Влияние гипоксии на функциональную активность мезенхимных стволовых клеток при лечении ранений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Волкова Марина Викторовна

• Волкова Марина Викторовна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Волкова Марина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки: функции и применение

Иммунологические основы и секреторная активность мезенхимных стволовых клеток

Культивирование мезенхимных стволовых клеток в условиях гипоксии

Патогенез и заживление ранений

Ранения

Ожоги

Обморожения

Процесс заживления ранений и возможные осложнения

Влияние арктических условий на патогенез заболеваний

Потенциал применения мезенхимных стволовых клеток для лечения ранений

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение и идентификация мезенхимных стволовых клеток

Выделение мезенхимных стволовых клеток из красного костного мозга лабораторных

животных

Культивирование мезенхимных стволовых клеток из красного костного мозга лабораторных

животных

Криоконсервирование мезенхимных стволовых клеток из красного костного мозга

лабораторных животных

Фенотипический анализ мезенхимных стволовых клеток

Оценка способности к дифференцировке

Изучение функциональной активности мезенхимных стволовых клеток

Оценка ДНК-профилей клеточных популяций

Метод колониеобразования

Подготовка образцов для оценки секреторной активности

Метод интерферометрии слоя биомолекул

Фенотипирование и оценка пролиферативной активности мезенхимных стволовых клеток

после криоконсервации

Проведение доклинических исследований in vivo

Модель химического ожога III-IV степени на мышах Balb/с

Экспериментальное исследование эффективности мезенхимных стволовых клеток на модели химического ожога

Модель обморожения III-IV на крысах Wistar

Экспериментальное исследование эффективности мезенхимных стволовых клеток на модели

обморожения

Модель механической травмы на крысах Wistar

Экспериментальное исследование эффективности мезенхимных стволовых клетокэкс на

модели механической травмы

Подготовка образцов для гистологического анализа тканей

Подготовка лизатов тканей и оценка количества общего белка

Анализ лизатов тканей методом иммуноферментного анализа

Анализ лизатов тканей методом иммунноблоттинга

Подготовка и иммунногистохимическое окрашивание срезов тканей

Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика используемых мезенхимных стволовых клеток in vitro

Влияние среды с пониженной концентрацией кислорода на мезенхимные стволовые клетки

Оценка пролиферативной активности мезенхимных стволовых клеток

Оценка секреторной активности мезенхимных стволовых клеток методом

интерферометрии

Влияние криоконсервации на функциональную активность мезенхимных стволовых клеток

Влияние условий гипотермии на животных

Безопасность введения суспензии мезенхимных стволовых клеток

Экспериментальное исследование на модели химического ожога

Экспериментальное исследование на модели обморожения

Молекулярный профиль раны и васкуляризация тканей

Экспериментальное исследование на модели механической травмы

Рекомендации по применению и перспективы использования мезенхимных стволовых клеток

при заживлении ран

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние гипоксии на функциональную активность мезенхимных стволовых клеток при лечении ранений»

Актуальность исследования

Раны полной толщины из-за поражения всех слоев кожи и высокого риска инфицирования часто оказываются трудными для лечения: существует риск перехода таких ран из острой фазы в хроническую (Rousselle P. et al., 2019). Осложнения могут возникнуть и под воздействием на живые организмы экстремальных факторов внешней среды. В частности, развитие полярно-гипоксического синдрома, характеризующегося гипервентиляцией легких, низким коэффициентом использования кислорода и, как следствие, тканевой гипоксией, в совокупности с влиянием низких температур осложняет заживление травм, полученных в условиях Крайнего Севера (Trupkovic T. et al., 2008). Исследования последних 40 лет позволили достичь прогресса в увеличении эффективности обработки и покрытия ран, но уровень смертности и риски осложнений до сих пор остаются на высоком уровне, а необходимые для пациентов ресурсы создают огромную нагрузку на систему здравоохранения (Abdullahi A. et al., 2014; Oryan A. et al., 2017). Поэтому разработка новых эффективных способов лечения травм, сопровождающихся значительной потерей тканей и осложненных воздействием климатических факторов, остается актуальной.

Одним из ключевых повреждающих факторов при ранениях, полученных в экстремальных условиях, является ишемически-реперфузионное повреждение (ИРП) (Murphy J.V. et al., 2000; Gupta A. et al., 2021). Восстановление кровотока к ишемизированным тканям приводит к чрезмерному производству активных форм кислорода (АФК), с которыми не справляются антиоксидантные системы поврежденных митохондрий (Slegtenhorst B.R. et al., 2014). Накопление АФК и появление некротических клеток способствует развитию стерильного воспаления (Kalogeris T. et al., 2016).

Использование мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) для снижения тяжести ИРП является одной из потенциальных стратегий лечения различных травм. Многочисленные исследования подтвердили противовоспалительный и ранозаживляющий потенциал ММСК в лечении заболеваний сердца, костной ткани, нервной системы и т.д., на разных моделях in vitro и in vivo (Margiana R et al., 2022). Терапевтическая эффективность ММСК обусловлена способностью клеток мигрировать к поврежденному участку, дифференцироваться в клетки поврежденной ткани и секретировать хемокины, цитокины и факторы роста (Han Y. et al., 2019). На сегодняшний день ММСК применяются в клинической практике (Margiana R. et al., 2022), изучаются перспективы их использования в терапии ранений.

Основным механизмом терапевтического действия клеток является секреторная активность (Payushina O.V. et al., 2018). Для оценки секреции факторов роста и цитокинов

используют иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблоттинг или масс-спектрометрию. В некоторых случаях, секрецию оценивают по экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Ahmadi A.R. et al., 2019). Методы являются трудоемкими, длительными и затратными для оценки единичного количества проб. Для исследования секреторной активности может быть применен биофизический подход - методика интерферометрии слоя биомолекул (BLI), использование которой позволит быстро определять уровень секреции ключевых факторов роста в малом объеме образца.

Одним из серьезных ограничений эффективности терапии на основе ММСК является гибель более 90 % клеток при трансплантации (Bhang S.H. et al., 2011). Повысить способность к приживлению и стимулировать секрецию иммуномодулирующих и ангиогенных цитокинов и факторов роста можно путем культивирования ММСК в условиях физиологической гипоксии (2-8 об.% кислорода) (Samal J.R.K. et al., 2021). Гипоксическая клеточная культура обладает повышенным пролиферативным потенциалом и большей колониеобразующей активностью, а также длительно сохраняет фенотип по сравнению с клетками, выращенными в стандартных условиях (Buravkova L.B. et al., 2014; Madrigal M. et al., 2014; Liu Y. et al., 2017; Fan X.L. et al., 2020). Более благоприятными условиями является ведение постоянной гипоксической культуры, так как ниша ММСК in vivo характеризуется низкой концентрацией кислорода. Это помогает снизить окислительный стресс и уменьшить производство АФК в клетках.

Таким образом, клеточная терапия с использованием гипоксических ММСК может стать новым эффективным способом лечения травм, полученных в экстремальных для организма условиях.

Цель исследования:

оценка влияния физиологической гипоксии при культивировании мезенхимных стволовых клеток in vitro на их функциональную активность при лечении ран.

С этой целью были поставлены следующие задачи:

1. оценить влияние среды с пониженным содержанием кислорода на секрецию ростовых факторов мезенхимными стволовыми клетками методом интерферометрии слоя биомолекул;

2. изучить влияние трансплантируемых мезенхимных стволовых клеток, выращенных в условиях пониженного и нормального содержания кислорода в атмосфере, на динамику заживления химического ожога у мышей, полученного в условиях гипотермии и гипоксии;

3. изучить влияние трансплантируемых мезенхимных стволовых клеток, выращенных в условиях пониженного и нормального содержания кислорода в атмосфере, на динамику заживления обморожения и рвано-ушибленной раны у крыс, полученных в условиях гипотермии и гипоксии.

Научная новизна

Впервые предложено использовать метод интерферометрии слоя биомолекул для количественной оценки секреторной активности ММСК. Адаптация биофизического метода для количественного определения факторов роста в биологических жидкостях позволила измерить содержание VEGFA и bFGF в кондиционированной питательной среде ММСК.

