Влияние глюкозаминилмурамоилдипептида на биологическую активность цисплатина и фактора некроза опухолей-α тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Симонова, Мария Александровна

• Симонова, Мария Александровна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Симонова, Мария Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Программируемая клеточная гибель и фактор некроза опухолей

1.1.1 Пути реализации апоптоза.

1.1.2 Виды клеточной гибели, отличные от апоптоза.

1.1.3 ФНОа, история открытия, общая характеристика.

1.1.4 Механизм действия ФНОа и его общие биологические эффекты.

1.1.5 Механизм действия ФНОа на клетки L-929.

1.2 Мурамоилпептиды.

1.2.1 Особенности химической структуры мурамоилпептидов.

1.2.2 Биологическая активность мурамоилпептидов.

1.2.3 Клетки-мишени мурамоилпептидов.

1.2.4 Молекулярные механизмы биологического действия мурамоилпептидов.

1.2.5 Использование мурамоилпептидов в противоопухолевой терапии.

1.2.6 Совместные эффекты мурамоилпептидов с различными веществами.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние глюкозаминилмурамоилдипептида на биологическую активность цисплатина и фактора некроза опухолей-α»

Несмотря на безусловные достижения современной онкологии проблема повышения эффективности методов лечения злокачественных новообразований по-прежнему важна. Приоритетными задачами являются поиск и разработка принципиально новых подходов, а также усовершенствование традиционных способов лечения онкологических заболеваний. Неотъемлемой частью терапии злокачественных опухолей остается применение широкого спектра противоопухолевых химиопрепаратов и цитокинов. В связи с тем, что химиопрепараты высоко токсичны для организма, наиболее перспективно их использование в сочетании с иммуномодуляторами. Данный подход позволяет снижать дозу химиопрепаратов без снижения эффективности терапии. К числу успешно применяемых иммуномодулирующих агентов относятся мурамоилпептиды (МП) -фрагменты клеточных стенок бактерий и их производные, полученные путем химического синтеза. Они стимулируют цитотоксическую активность эффекторных клеток иммунной системы: макрофагов, NK-клеток, лимфоцитов, и индуцируют продукцию ряда цитокинов, в том числе фактора некроза опухолей-а (ФНОа), проявляющего токсическое действие в отношении опухолевых клеток. В ИБХ РАН проводится изучение ГМДП - N-ацетилглюкозаминил-р 1 —>4-М-ацетилмурамоил-аланил-Б-изоглутамина, обладающего иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью. Было показано непосредственное действие ГМДП на опухолевые клетки различных линий. ГМДП вызывал изменения в экспрессии мембранных антигенов опухолевых клеток, а именно опухолеассоциированных антигенов (ОАА), молекул адгезии, антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса и др. Одним из последствий изменений спектра экспрессируемых антигенов явилось усиление цитолиза опухолевых клеток аллогенными мононуклеарными клетками крови in vitro. Кроме того, ГМДП усиливал цитотоксическое действие ФНОа и цитостатиков на опухолевые клетки. Данный эффект ГМДП наблюдался на клетках как постоянных линий, так и полученных от онкологических больных. Следует подчеркнуть, что ГМДП не усиливал цитотоксического действия цисплатина и ФНОа на нормальных клетках.

В связи с выше сказанным нам представилось важным и интересным оценить перспективу использования ГМДП совместно с цитостатиками и цитокинами в противоопухолевой терапии. С этой целью изучалось влияние ГМДП на противоопухолевую активность химиопрепарата цисплатина (ЦП) и ФНОа, а также их комбинации, на моделях мышиных перевиваемых опухолей — аденокарциномы Эрлиха, меланомы В-16 и лимфолейкоза Р-388. Важно также было выяснить механизм потенцирующей активности ГМДП в отношении цитотоксического эффекта ФНОа на модели ФНОа-чувствительных клеток, поскольку его знание могло бы сыграть существенную роль в оптимизации подбора препаратов при их комплексном применении с МП в терапии онкологических заболеваний. Поэтому в данной работе более подробно изучалось влияние ГМДП на проявления активности ФНОа на модели ФНОа-чувствительных клеток линии Ь-929.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Симонова, Мария Александровна

выводы

1. Установлено, что ГМДП усиливает противоопухолевое действие цисплатина, ФНОа и их комбинации на моделях мышиных перевиваемых опухолей. Подобраны дозы ЦП, ФНОа и ГМДП, а также условия введения комбинаций, обеспечивающие 100%-ную выживаемость мышей с аденокарциномой Эрлиха.

2. Показано, что ГМДП снижает токсические проявления комбинации ЦП/ФНОа, введенной интактным мышам, а также нормализует у этих мышей изменения гематологических показателей.

3. Установлено, что ГМДП усиливает ФНОа-индуцированную гибель трансформированных мышиных фибробластов Ь-929, что сопровождается усилением фрагментации клеточной ДНК по апоптотическому типу, снижением митохондриального потенциала клеток и накоплением в среде культивирования эндогенного ФНОа.

4. Продемонстрирована способность ГМДП оказывать декомпактизирующее действие на структуру хроматина клеток Ь-929.

5. Показано, что ГМДП индуцирует продукцию активных форм кислорода (АФК) в клетках Ь-929, а также усиливает ФНОа-индуцированную продукцию АФК.

2.3 Заключение

На первом этапе данной работы оценивалась возможность использования ГМДП в противоопухолевой терапии мышей-носителей опухолей различной этиологии: аденокарциномы Эрлиха, меланомы В-16 и лимфолейкоза Р-388. Было показано, что ГМДП на данных моделях не обладал значимой противоопухолевой активностью, однако его выраженные иммуномодулирующие свойства позволяли надеяться на успешное применение данного мурамоилпептида в комбинации с химиопрепаратами и цитокинами. В настоящем исследовании в качестве основного химиопрепарата использовали цисплатин, препарат, широко применяемый для химиотерапии ряда злокачественных новообразований. Клетки выше указанных опухолей чувствительны к цисплатину. В качестве цитокина использовали ФНОа, который кроме цитотоксического обладает иммуномодулирующим действием. Аденокарцинома Эрлиха и меланома В-16 чувствительны к цитотоксическому действию ФНОа, клетки лимфолейкоза Р-388 резистентны к данному цитокину.

Было показано, что ГМДП на моделях выше перечисленных опухолей усиливал противоопухолевое действие цисплатина. В случаях ФНОа-чувствительпых меланомы file и аденокарциномы Эрлиха, ГМДП также усиливал противоопухолевое действие ФНОа, что согласуется с данными, полученными для этих клеток в системах in vitro. Основной задачей данного этапа работы явилось подробное изучение действия тройной комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на исследуемых моделях. Впервые показано, что данная комбинация с определенными дозами составляющих ее препаратов оказалась более эффективной при лечении мышей с аденокарциномой Эрлиха и меланомой В-16, чем составляющие ее препараты в тех же дозах по отдельности или парные сочетания препаратов.

В случае аденокарциномы Эрлиха стопроцентной выживаемости мышей-опухоленосителей удалось добиться как при единовременном, так и при многократном введении комбинации. Следует отметить, что обе дозы ЦП (40 и 80 мкг на мышь), входящие в состав комбинаций, обеспечивающих стопроцентную выживаемость мышей с аденокарциномой Эрлиха, были значительно ниже, чем его полулетальная доза (ЛД50), которая для мышей при внутрибрюшинном введении составляет 250 мг на мышь [282] Также следует подчеркнуть, что предлагаемая доза ФНОа (500 ед. на мышь, что соответствует концентрации в кровотоке менее 10"9 М) находится в диапазоне доз, безвредных для организма [22]. Кроме того, для ГМДП показана детоксицирующая активность, выражающаяся в предотвращении проявления острой токсичности комбинации ЦП/ФНОа.

На следующем этапе работы на модели ФНОа-чувствительпых клеток L-929 изучали влияние ГМДП на различные стадии реализации цитотоксического действия ФНОа. Следует отметить, что ГМДП не проявлял токсической активности в отношении данных клеток. Было показано, что ГМДП усиливал ФНОа-индуцированную гибель клеток L-929. При этом увеличивалось содержание клеток, находящихся на поздних стадиях апоптоза. В клетках, обработанных комбинацией ГМДП с ФНОа, отмечалось значительное снижение мембранного митохондриального потенциала как по сравнению с контрольными (необработанными) клетками, так и по сравнению с клетками, обработанными препаратами ГМДП или ФНОа по отдельности. Кроме того, нами было показано, что в клетках, погибших в результате действия ФНОа в присутствии ГМДП, ДНК была фрагментирована в большей степени, чем в клетках, обработанных одним ФНОа. Последний факт может быть объяснен влиянием ГМДП на нуклеосомальную структуру хроматина, что было показано методом электронной микроскопии. Хроматин клеток, обработанных ГМДП, отличался большей декомпактизацией нуклеосом по сравнению с контрольными клетками. Кроме того, для хроматина, выделенного из обработанных ГМДП клеток было отмечено меньшее содержание гистона HI. Следует отметить, что ГМДП вызывал выше означенные изменения в структуре хроматина не только при инкубации с ним интактных клеток, но и предварительно выделенных ядер. Поэтому молено предположить, что обработка клеток L-929 ГМДП приводит к тому, что их ДНК из-за общего ослабления связи с ней гистона HI становится более доступной для ферментов - эндонуклеаз, активизирующихся в процессе ФНОа-зависимой сигнализации, ведущей к гибели этих клеток. Это предположение подкрепляется ранее полученными данными о способности ГМДП конкурировать с ДНК за связывание с гистоном Н5 цыпленка (аналог гистона HI млекопитающих) и усиливать межнуклеосомальную деградацию ДНК под действием микрококковой нуклеазы [276]. Расщепление ДНК приводит к усилению активности системы ее репарации и большему расходу энергетических эквивалентов (нуклеозидтрифосфатов) в клетках. В результате происходят нарушения в работе митохондрий, и, как следствие, падение их мембранного электрохимического потенциала. Изменение степени ассоциации гистона HI с ДНК также может приводить к изменению экспрессии генов в обработанных ГМДП клетках. Однако в нашем случае, даже если такие изменения имеют место, они не важны для реализации потенцирующего эффекта ГМДП, поскольку этот эффект наблюдается в присутствии ингибитора транскрипции актиномицина Д [29].

Было также показано, что ГМДП индуцирует в клетках L-929 секрецию в культуральную среду эндогенного ФНОа. Однако его количества невелики и не могут обеспечить наблюдаемый для ГМДП потенцирующий эффект по отношению к цитотоксичности экзогенного ФНОа. Индукция секреции ФНОа клетками под действием ГМДП может, с одной стороны, зависеть от синтеза ФНОа de novo, и это может быть связано с прямым влиянием ГМДП на структуру клеточного хроматина. С другой стороны, для клеток L-929 было показано, что в них конститутивно присутствует мРНК, кодирующая ФНОа [41]. Возможно, что ГМДП индуцирует транскрипцию этой мРНК и дальнейшую секрецию ФНОа. У

Продемонстрирована способность ГМДП индуцировать продукцию О " в клетках L-929, а также усиливал ее под действием ФНОа. Данный эффект ГМДП может быть вызван его влиянием на структуру хроматина, поскольку известно, что при модификациях ДНК в клетках может усиливаться продукция активных форм кислорода [2, 7]. Генерация супероксид-радикала под действием ГМДП может быть не связана с митохондриями. В частности, было показано, что ГМДП напрямую активизирует систему окисления цитохрома р450 в мембранной фракции печени [266], и известно, что данная система также может быть источником активных форм кислорода [283].

