. Сравнительный анализ структуры вакуолярной системы гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки и комплекса сократительной вакуоли простейших // Цитология. - 1983. - Т.25, №8. -С.889-895.

107. Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю. Анализ структурных изменений цитоскелета гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки при стимулировании водного транспорта // Цитология. - 1987. - Т.29, №2. -С.150-155.

108. Снигиревская Е.С. Изменение ультраструктуры клеток вазопрессин-чувствительных эпителиев при стимуляции транспорта воды // Цитология. -1990. - Т.32, №8. - С.766-794.

109. Соколов О.И., Богатырев В.А., Туркина М.В. Миозинподобный белок из высшего растений Heracleum sosnowsky // Доклады АН СССР. - 1985. -Т.282, №6. - С.1513-1519.

110. Соколов О.И., Богатырев В.А., Туркина М.В. Миозин из проводящих тканей Heracleum sosnovsky: взаимодействие с мышечным актином и образование филаментов // Физиология растений. - 1986. - Т.33, №3. -С.421-431.

Ш.Соколов О.И., Грингауз O.K., Рихтер Т.Я. Идентификация F-актина растений фаллоидин-коллоидным золотом. 1 .Биохимические препараты // Физиология растений. - 1998. - Т.45, №2. - С.227-234.

112. Сопина Н.Ф., Карасев Г.С., Трунова Т.И. АБК как фактор закаливания суспензионной культуры пшеницы к морозу // Физиология растений. -1994. - Т.41, №4. - С.546-551.

113. Старцева A.B., Шкляев Ю.Н. Изменение структурной вязкости цитоплазмы субэпидермальных клеток стеблей гороха при обезвоживании // Доклады АН СССР. - 1970. -Т.193, №1. - С.158-163.

114. Сырников Ю.П. Структура и роль воды в живом организме. - Ленинград: Изд-во ЛГУ. - 1966. -С.58.

115. Туркина М.В., Куликова А.Л. Пути изучения актиноподобного белка в тканях высших растений // Физиология растений. - 1982. Т.5. - С. 837845.

Пб.Туркина M.B. Транспорт ассимнлятов: факты и гипотезы / Новые направления в физиологии растений / Под ред. Курсанова A.JI. М.: Наука, 1985. С.231-252.

117. Туркина М.В., Акатова J1.3. Термостабильные актин-связывающие белки из флоэмы Heracleum sosnowsky // Физиология растений. - 1994. -Т.41, №3. - С.367-373.

118. Туркина М.В., Куликова А.Л., Коппель Л.А., Акатова Л.З., Бутенко Р.Г. Актин и термостабильные актин-связывающие белки в культуре клеток пшеницы // Физиология растений. -1995. - Т.42, №3. - С.348-355.

119. Удовенко Г.В. Физиологические механизмы адаптации растений к различным экстремальным условиям //Тр. прикл. генет. селекции. - 1979. - Т.64. -№3. - С.5-20.

120. Уоттерсон Д.Г. Роль воды в функции клетки // Биофизика. - 1991. -Т.36, вып.1. - С.5-30.

121.Урманцев Ю.А., Гудсков Н.Л. Проблема специфичности ответных реакций растений на повреждающее воздействие // Журнал общей биологии. - 1986. -Т.48. -№3. -С.337-349.

122. Фрей-Висслинг А., Мюлеталер К. Ультраструктура растительной клетки. М.: Мир, 1968. -453с.

123. Фултон А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки. М.: Мир, 1987. - 117 с.

124. Хохлова Л.Г1. О значении оценки состояния высокополимеров цитоплазмы при изучении водного режима растений. Сб.: Водный режим сельскохозяйственных растений. М.: Наука, 1969. С.98-112.

125. Хохлова Л.Г1. Роль структурно-функционального состояния митохондрий при адаптации растений к низкой температуре. Казань: Изд-во Казанск. ун-та, 1976. -166с.