Одна из первых экспериментальных работ на животных, в которой определена возможность создания гипоксии и гипотермии у крыс и мышей с целью изучения заживления ран. Разработана установка, которая обеспечивает проведение экспериментов на нескольких группах мелких лабораторных животных в условиях гипоксии при низких температурах.

Впервые проведены экспериментальные исследования по изучению влияния ММСК костного мозга, выращенных в условиях физиологической гипоксии (5 % кислорода в атмосфере), на динамику заживления химического ожога. Установлено полное заживление ран у всех мышей, леченых ММСК-гипоксия, что в 2,3 раза выше, чем при заживлении раны без лечения.

Данная работа является первым исследованием по изучению возможности применения инъекции ММСК костного мозга для лечения обморожений. Установлено стимулирование регенерации мышц и васкуляризации поврежденных тканей на ранних сроках раневого процесса.

Исследование является одним из первых по оценке возможности применения суспензии ММСК костного мозга для заживления рвано-ушибленных ран. Обнаружено ускорение регенеративных процессов в тканях. При этом основным эффектом использования ММСК является снижение интенсивности воспалительной реакции (отека) в травмированных тканях.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные в ходе выполнения научной работы экспериментальные данные вносят существенный вклад в понимание терапевтического эффекта ММСК при лечении ран. В частности, проведена оценка молекулярного профиля холодовой раны при введении ММСК в сравнении с естественным заживлением травмы. В ходе работы также была изучена возможность проведения эксперимента на животных в имитирующей экстремальные условия среде.

Проведенные исследования имеют преимущественно практическую значимость. На сегодняшний день ММСК широко используются в области регенеративной медицины за границей, на их основе зарегистрировано значительное количество биомедицинских клеточных продуктов. Полученные результаты расширяют спектр применения ММСК и подтверждают возможность их использования для лечения полнослойных кожных ран различной этиологии. Разработанная установка может быть использована в иных экспериментах, связанных с воздействием гипотермии и гипоксии на организм. Использование метода интерферометрии

слоя биомолекул имеет перспективы в рутинном контроле качества биомедицинских клеточных продуктов, заменяя длительные и трудоемкие биохимические методы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод интерферометрии слоя биомолекул является перспективным подходом количественного определения секреции ростовых факторов ММСК. Разработанная методика позволяет с минимальными затратами быстро и достоверно оценить концентрацию факторов роста в кондиционированной питательной среде. С помощью разработанного протокола по оценке секреторной активности методом интерферометрии слоя биомолекул подтверждено увеличение секреции VEGFA и bFGF при культивировании ММСК в условиях гипоксии.

2. Введение ММСК костного мозга способствует ускорению регенеративных процессов в тканях при химическом ожоге, в том числе, полученном в условиях гипоксии и гипотермии, а также значительно снижает случаи патологического заживления ран. Для введения на первой стадии заживления химического ожога наиболее эффективны ММСК костного мозга, культивируемые в условиях 5 %-ного содержания кислорода в атмосфере.

3. Введение ММСК костного мозга способствует ускорению регенеративных процессов и значительно снижает случаи патологического заживления ран в тканях при холодовой травме. ММСК также могут быть использованы для снижения воспаления при рвано-ушибленной ране, в том числе полученной в условиях гипоксии и гипотермии. Для введения на первой стадии заживления обморожений и рвано-ушибленных ран наиболее эффективны ММСК костного мозга, культивируемые в условиях 21 %-ного содержания кислорода в атмосфере.

Апробация результатов

Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на научных конференциях: 62-я Всероссийская научная конференция МФТИ (Москва, 2019), II Всероссийская научно-техническая конференция «Состояние и перспективы развития науки по направлению «Биотехнические системы и технологии» (Анапа, 2020), 24-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2020), 73-я Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Н. Новгород, 2020), VIII и IX международные научно-практические конференции молодых ученых в рамках площадки открытых коммуникаций OpenBio (Кольцово, 2021 и 2022), XVII Международная Пироговская научная медицинская конференция (Москва, 2022), V Национальный конгресс по Регенеративной медицине (Москва, 2022), XXIX Всероссийская

конференция молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы биомедицины - 2023» (Санкт-Петербург, 2023).

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ: 5 статей и 1 письмо редактору, в том числе 4 статьи в журналах баз данных Scopus, 1 патент на полезную модель и 1 патент на изобретение, 9 тезисов докладов.

Личный вклад автора в проведенное исследование и получение результатов

Выбор тематики осуществлен совместно с научным руководителем. Автором самостоятельно проведены поиск, систематизация, обобщение и анализ литературных данных по теме исследования; проведена наработка и характеристика клеточных линий ММСК животных, апробирована методика оценки факторов роста с помощью интерферометрии слоя биомолекул. Автор непосредственно принимал участие в исследовании эффективности инъекций ММСК на животных моделях в условиях гипоксии и гипотермии, проводимом сотрудниками НИЦ ТБП -ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, а также провел исследования по изучению молекулярного профиля холодовой травмы методами ИФА, иммуноблоттинга и иммуногистохимии. Автором совместно с соавторами подготовлены публикации по результатам проведенных исследований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки: функции и применение

Мультипотентные мезенхимные стволовые (стромальные) клетки являются самообновляющимися и доступными клеточными популяциями, которые можно культивировать in vitro. Помимо этого, ММСК обладают исключительной геномной стабильностью на ранних пассажах и их использование сопровождается незначительными этическими проблемами. Все это подчеркивает важность мезенхимных стволовых клеток в регенеративной медицине (Ayala-Cuellar A.P. et al., 2019). Международное общество клеточной и генной терапии установило основные показатели, которым должны соответствовать клетки, характеризующиеся как ММСК. Критерии включают в себя способность к адгезии к пластику, положительную и отрицательную панель антигенов на клеточной поверхности (фенотипический профиль) и потенциал к дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях (Fitzsimmons R.E.B. et al., 2018).

Для идентификации клеточной культуры как популяции мезенхимных стволовых клеток необходимо, чтобы они имели на своей клеточной мембране следующие антигены: CD105 - эндоглин, участвующий в организации цитоскелета, влияющего на морфологию и пролиферацию клетки и CD73 - нуклеотидаза, которая катализирует при нейтральном рН преобразование пуриновых 5'-мононуклеотидов до нуклеозидов. Также мезенхимные клетки могут иметь на своей клеточной поверхности: CD90 - антиген тимоцитов; CD44 - интегральный клеточный гликопротеин, необходимый для межклеточных взаимодействий, клеточной адгезии и миграции, является рецептором для гиалуроновой кислоты и некоторых других лигандов, таких как коллаген и металлопротеиназы матрикса; CD29 - бета-цепь интегрина, экспрессирующая прежде всего на лейкоцитах и Т-лимфоцитах и Sca-1 - антиген стволовых клеток (Soleimani M. et al., 2009; Zhu H. et al., 2010; Fitzsimmons R.E.B. et al., 2018; Han Y. et al., 2019).

Помимо этого, для подтверждения однородности популяции, необходимо, чтобы клетки не имели на своей поверхности следующие маркеры кроветворных клеток: CD45 -протеинфосфатаза, участвует в сигнальных путях и CD34 - молекула межклеточной адгезии (Fitzsimmons R.E.B. et al., 2018). Другие отрицательные маркеры клеточной мембраны могут варьироваться, их выбирают, в том числе, исходя из источника ММСК. Дополнительно, в качестве отрицательной панели антигенов для мезенхимных клеток могут быть рассмотрены: CD117 (c-kit) - рецептор фактора роста тучных клеток (SCFR); CD31 (PECAM-1) - гликопротеин, обеспечивающий межклеточную адгезию эндотелиальных клеток; CD14 - мембранный гликозилфосфатидилинозитол-связанный белок, экспрессированный на поверхности клеток

миелоидного ряда, особенно макрофагах; CD11b - трансмембранный гликопротеин, высоко экспрессированный на поверхности NK-клеток, нейтрофилов, моноцитов и макрофагов (Soleimani M. et al., 2009; Zhu H. et al., 2010; Fitzsimmons R.E.B. et al., 2018; Han Y. et al., 2019).