Итак, в данной работе были изучены некоторые аспекты влияния ГМДП на биологическую активность ФНОа. Однако вопрос о механизме действия данного мурамоилпептида остается открытым. Для окончательного выяснения механизма действия ГМДП на опухолевых клетках необходимо дальнейшее проведение экспериментов. В частности, учитывая то, что в индукции ФНОа-зависимой гибели клеток Ь-929 в качестве вторичного мессенджера участвует церамид, представляется нужным и интересным определить влияние ГМДП на цитотоксическое действие церамида на этих клетках. Несмотря на то, что потенцирующее действие ГМДП не зависит от синтеза белка, необходимо проверить, экспрессируется ли белок N002 в клетках Ь-929, и, в конечном счете, не изменяется ли профиль экспрессии генов в данных клетках под действием ГМДП.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали культуральную среду и другие составляющие ростовой среды фирмы «Gibco» (Европа), растворы 0,25% трипсина и Версена - «ПанЭко» (РФ), пластиковую культуральную посуду - «Nunc» (Дания).

Диметилсульфоксид (ДМСО) был получен от фирмы «Мегск» (Германия), 0,4% раствор трипанового синего — от «Gibco» (Европа), актиномицин Д, 7-ААД, бромистый этидий, йодистый пропидий, люцигенин, МТТ, смесь фенол:хлороформ:изопропиловый спирт (25:24:1), родамин 123, РНКаза А, ротенон - от «Sigma» (США), набор реактивов «Annexin V-FITC Kit» — от «Immunotech» (Франция), протеиназа К - от «BRL» (США), маркеры молекулярного веса ДНК - от «СибЭпзим» (РФ).

М-ацетилглюкозаминил-(р 1 -4)-М-ацетилмурамоил-аланил-Э-изоглутамин (ГМДП) и М-ацетилглюкозаминил-(р 1 -4)-М-ацетилмурамоил-аланил-Ь-изоглутамин (LL-ГМДП), были синтезированы в лаборатории химии пептидов ИБХ РАН согласно ранее описанной методике [60]. п

Рекомбинантный человеческий ФНОа (активность 5x10 ед. на 1 мг белка) был получен от НИКТИ БАВ «Вектор» (РФ), цисплатин (готовый лекарственный препарат) -от фирмы «Эбеве» (Швеция).

Антитела к рецептору TNFR1 были получены от фирмы «BioLegend» (США), антитела к гистону HI — от «Biomeda» (США), нейтрализующие антитела к ФНОа - от «Caltag» (США). Конъюгат антител против гистона HI с частицами коллоидного золота был синтезирован И.А. Любавиной (лаборатория биотехнологии ИБХ РАН) по ранее описанной методике [284]. Размер частиц коллоидного золота составил 16 нм.

Клетки мышиной фибросаркомы L-929 были получены из Американской типовой коллекции клеточных культур (США), клетки аденокарциномы Эрлиха, меланомы В-16 и лимфолейкоза Р-388 были получены из коллекции клеточных культур ОНЦ РАМН.

Культивирование клеток. Клетки L-929 культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС и 10 мкг/мл гентамицина. Клетки росли в культуральных флаконах

9 П площадью 25 см в СОг-инкубаторе (37 С, 5% СОг). С поверхности флаконов клетки снимали инкубацией в течение 3 минут с растворами трипсина (0,25%) и Версена (1:1). После центрифугирования на 300 g при комнатной температуре в течение 10 мин клеточный осадок ресуспендировали в полной ростовой среде. Отбирали из образца аликвоту и с помощи камеры Горяева определяли концентрацию клеток. Плотность клеточной суспензии доводили до нужной величины и клетки использовали для экспериментов или дальнейшего культивирования.

Модели экспериментальных опухолей и схемы введения препаратов

Мыши линий Ва1Ь/С, С57В1/6), Р1[СВАхС57В1/б]] и БВА/2 были получены из питомника «Столбовая» Московской области (РФ).

Аденокарцинома Эрлиха

Клетки асцитной карциномы Эрлиха поддерживали на мышах Ва1Ь/С. Развитый асцит (10 дней после имплантации опухолевых клеток) центрифугировали 10 мин на 300§ при комнатной температуре, суспендировали в физиологическом растворе, доводили до концентрации 5, 10 или 50 млн. клеток в 1 мл и вводили внутрибрюшинно мышам линии Ва1Ь/С в количестве 1, 2 или 10 млн. клеток на мышь в объеме 0,2 мл.

Через 2 суток после введения клеток внутрибрюшинно, подкожно или внутривенно вводили растворы препаратов ЦП, ФНОа и ГМДП в физиологическом растворе в разных шприцах (0,2 мл на мышь). При однократном введении использовали дозы: ЦП - 40 или 80 мкг на мышь, ФНОа - 5000, 2000, 500, 250 или 50 ед. на мышь и ГМДП - 160, 150, 80, 45, 40, 20, 15, 10, 1,5 0,15 и 0,05 мкг на мышь. Контрольным животным вводили физиологический раствор. В качестве стандартного препарата использовали ЦП в дозе 40 или 80 мкг на мышь. £.

В экспериментах с многократным введением препаратов комбинация состояла из

ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь). Комбинацию

Г- ' препаратов заданного состава и ЦП, используемый в качестве стандартного препарата, вводили мышам-опухоленосителям, которым имплантировали клетки аденокарциномы Эрлиха в количестве 10 млн., 1 раз в неделю в течение 1 месяца.

В экспериментах с разновременным введением препаратов мышам-опухоленосителям, которым имплантировали опухолевые клетки в дозе 10 млн. на мышь, через 2 дня после имплантации клеток внутрибрюшинно вводили ГМДП в дозе 0,05 мкг на мышь, а затем через 1 сутки внутрибрюшинно вводили ЦП (40 мкг на мышь) и ФНОа (500 ед. на мышь).

Выживаемость животных оценивали в течение 90 суток со дня введения опухолевых клеток с интервалом наблюдения 10 дней.

Меланома В-16

Клетки меланомы В-16 поддерживали на мышах линии С57В1/6]. Развитую солидную опухоль (10 дней после имплантации), освобождали от соединительной ткани, взвешивали, измельчали в гомогенизаторе Поттера, центрифугировали 10 мин на 300g при комнатной температуре, суспендировали в физиологическом растворе из расчета 200 мкг опухоли на 1 мл и вводили подкожно в область спины мышам Р1[СВАхС57В1Лу] в дозе 50 мкг на мышь.

Через 2 суток вводили подкожно, внутрибрюшинно или внутривенно в физиологическом растворе препараты ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь) или их комбинации в объеме 0,2 мл в разных шприцах. Препараты и их комбинации вводили 1 раз в неделю в течение всего срока наблюдения (2 месяца). Контролем служили мыши-опухоленосители, которым вводили физиологический раствор. В качестве стандартного препарата вводили ЦП (40 мкг на мышь). Группа животных, которым вводили одинаковую комбинацию препаратов, включала 10 особей.

В экспериментах по изучению влияния предварительного введения мурамоилпептида на эффективность лечения инъекцию ГМДП (0,05 мкг на мышь) производили через 1 сутки после имплантации опухолевых клеток и за 1 сутки до введения комбинации препаратов. Для лечения использовали комбинацию препаратов ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь), которую вводили мышам-опухоленосителям 1 раза в неделю в течение всего срока наблюдения.

В течение 90 суток со дня введения опухолевых клеток с интервалом 10 дней оценивали выживаемость мышей, а по окончании срока наблюдения вычисляли их среднюю продолжительность жизни.

Лимфолейкоз Р-388

Клетки асцитного лимфолейкоза Р-388 поддерживали на мышах БВА/2. Развитый асцит (10 дней после имплантации опухолевых клеток) центрифугировали 10 мин на 300§ при комнатной температуре, суспендировали в физиологическом растворе, доводили до концентрации 5 млн. клеток на 1 мл и вводили внутрибрюшинно мышам линии БВА/2 в количестве 1 млн. клеток на мышь в объеме 0,2 мл.

Через 1 сутки мышам вводили внутрибрюшинно в физиологическом растворе в объеме 0,2 мл препараты ЦП (160 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0, 015, 0,15, 1,5, 15 и 150 мкг на мышь) или их комбинации в одном шприце. Инъекцию производили однократно. Контрольным мышам вводили физиологический раствор.

В экспериментах с многократным введением препаратов комбинация состояла из ЦП (40 и 80 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 и 0,15 мкг на мышь). Контролем служили мыши-опухоленосители, которым вводили физиологический раствор. В качестве стандартного препарата вводили ЦП (40 и 80 мкг на мышь). Группа животных, которым вводили одинаковую комбинацию препаратов, включала 10 особей.

В течение 40 суток со дня введения опухолевых клеток с интервалом 10 дней оценивали выживаемость мышей, а по окончании срока наблюдения вычисляли их среднюю продолжительность жизни.

Определение выживаемости и средней продолжительности жизни экспериментальных животных

Выживаемость определяли по формуле: S=(A/B)xlOO%, где А - число живых мышей на данный срок наблюдения после прививки опухоли, В - исходное число мышей в группе. Среднюю продолжительность жизни в сутках определяли по методу Каплана-Мейера [285].

Тестирование токсичности комбинации препаратов ЦП/ФНОа/ГМДП на мышах

Тестирование токсичности исследуемых комбинаций препаратов проводили на мышах Fl [CBAxC57Bl/6j].

Для проведения теста по изменению массы мышей (подосторая токсичность) под влиянием исследуемых комбинаций препаратов ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП использовали 3 группы мышей. Мышам из первой группы вводили ЦП (40 мкг на мышь) и ФНОа (500 ед. на мышь), мышам из второй группы - ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь), мышам из третьей группы - физиологический раствор. Препараты вводили мышам внутрибрюшинно однократно. Каждая экспериментальная группа включала 10 мышей. Мышей взвешивали до введения

Г/ ч препаратов и на 1, 3 и 7 сутки после введения препаратов и высчитывали процент прироста массы мышей по отношению к контрольной группе, в которой прирост был принят за 100%.

Для определения острой токсичности комбинаций ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП вводили внутрибрюшинно в однократных, двукратных, четырехкратных и восьмикратных дозах: ЦП 40, 80, 160 и 320 мкг на мышь; ФНО 500, 1000, 2000 и 4000 ед. на мышь и ГМДП 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 мкг на мышь. Каждая экспериментальная группа включала 10 мышей. Учитывали гибель мышей в течение 7 дней. Оценку результатов производили по проценту гибели животных. Среднелетальная доза была рассчитана по методу Ван дер Вардена [286].