126. Хохлова Л.П., Олиневич О.В., Панкратова О.В. Изменение водоудер-живающей способности тканей озимой пшеницы под влиянием струк-

турных модификаторов цитоскелета // Физиология растений. - 1997а. -Т.44, №3. - С.379-384.

127. Хохлова Л.П., Палих Е., Олиневич О.В., Тараканова НЛО. Влияние цитохалазина Б и колхицина на водный обмен растений при холодовом закаливании и разных условиях замораживания-оттаивания // Цитология. - 19976. - Т.39, №4/5. - С.236-257.

128. Ченцов Ю.С. Общая цитология (Введение в биологию клетки).3-е изд. - М.: Изд-во МГУ, 1995. -352 с.

129. Шматько И.Г., Григорюк И.А., Шведова О.Е. Устойчивость растений к водному и теспературному стрессам. - Киев: Наукова думка,!989. -224с.

130. Шматько И.Г., Жук О.И. Реакция первичного корня кукурузы на водный стресс // Физиология и биохимия культурных растений. - 1993. -Т.25, №1. - С.72-77.

131. Akashi Т., Kawasaki S., Shibaoka H. Stabilization of cortical microtubules by the cell wall in cultured tobacco cells // Planta. - 1990. - V.l 82. - P.363-369.

132. Allen N.S., Allen R.D. Cytoplasmic streaming in green plants // Ann. Rev. Bioenerg. - 1978. - V.7. - P.497-526.

133. Anderson J.L., Malone D.M. Mechanism of osmotic flow in porous membranes // Biophysical J. - 1974. - V. 14, N12. - P.957-982.

134. Anisimov A.V., Miftahutdinova F.G. Self-diffusion coefficient of water in biological systems from results of pulsed NMR experiments // Studia biofísica. - 1978. -B.72. -S.59-60.

135. Arisz W.H. Significance of the symplasm theory for transport across the root //Protoplasma. - 1956. - V.46. - P.5-62.

136. Artlip T.S., Setter T.L., Madison J.T. Water deficit affects (3-tubulin in developing maize endosperms // Plant Physiology. - 1993. - V.l02. - P.889.

137. Bayley P. What makes microtubules dynamic? // J. Cell Sci. - 1990. - V.95. -P.329-334.

138. Bartolo M.E., Carter J.V. Microtubules in mesophyll cells of nonacclimated and cold-acclimated spinach // Plant Physiol. - 1991. - V.97. - P. 175-181.

139. Beal P.T. Water - macromolecular interactions during the cell cycle / Nuclear cytoplasmic interactions during the cell cycle. New York: Academic press. -1980. - P.223-270.

140. Beese L., Stubbs G., Thomas J., Cohen C. Structure of microtubules with reduced hydration comparison of results from X-ray diffraction and electron microscopy // J. Mol. Biol. - 1987. - V.l96. - P.575-580.

141. Bernier-Valentin F., Aunis D., Rosset B. Evidence eor tubulin binding sites on cellular membranes: plasma membranes, mitochondrial membranes and secretory membranes // J. Cell Biol. - 1983. - V.97. - P.209-216.

142. Bokros C.L., Hugduhl J.D., Blumental S.S.D., Morejohn L.C. Proteolic analisis of polymerized maize tubulin: regulation of microtubule stability of low temperature and Ca2+ by the carboxyl terminus of R-tubulin // Plant, Cell and Environment. - 1996. - V.l9. - P.539-548.

143. Berger L.G., Borisy G.G. Tubulin-colchicine complex inhibits micritubule elongation at both plus and minus ends // J. Biol. Chem. - 1983. -V.258. - P.4190-4194.

144. Brown D. Membrane recycling and epithelial function // Amer. J. Phtsiol. -1989.-V. 256.-P.F1-F2.

145. Carr H.V., Purcell E.M. Effect of diffusion on free precession im nuclear magnetic resonance experiments // Phys. Rev. - 1954. - V.94, N3. - P.630-634.