Стоит отметить, что фенотипический профиль ММСК может немного различаться в зависимости от вида, к которому принадлежит организм - донор клеток. Помимо этого, различия фенотипа могут быть обусловлены тем, что клетки были получены из разных источников. Например, ММСК из жировой ткани на первых пассажах имеют значительно большее количество CD34-положительных клеток. На более поздних пассажах значительных различий в иммунофенотипе между популяциями, полученными из красного костного мозга и жировой ткани, как правило, не наблюдается (Bernardo M.E. et al., 2015).

В целом, мезенхимные стволовые клетки могут быть выделены из широкого спектра источников: красный костный мозг, жировая ткань, печень, пуповина, множественные ткани зуба, кожа и другие ткани и органы (Majka M. et al., 2017; Berebichez-Fridman R. et al., 2017; Cagliani J. et al., 2017 Ayala-Cuellar A.P. et al., 2019 и др.).

Наиболее широко исследованным источником ММСК является костный мозг. Клетки костного мозга обладают высокой пролиферативной активностью. Многочисленные клинические испытания ММСК красного костного мозга подтвердили безопасность и эффективность данного типа клеток для лечения ряда заболеваний (дефекты коленного хряща, инфаркт миокарда, боковой амиотрофический склероз и др.). С другой стороны, получение клеток требует проведение болезненной процедуры, сопряженной с риском заражения инфекциями (Berebichez-Fridman R. et al., 2017; Cagliani J. et al., 2017; Ayala-Cuellar A.P. et al., 2019 и др.).

Другим перспективным источником является жировая ткань. Основным преимуществом считается возможность получения большого количества ММСК минимально инвазивными методами. Безопасность применения ММСК из жировой ткани была исследована в клинических испытаниях (Ra J.C. et al., 2011). Ключевой недостаток такого источника клеток связан с низким остеогенным и хондрогенным потенциалом получаемых ММСК (Berebichez-Fridman R. et al., 2017; Majka M. et al., 2017 и др.).

Культуры ММСК из костного мозга и жировой ткани на ранних пассажах похожи по таким основным характеристикам, как клоногенность и экспрессия ряда стромальных факторов. Выход и потенциал клеток, полученных как из костного мозга, так и из жировой ткани, зависит от характеристик донора, в частности, его возраста (Cheng H.Y. et al., 2014; Majka M. et al., 2017; Berebichez-Fridman R. et al., 2017). В первую очередь, различие между ММСК из костного мозга и жировой ткани заключается в направлениях дифференцировки клеток. В случае ММСК из костного мозга дифференцировка идет преимущественно в остеогенном и хондрогенном

направлении, а ММСК из жировой ткани легче дифференцируются в адипоциты. Предположительно, это связано с набором сигнатурных генов и влиянием тканеспецифичной микросреды (Hsiao S.T.F. et al., 2012). Кроме того, ММСК из разных источников различаются по профилю секреции цитокинов. Например, уровень секреции ключевых факторов роста, таких как VEGF и TGFpi, на ранних пассажах в ММСК из костного мозга значительно выше, чем в ММСК из жировой ткани (Dmitrieva R.I. et al., 2012). С другой стороны, иммуносупрессивная способность ММСК из жировой ткани выше, чем у ММСК из костного мозга (Cheng H.Y. et al., 2014; Majka M. et al., 2017; Berebichez-Fridman R. et al., 2017 и др.). Вариации профиля секреции в разных популяциях могут быть использованы при выборе метода лечения (использование тканеинженерных конструкций или клеточной терапии), специфичного для пациента. Также это указывает на преимущество использования ММСК перед бесклеточной терапией. Клеточная терапия обеспечивает регулируемое производство различных паракринных факторов, действующих синергетически, что обеспечивает высокую эффективность по сравнению с терапией одним фактором роста (Hsiao S.T.F. et al., 2012).

Потенциал ММСК для регенеративной медицины обусловлен тем, что клетки способны мигрировать к поврежденному участку, дифференцироваться в клетки поврежденной ткани и обладают иммунорегуляторными свойствами, благодаря секреции хемокинов, цитокинов и факторов роста (Han Y. et al., 2019). Несмотря на то, что способность ММСК к миграции была задокументирована, точный механизм этого процесса неизвестен и мезенхимные стволовые клетки лишены рецепторов «самонаведения», экспрессируемых на гемопоэтических стволовых клетках или лейкоцитах. Более того, культивирование ex vivo может снизить их способность к миграции, в результате чего, при системном введении большинство ММСК фильтруются и накапливаются в легких, печени и селезенке (Park J.S. et al., 2015). Вклад трансдифференцировки стволовых клеток в соматические клетки при репарации также остается спорным, так как частота дифференцировки in vivo имплантированных ММСК довольна низка (Peng Y. et al., 2015). Поэтому секреторная активность является основным механизмом терапевтического влияния мезенхимных стволовых клеток (Payushina O.V. et al., 2018).

Иммунологические основы и секреторная активность мезенхимных стволовых клеток

Секретом ММСК содержит широкий спектр цитокинов, факторов роста и хемокинов, которые в совокупности модулируют функции клеток и способствуют восстановлению тканей. Биологически активные молекулы способствуют пролиферации и дифференцировке других стволовых клеток или клеток-предшественников, ангиогенезу и иммуномодуляции, снижают развитие фиброза, обладают антиапоптотическим действием, (Li H. et al., 2019; Fu X. et al., 2019

и др.). Большинство секретируемых биомолекул действуют локально и могут быть классифицированы как паракринные или аутокринные факторы, которые вырабатываются клеткой для стимуляции другой клетки или самой себя соответственно (Graves D.T. et al., 1990). ММСК секретируют фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), факторы роста фибробластов (FGF-2, FGF-4, FGF-6, FGF-9, FGF-17), трансформирующие факторы роста (TGF-ß1, TGF-ß2), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста плаценты (PGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I), фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-а), выделенный из стромы фактор (SDF-1), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерлейкины (IL-6, IL-10), простагландин Е2 (PGE2), интерферон (ИФНу), гемоксигеназу-1 (HO-1), индоламин-2,3-диаоксигеназу (IDO) и индуцированную синтазу оксида азота (iNOS), а также множество хемокинов (CCR1, CCR2, CCR4, CCR7, CXCR5, CCR10) (Eom Y.W. et al., 2014; Kwon H.M. et al., 2014; Song N. et al., 2020; Wu X. et al., 2020).

Одним из ключевых факторов является фактор роста эндотелия сосудов, который участвует в процессе ангиогенеза и неоваскуляризации (El Sadik A.O. et al., 2015). В частности, при заживлении ран он способствует ранним событиям: миграции эндотелиальных клеток, фибробластов, тромбоцитов, нейтрофилов и макрофагов, пролиферации кератиноцитов (Barrientos S. et al., 2014). VEGF продуцируется множеством тканей в ответ на пониженное давление кислорода, так как транскрипция фактора частично опосредуется активацией фактора индуцируемого гипоксией (HIF) HIF-1 (Zisa D. et al., 2009; Madrigal M. et al., 2014). Основной ролью VEGF является поддержание выживания, пролиферации, миграции и дифференцировки эндотелиальных клеток. Описаны шесть белков семейства факторов роста эндотелия сосудов: VEGFA, -B, -C, -D, -E и PIGF (Kyurkchiev D. et al., 2014; Barrientos S. et al., 2014). VEGFA взаимодействует с рецепторами VEGF-R1 и VEGF-R2, экспрессирующимися на эндотелиальных и некоторых иммунных клетках. Помимо этого, VEGF отвечает за привлечение воспалительных клеток и экспрессию стимулирующих молекул на рекрутированных и резидентных мононуклеарных клетках, что приводит к активации провоспалительных цитокинов Т-хелперных клеток (Th1 и Th17). Известно, что VEGF также является ключевым медиатором в развитии прайминга Т-клеток и поляризации Th1 и Th17 в дыхательных путях (Kyurkchiev D. et al., 2014). Клиническое использование VEGF для лечения ишемических состояний не привело к требуемым результатам, отчасти из-за недостаточно контролируемой регуляции VEGF-индуцированного ангиогенеза. Напротив, экспрессия фактора роста в ММСК жестко регулируется на основании физиологической потребности и может представлять собой перспективное средство индукции терапевтического ангиогенеза (Madrigal M. et al., 2014).