Для определения хронической токсичности, вызываемой исследуемыми нами комбинациями препаратов ЦП/ФНОа и ЦП/ФНОа/ГМДП, мышам внутрибрюшинно вводили 1/10 части дозы каждого из препаратов, составляющих комбинацию, в равных аликвотах в течение 10 дней. Единовременно мышам вводили: первой группе - ЦП (4 мкг на мышь), ФНОа (50 ед. на мышь) и ГМДП (0,005 мкг на мышь); второй - ЦП (4 мкг на мышь) и ФНОа (50 ед. на мышь); третьей - физиологический раствор. Каждая экспериментальная группа включала 10 мышей. Перед каждым введением препаратов мышей взвешивали. После последней инъекции препаратов мышей взвешивали еще в течение 7 дней и определяли процент прироста массы животных по отношению к контрольной группе, в которой прирост был принят за 100%.

Тестирование влияния комбинации ЦП/ФНОа/ГМДП на гематологические показатели мышей

Для определения влияния исследуемых комбинаций на гематологические показатели мышам внутрибрюшинно вводили ЦП (40 мкг на мышь) и ФНОа (500 ед. на мышь) или ЦП (40 мкг на мышь), ФНОа (500 ед. на мышь) и ГМДП (0,05 мкг на мышь). Контролем служили мыши, которым вводили физиологический раствор. Каждая группа животных включала 10 особей. Через 7 суток после введения препаратов у мышей из глазного синуса забирали кровь, делали мазки, окрашивали их по методу Романовского-Гимза и под микроскопом определяли количество сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов.

Определение содержания апоптотических и некротических клеток L-929 в культурах проводили при помощи набора реактивов «Annexin V-FITC Kit» по стандартной методике, описанной ниже (все процедуры проводились при температуре 4°С). Клетки снимали с подложки с помощью трипсина и промывали два раза ФСБ (рН 7,4) центрифугированием на 300 g в течение 10 мин. Полученные осадки клеток ресуспендировали в связывающем буфере (плотность клеток 5x10б кл./мл). К суспензиям клеток объемами по 100 мкл добавили по 5 мкл раствора аннексина V-ФЛИТЦ и по 2,5 мкл раствора йодистого пропидия и перемешивали на миксере. Образцы инкубировали 10 мин на льду в темноте. По окончании инкубации к каждому из образцов клеток добавили по 150 мкл связывающего буфера. Образцы анализировали на проточном цитометре «Epics Elite» (Beckman Coulter, США).

Оценка жизнеспособности клеток в тесте с МТТ [287]

Клетки (2x105 клеток в мл) в объеме 100 мкл полной ростовой среды помещали в лунки 96-луночного культурального плоскодонного планшета. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе (37°С, 5% СОг) в течение ночи, затем к ним добавляли тестируемые препараты, растворенные в ФСБ (рН 7,4), в объемах 20 мкл на лунку. Объем жидкости в каждой лунке планшета доводился ФСБ (рН 7,4) до 200 мкл. Затем проводили инкубацию в течение 24-48 часов в СОг-инкубаторе (см. выше). По окончании инкубации в каждую лунку планшета вносили по 20 мкл раствора МТТ в ФСБ (2,5 мг/мл) и инкубировали клетки в СОг-инкубаторе в течение 2 ч. По окончании инкубации из лунок планшета удаляли среду и добавляли по 100 мкл ДМСО. После полного растворения образовавшихся кристаллов проводили измерение оптической плотности в каждой лунке планшета с помощью планшетного спектрофотометра «Spectra Count» (Packard, США) при длине волны 540 нм. Цитотоксичность, выраженную в процентах, определяли по формуле С=Вх100%/А, где А — значение оптической плотности в контроле (клетки, к которым вместо препаратов добавляли ФСБ), В — значение оптической плотности в лунке с клетками, обработанными теми или иными препаратами, С - цитотоксичность.

Анализ рецепторов к ФНОа на поверхности клеток L-929

Суспензии клеток L-929 (5x105 клеток на лунку) в объеме 0,5 мл полной ростовой среды помещали в лунки 24-луночного плоскодонного планшета. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе в течение ночи, затем к ним добавляли препарат ГМДП в конечной концентрации 10 мкг/мл. Объем жидкости в каждой лунке планшета доводился средой без ЭТС до 1 мл. Затем проводили инкубацию в течение 0,5, 1, 4 и 6 часов в СОг-инкубаторе. По окончании инкубации клетки снимали пипетированием, промывали ФСБ (рН 7,4), центрифугируя их в течение 10 мин на 300 g при температуре 4°С. Клеточные осадки ресуспендировали в 100 мкл холодного ФСБ (рН 7,4) с 2% ЭТС и 0,02% азида натрия, к ним добавляли по 3 мкл раствора антител против мышиного TNFR1 (aHTH-CD120a), меченых фикоэритрином и перемешивали на миксере. Образцы инкубировали, при 4°С в течение 20 мин на льду, после чего к ним добавляли по 3 мкл 0,005% раствора 7-А АД, перемешивали на миксере и инкубировали еще 10 мин на льду. По окончании инкубации клетки промывали ФСБ (рН 7,4) с ЭТС и азидом натрия центрифугированием в течение 10 мин на 300 g при температуре 4°С, осадки ресуспендировали в 0,5 мл ФСБ (рН7,4) с ЭТС и азидом натрия. Образцы анализировали на проточном цитометре «Cytomics FC500» (Beckman Coulter, США). С целью исключения из анализа мертвых клеток детектировали только 7-ААД-негативные события.

Выделение ядер из клеток L-929

Клетки промывали дважды холодным ФСБ (рН 7,4) и снимали с подложки пипетированием, после чего осаждали центрифугированием при 300 g и 4°С в течение 10 мин. Супернатант отбирали, а осадок клеток ресуспендировали в холодном буфере для экстракции ядер (10 mM HEPES, (рН 7,4) 320 гаМ сахарозы, 5 шМ MgCh, 1% тритон-XI00) из расчета 1 мл на 1 млн клеток, осторожно перемешивали на миксере и инкубировали 10 мин на льду. Эффективность выделения ядер контролировали в световой микроскоп с использованием красителя трипанового синего. По окончании инкубации ядра осаждали центрифугированием на 2000 g при 4°С в течение 10 мин. Осадок промывали дважды в буфере для ядер (10 шМ HEPES (рН 7,4) 320 шМ сахарозы, 5 шМ

MgCb) центрифугированием (см. выше), и ресуспендировали в 100 мкл того же буфера. Полученную суспензию ядер использовали для выделения хроматина.

Приготовление образцов для электронной микроскопии

Выделенные ядра лизировали гипотоническим шоком. Образцы хроматина объемом 7 мкл помещали на медные сеточки для электронной микроскопии, покрытые пленкой из пиелоформа, и инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. Избыточную жидкость отбирали, сеточки инкубировали с антителами к гистону HI, мечеными коллоидным золотом в течение 30 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации образцы высушивали и проводили их контрастирование 1% раствором уранилацетата в течение 50 сек. Образцы на сеточках высушивали и анализировали на трансмиссионном электронном микроскопе «JEM 100СХ» (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Анализ прохождения клеток по клеточному циклу

Суспензии клеток L-929 (6x104 клеток на лунку) в объеме 0,5 мл полной ростовой среды помещали в лунки 24-луночного плоскодонного планшета. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе в течение ночи, затем к ним добавляли препарат ГМДП в конечной концентрации 10 мкг/мл. Объем жидкости в каждой лунке планшета доводился средой без ЭТС до 1 мл. Затем проводили инкубацию в течение 3, 6, 12 и 24 часов в СОг-инкубаторе. По окончании инкубации клетки снимали раствором Версена, промывали два раза ФСБ (рН 7,4), центрифугируя их в течение 10 мин на 300 g при температуре 4°С. Клеточные осадки ресуспендировали в 1 мл ФСБ (рН 7,4), к ним добавляли по 2 мл холодного 96% I этанола и перемешивали на миксере. Образцы инкубировали при 4°С в течение 2 ч, после чего промывали 2 раза ФСБ (рН 7,4) центрифугированием в течение 10 мин на 1000 g при температуре 4°С. К осадкам клеток добавляли 0,5 мл раствора РНКазы, не содержащей ДНКазы (0,5 мг/мл), в ФСБ (рН 7,4) и 40 мкл водного раствора йодистого пропидия (1 мг/мл) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Образцы анализировали на проточном цитометре «Epics Elite» (Beckman Coulter, США).

Оценка величины мембранного потенциала митохондрий в клетках L-929

Суспензии клеток L-929 (1x105 клеток на лунку) в объеме 0,5 мл полной ростовой среды помещали в лунки 24-луночного плоскодонного планшета. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе в течение ночи, затем к ним добавляли препараты ГМДП и ФНОа в конечных концентрациях 10 мкг/мл и 500 ед./мл, соответственно. Объем жидкости в каждой лунке планшета доводился средой без ЭТС до 1 мл. Затем проводили инкубацию в течение 2, 4, 6 и 9 часов в СОг-инкубаторе. За час до окончания инкубации к клеткам добавляли раствор родамина 123 в ДМСО в конечной концентрации 1|аМ. По окончании инкубации клетки снимали пипетированием, промывали ФСБ (рН 7,4), центрифугируя их в течение 10 мин на 300 g при комнатной температуре. Клеточные осадки ресуспендировали в 0,5 мл ФСБ (рН 7,4). Образцы анализировали на проточном цитометре «Cytomics FC500» (Beckman Coulter, США). Детекцию флуоресценции осуществляли на ФЭУ1. Оценивали величины средней флуоресценции клеток, относительную величину флуоресценции вычисляли по формуле: ОФ=СО/СК, где ОФ -относительная величина флуоресценции, СО - средняя величина флуоресценции обработанных клеток, СК - средняя величина флуоресценции контрольных клеток.