146. Carvajal M., Cooke D.T., Clarkson D.T. Response of wheat plants to nutrient deprivation may involve the regulation of water-channel function // Planta. -1996. V.199.-P.372-381.

147. Chang D.C., Cooper R.L., Young A.C., Martin C.J., Ancker-Johnson B. Restricted diffusion in physical systems: theory // J. Theor. Biol. - 1975. - V.50. -P.285-308.

148. Chrispeels M.J., Agre P. Aquaparins: water canrtal proteins of plant and animal cells 11 Trends Biol. Sci. - 1994. - N19. - P.421-425.

149. Chrispeels M.J., Maurel C. Aquaparins: the molecular basis of facilitated water movement through living plant cells // Plant Physiology. -1994. -105. P.9-13.

150. Chowdhury S., Smith K.W., Gustin M.C. Osmotic stress and the yaest cy-toskeleton: phenotype-specific suppression of an actin mutation // J. Cell Biol. -1992. - V.l 18, N3. - P.561-571.

151. Cleary A.L., Hardham A.R. Microtubule organization during development of stomatal complexes in Lolium rigidum // Protoplasma. - 1989. - V.l49, N 2—3. - P.67-81.

152. Clegg J.C. Intracellular water and cytomatrix: some methods of study and current views // J. Cell Biol. - 1984,- V.99, N1. - P. 167-171.

153. Collander R. The permeability of Nitella cells to non-electrolytes // Physiol. Plantarum. - 1954. - V.7. - P.420-445.

154. Conlon T., Outred R. Water diffusion permeability of erythrocytes using NMR technique // Biochem. Biophys. Acta. - 1972. - V.288. - P.354-361.

155. Cooper R.L., Chang D.B., Young A.C., Martin C.J., Ancker-Johnson B. Restricted diffusion in biologycal systems // Biophys. J. - 1974. - V.l4. - P. 161177.

156. Cooper G.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin // J. of Cell Biol. - 1987. - V.105. - P.1473-1478.

157. Cyr R.J., Palevitz B.A. Microtubule-binding proteins from carrot // Planta. 1989. - V.l77. - P.245-260.

158. Cyr R.J. Calcium-calmodulin effects microtubule stability in lysed protoplasts//J. Cell Sci. - 1991. - V.l00. - P.311-317.

159. Dainty J., Ginsburg B.Z. Irreversible thermodynamics and frictional models of membrane procasses, with particular reference to the cell membrane // Journal of theoretical biology. - 1963. - V.105. - P.256-265.

160. Ding B., Turgeon R., Partharathy M.V. Micrifilament organization and distribution in freeze-substituted tobacco root cells // Protoplasms. - 1991. -V.165, N1-3. P.96-105.

161. Dawson P. J., Lloyd C.W. Identification of multiple tubulins in taxol micritu-bules purified from carrot suspension cells // EMBO J. - 1987; . -V.4. - P.2451-2455.

162. Durbin R.P., Frank H., Solomon A.K. Water flow through frog gastric mucosa //J. Gen. Physiol. -1956. - V.39. - P.535-551.

163. Edmonds B.T., Murray J., Condeelis J. pH regulation of the F-actin binding properties of Dictyostelium elongation factor la // J. Biol. Chem. - 1995. -V.270. - P.15222-15230.

164. Eleftheriou E.P., Palevitz B.A. The effect of cytochalasin D on preprophase band organisation in root tip cells of Allium // J. Cell Sci. - 1992. - V.l 03, pt.4. - P.989-998.

165. Fairbairn D.J., Goodbody K.C., Lloyd C.W. Simultaneous labelling of microtubules and fibrillar bundles in tobacco BY-2 cells by the anti-intermediate filament antibody, ME 101 //Protoplasma. - 1994. - V. 182, N3-4. - P. 160-169.

166. Finkelstein A. Water movement through lipid bilayers, pores and plasma membranes. Theory and reality / Distinguished lecture series of the Society of General Physiologists. - 1987. - V.4. New York: John Wiley & Sons.