Другим из наиболее заметных иммуномодулирующих цитокинов является трансформирующий фактор роста бета, который продуцируется и постоянно секретируется ММСК. Данный плейотропный цитокин регулирует тканевый морфогенез и множество фундаментальных клеточных функций (пролиферация, дифференцировка, миграция, адгезия и апоптоз), влияющих на многочисленные биологические процессы, такие как развитие, заживление ран, канцерогенез, ангиогенез и иммунные ответы (Kwon H.M. et al., 2014). Идентифицированы три изоформы - TGFß1, TGFß2, TGFß3, - которые зависят от типа клетки-мишени, ее состояния дифференцировки и роста. TGFß оказывает разное модулирующее влияние на функции иммунных клеток: ингибирование пролиферации и функции эффекторных Т-клеток, образование регуляторных Т-клеток из наивных Т-лимфоцитов, ослабление продукции цитокинов, подавление пролиферации В-клеток, дендритных клеток и макрофагов (Kyurkchiev D. et al., 2014). Помимо этого, TGFß считается важным фактором заживления ран, так как in vivo стимулирует образование грануляционной ткани и может стимулировать хемотаксис и побуждать моноциты продуцировать факторы роста, стимулирующие ангиогенез и пролиферацию стромальных клеток. Также TGFß оказывает иммунносупрессивное действие на лимфоциты. Другим действием при заживлении ран является прямое усиление путем стимулирования хемотаксиса фибробластов и продукции ими внеклеточного матрикса (ВКМ), что частично достигается за счет повышенной транскрипции генов, кодирующих белки ВКМ (Graves D.T. et al., 1990).

Фактор роста фибробластов является мощным митогеном, который может способствовать миграции клеток и стимулирует пролиферацию и производство внеклеточного матрикса во многих основных типах клеток, связанных с заживлением ран, таких как эндотелиальные клетки, хондроциты, миобласты и фибробласты (Graves D.T. et al., 1990; Barrientos S. et al., 2014). FGF можно выделить из нормальной ткани в двух формах, одна из которых является основной (bFGF), а другая - кислой (aFGF). bFGF обнаруживается в нескольких различных тканях, особенно в тканях мезодермального и нейроэктодермального происхождения, аFGF - в основном в головном мозге и костях (Graves D.T. et al., 1990). FGF-2 или bFGF регулирует синтез и отложение различных компонентов внеклеточного матрикса, увеличивает подвижность кератиноцитов во время реэпителизации, способствует миграции фибробластов и стимулирует продуцирование коллагеназы. При переходе раны в хроническую, уровень bFGF снижается (Barrientos S. et al., 2014).

Другим продуцируемым фактором роста является цитопротекторный и анаболический низкомолекулярный одноцепочечный полипептид - инсулиноподобный фактор роста, который способен активировать каскады фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) или митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), регулирующие гены, участвующие в выживании и росте клеток,

дифференцировке стволовых клеток (Ayatollahi M. et al., 2011; Granero-Molto F. et al., 2011). Идентифицированы две структуры: соматомедин С (IGF-I) и IGF-II, обладающий стимулирующей размножение активностью. IGF-I значительно увеличивает активность щелочной фосфатазы в остеобластических клетках, что предположительно связано с его ролью в стимуляции дифференцировки. Кроме того, транскрипты IGF-II были идентифицированы в выделенных из раны макрофагах, что свидетельствует о паракринной функции фактора в заживлении ран. IGF-II функционально подобен IGF-I, но считается более важным для роста плода (Graves D.T. et al., 1990).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Волкова Марина Викторовна, 2023 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абрашова Т. В. и др. Справочник. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных //СПБ.: ЛЕМА. - 2013.

2. Волкова М. В. и др. Адаптация метода интерферометрии слоя биомолекул для количественной оценки содержания фактора роста эндотелия сосудов в кондиционированной клеточной среде //Биофизика. - 2020. - Т. 65. - №. 6. - С. 1099-1106.

3. Волкова М.В. и др. Эффективность применения мезенхимальных стромальных клеток для лечения рвано-ушибленных ран в условиях гипотермии и гипоксии //Известия Российской Военно-медицинской академии. - 2022. - Т. 41. - №. 3. - С. 261-268.

4. Гришин О. В. Медленно развивающиеся реакции органов дыхания / О. В. Гришин, Н. В. Устюжанинова // Дыхание на Севере. Функция. Структура. Резервы. Патология. -Новосибирск, 2006. - С. 38-40.

5. Гришин О.В. Гипометаболизм у северян в условиях действия низких температур / О. В. Гришин, Н. В. Устюжанинова // Бюл.СО РАМН. - 2010. - №3. - С.12-17.

6. Гудков А.Б. Внешнее дыхание человека на Европейском Севере: монография. -Изд. 2-е, испр. и доп. / А.Б.Гудков, О.Н.Попова. - Архангельск: Изд-во СГМУ, 2012. - 252 с.

7. Домарацкая Е. И., Паюшина О. В. Перспективы использования мезенхимных стромальных клеток для регенерации поврежденной кожи //Успехи современной биологии. -

2017. - Т. 137. - №. 1. - С. 56-69.

8. Ермолин С.П. Физиологические реакции организма военнослужащих в условиях арктической зоны: дис. канд. мед. наук: 03.03.01. - Архангельск, 2015. - 139 с.

9. Журавель В.П. Российская армия, МЧС и росгвардия в Арктике: вопросы безопасности и международного сотрудничества // Научно-аналитический вестник Института Европы РАН. -

2018. - №5.

10. Здравоохранение в России. 2021: Стат.сб./Росстат. - М., 2021. - 171 с.

11. Зиновьев Е. В. и др. Опыт применения стволовых клеток при лечении ожогов кожи //Педиатр. - 2018. - Т. 9. - №. 4. - С. 12-27.

12. Зиновьев Е. В. и др. Экспериментальная оценка эффективности применения адипогенных мезенхимальных стволовых клеток для лечения ожогов кожи III степени //Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2017. - №. 1. - С. 137-141.

13. Котенко К. В. и др. Клеточные технологии в лечении радиационных ожогов: опыт ФМБЦ им. АИ Бурназяна //Гены и клетки. - 2012. - Т. 7. - №. 2. - С. 97-102.

14. Крайнюков П. Е. и др. Применение клеточных технологий в лечении ран различной этиологии //Вестник Национального медико-хирургического центра им. НИ Пирогова. -2021. - Т. 16. - №. 2. - С. 132-137.

15. Патент №201120 Российская Федерация МПК A61M 16/00, G09B 23/28. Установка для проведения экспериментальных исследований на животных в гипоксических условиях при низких температурах, опубл. 27.11.2020 / Бояринцев В.В. и др.; заявитель МФТИ.

16. Патент №2748539 Российская Федерация МПК А6№ 35/28; A61P 17/02. Способ лечения обморожений с использованием мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из красного костного мозга, опубл. 26.05.2021 / Бояринцев В.В. и др.; заявитель МФТИ.

17. Петров С В. Общая хирургия. - 4-е изд. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2020. - 832 с.

18. Расторгуева А. А. и др. Оценка терапевтического потенциала кондиционированной среды мезенхимальных стволовых клеток при химических ожогах у лабораторных животных //Гены и Клетки. - 2019. - Т. 14. - №. S. - С. 192-193.

19. Ратушный А. Ю., Рудимова Ю. В., Буравкова Л. Б. Изменение транскрипции генов, ассоциированных с реакцией на гипоксию, в мезенхимальных стромальных клетках при репликативном старении в условиях физиологического содержания кислорода //Биохимия. -2019. - Т. 84. - №. 3. - С. 380-391.

20. Шишкин Г.С. Функциональные состояния внешнего дыхания здорового человека / Г.С. Шишкин, Н.В. Устюжанинова; отв. ред. С.Г. Кривощеков; Рос.акад.мед.наук, Сиб.отд-ние, ФГБУ «Научно-исследовательский институт физиологии». - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2012. - 329 с.

21. Abbas O. L. et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, and dental pulp as sources of cell therapy for zone of stasis burns //Journal of Investigative Surgery. - 2019. - Т. 32. - №. 6. - С. 477-490.

22. Abbas O. L. et al. Prevention of burn wound progression by mesenchymal stem cell transplantation: deeper insights into underlying mechanisms //Annals of plastic surgery. - 2018. -Т. 81. - №. 6. - С. 715-724.