Анализ фрагментации ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле

Суспензии клеток L-929 (2x10б клеток на флакон) в объеме 5 мл полной ростовой о , среды помещали в культуральные флаконы площадью 25 см . Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе в течение ночи, затем к ним добавляли препараты ГМДП и ФНОа в конечной концентрации 10 мкг/мл и 500 ед./мл, соответственно. Далее проводили инкубацию в течение 48 часов в СОг-инкубаторе. По окончании инкубации клетки снимали с поверхности флаконов пипетированием и промывали 2 раза холодным ФСБ (рН 7,4), центрифугируя их в течение 10 мин на 300 g при температуре 4°С. К образцам клеток (по 2х10б клеток на образец) добавляли по 300 мкл лизирующего буфера (10 шМ tris-HCl, рН 8,0, 3 шМ MgCl2, 10 шМ NaCl, 0,5% NP-40), перемешивали на миксере и инкубировали 10 мин во льду. По окончании инкубации к образцам добавляли по 12,5 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия и по 2 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали образцы при 50°С в течение 1 ч. Далее к образцам добавляли по 2 мкл раствора РНКазы А (10 мг/мл) и проводили инкубацию образцов при 37°С в течение 1 ч. По окончании инкубации производили экстракцию ДНК, добавляя к образцам по 1 объему смеси фенол:хлороформ:изопропиловый спирт (25:24:1) с интенсивным перемешиванием. Образцы центрифугировали при 13 000 g в течение 10 мин при 4°С. Образовавшиеся водные фазы переносили в новые пробирки и производили осаждение ДНК добавлением по 0,1 объема 3 М ацетата натрия и 2 объемов 96% этанола и последующей инкубацией при -18°С в течение 1 ч. По окончании инкубации образцы центрифугировали на 13 000 g в течение 10 мин при 40С. Удаляли супернатант, а осадок высушивали и растворяли в 10 мкл буфера ТЕ (10 шМ tris-HCl, 1 шМ ЭДТА, рН 8,0). К полученным растворам добавляли 10х буфер нанесения (ТЕ, 0,1% ксиленцианол, 0,1% бромфеноловый синий, 50% глицерин). Образцы анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве электродного буфера использовали ТАЕ (40 шМ tris-CH3COOH, 1 шМ ЭДТА, рН 8,0), электрофорез проводили при постоянном напряжении 60 В.

Оценка продукции супероксид-аниона клетками L-929

Суспензии клеток L-929 (4x106 клеток на кювету) в объеме 3 мл полной ростовой среды помещали в полистирольные кюветы хемилюминометра. Клетки инкубировали в течение ночи в роллерном инкубаторе, затем культуральную среду в кюветах заменяли на раствор Хэнкса, содержащий 5% ЭТС и добавляли препараты ГМДП (10 мкг/мл), ФНОа (500 ед./мл), люцигенина (100 цМ), ротенона (0,2 цМ). Образцы помещали в хемилюминометр «LUMINOMETER» 1251 (LKB, Швеция) и в течение 75 мин измеряли хемилюминесценцию образцов при 37°С. Эксперименты были проведены минимум три раза. В работе отображены наиболее типичные результаты.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку проводили с помощью встроенного статистического пакета программы «MS Excel». Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Симонова, Мария Александровна, 2008 год

1. Ярилин А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии, в кн. Актуальные проблемы патофизиологии, под ред. Б. Мороза. Медицина: Москва, 2001. С. 13-56.

2. Самуилов В., Олескин А., Лагунова Е. Программируемая клеточная смерть. (2000) Биохимия. 65(8), 1029-1046.

3. Kerr J., Wyllie A., Currie A. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. (1972) Br J Cancer. 26(4), 239-257.

4. Guimaraes C., Linden R. Programmed cell deaths. Apoptosis and alternative deathstyles. (2004) Eur J Biochem. 271(9), 1638-1650.

5. Okada H., Mak T. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. (2004) Nat Rev Cancer. 4(8), 592-603.

6. Барышников А., Шишкин Ю. Иммунологические проблемы апоптоза. Москва: Эдиториал УРСС, 2002. С. 11-14.

7. Adams J. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. (2003) Genes Dev. 17(20), 2481-2495.

8. Cohen G. Caspases: the executioners of apoptosis. (1997) Biochem J. 326(Pt 1), 1-16.

9. Riedl S., Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. (2004) Nat Rev Mol Cell Biol. 5(11), 897-907.

10. Ashkenazi A., Dixit V. Death receptors: signaling and modulatioa (1998) Science. 281(28), 1305-1308.

11. Shu K., Li В., Wu L. The p53 network: p53 and its downstream genes. (2007) Colloids Surf В Biointerfaces. 55(1), 10-18.

12. Lleo A., Invernizzi P., Selmi C., Coppel R., Alpini G., Podda M., Mackay I., Gershwin M. Autophagy: Highlighting a novel player in the autoimmunity scenario. (2007) J Autoimmunity. 29, 61-68.

13. Han S., Kim Y.-S., Kim T.-H. Role of apoptotic and necrotic cell death under physiologic conditions. (2008) BMB Reports. 41(1), 1-10.

14. Carswell E., Old L., Kassel R., Green S., Fiore N., Williamson B. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. (1975) Proc Natl Acad Sci USA. 72(9), 3666-3670.

15. Ярилин А. Основы иммунологии. Москва: Медицина, 1999. С. 259-262.

16. Kriegler M., Perezb С., DeFaya К., Alberta I., Lu S. A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: Ramifications for the complex physiology of TNF. (1988) Cell. 53(1), 45-53.

17. Tang P., Hung M.-C., Klostergaard J. Human pro-tumor necrosis factor is a homotrimer. (1996) Biochemistry. 35(25), 8216-8225.

18. Locksley R., Killeen N., Lenardo M. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. (2001) Cell. 104(4), 487-501.

19. Nagata S. Apoptosis by death factor. (1997) Cell. 88(3), 355-365.

20. Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling. (2003) Cell Death Differ. 10, 45-65.

21. Hehlgans Т., Pfeffer K. The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. (2005) Immunology. 115, 120.

22. Несмеянов В. (1997) Цитокины иммунной системы, в кн. Белки иммунной системы, под ред. В. Иванова. ИБХ РАН: Москва, 1997. С. 79-120.

23. Ковальчук Л., Ганковская Л., Рубакова Э. Система цитокинов. РГМУ: Москва. 2000. С. 21-23.

24. Earle W. Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. (1943) J Natn Cancer Inst. 4, 165-212.

25. Sanford K., Earle W., Likely G. The growth in vitro of single isolated tissue cells. (1948) J Natl Cancer Inst. 9(3), 229-246.

26. Sugarman В., Aggarwal В., Hass P., Figari I., Jr M.P., Shepard H. Recombinant human tumor necrosis factor-alpha: effects on proliferation of normal and transformed cells in vitro. (1985) Science. 230(4728), 943-945.

27. Ruff M., Gifford G. Rabbit tumor necrosis factor: mechanism of actioa (1981) Infect Immun. 31(1), 380-385.

28. Humphreys D., Wilson M. Modes of L929 cell death induced by TNF-alpha and other cytotoxic agents. (1999) Cytokine. 11(10), 773-782.

29. Мошникова А., Кротова К., Галат В., Афанасьев В., Садовников В., Белецкий И. Апоптоз клеток L-929 под действием фактора некроза опухолей. (2000) Цитология. 42(6), 561-567.

30. Lagarkova M., Iarovaia O., Razin S. Large-scale fragmentation of mammalian DNA in the course of apoptosis proceeds via excision of chomosomal DNA loops and their oligomers. (1995) J Biol Chem. 270(35), 20239-20241.

31. Kouroku Y., Fujita E., Jimbo A., Mukasa T., Tsuru T., Momoi M., Momoi T. Localization of active form of caspase-8 in mouse L929 cells induced by TNF treatment and polyglutamine aggregates. (2000) Biochem Biophys Res Commun. 270(3), 972-977.

32. Tafani M., Schneider T., Pastorino J., Farber J. Cytochrome c-dependent activation of caspase-3 by tumor necrosis factor requires induction of the mitochondrial permeability transition. (2000) Am J Pathol. 156(6), 2111-2121.

33. Piret J., Arnould T., Fuks B., Chatelain P., Remacle J., Michiels C. Caspase activation precedes PTP opening in TNF-alpha-induced apoptosis in L929 cells. (2004) Mitochondrion. 3(5), 261-278.

34. Hennet T., Richter C., Peterhans E. Tumour necrosis factor-alpha induces superoxide anion generation in mitochondria of L929 cells. (1993) Biochem J. 289(Pt2), 587-592.

35. Powell C., Herzog T., Scott J., Collins J. Evidence for a protein synthesis-dependent and -independent TNF alpha cytolytic mechanism. (1995) Gynecol Oncol. 58(3), 327-335.

36. Hehner S., Hofmann Т., Ratter F., Dumont A., Droge W., Schmitz M. Tumor necrosis factor-alpha-induced cell killing and activation of transcription factor NF-kappaB are uncoupled in L929 cells. (1998) J Biol Chem. 273(29), 18117-18121.

37. Jayadev S., Hayter H., Andrieu N., Gamard C., Liu В., Balu R., Hayakawa M., Ito F., Hannun Y. Phospholipase A2 is necessary for tumor necrosis factor alpha-induced ceramide generation in L929 cells. (1997) J Biol Chem. 272(27), 17169-17203.

38. Thon L., Mohlig H., Mathieu S., Lange A., Bulanova E., Winoto-Morbach S., Schütze S., Bulfone-Paus S., Adam D. Ceramide mediates caspase-independent programmed cell death. (2005) FASEB J. 19(14), 1945-1956.

39. Strelow A., Bernardo K., Adam-Klages S., Linke Т., Sandhoff K., Kronke M., Adam D. Overexpression of acid ceramidase protects from tumor necrosis factor-induced cell death. (2000) J Exp Med. 5(4), 601-611.

40. Lavelle E., McGuirk P., Mills K. Molecules of infectious agents as immunomodulatory drugs. (2004) Curr Top Med Chem. 2004(4), 5.

41. Hamann L., El-Samalouti V., Ulmer A., Fiad H., Rietschel E. Components of gut bacteria as immunomodulators. (1998) Int J Food Microbiol. 41(2), 141-154.

42. Гусев M., Минеева JI. Микробиология, 4-е изд. Москва: Издательский центр "Академия", 2003.

43. Pabst М., Beranova-Giorgianni S., Krueger J. Effects of muramyl peptides on macrophages, monokines, and sleep. (1999) Neuroimmunomodulation. 6(4), 261-283.

44. Andronova Т., Ivanov V. (1991) The structure and immunomodulating function of glucosaminylmuramyl peptides, in Sov Medical Review D Immunology. Harwood Academic Publishers, pp. 1-63.

45. Adam A., Ciorbaru R., Petit J.-F., Lederer E. Isolation and properties of a macromolecular, water-soluble, immuno-adjuvant fraction from the cell wall of Mycobacterium smegmatis. (1972) Proc Natl Acad Sci USA. 69(4), 851-854.

46. Ellouz F., Adam A., Ciorbaru R., Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. (1974) Biochem Biophys Res Commun. 59(4), 1317-1325.

47. Kotani S., Watanabe Y., Kinoshita F., Shimono Т., Morisaki I. Immunoadjuvant activities of synthetic N-acetyl-muramyl-peptides or -amino acids. (1975) Biken J. 18(2), 105111.

48. Богданов И., Величков В., Гуревич А., Далев П., Колосов М. Антиопухолевые эффекты гликопептидов клеточной стенки Lactobacillus bulgaricus. (1977) Бюлллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. 84(12), 709-712.

49. Bogdanov I., Dalev P., Gurevich A., Kolosov M., Mal'kova V., Plemyannikova L., Sorokina I. Antitumour glycopeptides from Lactobacillus bulgaricus cell wall. (1975) FEBS Lett. 57(3), 259-261.