167. Gatalis B. , Apostolakos B. Patterns of microtubule reappearance in root cells of Vigna sinesis recovering from a colchicine treatment // Protoplasma. -1991,-V.160, N2-3. - P. 131-143.

168.Giddings T.H., Staehelin Jr., Staehelin L. Microtubule-mediated control of microtubule deposition: a re-examination of the hypothesis / The cytoskeletal basis of plant growth and form, 1991. Academic Press Limited. - P.86-98.

169. Gieder B., Avnur L., Rinnerthaler II., i linsen IL, Small V.J. Microfilament-organizng centres in areas of cell contact: cytoskeletal interactions during cell attachment and locomotion // J. Cell Biol. -1984. - V.99, pt2. - P.83s-91s.

170. Goddard R.H., Wick S.M., Silflow C.D., Snustad D.P. Micritubule components of the plant cell cytockeleton // Plant Physiol. - 1994. - V. 104. - P. I -6.

171. Gunning B.E.S., Hardham A.R. Microtubules // Annu. Rev. Plant Physiol. -1982,-V.33.-P.651-698.

172. Gusta L., Fowler D.B., Chen P. Et al. A nuclear magnetic resonance study of water in coldacclimating cereals // Plant Physiol. - 1979. - V.63, N4. _ P.627-634.

173. Hann E.L. Spin echoes // Phys. Rev. - 1950. - V.80. - P.580-584.

174. Heackock C.S., Brown Sh.L., Bamburg J.R. In vitro inactivation of actin by neat//Nat. Cancer. Inst. Monograph. - 1982. - V.61. - P.73-75.

175. Harris E.J. Transport and accumulation in biological systems. - London: Batterwarths Scientific Publication, 1960. -160 p.

176. Hasezawa S., Nagata T., Syono K. The presence of ring formed actin filaments in plant cells//Protoplasma. - 1988. - V.l46, N1. - P.61-63.

177. Hawes C.R. Conventional and high voltage electron microscopy of the cy-toskeleton and cytoplasmic matrix of carrot // Eur. J. Cell Biol. - 1985. - V.38. ~ P.201-210.

178. Hightower R., Meagher B. The Molecular evolution of actin // Genetics. -1986. -V.l 14. - P. 315-332.

179. Hugdahl J.D., Morejohn L.C. Rapid and reversible high-affinity binding of the dinitroalanine herbicide oryzalin to tubulin from Zea mays L. // Plant Physiol. - 1993. - V.102. - P.725-740.

180. Hush J.M., Wadsworth P., Callaham D.A., Hepler P.K. Quantification of microtubule dynamics in living plant cells using fluorescence redistribution after photobleaching // J. Cell Sci. - 1994. - V.l07, pt.4. - P.775-584.

181. Ishikawa M., Robertson A.J., Gusta L.V. Comparison of viability tests for assessing cross-adaptation to freezing, heat and salt stresses induced by abscisic acid in bromegrass (Bromus intermis Leyss) suspension cultured cells // Plant Science. - 1990. - V.l07. - P.83-93.

182. Ishikawa M., Gusta L.Y. Effect of temperature, light, nutrients and dehardening on abscisic acid indused cold hardiness in Bromus inermis Leyss sus 1995.

183. Job D., Rach C.T., Fischer E.H., Margolis R.L. Recycling of cold-stable microtubules: Evidence that cold stability is due to substoichiometric polimer blocks // Biochemostry. - 1982. - V.21. - P.509-515.

184. Johansson I., Larsson C., Ek B., Kjellbom P. The major integral proteins of spinach leaf plasma membranes are putative aquaporins and are phosphorylated in response to Ca2+ and apoplastic water potential // The Plant Cell. - 1996. -V.8. - P.l 181-1191.

185.Kabch V., Vandekerckove J. Structure and function of actin // Ann. Rev. Biophys. - 1992. -P.49-76.