23. Abdel-Gawad D. R. I. et al. Therapeutic effect of mesenchymal stem cells on histopathological, immunohistochemical, and molecular analysis in second-grade burn model //Stem Cell Research & Therapy. - 2021. - Т. 12. - №. 1. - С. 1-16.

24. Abdullahi A., Amini-Nik S., Jeschke M. G. Animal models in burn research //Cellular and molecular life sciences. - 2014. - Т. 71. - №. 17. - С. 3241-3255.

25. Ahmadi A. R. et al. Stem cells in burn wound healing: A systematic review of the literature //Burns. - 2019. - Т. 45. - №. 5. - С. 1014-1023.

26. Alaribe F. N., Manoto S. L., Motaung S. C. K. M. Scaffolds from biomaterials: advantages and limitations in bone and tissue engineering //Biologia. - 2016. - T. 71. - №. 4. - C. 353-366.

27. Aryan A. et al. Human bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium promotes wound healing in deep second-degree burns in male rats //Cells Tissues Organs. - 2018. - T. 206. -№. 6. - C. 317-329.

28. Ayala-Cuellar A. P. et al. Roles of mesenchymal stem cells in tissue regeneration and immunomodulation //Biomolecules & therapeutics. - 2019. - T. 27. - №. 1. - C. 25.

29. Ayatollahi M. et al. Insulin-like growth factor 1 (IGF-I) improves hepatic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells //Cell biology international. - 2011. - T. 35. -№. 11. - C. 1169-1176.

30. Barrientos S. et al. Clinical application of growth factors and cytokines in wound healing //Wound Repair and Regeneration. - 2014. - T. 22. - №. 5. - C. 569-578.

31. Berebichez-Fridman R. et al. The holy grail of orthopedic surgery: mesenchymal stem cells—their current uses and potential applications //Stem Cells International. - 2017. - T. 2017.

32. Berebichez-Fridman R., Montero-Olvera P. R. Sources and clinical applications of mesenchymal stem cells: state-of-the-art review //Sultan Qaboos University Medical Journal. -2018. - T. 18. - №. 3. - C. e264.

33. Bernardo M. E., Fibbe W. E. Mesenchymal stromal cells and hematopoietic stem cell transplantation //Immunology letters. - 2015. - T. 168. - №. 2. - C. 215-221.

34. Bertolo A. et al. Oxidative status predicts quality in human mesenchymal stem cells //Stem Cell Research & Therapy. - 2017. - T. 8. - №. 1. - C. 1-13.

35. Bhang S. H. et al. Angiogenesis in ischemic tissue produced by spheroid grafting of human adipose-derived stromal cells //Biomaterials. - 2011. - T. 32. - №. 11. - C. 2734-2747.

36. Bhatti F. U. et al. Vitamin E protects rat mesenchymal stem cells against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in vitro and improves their therapeutic potential in surgically-induced rat model of osteoarthritis //Osteoarthritis and cartilage. - 2017. - T. 25. - №. 2. - C. 321-331.

37. Bian D. et al. The application of mesenchymal stromal cells (MSCs) and their derivative exosome in skin wound healing: a comprehensive review //Stem Cell Research & Therapy. - 2022. -T. 13. - №. 1. - C. 24.

38. Böttcher-Haberzeth S., Biedermann T., Reichmann E. Tissue engineering of skin //Burns. -2010. - T. 36. - №. 4. - C. 450-460.

39. Bouffi C. et al. IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis //PloS one. - 2010. - T. 5. - №. 12. - C. e14247.

40. Buravkova L. B. et al. Low ATP level is sufficient to maintain the uncommitted state of multipotent mesenchymal stem cells //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. -2013. - T. 1830. - №. 10. - C. 4418-4425.

41. Buravkova L. B. et al. Mesenchymal stem cells and hypoxia: where are we? //Mitochondrion. - 2014. - T. 19. - C. 105-112.

42. Cagliani J. et al. Immunomodulation by mesenchymal stromal cells and their clinical applications //Journal of stem cell and regenerative biology. - 2017. - T. 3. - №. 2.

43. Cesarz Z., Tamama K. Spheroid culture of mesenchymal stem cells //Stem cells international. - 2016. - T. 2016.

44. Chang Y. W. et al. Autologous and not allogeneic adipose-derived stem cells improve acute burn wound healing //PloS one. - 2018. - T. 13. - №. 5. - C. e0197744.

45. Chaudhari A. A. et al. Future prospects for scaffolding methods and biomaterials in skin tissue engineering: a review //International journal of molecular sciences. - 2016. - T. 17. - №. 12. -C. 1974.

46. Chen C. H. et al. Construction and characterization of fragmented mesenchymal-stem-cell sheets for intramuscular injection //Biomaterials. - 2007. - T. 28. - №. 31. - C. 4643-4651.

47. Chen F. et al. Oxidative stress in stem cell aging //Cell transplantation. - 2017. - T. 26. -№. 9. - C. 1483-1495.

48. Chen L. et al. Conditioned medium from hypoxic bone marrow-derived mesenchymal stem cells enhances wound healing in mice //PloS one. - 2014. - T. 9. - №. 4. - C. e96161.

49. Chen X. I., Armstrong M. A., Li G. Mesenchymal stem cells in immunoregulation //Immunology and cell biology. - 2006. - T. 84. - №. 5. - C. 413-421.

50. Cheng H. Y. et al. The impact of mesenchymal stem cell source on proliferation, differentiation, immunomodulation and therapeutic efficacy //J Stem Cell Res Ther. - 2014. - T. 4. -№. 10. - C. 1-8.

51. Cheng J. Z. et al. Therapeutic use of stem cells in treatment of burn injuries //Journal of Burn Care & Research. - 2018. - T. 39. - №. 2. - C. 175-182.

52. Chocarro-Wrona C. et al. Therapeutic strategies for skin regeneration based on biomedical substitutes //Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. - 2019. - T. 33. -№. 3. - C. 484-496.

53. Ciria M. et al. Mesenchymal stem cell migration and proliferation are mediated by hypoxia-inducible factor-1a upstream of notch and SUMO pathways //Stem Cells and Development. - 2017. -T. 26. - №. 13. - C. 973-985.

54. Cochran A., Morris S. E. Cold-induced injury: frostbite //Total burn care. - Elsevier, 2018. - C. 403-407. e2.

55. Dash B. C. et al. Stem cells and engineered scaffolds for regenerative wound healing //Bioengineering. - 2018. - T. 5. - №. 1. - C. 23.

56. Dengler V. L., Galbraith M. D., Espinosa J. M. Transcriptional regulation by hypoxia inducible factors //Critical reviews in biochemistry and molecular biology. - 2014. - T. 49. - №. 1. -C. 1-15.

57. Denu R. A., Hematti P. Effects of oxidative stress on mesenchymal stem cell biology //Oxidative medicine and cellular longevity. - 2016. - T. 2016.

58. Denu R. A., Hematti P. Optimization of oxidative stress for mesenchymal stromal/stem cell engraftment, function and longevity //Free Radical Biology and Medicine. - 2021. - T. 167. -C. 193-200.

59. Dmitrieva R. I. et al. Bone marrow-and subcutaneous adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: differences and similarities //Cell cycle. - 2012. - T. 11. - №. 2. - C. 377-383.

60. Dos Santos F. et al. Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells: a more effective cell proliferation kinetics and metabolism under hypoxia //Journal of cellular physiology. - 2010. -T. 223. - №. 1. - C. 27-35.

61. Ejtehadifar M. et al. The effect of hypoxia on mesenchymal stem cell biology //Advanced pharmaceutical bulletin. - 2015. - T. 5. - №. 2. - C. 141.

62. El Sadik A. O., El Ghamrawy T. A., Abd El-Galil T. I. The effect of mesenchymal stem cells and chitosan gel on full thickness skin wound healing in albino rats: histological, immunohistochemical and fluorescent study //PloS one. - 2015. - T. 10. - №. 9. - C. e0137544.

63. Eom Y. W. et al. The role of growth factors in maintenance of stemness in bone marrow-derived mesenchymal stem cells //Biochemical and biophysical research communications. - 2014. -T. 445. - №. 1. - C. 16-22.