50. Андронова Т., Ростовцева Л., Добрушкина Е., Гаврилов Ю., Дешко Т., Иванов В. О структуре противоопухолевого гликопептида из клеточной стенки Lactobacillus bulgaricus. (1980) Биоорганическая Химия. 6(12), 1830-1840.

51. Ростовцева Л., Андронова Т., Малькова В., Сорокина И., Иванов В. Синтез и противоопухолевое действие гликопептидов, содержащих N-ацетилглюкозаминил-ф 1 -4)-N-ацетилмурамил-дисахаридное звено. (1981) Биоорганическая химия. 7(12), 1843-1858.

52. Lefrancier P., Lederer E. Muramyl-peptides. (1987) Pure Appl Chem. 59(3), 449-454.

53. Tandon P., Utsugi Т., Sone S. Lack of production of interleukin 1 by human blood monocytes activated to the antitumor state by liposome-encapsulated muramyl tripeptide. (1986) Cancer Res. 46(10), 5039-5044.

54. Sone S., Mutsuura S., Ogawara M., Tsubura E. Potentiating effect of muramyl dipeptide and its lipophilic analog encapsulated in liposomes on tumor cell killing by human monocytes. (1984) J Immunol. 132(4), 2105-2110.

55. Akasaki M., Takashi T., Kita Y., Tsukada W. Augmentation of immune responses by a muramyl dipeptide analog, MDP-Lys(L18). (1987) Agents Actions. 22(1-2), 144-150.

56. Karnovsky M.L. Muramyl peptides in mammalian tissues and their effects at the cellular level. (1986) Fed Proc. 45(11), 2556-2560.

57. Johannsen L. Biological properties of bacterial peptidoglycan. (1993) APMIS. 101(5), 337-44.

58. Shockman G., Daneo-Moore L., Kariyama R., Massidda. O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. (1996) Microb Drug Resist. 2(1), 95-98.

59. Vermeulen M., Gray G. Processing of Bacillus subtilis peptidoglycan by a mouse macrophage cell line. (1984) Infect Immun. 46(2), 476-483.

60. Johannsen L., Wecke J., Jr F.O., Krueger J. Macrophages produce somnogenic and pyrogenic muramyl peptides during digestion of staphylococci. (1991) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 260(1), R126-R133.

61. Fincher E., Johannsen L., Kapas L., Takahashi S., Krueger J. Microglia digest Staphylococcus aureus into low molecular weight biologically active compounds. (1996) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 271, 149 156.

62. Khaitov R., Kulakov A., Pinegin В., Makarov E., Ledger P. The study of serum level and immunochemical properties of natural antibodies to N-acetylglucosaminyl-N-acetylmurarnyl dipeptide in healthy donors. (1996) Russ J Immunol. 1(1), 5-8.

63. Иванов В., Андронова Т., Несмеянов В., Пинегин Б., Ledger P., Bomford R., Хаитов Р. Механизм действия и клиническая эффективность иммуномодулятора глюкозаминилмурамил дипептида (ликопида). (1997) Клиническая медицина. 3,11-15.

64. Fox A., Fox К. Rapid elimination of a synthetic adjuvant peptide from the circulation after systemic administration and absence of detectable natural muramyl peptides in normal serum at current analytical limits. (1991) Ifect Immun. 59(3), 1202-1205.

65. Harrison J., Fox A. Degradation of muramyl dipeptide by mammalian serum. (1985) Infect Immun. 50(1), 320-321.

66. Ganley J., Redens Т., Kooragayala L., Welbourne Т., Langford M. Serum muramyl dipeptidase activity against synthetic bacterial cell wall peptidoglycans. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, E-abstract 1443.

67. Fogler W., Wade R., Brundish D., Fidler I. Distribution and fate of free and liposome-encapsulated 3H.nor-muramyl dipeptide and [3H]muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine in mice. (1985) J Immunol. 135(2), 1372-1377.

68. Shi F., Kurzman I., MacEwen E. In vitro and in vivo production of interleukin-6 induced by muramyl peptides and lipopolysaccharide in normal dogs. (1995) Cancer Biother. 10(4), 317-325.

69. Adeleye Т., Moreno C., Ivanyi J., Aston R. The modulation of tumour necrosis factor-alpha, interleukin-1 alpha and glucose levels with GMDP and other analogues of muramyl dipeptide. (1994) APMIS. 102(2), 145-152.

70. Fukuyama R., Takeda H., Fushiki S., Yamamoto T. Muramyl dipeptide injected into crushed sciatic nerve, activates macrophages and promotes recovery of walking locomotion in rats. (1998) Restor Neurol Neurosci. 13(3-4), 213-219.

71. Sugawara Т., Takada S., Miyamoto M., Nomura M., Kato M. Inflammatory cytokine production induced by an analogue of muramyl dipeptide MDP-Lys(L18) in rat macrophage cultures and dog synovial fluid. (1996) Inflammation. 20(1), 43-56.

72. Galelli A., Chariot В., Phillips N., Chedid L. Induction of colony-stimulating activity in mice by injection of liposomes containing lipophilic muramyl peptide derivatives. (1989) Cancer Res. 49(4), 810-815.

73. Broudy V., Kaushansky K., Shoemaker S., Aggarwal В., Adamson J. Muramyl dipeptide induces production of hemopoietic growth factors in vivo by a mechanism independent of tumor necrosis factor. (1990) J Immunol. 144(10), 3789-3794.

74. Tavares E., Maldonado R., Ojeda M., Minano F. Circulating inflammatory mediators during start of fever in differential diagnosis of gram-negative and gram-positive infections in leukopenic rats. (2005) Clin Diagn Lab Immunol. 12(9), 1085-1093.

75. Пименов А., Рахмилевич А., Деев В., Кириллова И., Мигдаль Т., Андронова Т., Фукс В. Активация клеточного иммунитета у мышей в норме и при опухолевом росте под действием глюкозаминилмурамилдипептида (1990) Вопросы Медицинской Химии. 36(1), 58-60.

76. Cummings N., Pabst M., Jr R.J. Activation of macrophages for enhanced release of superoxide anion and greater killing of Candida albicans by injection of muramyl dipeptide. (1980) J Exp Med. 152, 1659-1669.

77. Fidler I., Sone S., Fogler W., Barnes Z. Eradication of spontaneous metastases and activation of alveolar macrophages by intravenous injection of liposomes containing muramyl dipeptide. (1981) Proc Natl Acad Sci USA. 78(3), 1680-1684.

78. Garrec Y.L., Morin A. Modulation of natural killer activity by muramyl peptides: relationship with adjuvant and anti-infectious properties. (1987) Nat Immun Cell Growth Regul. 6(2), 65-76.

79. Talmadge J., Schneider M., Collins M., Phillips H., Herberman R., Wiltrout R. Augmentation of NK cell activity in tissue specific sites by liposomes incorporating MTP-PE. (1985) J Immunol. 135(2), 1477-1483.

80. Chedid L., Audibert F., Lefrancier P., Choay J., Lederer E. Modulation of the immune response by a synthetic adjuvant and analogs. (1976) Proc Natl Acad Sci USA. 73(7), 24722475.

81. Specter S., Cimprich R., Friedman H., Chedid L. Stimulation of an enhanced in vitro immune response by a synthetic adjuvant, muramyl dipeptide. (1978) J Immunol. 120(2), 487491.

82. Reese R., Trager W., Jensen J., Miller D., Tantravahi R. Immunization against malaria with antigen from Plasmodium falciparum cultivated in vitro. (1978) Proc Natl Acad Sci USA. 75(11), 5665-5668.

83. Lôwy I., Bona C., Chedid L. Target cells for the activity of a synthetic adjuvant: Muramyl dipeptide. (1977) Cell Immunol. 29(1), 195-199.

84. Pietersz G., Li W., Popovski V., Caruana J., Apostolopoulos V., McKenzie I. Parameters for using mannan-MUCl fusion protein to induce cellular immunity. (1998) Cancer Immunol Immunother. 45(6), 321-326.

85. Fast D., Vosika G. The muramyl dipeptide analog GMTP-N-DPG preferentially induces cellular immunity to soluble antigens. (1997) Vaccine. 15(16), 1748-1752.

86. Vogel F., Powell M. A compendium of vaccine adjuvants and excipients. (1995) Pharm Biotechnol. 6, 141-228.

87. Pap В., Макаров E., Юровский В., Мещерякова Е., Андронова Т., Иванов В. Синтетические иммуногенные комплексы на основе пептида поверхностного белка вируса ящура (1990) Биоорганическая Химия. 16(7), 904-915.

88. Иванов В., Мещерякова Е., Андронова Т., Иванов В. Использование синтетических носителей и адъювантов для повышения иммуногенности синтетического пептида CS-белка Plasmodium falciparum. (1991) Биоорганическая Химия. 17(6), 732-746.

89. Stills H. Adjuvants and antibody production: dispelling the myths associated with freund's complete and other adjuvants. (2005) ILAR Journal. 46(3), 281-293.

90. Passlick В., Labeta M., Izbicki J., Ostertag P., Loffler Т., Siebeck M., Pichlmeier U., Schweiberer L., Ziegler-Heitbrock H. Prevention of experimental endotoxin shock by a monocyte activator. (1995) Antimicrob Agents Chemother. 39(11), 2535-2540.

91. Пинегин Б., Андронова Т., Карсонова М. Препараты мурамилдипептидного ряда иммунотропные лекарственные средства нового поколения. (1997) International Journal on Immunorehabilitation. 6(27-33).

92. Azuma I. Development of the cytokine inducer romurtide: experimental studies and clinical applicatioa (1992) Trends Pharmacol Sci. 13(12), 425-428.

93. Семенова И. Принципы коррекции вторичных иммунодефицитов путем использования двух иммуномодуляторов различной природы очищенного стафилококкового анатоксина и ликопида (1998) Журнал Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунобиологии. 1,100-104. ;

94. Баранова И., Молотинов В., Симонова А. Клинико-иммунологическая эффективность применения иммуномодуляторов в лечении больных фурункулёзом. (1998) Иммунология. 4, 63-64.

95. Свистунова А., Аршинова С., Климова С., Симонова А., Мазуров Д., Голубева Н., Андронова Т. Клиническая и иммунологическая эффективность иммуномодулятора ликопида при туберкулезе легких. (2000) Иммунология. 5, 59-62.

96. Riveau G., Masek K., Parant M., Chedid L. Central pyrogenic activity of muramyl dipeptide. (1980) J Exp Med. 152(4), 869-877.

97. Johannsen L., Obal F., Kapas L., Kovalzon V., Krueger J. Somnogenic activity of muramyl peptide-derived immune adjuvants. (1994) Int J Immunopharmacol. 16(2), 109-116.

98. Lederer E. (1988) Natural and synthetic immunomodulators derived from the mycobacterial cell wall, in Advanses in Immunomodulation, B. Bizzini, E. Bonmassar, Editors. Pythagora Press: Roma-Milan, pp. 9-36.