186. Kachadorian W.A., Ellis S.J., Muller J. Possible role for microtubules and microfilaments in ADH action on toad urinary bladder // Amer. J. Physiol. -1979. - V.236. - P.F14-F20.

187. Kammerloher W., Fisher U., Piechottka G.P., Schaffer A.R. Water channels in the plant plasma membrane cloned by immunoselection from a mammalian expression system // Plant J. - 1994. - V.6. - P. 187-199.

188. Karger J. Zur Bestimung des diffusion in cinem Zweiberreich-system mit Hilfe von gepulsten Feldgradient // Annalen der Phyzik. - 1969. B.24. S. 1-4.

189. Kedem O., Katchalsky A. A physical interpretation of the phenomenologi-cal coefficient of membrane permeability // Journal of General Physiology. -1961. - v.45. - P.143-179.

190. Kerr G., Carter J. Relationship between freezing tolerance of root-tip cells and cold stability of microtubules in rye (Secale cereale L. Cv Puma) // Plant Physiol. - 1990. - V.93. - P.77-82.

191. Khokhlova L., Olinevich O., Pahlich E., Tarakanova N., Asafova E., Volov-nic I. The effect of tubulin protein modificatos s on the water exchange of the

nonhardened and cold-hardened plant of winter wheat // J. Acta Agronómica Hungarica. - 1997. - V.45, N4. - P.377-382.

192. Kuiper P.J.C. Water transport across membranes // Ann. Rev. Plant Physiol. -1972.

193. Laporte K., Rossignol M., Traas J.A. Interaction of tubulin with the plasma membrane: tubulin is present in purified plasmalemma and behaves as an integral membrane protein//Planta. - 1993. - V. 191. - P.413-416.

194. Lee C., Ferguson ML, Chen L.B. Construction of the endoplasmic reticulum // J. Cell Biol. - 1995. - V.105, N5. - P.l 19-139.

195. Lee J.C., Timasheff S.N. In vitro reconstitution of calf brain microtubules: effects of solution variables // Biochemistry. - 1977. - V.16, N8. - P. 1754-1764.

196. Lichtscheid I.K., Lancelle S.A., Hepler P.K. Actin-endoplasmic reticulum complexes in Dosera. Their structural relationship with the plasmalemma, nucleus and organelles in cells prepared by high pressure freezing // Protoplasma. - 1990. - V.155. -Nl-3. - P.l 16-126.

197. Liebe S., Quander H. Myosin in Onion (allium cepa) bulb scale epidermal cells: involvement in dynamics of organelles and endoplasmic reticulum // Physiol. Plant. - 1994. - Y.90. - P. 114-124.

198. Lloyd C.W. The cytoskeleton in plant growth and development. - London: Academic Press, 1982. -466p.

199. Lloyd C.W. The plant cytoskeleton: the impact of fluorescence microscopy // Ann. Rev. Plant Physiol. - 1987. - V.38. - P.l 19-139.

200. Lynch J., Polito V.S., Lauchli A. Salinity stress increases cytoplasmic Ca activity in maize root protoplasts // Plant Physiol. - 1989. - V.90. - P. 1271-1274.

201. Luttge U., Higinbotham N. Transport in plants. Heidelberg: Springer-Verlag, 1979.

202. Marchant H.J. Microtubules associated with the plasma membrane isoleted from protoplasts of the green alga Mougeotia // Exp. Cell Research. - 1978. -V.I 15. -P.25-30.

203. Maurel C., Reizer J., Schroeder J.I., Chrispeels M.J. The vacuolar membrane protein y-TIP creates water specific channels in Xenopus oocytes // EMBO J. -1993. - V.12. - P.2241-2247.

204. Maurel C., Kado R.T., Guern J., Chrispeels M.J. Phosphorylation regulates the water cannel activity of the seed-specific aquporin a-TIP // EMBO J. -1995.-V.14.-P.302803035.