64. Fan X. L. et al. Mechanisms underlying the protective effects of mesenchymal stem cell-based therapy //Cellular and molecular life sciences. - 2020. - T. 77. - №. 14. - C. 2771-2794.

65. Fernández-Colino A. et al. Fibrosis in tissue engineering and regenerative medicine: treat or trigger? //Advanced drug delivery reviews. - 2019. - T. 146. - C. 17-36.

66. Fitzsimmons R. E. B. et al. Mesenchymal stromal/stem cells in regenerative medicine and tissue engineering //Stem Cells International. - 2018. - T. 2018.

67. Flow cytometric analysis of cell cycle with propidium iodide DNA staining. URL: https://www.abcam.com/protocols/flow-cytometric-analysis-of-cell-cycle-with-propidium-iodide-dna-staining.

68. Fontaine M. J. et al. Unraveling the mesenchymal stromal cells' paracrine immunomodulatory effects //Transfusion medicine reviews. - 2016. - T. 30. - №. 1. - C. 37-43.

69. Formigli L. et al. MSCs seeded on bioengineered scaffolds improve skin wound healing in rats //Wound Repair and Regeneration. - 2015. - T. 23. - №. 1. - C. 115-123.

70. François S. et al. Synergistic effect of human bone morphogenic protein-2 and mesenchymal stromal cells on chronic wounds through hypoxia-inducible factor-1 a induction //Scientific Reports. - 2017. - T. 7. - №. 1. - C. 1-13.

71. Fu X. et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair //Cells. - 2019. - T. 8. -№. 8. - C. 784.

72. Gala D. N., Fabian Z. To breathe or not to breathe: The role of oxygen in bone marrow-derived mesenchymal stromal cell senescence //Stem cells international. - 2021. - T. 2021.

73. Galipeau J., Sensébé L. Mesenchymal stromal cells: clinical challenges and therapeutic opportunities //Cell stem cell. - 2018. - T. 22. - №. 6. - C. 824-833.

74. Gardner J. K., Pieterse Z., Kaur P. Mesenchymal Cells that Support Human Skin Regeneration //Regenerative Medicine and Plastic Surgery. - Springer, Cham, 2019. - C. 91-107.

75. Ge Q. et al. VEGF secreted by mesenchymal stem cells mediates the differentiation of endothelial progenitor cells into endothelial cells via paracrine mechanisms //Molecular medicine reports. - 2018. - T. 17. - №. 1. - C. 1667-1675.

76. Ghieh F. et al. The use of stem cells in burn wound healing: a review //BioMed research international. - 2015. - T. 2015.

77. Gnecchi M. et al. Paracrine mechanisms of mesenchymal stem cells in tissue repair //Mesenchymal Stem Cells. - Humana Press, New York, NY, 2016. - C. 123-146.

78. Goertz O. et al. Intravital pathophysiologic comparison of frostbite and burn injury in a murine model //Journal of Surgical Research. - 2011. - T. 167. - №. 2. - C. e395-e401.

79. Goey C. H., Bell D., Kontoravdi C. Mild hypothermic culture conditions affect residual host cell protein composition post-Protein A chromatography //MAbs. - Taylor & Francis, 2018. - T. 10. -№. 3. - C. 476-487.

80. Granero-Molto F. et al. Mesenchymal stem cells expressing insulin-like growth factor-I (MSCIGF) promote fracture healing and restore new bone formation in Irs1 knockout mice: analyses of MSCIGF autocrine and paracrine regenerative effects //Stem Cells. - 2011. - T. 29. - №. 10. -C. 1537-1548.

81. Granger D. N., Kvietys P. R. Reperfusion injury and reactive oxygen species: The evolution of a concept //Redox biology. - 2015. - T. 6. - C. 524-551.

82. Graves D. T., Cochran D. L. Mesenchymal cell growth factors //Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. - 1990. - T. 1. - №. 1. - C. 17-36.

83. Groeber F. et al. Skin tissue engineering—in vivo and in vitro applications //Advanced drug delivery reviews. - 2011. - T. 63. - №. 4-5. - C. 352-366.

84. Guo L. et al. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids //Journal of Cellular and Molecular Medicine. - 2014. - T. 18. - №. 10. - C. 2009-2019.

85. Gupta A., Soni R., Ganguli M. Frostbite-manifestation and mitigation //Burns Open. - 2021.

86. Han H. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells rescue injured H9c2 cells via transferring intact mitochondria through tunneling nanotubes in an in vitro simulated ischemia/reperfusion model //Molecular Medicine Reports. - 2016. - T. 13. - №. 2. - C. 1517-1524.

87. Han Y. et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine //Cells. - 2019. - T. 8. -№. 8. - C. 886.

88. Handford C., Thomas O., Imray C. H. E. Frostbite //Emergency Medicine Clinics. - 2017. -T. 35. - №. 2. - C. 281-299.

89. Hertl M. Introduction to the Skin and Dermatology //Braun-Falco' s Dermatology. -2020. - C. 1-20.

90. Hober S., Nord K., Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification //Journal of Chromatography B. - 2007. - T. 848. - №. 1. - C. 40-47.

91. Hsiao S. T. F. et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue //Stem cells and development. - 2012. - T. 21. - №. 12. - C. 2189-2203.

92. Hu C. et al. Regulation of the mitochondrial reactive oxygen species: Strategies to control mesenchymal stem cell fates ex vivo and in vivo //Journal of cellular and molecular medicine. -2018. - T. 22. - №. 11. - C. 5196-5207.

93. Huang Y. Z. et al. Mesenchymal stem cells for chronic wound healing: current status of preclinical and clinical studies //Tissue Engineering Part B: Reviews. - 2020. - T. 26. - №. 6. -C. 555-570.

94. Imbarak N. et al. Effect of mesenchymal stem cells versus aloe vera on healing of deep second-degree burn //Stem Cell Investigation. - 2021. - T. 8.

95. Jeschke M. G. Burn care and treatment: a practical guide. - New York: Springer, 2013.

96. Jeschke M. G. et al. Burn injury //Nature Reviews Disease Primers. - 2020. - T. 6. -№. 1. - C. 1-25.

97. Jo H. et al. Applications of mesenchymal stem cells in skin regeneration and rejuvenation //International journal of molecular sciences. - 2021. - T. 22. - №. 5. - C. 2410.

98. Joshi K. et al. Frostbite: Current status and advancements in therapeutics //Journal of Thermal Biology. - 2020. - C. 102716.

99. Kaddoura I. et al. Burn injury: review of pathophysiology and therapeutic modalities in major burns //Annals of burns and Fire Disasters. - 2017. - T. 30. - №. 2. - C. 95.

100. Kalogeris T. et al. Cell biology of ischemia/reperfusion injury //International review of cell and molecular biology. - 2012. - T. 298. - C. 229-317.

101. Kalogeris T. et al. Ischemia/reperfusion //Comprehensive Physiology. - 2016. - T. 7. -№. 1. - C. 113.

102. Kamel R. A. et al. Tissue engineering of skin //Journal of the American College of Surgeons. - 2013. - T. 217. - №. 3. - C. 533-555.

103. Kato Y. et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity //Diabetes. - 2015. - T. 64. - №. 8. - C. 2723-2734.

104. Kemp K. C., Hows J., Donaldson C. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells //Leukemia & lymphoma. - 2005. - T. 46. - №. 11. - C. 1531-1544.

105. Kierans S. J., Taylor C. T. Regulation of glycolysis by the hypoxia-inducible factor (HIF): implications for cellular physiology //The Journal of physiology. - 2021. - T. 599. - №. 1. - C. 23-37.

106. Kim H. J., Park J. S. Usage of human mesenchymal stem cells in cell-based therapy: advantages and disadvantages //Development & reproduction. - 2017. - T. 21. - №. 1. - C. 1.

107. Kumar P. et al. The mesenchymal stem cell secretome: a new paradigm towards cell-free therapeutic mode in regenerative medicine //Cytokine & Growth Factor Reviews. - 2019. - T. 46. -C. 1-9.

108. Kumar S. et al. Therapeutics effect of mesenchymal stromal cells in reactive oxygen species-induced damages //Human Cell. - 2021. - C. 1-14.