99. Balitsky K., Umansky V., Tarakhovsky A., Andronova T., Ivanov V. Glucosaminylmuramyl dipeptide-induced changes in murine macrophage metabolism. (1989) Int J Immunopharmacol. 11(5), 429-434.

100. Darcissac E., Bahr G., Parant M., Chedid L., Riveau G. Selective induction, of CD1 la,b,c/CD18 and CD54 expression at the cell surface of human leukocytes by muramyl peptides. (1996) Cell Immunol. 169(2), 294-301.

101. Nesmeyanov V., Khaidukov S., Komaleva R., Andronova T., Ivanov V. Muramylpeptides augment expression of la-antigens on mouse macrophages. (1990) Biomed Sci. 1(2), 151-154.

102. Khaidukov S., Komaleva R., Nesmeyanov V. N-acetylglucosamine-containing muramyl peptides directly affect macrophages. (1995) Int J Immunopharmacol. 17(11), 903-911.

103. Todd R., Alvarez P., Brott D., Liu D. Bacterial lipopolysaccharide, phorbol myristate acetate, and muramyl dipeptide stimulate the expression of a human monocyte surface antigen, Mo3e. (1985) J Immunol. 135(6), 3869-3877.

104. Cohen L., Courtois G., Parant M. Differentiation of murine pre-B cell line by an adjuvant muramyl peptide viaNF-KB activation. (1995) Immunobiology. 193(5), 363-377.

105. Todate A., Suda T., Kuwata H., Chida K., Nakamura H. Muramyl dipeptide-Lys stimulates the function of human dendritic cells. (2001) J Leukoc Biol. 70(5), 273-279.

106. Riveau G., Brunel-Riveau В., Audibert F., Chedid L. Influence of a muramyl dipeptide on human blood leukocyte functions and their membrane antigens. (1991) Cell Immunol. 134(1), 147-156.

107. Валякина Т., Макаров E., Малахов А., Андронова Т., Ревазова Е., Несмеянов В., Иванов В. Мурамилпептиды повышают экспрессию опухолеассоциированных антигенов. (1993) Иммунология. 4, 32-36.

108. Valyakina Т., Komaleva R., Petrova Е., Malakhov A., Shamborant О., Andronova Т., Nesmeyanov V. Endogenous tumour necrosis factor-alpha sensitise melanoma cells to glucosaminylmuramyl dipeptide. (1998) FEBS Lett. 426(3), 373-376.

109. Langford М., Chen D., Welboume Т., Redens Т., Ganley J. Stereo-isomer specific induction of renal cell apoptosis by synthetic muramyl dipeptide (N-acetylmuramyl-:L-alanyl-D-isoglutamine). (2002) Mol Cell Biochem. 236(1-2), 63-73.

110. Srur L., Langford M. Caspase mediated apoptosis of conjunctival cells associated with muramyl dipeptide induced conjunctivitis. (2007) Inves Ophtalmol Vis Sci. 48, E-abstract 1925.

111. Galelli A., Dosne A., Morin A., Dubor F., Chedid L. Stimulation of human endothelial cells by synthetic muramyl peptides: production of colony-stimulating activity (CSA). (1985) Exp Hematol. 13(11), 1157-1163.

112. Li C., Kumar S., Ledger P., Ponting J., Carette M., Allan E. Glucosaminylmuramyl dipeptide (GMDP) modulates endothelial cell activities in vitro but has no effect on angiogenesis in vivo. (1997) Inflamm Res. 46(9), 348-353.

113. Silverman D., Wu H., Karnovsky M. Muramyl peptides and serotonin interact at specific binding sites on macrophages and enhance superoxide release. (1985) Biochem Biophys Res Commun. 131(3), 1160-1167.

114. Polanski M., Karnovsky M. Serotonergic aspects of the response of human platelets to immune-adjuvant muramyl dipeptide. (1992) J Neuroimmunol. 37(1-2), 149-160.

115. Polanski M., Vermeulen M., Wu J., Karnovsky M. Muramyl dipeptide mimicry in the regulation of murine macrophage activation by serotonin (1995) Int J Immunopharmacol. 17(3), 225-232.

116. Silverman D., Krueger J., Karnovsky M. Specific binding sites for muramyl peptides on murine macrophages. (1986) J Immunol. 136(6), 2195-2201.

117. Root-Bernstein R., Westall F. Serotonin binding sites. II. Muramyl dipeptide binds to serotonin binding sites on myelin basic protein, LHRH, and MSH-ACTH 4-10. (1990) Brain Res Bull. 25(6), 827-841.

118. Мещерякова E., Алексеева JI. Поиск гликопептид- и серотонин-связывающих пептидов из рецептора серотонииа. (1996) Информационный Бюллетень РФФИ. 4(3), 314.

119. Мещерякова Е. Поиск гликопептид- и серотонин-связывающих пептидов из рецептора серотонина (1998) Информационный Бюллетень РФФИ. 5(3), 237.

120. Kaydalov A., Utkin Y., Andronova Т., Tsetlin V., Ivanov V. Muramyl peptides bind specifically to rat brain membranes. (1989) FEBS Lett. 248(1-2), 78-82.

121. Кайдалов А., Уткин Ю., Андронова Т., Цетлин В., Иванов В. Специфическое связывание мурамоилпептидов с мембранами мозга крысы. (1987) Биоорганическая Химия. 13(11), 1523-1529.

122. Tenu J., Adam A., Souvannavong V., Yapo A., Petit J., Douglas K. Photoafflnity• 1") ^ labeling of macrophages and B-lymphocytes using I-labeled aryl-azide derivatives ofmuramyldipeptide. (1989) Int J Immunopharmacol. 11(6), 653-661.

123. Sumaroka M., Litvinov I., Khaidukov S., Golovina Т., Kamraz M., Komaleva R., Andronova Т., Makarov E., Nesmeyanov V., et al. Muramyl peptide-binding sites are located inside target cells. (1991) FEBS Lett. 295(1-3), 48-50.

124. Golovina Т., Sumaroka M., Samokhvalova L., Shebzukhov Y., Andronova Т., Nesmeyanov V. Biochemical characterization of glucosaminylmuramyldipeptide binding sites of murine macrophages. (1994) FEBS Lett. 365, 9-12.

125. Головина Т., Сумарока M., Самохвалова Л., Шебзухов Ю., Макаров Е., Несмеянов В. Полипептиды из мышиных перитонеальных макрофагов, распознающие глюкозаминилмурамоилдипептид. (1995) Биоорганическая Химия. 21(4), 268-274.

126. Golovina Т., Fattakhovaa G., Swiderekb К., Makarov Е., Bovina N., Shivelyb J., Nesmeyanov V. Specific binding of glucosaminylmuramyl peptides to histones. (1999) FEBS Lett. 454,152-156.

127. Ohe Y., Hayashi H., Iwai K. Human spleen histone HI. Isolation and amino acid sequence of a main variant, Hlb. (1986) J Biochem (Tokyo). 100(2), 359-368.

128. Dziarski R. Recognition of bacterial peptidoglycan by the innate immune system. (2003) Cell Mol Life Sci. 60, 1793-1804.

129. Chen D., Texada D., Duggan C., Liang C., Reden Т., Kooragayala L., Langford M. Surface calreticulin mediates muramyl dipeptide-induced apoptosis in RK13 cells. (2005) J Biol Chem. 280(23), 22425-2236.

130. Dziarski R., Tapping R., Tobias P. Binding of bacterial peptidoglycan to CD 14. (1998) J Biol Chem. 273(15), 8680-8690.

131. Inamura S., Fujimoto Y., Kawasaki A., Shiokawa Z., Woelk E., Heine H., Lindner В., Inohara N., Kusumotoa S., et al. Synthesis of peptidoglycan fragments and evaluation of their biological activity. (2006) Org Biomol Chem. 4, 232-242.

132. Girardin S., Boneca I., Viala J., Chamaillard M., Labigne A., Thomas G., Philpott D., Sansonetti P. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detectioa (2003) J Biol Chem. 278(11), 8869-8872.

133. Chamaillard M., Hashimoto M., Horie Y., Masumoto J., Qiu S., Saab L., Ogura Y., Kawasaki A., Fukase K., et al. An essential role for NODI in host recognition of bacterial peptidoglycan containing diaminopimelic acid. (2003) Nat Immunol. 4(7), 702-707.

134. Pauleau A.-L., Murray P. Role of Nod2 in the response of macrophages to toll-like receptor agonists. (2003) Mol Cell Biol. 23(21), 7531-7539.

135. Kobayashi K., Chamaillard M., Ogura Y., Henegariu O., Inohara N., Nunez G., Flavell R. Nod2-dependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal tract. (2005) Science. 307(4), 731-734.

136. Girardin S., Travassos L., Herve M., Blanot D., Boneca I., Philpott D., Sansonetti P., Mengin-Lecreulx D. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nodi and Nod2. (2003) J Biol Chem. 278(43), 41702-41708.

137. Inohara N., Nunez G. NODS: intracellular proteins involved in inflammation and apoptosis. (2003) Nat Rew Immunol. 3, 371-382.

138. Tanabe T., Chamaillard M., Ogura Y., Zhu L., Qiu S., Masumoto J., Ghosh P., Moran A., Predergast M., et al. Regulatory regions and critical residues of NOD2 involved in muramyl dipeptide recognitioa (2004) EMBO J. 23(7), 1587-1597.

139. Leung E., Honga J., Fraser A., Krissansen G. Splicing of NOD2 (CARD 15) RNA transcripts. (2007) Moll Immunol. 44, 284-294.

140. Murray P. NOD proteins: an intracellular pathogen-recognition system or signal transduction modifiers? (2005) Curr Opin Immunol. 17, 352-358.

141. Windheim M., Lang C., Peggie M., Plater L., Cohen P. Molecular mechanisms involved in the regulation of cytokine production by muramyl dipeptide. (2007) Biochem J. 404(2), 179-190.

142. Yang Y., Yin C., Pandey A., Abbott D., Sassetti C., Kelliher M. NOD2 pathway activation by MDP or Mycobacterium tuberculosis infection involves the stable polyubiquitination of Rip2. (2007) J Biol Chem. 282(50), 36223-36229.

143. Kim J.-Y., Omori E., Matsumoto K., Nunez G., Ninomiya-Tsuji J. TAK1 is a central mediator of NOD2 signaling in epidermal cells. (2007) J Biol Chem. 283(1), 137-144.

144. Pan Q., Kravchenko V., Katz A., Huang S., Ii M., Mathison J., Kobayashi K., Flavell R., Schreiber R., et al. NF-KB-Inducing Kinase Regulates Selected Gene Expressionin the Nod2 Signaling Pathway. (2006) Infect Immun. 74(4), 2121-2127.

145. Kufer T., Kremmer E., Banks D., Philpott D. Role for erbin in bacterial activation of Nod2. (2006) Infect Immun. 74(6), 3115-3124.