205. Mauro A. Some properties of ionic and nonionic semmipernieable membranes//Circulation. -1960. - V. 21. - P.845-854.

206. Meiboom S., Gill D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times // Rev. Sci. Instr. - 1958. - V.29, N8. - P.688-691.

207. Mills J.W., Mandel L.J. Cytoskeletal regulation of membrane transport events //FASEB J. - 1994. - V.8, N14. - P.l 161-1165.

208. Miyake K., Nakamura M. Some factors concerning the centripetal diposition of bundle sheath chloroplasts during leaf development of Eleusine coracana // Ann. Bot. - 1993. - V.72, N3. - P.205-211.

209. Morejohn L.C., Fosket D.E. The biochemistry of compounds with anti-microtubule activity in plant cells // Pharmac. Theor. - 1991. - V.51. - P.217-230.

210. Morejohn L.C. The molecular pharmacology of plant tubulin and microtubules // The cytoskeletal basis of plant growth and form. London: Acad. Press, 1991. -P.29-43.

211. Muller J., Kachadorian W., Di Scala V.A. Evidence that ADH-stimulated intramembrane particle aggregated are transferred from cytoplasmic to luminel membranes in toad bladder epithermal cell;; // J. Cell Biol. - 1980. - V.85. -P.83-95.

212. Nagai R. Regulation of intracellular movements in plant cells by environment stimuli // Internat. Rev. Cytol. - 1993. - V. 145. - P.251-310.

213. Nick P., Bergfeld R., Schafer E., Schopfer P. Unilateral reorientation of microtubules at the outer epidermal wall during foto- and gravitropic curvature of

maize coleoptiles and sunflower hypocotyls // Planta. - 1990. - V.181. - P. 439-447.

214. Nick P. Signaling to the microtubular cytoskeleton in plants // International Review of Cytology. - 1998. - V .1 84. - P.33-80.

215.Niggli V., Burger M.M. Interaction of the cytoskeleton with the plasma membrane //Membr. Biol. - 1987. - V.100. - P.97-121.

216. Okamura S., Kakiuchi M., Sano A. Loss of tubulin during cold treatment of cultured carrot cells // Physiol. Plant. - 1993. - V.88. - P.93-98.

217. Olesen P. The neck constriction in plasmodesmata // Planta. - 1979. - V.144, N4. - P.349-358.

218. Owerall R.L., Wolfe J., Gunning B.E.S. Intercellular communication in Ar-olla roots. I. Ultrastructure of plasmodesmata // Protoplasma. - 1982. V. 111. -P. 134-150.

219. Palevitz B.A. Comparative effects of phalloidin and cytochalasin B on mobility and morphogenesis in Allium // Canad. J. Bot. - 1980. -.58, N7. - P.773-785.

220. Palevitz B.A. Accumulation of F-actin during cytokinesis in Allium. Correlation with microtubule distribution and effects of drugs // Protoplasma. - 1987. - V.141,N1.-P.24-32.

221. Parisi M., Bourguet J. Water cannels in animal cells: a widespread structure? // Biol. Cell. - 1985. - V.55. - P.155-158.

222. Partharathy M.V., Perdue T.D., Wiztum A., Alvenaz J. Actin network as a normal comonent of the cytoskeleton in many vascular plant cells // Amer. J. Bot. - 1985. - V.72, N8. - P.1318-1323.

223. Pearce R.S. A freeze-fracture study of the cell membranes of wheat adapted to extracellular freezing and to growth at low temperatures // J. of Experimental Botany. - 1985. - V.36, N164. - P.369-381.

224. Pickard B.G., Ding J.P. Gravity sensing by lr'gher plants. Medically activated channels in a model plant systems // Comparative Aspeats of Mechanoreceptor

systems / Ed. Ito. F. Comparative and Environmental Physiol.) Springer: Berlin. -1992. -V.10. -P.82-110.