109. Kwon H. M. et al. Multiple paracrine factors secreted by mesenchymal stem cells contribute to angiogenesis //Vascular pharmacology. - 2014. - T. 63. - №. 1. - C. 19-28.

110. Kyurkchiev D. et al. Secretion of immunoregulatory cytokines by mesenchymal stem cells //World journal of stem cells. - 2014. - T. 6. - №. 5. - C. 552.

111. L Maranda E., Rodriguez-Menocal L., V Badiavas E. Role of mesenchymal stem cells in dermal repair in burns and diabetic wounds //Current stem cell research & therapy. - 2017. - T. 12. -№. 1. - C. 61 -70.

112. Lacey A. M. et al. An Institutional Protocol for the Treatment of Severe Frostbite Injury— A 6-Year Retrospective Analysis //Journal of Burn Care & Research. - 2021.

113. Lampe J. W., Becker L. B. State of the art in therapeutic hypothermia //Annual review of medicine. - 2011. - T. 62. - C. 79-93.

114. Law S., Chaudhuri S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges //American journal of stem cells. - 2013. - T. 2. - №. 1. -C. 22.

115. Lee J. et al. Pharmacological regulation of oxidative stress in stem cells //Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2018. - T. 2018.

116. Lee P., Chandel N. S., Simon M. C. Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond //Nature reviews Molecular cell biology. - 2020. - T. 21. - №. 5. -C. 268-283.

117. Lee R. H. et al. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair //Journal of cellular biochemistry. - 2011. - T. 112. - №. 11. - C. 3073-3078.

118. Leuning D. G. et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment //Scientific reports. - 2018. - T. 8. - №. 1. -C. 1 -9.

119. Li H. et al. Immunomodulatory functions of mesenchymal stem cells in tissue engineering //Stem cells international. - 2019. - T. 2019.

120. Li Z., Maitz P. Cell therapy for severe burn wound healing //Burns & trauma. - 2018. -

T. 6.

121. Liang L. et al. Safety and feasibility of subconjunctival injection of mesenchymal stem cells for acute severe ocular burns: A single-arm study //The Ocular Surface. - 2021. - T. 22. -C. 103-109.

122. Lin W. et al. Endowing ipsc-derived mscs with angiogenic and keratinogenic differentiation potential: A promising cell source for skin tissue engineering //BioMed research international. - 2018. - T. 2018.

123. Liu L. et al. Hypoxia preconditioned human adipose derived mesenchymal stem cells enhance angiogenic potential via secretion of increased VEGF and bFGF //Cell biology international. - 2013. - T. 37. - №. 6. - C. 551-560.

124. Liu Y. et al. Permanently hypoxic cell culture yields rat bone marrow mesenchymal cells with higher therapeutic potential in the treatment of chronic myocardial infarction //Cellular Physiology and Biochemistry. - 2017. - T. 44. - №. 3. - C. 1064-1077.

125. Loder S. et al. Wound healing after thermal injury is improved by fat and adipose-derived stem cell isografts //Journal of Burn Care & Research. - 2015. - T. 36. - №. 1. - C. 70-76.

126. Ma T. et al. Hypoxia and stem cell-based engineering of mesenchymal tissues //Biotechnology progress. - 2009. - T. 25. - №. 1. - C. 32-42.

127. Maacha S. et al. Paracrine mechanisms of mesenchymal stromal cells in angiogenesis //Stem cells international. - 2020. - T. 2020.

128. Madrigal M., Rao K. S., Riordan N. H. A review of therapeutic effects of mesenchymal stem cell secretions and induction of secretory modification by different culture methods //Journal of translational medicine. - 2014. - T. 12. - №. 1. - C. 1 -14.

129. Magne B., Lataillade J. J., Trouillas M. Mesenchymal stromal cell preconditioning: the next step toward a customized treatment for severe burn //Stem Cells and Development. - 2018. -T. 27. - №. 20. - C. 1385-1405.

130. Majka M. et al. Concise review: mesenchymal stem cells in cardiovascular regeneration: emerging research directions and clinical applications //Stem cells translational medicine. - 2017. -T. 6. - №. 10. - C. 1859-1867.

131. Margiana R. et al. Clinical application of mesenchymal stem cell in regenerative medicine: a narrative review //Stem Cell Research & Therapy. - 2022. - T. 13. - №. 1. - C. 1-22.

132. McDonald A. et al. Environmental Injuries: Hyperthermia and Hypothermia //MacEwan University Student eJournal. - 2020. - T. 4. - №. 1.

133. McIntosh S. E. et al. Wilderness medical society clinical practice guidelines for the prevention and treatment of frostbite: 2019 update //Wilderness & Environmental Medicine. - 2019. -T. 30. - №. 4. - C. S19-S32.

134. Moffatt S. E. Hypothermia in trauma //Emergency Medicine Journal. - 2013. - T. 30. -№. 12. - C. 989-996.

135. Moussa M. H. et al. Comparative study on bone marrow-versus adipose-derived stem cells on regeneration and re-innervation of skeletal muscle injury in wistar rats //Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2020. - T. 17. - №. 6. - C. 887-900.

136. Müller-Esparza H. et al. Bio-layer interferometry analysis of the target binding activity of CRISPR-Cas effector complexes //Frontiers in molecular biosciences. - 2020. - T. 7. - C. 98.

137. Murphy J. V. et al. Frostbite: pathogenesis and treatment //Journal of Trauma and Acute Care Surgery. - 2000. - T. 48. - №. 1. - C. 171.

138.Nammian P. et al. Comparative analysis of mouse bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells for critical limb ischemia cell therapy //Stem Cell Research & Therapy. -2021. - T. 12. - №. 1. - C. 1-15.

139. Nguyen T. Q., Song D. H. Pathophysiologic difference between frostbite and burn injury and implications for therapy //Journal of Surgical Research. - 2012. - T. 174. - №. 2. - C. 247-249.

140. Niezgoda A. et al. Properties of skin stem cells and their potential clinical applications in modern dermatology //European Journal of Dermatology. - 2017. - T. 27. - №. 3. - C. 227-236.

141. Nix D. Frostbite //Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. - 2008. - T. 35. -№. 3. - C. 347-349.

142. Ojeh N. et al. Stem cells in skin regeneration, wound healing, and their clinical applications //International journal of molecular sciences. - 2015. - T. 16. - №. 10. - C. 25476-25501.

143. Öksüz S. et al. The effect of subcutaneous mesenchymal stem cell injection on statis zone and apoptosis in an experimental burn model //Plastic and reconstructive surgery. - 2013. - T. 131. -№. 3. - C. 463-471.

144. Oryan A., Jalili M., Kamali A. Tissue engineering in burn wound healing: current modalities and future directions //Int. Clin. Pathol. J. - 2017. - T. 4. - C. 31-34.

145. Ovechkina E., Ovechkin F. Human Pathophysiology in the Conditions of North Russia //Bulletin of Science and Practice. - 2021.

146.Ozturk S., Karagoz H. Experimental stem cell therapies on burn wound: do source, dose, timing and method matter? //Burns. - 2015. - T. 41. - №. 6. - C. 1133-1139.

147. P De Miguel M. et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells: advances and applications //Current molecular medicine. - 2012. - T. 12. - №. 5. - C. 574-591.

148. Palao R. et al. Chemical burns: pathophysiology and treatment //Burns. - 2010. - T. 36. -№. 3. - C. 295-304.

149. Panahi M. et al. Cytoprotective effects of antioxidant supplementation on mesenchymal stem cell therapy //Journal of cellular physiology. - 2020. - T. 235. - №. 10. - C. 6462-6495.

150. Park J. S. et al. Engineering mesenchymal stem cells for regenerative medicine and drug delivery //Methods. - 2015. - T. 84. - C. 3-16.

151. Payushina O. V. et al. Effect of mesenchymal stromal cells and conditioned media on healing of skin wound //Bulletin of experimental biology and medicine. - 2018. - T. 165. - №. 4. -C. 572-575.

152. Peng Y. et al. Freeze-dried rat bone marrow mesenchymal stem cell paracrine factors: a simplified novel material for skin wound therapy //Tissue Engineering Part A. - 2015. - T. 21. -№. 5-6. - C. 1036-1046.