146. McDonald C., Chen F., Ollendorff V., Ogura Y., Marchetto S., Lecine P., Borg J.-P., Nunez G. A role for erbin in the regulation of Nod2-dependent NF-kB signaling. (2005) J Biol Chem. 280(48), 40301-40309.

147. Yamamoto-Furusho J., Barnich N., Xavier R., Hisamatsu T., Podolsky D. Centaurin pi down-regulates nucleotide-binding oligomerization domains 1- and 2-dependent NF-kB activation. (2006) J Biol Chem. 281(47), 36060-36070.

148. Barnich N., Aguirre J., Reinecker H.-C., Xavier R., Podolsky D. Membrane recruitment of NOD2 in intestinal epithelial cells is essential for nuclear factor-kb activation in muramyl dipeptide recognition. (2005) J Cell Biol. 170(1), 21-26.

149. Lecine P., Esmiol S., Metais J.-Y., Nicoletti C., Nourry C., McDonald C., Nunez G., Hugot J.-P., Borg J.-P., et al. The NOD2-RICK complex signals from the plasma membrane. (2007) J Biol Chem. 282(20), 15197-15207.

150. Oh H., Lee H., Seo G., Choi E., Kweon S., Chun C., Han W., Lee K., Lee M., et al. Induction and localization of NOD2 protein in human endothelial cells. (2005) Cell Immunol. 237(1), 37-44.

151. Hisamatsu T., Suzuki M., Reinecker H., Nadeau W., McCormick B., Podolsky D. CARD15/NOD2 functions as an antibacterial factor in human intestinal epithelial cells. (2003) Gastroenterology. 124(4), 993-1000.

152. Ogura Y., Inohara N., Benito A., Chen F., Yamaoka S., Nunez G. Nod2, a Nodl/Apaf-1 family member that is restricted to monocytes and activates NF-kB. (2001) J Biol Chem. 276(7), 4812-4818.

153. Gutierrez O., Pipaon K., Inohara N., Fontalba A., Ogura Y., Prosper F., Nunez G., Fernandez-Luna J. Induction of Nod2 in myelomonocytic and intestinal epithelial cells via nuclear factor-kB activation (2002) J Biol Chem. 277(44), 41701-41705.

154. D Sterka J., Marriott I. Characterization of nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) protein expression in primary murine microglia (2006) J Neuroimmunol. 179(1-2), 6575.

155. Costello M., Joyce S., Abrahams V. NOD protein expression and function in first trimester trophoblast cells. (2007) Am J Reprod Immunol. 57, 67-80.

156. Davey M., Martin T., Planck S., Lee J., Zamora D., Rosenbaum J. Human endothelial cells express NOD2/CARD15 and increase IL-6 secretion in response to muramyl dipeptide. (2006) Microvasc Res. 71(2), 103-107.

157. Rosenstiel P., Fantini M., Brautigam K., Kuhbacher T., Waetzig G., Seegert D., Schreiber S. TNF-a and IFN-y regulate the expression of the NOD2 (CARD 15) gene in human intestinal epithelial cells. (2003) Gastroenterology. 124(4), 1001-1009.

158. Li J., Moran T., Swanson E., Julian C., Harris J., Bonen D., Hedl M., Nicolae D., Abraham C., et al. Regulation of IL-8 and IL-ip expression in Crohn's disease associated NOD2/CARD15 mutations. (2004) Hum Mol Genet. 13(16), 1715-1725.

159. Voss E., Wehkamp J., Wehkamp K., Stange E., Schroder J., Harder J. NOD2/CARD15 mediates induction of the antimicrobial peptide human p-defensin-2. (2006) J Biol Chem. 281(4), 2005-2011.

160. Rosenzweig H., Davey M., Planck S., Sawkar H., Pengshung M., Jensen J., Goodwin K., Rosenbaum J.T., Martin T.M. Characterization of a novel model of NOD2-dependent ocular inflammatioa (2007) Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, E-abstract 3628.

161. Weichart D., Gobom J., Klopfleisch S., Hasler R., Gustavsson N., Billmann S., Lehrach H., Seegert D., Schreiber S., et al. Analysis of NOD2-mediated proteome response to muramyl dipeptide in HEK293 cells. (2006) J Biol Chem. 281(4), 2380-2389.

162. Chamaillard M., Girardin S., Viala J., Philpott D. Nods, Nalps and Naip: intracellular regulators of bacterial-induced inflammatioa (2003) Cell Microbiol. 5(9), 581-592.

163. Martinon F., Agostini L., Meylan E., Tschopp J. Identification of bacterial muramyl dipeptide as activator of the NALP3/cryopyrin inflammasome. (2004) Curr Biol. 14(9), 19291934.

164. Faustin B., Lartigue L., Bruey J., Luciano F., Sergienko E., Bailly-Maitre B., Volkmann N., Hanein D., Rouiller I., et al. Reconstituted NALP1 inflammasome reveals two-step mechanism of caspase-1 activation. (2007) Mol Cell. 25(5), 713-724. i

165. Pan Q., Mathison J., Fearns C., Kravchenko V., Correia J., Hoffman H., Kobayashi K., Bertin J., Grant E., et al. MDP-induced interleukin-ip processing requires Nod2 and CIAS1/NALP3. (2007) J Leukoc Biol. 82(1), 177-183.

166. Dong W., Liu Y., Peng J., Chen L., Zou T., Xiao H., Liu Z., Li W., Bu Y., et al. The IRAK-1 -BCL10-MALT1-TRAF6-TAK1 cascade mediates signaling to NF-B from toll-like receptor 4. (2006) J Biol Chem. 281(36), 26029-26040.

167. Lenz L., Mohammadi S., Geissler A., Portnoy D. SecA2-dependent secretion of autolytic enzymes promotes Listeria monocytogenes pathogenesis. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 100(21), 12432-12437.

168. Chen D., Duggan C., Reden T., Kooragayala L., Texada D., Langford M. Calreticulin is a binding protein for muramyl dipeptide for muramyl dipeptide and peptidoglycan in RK13 cells. (2004) Biochemistry. 43, 11796-11801.

169. Michalak M., Mesaeli E.C.N., Nakamura К., Opas M. Calreticulin: one protein, one gene, many functions. (1999) Biochem J. 344(2), 281-292.

170. Groenendyk J., Lynch J., Michalak M. Calreticulin, Ca2+, and calcineurin signaling from the endoplasmic reticulum. (2004) Mol Cells. 17(3), 383-389.

171. Elliott Т., Williams A. The optimization of peptide cargo bound to MHC class I molecules by the peptide-loading complex. (2005) Immunol Rev. 207, 89-99.

172. Brownbill A., Braun D., Dukor P., Schumann G. Induction of tumouricidal leucocytes by the intranasal application of MTP-PE, a lipophilic muramyl peptide. (1985) Cancer Immunol Immunother. 20( 1), 11 -17.

173. Jarowenko D., Sigler S., Pellis N. Muramyl tripeptide: an effective immunotherapy in the surgical setting for pediatric abdominal neoplasms. (1987) J Pediatr Surg. 22(6), 497-500.

174. Malik S., Martin D., Hart I., Balkwill F. Therapy of human ovarian cancer xenografts with intraperitoneal liposome encapsulated muramyl-tripeptide phosphoethanolamine (MTP-PE) and recombinant GM-CSF. (1991) Br J Cancer. 63(3), 399-403.

175. Уманский В., Стефанов А., Бондарь О., Балицкий К., Пинчук В. Антиметастатический эффект заключенного в липосомы аналога мурамоилпептида. (1988) Вопросы Онкологии. 34(4), 433-438.

176. Phillips N., Tsao M. Inhibition of experimental liver tumor growth in mice by liposomes containing a lipophilic muramyl dipeptide derivative. (1989) Cancer Res. 49(4), 936939.

177. Nitta Y., Sugita Т., Ikuta Y., Murakami T. Inhibitory effect of liposomal MDP-Lys on lung metastasis of transplantable osteosarcoma in hamster. (2000) Oncol Res. 12(1), 25-31.

178. Yoo Y., Saiki I., Sato K., Azuma I. MDP-Lys(L18), a lipophilic derivative of muramyl dipeptide, inhibits the metastasis of haematogenous and non-haematogenous tumours in mice. (1994) Vaccine. 12(2), 175-160.

179. Nardin A., Lefebvre M.-L., Labroquere K., Faure O., Abastado J.-P. Liposomal muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine: Targeting and activating macrophages for adjuvant treatment of osteosarcoma (2006) Curr Cancer Drug Targets. 6(2), 123-133.

180. Talmadge J., Lenz B., Klabansky R., Simon R., Riggs C., Guo S., Oldham R., Fidler I. Therapy of autochthonous skin cancers in mice with intravenously injected liposomes containing muramyltripeptide. (1986) Cancer Res. 46(3), 1160-1163.

181. Karpoff H., Jarnagin W., Delman K., Fong Y. Regional muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine administration enhances hepatic immune function and tumor surveillance. (2000) Surgery. 128(2), 213-218.

182. Thomas K., Nijenhuis A., Dontje B., Daernen T., Scherphof G. Antitumor reactivity induced by liposomal MTP-PE in a liver metastasis model of colon cancer in the rat. (1995) Clin Exp Metastasis. 13(5), 328-336.

183. Dinney C., Tanguay S., Bucana C., Eve B., Fidler I. Intravesical liposomal muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine treatment of human bladder carcinoma growing in nude mice. (1995) J Interferon Cytokine Res. 15(6), 585-592.

184. Murray J., Kleinerman E., Cunningham J., Tatom J., Andrejcio K., Lepe-Zuniga J., Lamki L., Rosenblum M., Frost H., et al. Phase I trial of liposomal muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine in cancer patients. (1989) J Clin Oncol. 7(12), 1915-1925.

185. Urba W., Hartmann L., Longo D., Steis R., II J.S., Kedar I., Creekmore S., Sznol M., Gonion K., et al. Phase I and immunomodulatory study of a muramyl peptide, muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine. (1990) Cancer Res. 50(10), 2979-2986.

186. Gianan M., Kleinerman E. Liposomal muramyl tripeptide (CGP 19835A lipid) therapy for resectable melanoma in patients who were at high risk for relapse: an update. (1998) Cancer Biother Radiopharm. 13(5), 363-368.

187. Kleinerman E., Gano J., Johnston D., Benjamin R., Jaffe N. Efficacy of liposomal muramyl tripeptide (CGP 19835A) in the treatment of relapsed osteosarcoma (1995) Am J Clin Oncol. 18(2), 93-99.

188. Ullrich S., Fidler I. Liposomes containing muramyl .tripeptide phosphatidylethanolamine (MTP-PE) are excellent adjuvants for induction of ah immune response to protein and tumor antigens. (1992) J Leukoc Biol. 52(5), 489-494.