225. Pickard B.G. Contemplating the plasmalemmal control center model // Protoplasma. - 1994. - V.l82. - P. 1-9.

226. Pihakasky-Maunsbach K., Puhakainen T. Effect of cold exposure on cortical microtubules of rye (Secale cereale) as observed by immunocytochemistry // Physiologia Plantarum. - 1995. - V.93. - P.563-571.

227. Porter K.P. The cytomatrix: a short history of its study // J. Cell Biol. - 1984. - V.99, suppl. 2. - P. 3s-12s.

228. Preston R.D. Cellulose-microfibril-orienting mechanisms in plant cell walls // Planta. - 1988. - V.174. - P.67-74.

229. Preston G.M., Carroll T.P., Guggino W.B., Agre P. Appearance of water cannais in Xenopus oocytes expressing red cell CH1P28 protein // Science. - 1992. -N256. - P.385-387.

230. Quander H. Formation and désintégration of cisternae of the endoplasmic reticulum visualized in live cells conventional fliiorence and confocal microsk-opy: evidence for the involvement of calcium and cytoskeleton // Protoplasma. -1990.-V.155, N1-3,-P.160-175.

231. Rascio A., Platani C., Scalfarti G., Tonti A., Di Fonzo N. The Accumulation of Solutes and Water Binding Strength in Durum Wheat // Physiol. Plant. -1994. - V.90, N4. -P.715-721.

232. Ray P.M. On theory of osmotic water movement // Plant Physiol. -1960. -V.35. - P.783-795.

233. Reed R.H.., Chudek J.A., Foster R., Gadd G.M. Osmotic significance of glycerol accumulation in yeasts // Appl. Env. Microbiol. - 1987. - V.53. -P.2119-2123.

234. Roberts I.N., Lloyd C.W., Roberts K. Ethylene-induced microtubule reorientation: mediation by helical arrays // Planta. - 1985. - V.164. - P.439-447.

235. Ross J.H.E., Hutchings A., Butcher G.W., Lane E.B., Lloyd C.W. The intermediate filament-related system of higher plant cells shares an epitope with cytokreanin 8 // J. Cell Sci. - 1991. - V.99. - P.91-98.

236. Ryu J.-H., Tagai S., Nagai R. Stationary organization of the actin cytoskele-ton in Vallisneria: the role of stable micritubules // J. Cell Biol. - 1995. - V. 107, N4. - P.1531-1539.

237. Schellenbaum P., Vantard M., Lambert A.M. Higher plant microtubule-associated proteins (MAPs): a survey // Biol. Cell. - 1992. - V.76, N3. - P.359-369.

238. Schliwa M. The cytoskeleton an introductory survey // Cell Biol. Monogr. V.13. Wien, New York: Springer-Verlag, 1986. -328 p.

239. Seagull R.W. A quantitative electron microscopic study of changes in microtubule arrays and wall micrifibril orientation during in vitro cotton fiber development//J. Cell Sci. 1992. -V. 101. -P.561-577.

240. Sievers A., Braun M., Hejnowicz Z. Gravity and cytoskeleton // Proc, 5th Eur. Symp. On Life Science Research in Space. Arcachon. France. Europ. Space Agency. - SP-366. - 1994. - P.15-17.

241. Slater R.O. The significance of the permanent wilting percentage in stud ies of plant and soil water relations // Bot. Rev. - 1957. - V.23, N5. - P.585-636.

242. Solomon A.K. Pores in the living cell // Sci. Amer. -1960. - V.203. - P. 146156.

243. Steiger C.J., Schliwa M. Actin localization and function in higher plants // Protoplasma. - 1987. - V. 141, N1. - P. 1-12.

244. Stein W.D. Transport and diffusion across cell membranes. London: Academic Press Inc., 1986

245. Stephens R.E. Membrane tubulin // Biol. Cell. - 1986. - V.57. - P.95-100.

246. Steudle E., Henzler T. Water channels in plants: do basic concepts of water transport change? // J. Exp. Bot. - 1995. - V.46, N290. - P.1067-1076.