153. Peterson K. M. et al. Improved survival of mesenchymal stromal cell after hypoxia preconditioning: role of oxidative stress //Life sciences. - 2011. - T. 88. - №. 1-2. - C. 65-73.

154. Planat-Benard V., Varin A., Casteilla L. MSCs and inflammatory cells crosstalk in regenerative medicine: Concerted actions for optimized resolution driven by energy metabolism //Frontiers in Immunology. - 2021. - T. 12. - C. 626755.

155. Ra J. C. et al. Safety of intravenous infusion of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in animals and humans //Stem cells and development. - 2011. - T. 20. - №. 8. -C. 1297-1308.

156. Rahimzadeh A. et al. Biotechnological and biomedical applications of mesenchymal stem cells as a therapeutic system //Artificial cells, nanomedicine, and biotechnology. - 2016. - T. 44. -№. 2. - C. 559-570.

157. Rangatchew F. et al. Mesenchymal stem cell therapy of acute thermal burns: A systematic review of the effect on inflammation and wound healing //Burns. - 2020.

158. Rodriguez A. M. et al. Intercellular mitochondria trafficking highlighting the dual role of mesenchymal stem cells as both sensors and rescuers of tissue injury //Cell cycle. - 2018. - T. 17. -№. 6. - C. 712-721.

159. Rousselle P., Braye F., Dayan G. Re-epithelialization of adult skin wounds: cellular mechanisms and therapeutic strategies //Advanced Drug Delivery Reviews. - 2019. - T. 146. -C. 344-365.

160. Rowan M. P. et al. Burn wound healing and treatment: review and advancements //Critical care. - 2015. - T. 19. - №. 1. - C. 1-12.

161. Rowart P. et al. Mesenchymal stromal cell therapy in ischemia/reperfusion injury //Journal of immunology research. - 2015. - T. 2015.

162. Samal J. R. K. et al. Discrepancies on the Role of Oxygen Gradient and Culture Condition on Mesenchymal Stem Cell Fate //Advanced Healthcare Materials. - 2021. - T. 10. - №. 6. -C.2002058.

163. Shumakov V. I. et al. Mesenchymal bone marrow stem cells more effectively stimulate regeneration of deep burn wounds than embryonic fibroblasts //Bulletin of experimental biology and medicine. - 2003. - T. 136. - №. 2. - C. 192-195.

164. Slegtenhorst B. R. et al. Ischemia/reperfusion injury and its consequences on immunity and inflammation //Current transplantation reports. - 2014. - T. 1. - №. 3. - C. 147-154.

165. Soleimani M., Nadri S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow //Nature protocols. - 2009. - T. 4. - №. 1. - C. 102.

166. Song N., Scholtemeijer M., Shah K. Mesenchymal Stem Cell Immunomodulation: Mechanisms and Therapeutic Potential //Trends in Pharmacological Sciences. - 2020.

167. Tamama K., Kerpedjieva S. S. Acceleration of wound healing by multiple growth factors and cytokines secreted from multipotential stromal cells/mesenchymal stem cells //Advances in Wound Care. - 2012. - T. 1. - №. 4. - C. 177-182.

168. Togel F. et al. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms //American Journal of Physiology-Renal Physiology. - 2005. - T. 289. - №. 1. - C. F31-F42.

169. Trupkovic T., Giessler G. Das Verbrennungstrauma-Teil 1 //Der Anaesthesist. - 2008. -T. 57. - №. 9. - C. 898-907.

170. Tsiapalis D., O'Driscoll L. Mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles for tissue engineering and regenerative medicine applications //Cells. - 2020. - T. 9. - №. 4. - C. 991.

171. Turk E. E. Hypothermia //Forensic science, medicine, and pathology. - 2010. - T. 6. -№. 2. - C. 106-115.

172. Tutak F. N., Dogan F., Anna9 E. The effect of mesenchymal stem cell lyophilizate on the recovery of the zone of stasis following thermal burns //Burns. - 2021.

173. Valvis S. M. et al. The immune response to skin trauma is dependent on the etiology of injury in a mouse model of burn and excision //Journal of Investigative Dermatology. - 2015. -T. 135. - №. 8. - C. 2119-2128.

174. Van Linthout S. et al. Mesenchymal stem cells and inflammatory cardiomyopathy: cardiac homing and beyond //Cardiology research and practice. - 2011. - T. 2011.

175. Vilalta M. et al. Biodistribution, long-term survival, and safety of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells transplanted in nude mice by high sensitivity non-invasive bioluminescence imaging //Stem cells and development. - 2008. - T. 17. - №. 5. - C. 993-1004.

176. Vizoso F. J. et al. Mesenchymal stem cell secretome: toward cell-free therapeutic strategies in regenerative medicine //International journal of molecular sciences. - 2017. - T. 18. - №. 9. -C. 1852.

177. Wang M. et al. Mesenchymal stem cell-based therapy for burn wound healing //Burns & Trauma. - 2021. - T. 9.

178. Wang M. et al. STAT3 mediates bone marrow mesenchymal stem cell VEGF production //Journal of molecular and cellular cardiology. - 2007. - T. 42. - №. 6. - C. 1009-1015.

179. Wang Y. et al. Development of anti-Müllerian hormone immunoassay based on biolayer interferometry technology //Analytical and bioanalytical chemistry. - 2019. - T. 411. - №. 21. -C. 5499-5507.

180. Wang Y. et al. Safety of mesenchymal stem cells for clinical application //Stem cells international. - 2012. - T. 2012.

181. Weeramange C. J. et al. The strengths and limitations of using biolayer interferometry to monitor equilibrium titrations of biomolecules //Protein Science. - 2020. - T. 29. - №. 4. -C. 1004-1020.

182. Weidemann A., Johnson R. S. Biology of HIF-1 a //Cell Death & Differentiation. -2008. - T. 15. - №. 4. - C. 621-627.

183. Wu X. et al. Mesenchymal stromal cell therapies: immunomodulatory properties and clinical progress //Stem Cell Research & Therapy. - 2020. - T. 11. - №. 1. - C. 1-16.

184. Wu Y. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cell attenuates skin fibrosis development in mice //International wound journal. - 2014. - T. 11. - №. 6. - C. 701-710.

185. Xue L. et al. Effects of human bone marrow mesenchymal stem cells on burn injury healing in a mouse model //International journal of clinical and experimental pathology. - 2013. - T. 6. -№. 7. - C. 1327.

186. Yan W., Diao S., Fan Z. The role and mechanism of mitochondrial functions and energy metabolism in the function regulation of the mesenchymal stem cells //Stem Cell Research & Therapy. - 2021. - T. 12. - №. 1. - C. 1-17.

187. Yang J. A. et al. Potential application of adipose-derived stem cells and their secretory factors to skin: discussion from both clinical and industrial viewpoints //Expert opinion on biological therapy. - 2010. - T. 10. - №. 4. - C. 495-503.

188. Yang S. H. et al. Soluble mediators from mesenchymal stem cells suppress T cell proliferation by inducing IL-10 //Experimental & molecular medicine. - 2009. - T. 41. - №. 5. -C. 315-324.

189. Yao L. et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by acute alkali burn //PLoS one. - 2012. - T. 7. - №. 2. - C. e30842.

190. Yi H. et al. Efficacy assessment of mesenchymal stem cell transplantation for burn wounds in animals: a systematic review //Stem cell research & therapy. - 2020. - T. 11. - №. 1. - C. 1-13.

191. Yorukoglu A. C. et al. A concise review on the use of mesenchymal stem cells in cell sheet-based tissue engineering with special emphasis on bone tissue regeneration //Stem cells international. - 2017. - T. 2017.

192. Zhu H. et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone //Nature protocols. - 2010. - T. 5. - №. 3. - C. 550.

193. Zimmermann J. A., Mcdevitt T. C. Pre-conditioning mesenchymal stromal cell spheroids for immunomodulatory paracrine factor secretion //Cytotherapy. - 2014. - T. 16. - №. 3. - C. 331-345.

194. Zisa D. et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) as a key therapeutic trophic factor in bone marrow mesenchymal stem cell-mediated cardiac repair //Biochemical and biophysical research communications. - 2009. - T. 390. - №. 3. - C. 834-838.