189. Yoo Y., Saiki I., Sato K., Azuma I. B30-MDP, a synthetic muramyl" dipeptide derivative for tumour vaccination to enhance antitumour immunity and antimetastatic effect in mice. (1992) Vaccine. 10(11), 792-797.

190. Asao T., Shibata H., Batist G., Brodt P. Eradication of hepatic metastases of carcinoma H-59 by combination chemoimmunotherapy with liposomal muramyl tripeptide, 5-fluorouracil, and leucovoria (1992) Cancer Res. 52(22), 6254-6257.

191. Lowy I., Leclerc C., Bourgeois E., Chedid L. Inhibition of mitogen-induced polyclonal activation by by a synthetic adjuvant, muramyl dipeptide (MDP). (1980) J Immunol. 124(1), 320-325.

192. Traub S., Aulock S.v., Hartung T., Hermann C. MDP and other muropeptides-direct and synergistic effects on the immune system. (2006) J Endotox Res. 12(2), 69-85.

193. Galelli A., Chedid L. Induction of colony-stimulating activity (CSA) by a synthetic muramyl peptide (MDP): synergism with LPS and activity in C3H/HeJ mice and in endotoxin-tolerized mice. (1986) J Immunol. 137(10), 3211-3215.

194. Parant M., Parant F., Vinit M., Jupin C., Noso Y., Chedid L. Priming effect of muramyl peptides for induction by lipopolysaccharide of tumor necrosis factor production in mice. (1990) J Leukoc Biol. 47(2), 164-169.

195. Parant M., Pouillart P., Contel C.L., Parant F., Chedid L., Bahr G. Selective modulation of lipopolysaccharide-induced death and cytokine production by various muramyl peptides. (1995) Infect Immun. 63(1), 110-115.

196. Meshcheryakova E., Guryanova S., Makarov E., Alekseeva L., Andronova T., Ivanov V. Prevention of experimental septic shock by pretreatment of mice with muramyl peptides. (2001) Int Immunopharmacol. 1(9-10), 1857-1865.

197. Langhans W., Balkowski G., Savoldelli D. Differential feeding responses to bacterial lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. (1991) Am J Physiol Regul Integr Conip Physiol. 261(3), R659-R664.

198. Roth J., Asian T., Storr B., Zeisberger. E. Lack of cross tolerance between LPS and muramyl dipeptide in induction of circulating TNF-a and IL-6 in guinea pigs. (1997) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 273(4 Pt 2), R1529-R1533.

199. Wolfert M., Murray T., Boons G.-J., Moore J. The origin of the synergistic effect of muramyl dipeptide with endotoxin and peptidoglycaa (2002) J Biol Chem. 277(42), 3917939186.

200. Traub S., Kubasch N., Morath S., Kresse M., Hartung T., Schmidt R., Hermann C. Structural requirements of synthetic muropeptides to synergize with lipopolysaccharide in cytokine inductioa (2004) J Biol Chem. 279(10), 8694-8700.

201. Kim H., Yang J., Woo S., Kim S., Yun C.-H., Kim K., Han S. Lipoteichoic acid and muramyl dipeptide synergistically induce maturation of human dendritic cells and concurrent expression of proinflammatory cytokines. (2007) J Leukoc Biol. 81, 983-989.

202. Slesarev V., Ellithorpe R., Dimitroff T. Inhibition of systemic TNF-a cytotoxicity in cancer patients by D-peptidoglycaa (1998) Med Oncol. 15(1), 73-43.

203. Dubois С., Bissonnette E., Rola-Pleszczynski M. Platelet-activating factor (PAF) enhances tumor necrosis factor production by alveolar macrophages. Prevention by PAF receptor antagonists and lipoxygenase inhibitors. (1989) J Immunol. 143(3), 964-970.

204. Salem P., Deryckx S., Dulioust A., Vivier E., Denizot Y., Damais C., Dinarello C., Thomas Y. Immunoregulatory functions of paf-acether. IV. Enhancement of IL-1 production by muramyl dipeptide-stimulated monocytes. (1990) J Immunol. 144(4), 1338-1344.

205. Szlosarek P., Balkwill F. Tumour necrosis factor alpha: a potential target for the therapy of solid tumours. (2003) Lancet Oncol. 4(9), 565-573.

206. Yao X., Panichpisal K., Kurtzman N., Nugent K. Cisplatin nephrotoxicity: a review. (2007) Am J Med Sci. 334(2), 115-124.

207. Sacchi A., Gasparri A., Gallo-Stampino C., Toma S., Curnis F., Corti A. Synergistic antitumor activity of cisplatin, paclitaxel, and gemcitabine with tumor vasculature-targeted tumor necrosis factor-alpha (2006) Clin Cancer Res. 12(1), 175-182.

208. Петрова E. Изучение функциональной активности глюкозаминил-мурамоилдиггептида на опухолевых клетках. Автореферат дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук, Москва, 2002.

209. Terlikowski S., Sulkowska М., Nowak Н. The effect of recombinant human tumor necrosis factor-alpha on Ehrlich ascites tumor growth. (2002) J Environ Pathol Toxicol Oncol. 21(1), 87-92.

210. Трещалина E., Жукова О., Герасимова Г., Гарин А., Смирнова А. Методические рекомендации по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ, 1992, С. 319-325.

211. Sosnowska D., Mysliwski A., Dzierzbicka K., Kolodziejczyk A. The in vitro effect of new muramyl peptide derivatives on cytotoxic activity of NK (natural killer) cells from hamsters bearing Ab Bomirski melanoma (1997) Biotherapy. 10(2), 161-168.

212. Warzocha K., Robak T. Antileukemic effects of recombinant human tumor necrosis factor alpha (rh-TNF alpha) with cyclophosphamide or methotrexate on leukemia L1210 and leukemia P388 in mice. (1992) Acta Haematol Pol. 23(1), 55-62.

213. Maranda E., Robak T. Interactions of 2',2'-diflurodeoxycytidine (gemcitabine) with tumor necrosis factor alpha or its mutein VI in murine leukemias L1210 and P388. (1998) Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 46(2), 113-119.

214. Wang D., Lippard S. Cellular processing of platinum anticancer drugs. (2005) Nat Rev Drug Duscovery. 4, 307-320.

215. Арзамасцев E.B., Гуськова T.A., Либерман C.C., Любимов Б.И., Рудаков А.Г., Верстакова О.Л. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств, 1997.

216. Aston R., Kovalev I. Muramyl peptide for the treatment of toxicity. Vol. PCT/GB93/00408. USA: Peptech (UK) Limited (London, GB), 2003.

217. Correia J.d.S., Miranda Y., Austin-Brown N., Hsu J., Mathison J., Xiang R., Zhou H., Li Q., Han J., et al. Nodi-dependent control of tumor growth. (2006) Proc Natl Acad Sci USA. 103(6), 1840-1845.

218. Vermes I., Haanen C., Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death. (2000) J Immunol Methods. 243(1-2), 167-190.

219. Meers P., Mealy T. Calcium-dependent annexin V binding to phospholipids: stoichiometry, specificity, and the role of negative charge. (1993) Biochemistry. 32(43), 1171111721.

220. Rubin В., Anderson S., Sullivan S., Williamson В., Carswell E., Old L. Nonhematopoietic cells selected for resistance to tumor necrosis factor produce tumor necrosis factor. (1986) J Exp Med. 164(4), 1350-1355.

221. Ченцов Ю. Введение в клеточную биологию, 4-е изд. Москва: Академкнига, 2004. С. 117-121.

222. Lever М., Th'ng J., Sun X., Hendzel M. Rapid exchange of histone Hl.l on chromatin in living human cells. (2000) Nature. 408, 873-876.

223. Bustin M., Catez F., Lim J.-H. The dynamics of histone HI function in chromatia (2005) Mol Cell. 17, 617-620.

224. Woodcock C., Skoultchi A., Fan Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: HI stoichiometry and nucleosome repeat length. (2006) Chromosome Res. 14(1), 1725.

225. Головина Т. Локализация и характеристика мурамилпептидсвязывающих молекул клеток иммуной системы. Автореферат дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук, Москва, 1996.

226. Johnson L., Walsh M., Chen L. Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. (1980) Proc Natl Acad Sci USA. 77(2), 990-994.

227. Faulkner K., Fridovich I. Luminol and lucigenin as detectors for O2". (1993) Free Radic Biol Med. 15(4), 447-451.

228. Самуилов В., Олескин А. Технологическая биоэнергетика. Москва: Издательство Московского университета, 1994. С. 44.

229. Grivennikova V., Vinogradov A. Generation of superoxide by the mitochondrial Complex I. (2006) Biochim Biophys Acta. 1757(5-6), 553-561.

230. National Drug Information Service. NDIS Profile on Cisplatin. Commonwealth Department of Human Services and Health, Canberra. 1985.

231. Гулак П., Дудченко А., Зайцев В., Лукьянова Л., Новиков К., Орлов С., Покудин Н., Попова О., Уголев А. Гепатоцит: функционально-метаболические свойства. Москва: Наука, 1985. С. 125-145.

232. Kaplan Е., Meier P. Non-parametric estimation from incomplete observations. (1958) J Am Stat Assoc 53,457-481.

233. Ван дер Варден Б. Математическая статистика. Москва: Издательство иностранной литературы, 1960. С. 434.

234. Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. (1983) J Immunol Methods. 65(1-2), 55-63.

235. Bustin M., Catez F., Lim J.-H. The dynamics of histone HI function in chromatia (2005) Mol Cell. 17,617-620.

236. Woodcock C., Skoultchi A., Fan Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: HI stoichiometry and nucleosome repeat length. (2006) Chromosome Res. 14(1), 1725.

237. Головина Т. Локализация и характеристика мурамилпептидсвязывающих молекул клеток иммуной системы. Автореферат дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук, Москва, 1996.

238. Johnson L., Walsh M., Chen L. Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. (1980) Proc Natl Acad Sci USA. 77(2), 990-994.• • "J

239. Faulkner K., Fridovich I. Luminol and lucigenin as detectors for О (1993) Free Radic Biol Med. 15(4), 447-451.

240. Самуилов В., Олескин А. Технологическая биоэнергетика. Москва: Издательство Московского университета, 1994. С. 44.

241. Grivennikova V., Vinogradov A. Generation of superoxide by the mitochondrial Complex I. (2006) Biochim Biophys Acta. 1757(5-6), 553-561.

242. National Drug Information Service. NDIS Profile on Cisplatin. Commonwealth Department of Human Services and Health, Canberra. 1985.

243. Гулак П., Дудченко А., Зайцев В., Лукьянова Л., Новиков К., Орлов С., Покудин Н., Попова О., Уголев А. Гепатоцит: функционально-метаболические свойства. Москва: Наука, 1985. С. 125-145.

244. Kaplan Е., Meier P. Non-parametric estimation from incomplete observations. (1958) J Am Stat Assoc 53,457-481.

245. Ван дер Варден Б. Математическая статистика. Москва: Издательство иностранной литературы, 1960. С. 434.

246. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. (1983) J Immunol Methods. 65(1-2), 55-63.