247. Sundell C.L., Singer R.H. Requirement of microfilaments in sorting of actin mRNA // Science. - 1991. - V.253. - P. 1275-1277.

248. Schondohm E., Meyer-Wegener J. Actin polymerization as an essential process in light- and dark-controlled chloroplast anchorage // Biochem. Und Physiol. Pflanz. - 1989. - V.l85, N 5-6. - P.337-342.

249. Speranza A., Calzoni G.L. Cytochalasin B affects protein secretion in germination pollen of Malus domestica Borkn // J. Plant Physiol - 1989. - V.133, N6.-P.719-726.

250. Tanner T.E., Stejskal E.O. Restricted self-diffusion of protons in colloidal systems by the Pulse-Gradient Spin-echo Method // J. Chem. Phys. - 1968. - V.49.-P. 1768-1777.

251. Teoh T.S., Aylmore L.A.G., Quire J. Prevention of water by plant cell walls and implications for drought resistance // Austr. J. Biol. Sci. - 1967. - V.20. -P.41-50.

252. Tietz D., Tietz A. Streb im pflanzenreich// Biol. Unserer Zeit. - 1982. -Bd.12. - S.l 13-119.

253. Tiezzi A.', Moscatelli A., Bartalesi A., Cresti M. An immunoreactive homolog of mammalian kinesin in Nicotiana tabacum pollen tubes // Cell Motil Cytoskeleton. - 1992. - V.21. - P. 132-137.

254. Tiwary S.C., Wick S.M., Williamson R.E., Gunning B.E.S. Cytoskeleyon and integration of cellular function in cells of higher plants // J. Cell Biol. - 1984. -V.99, N1. - P.63-69.

255.Traas I.A. The plasma membrane-associated cytoskeleton / The Plant PI asma membrane. - Eds. C. Larson, J.M. Muller. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, 1990. -P.27-292.

256. Tyree M.T. The symolast concept. A general theiry of symplastic transport according to the thermodynamics of irreversible process // J. Theor. Biol. -1970. - V.26, N2. - P.181-214.

257. Verkman A.S. Water cannals in cells membranes // Annual Review of Physiology. - 1992. - Y.54. - P.97-108.

258. Vertucci C.W., Leopold A.C. The relationship between Water Binding and Desiccation Tolerance in Tissues // Plant Physiol. - 1987. - V.85. - P.232-238.

259. Villegas R., Barton T.C., Solomon A.K. The entrance of water into beef and dog red cells // J. Gen. Physio. - 1958. - V.42. - P.355-369.

260. Wang X.C., Zhang X.Q. Spectrin-like protein in Guard cells of Vicia faba L. // 10lh International Workshop on Plant Membrane Biology. Regensburg, August 6-11, 1995.-P.35.

261. Wayne R., Tazawa M. The actin cytoskeleton and polar water permeability in Characean cells // Protoplasma. - 1988. - V.2. - 116-130.

262. White R.G., Sack F.D. Actin microfilaments in presumptive statocytes of root caps and coleoptiles // Amer. J. Bot. 1990. - V.77, N1. - P. 17-26.

263. White R.G., Badelt K., Overall R.L., Vesk M. Actin assosiated with plas-modesmata//Protoplasma. - 1994. - V. 180. P. 169-184.

264. Wick S.M., Duniec J. immunofluorescence microscopy of tubulin and microtubule arrays in plant cells. I. Preprophase band development and concomitant appearance of nuclear envelope-associated tubulin // J. Cell Biol. - 1983. -V.97. - P.235-243.

265. Williamson R.E. Organelle movements // Ann. Rev. Plant Physiol. - 1993. -V.44. - P.181-202.

266. Woods C.M., Polito V.S., Reid M.S. Response to chilling stress in plant cells. II. Redistribution of intracellular calcium // Protoplasma. - 1984. - V. 121. -P. 17-24.