Влияние дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тка-ней и неоваскулогенез (экспериментальное исследование) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат медицинских наук Колесник, Инга Михайловна

• Колесник, Инга Михайловна
• кандидат медицинских наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Колесник, Инга Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы ишемического повреждения

1.2. Ишемическое прекондиционирование

1.2.1. Механизмы цитопротекции

1.2.2. Ангиогенез - основной механизм восстановления 23 ишемизированных тканей

1.3. Дистантное ишемическое прекондиционирование

1.4. Фармакологическое прекондиционирование. Наиболее 28 изученные препараты

1.5. Эритропоэтин. Негемопоэтические свойства гормона

1.6. Средства, препятствующие развитию процесса 36 прекондиционирования

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Протокол эксперимента по изучению влияния дистантного 41 ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тканей

2.2. Протокол эксперимента по изучению влияния дистантного 46 ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на неоваскулогенез

2.3. Протокол эксперимента по определению роли АТФ зависимых 54 калиевых каналов в механизме цитопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина

2.4. Протокол эксперимента по определению роли эндотелиальной 54 N0 синтазы в механизмах цитопротекторного и неоваскулогенного эффектов рекомбинантного эритропоэтина

2.5. Исследуемые методы

2.5.1. Метод дистантного ишемического 5 5 прекондиционирования

2.5.2. Метод фармакологического прекондиционирования 57 рекомбинантным эритропоэтином

2.6. Статистическая обработка результатов исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение влияния дистантного ишемического 59 прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке

3.2. Комплексная оценка влияния дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крысы с использованием результатов лазерной допплеровской флоуметрии и морфологического исследования

3.3. Определение роли АТФ зависимых калиевых каналов в механизме цитопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина

3.4. Исследование роли эндотелиальной N0 синтазы в механизме 81 цитопротекторного и неоваскулогенного эффектов рекомбинантного эритропоэтина

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тка-ней и неоваскулогенез (экспериментальное исследование)»

Актуальность исследования

Профилактика и коррекция последствий локальной ишемии, развивающейся при различных хирургических вмешательствах, является актуальной проблемой современной медицины. В связи с этим, высок интерес к изучению ишемического прекондиционирования, суть которого состоит в том, что короткие подпороговые периоды ишемии активируют эндогенные защитные механизмы, снижающие степень повреждения клеток в результате последующего продленного ишемического эпизода. Феномен был открыт и описан С.Е. Murry и соавт. в 1986 г., которые впервые продемонстрировали, что четыре коротких эпизода коронароокклюзии, перемежающиеся пятиминутными периодами реперфузии перед сорокаминутной коронароокклюзией, уменьшали размер инфаркта миокарда почти в 2 раза [173].

Исследования последних лет показали, что одного эпизода преходящей ишемии достаточно, чтобы вызвать прекондиционирование [107, 132, 198, 199]. Защитные свойства проявляются уже через 5 минут реперфузии. Тогда , наступает первая защитная фаза. Продолжительность её — 1-2 часа. Затем эффект исчезает и возобновляется в промежуток времени от 24 до 96 часов. Это вторая защитная фаза [9, 96, 108].

В 1993 году было открыто дистантное ишемическое прекондиционирование, суть которого состоит в том, что кратковременные эпизоды ишемии одного органа (почки, брыжейки, нижней конечности) повышают устойчивость других органов к тяжелым ишемическим повреждениям [86, 194]. Открытие подтвердило предположение о том, что эффект прекондиционирования реализуется не локально, а представляет систему многоуровневого иерархического дублирования, включающую нейрогенный компонент, гуморальный и внутриклеточный [102, 138, 197].

Последнее привело к необходимости поиска гуморального агента, выделяющегося в ответ на ишемию и способного' при экзогенном введении инициировать процесс без ишемии. С клинической точки зрения прекондиционирование фармакологическими средствами выглядит предпочтительнее, так как технологически проще и лишено потенциальной опасности ишемических эпизодов для патологически измененных тканей [206]. Еще больший интерес для клинического применения представляет возможность дозировать введение фармакологических средств, что делает управляемым временной интервал периода толерантности к ишемии.

Наиболее перспективным для изучения с нашей точки зрения является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон, главным фактором, регулирующим его продукцию, является гипоксия, [114, 127, 128]. Период полувыведения эритропоэтина значительно выше, чем у других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, временной интервал периода толерантности к ишемии, инициируемый им, должен быть существенно шире. Кроме того, открытие рецепторов эритропоэтина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибробластах мышечной ткани и нейронах позволило изучать неэритропоэтические функции гормона [25, 123, 125, 126].

Наиболее изучены эффекты прекондиционирования на сердце и головной мозг. Однако предполагаемый механизм реализации феномена указывает на возможность его универсального использования в хирургии для защиты органов и тканей в условиях нарушения кровообращения и, возможно, стимуляции неоваскулогенеза.

Цель исследования:

Установить влияние дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной скелетной мышце крыс.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние дистантного ишемического прекондиционирования на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс;

2. Изучить влияние рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс;

3. Оценить сочетанное влияние дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс;

4. Определить роль АТФ зависимых калиевых каналов в механизме реализации цитопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина; ,

5. Определить роль эндотелиальной N0 синтазы в механизме реализации цитопротекторного и неоваскулогенного эффектов рекомбинантного эритропоэтина.

Научная новизна исследования

В работе впервые предложены эффективные способы улучшения выживаемости ишемизированных тканей и стимуляции неоваскулогенеза в ишемизированной скелетной мышце с помощью дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе.

Впервые показано, что влияние рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тканей и неоваскулогенез аналогично влиянию дистантного ишемического прекондиционирования.

АТФ зависимые калиевые каналы являются эффекторным звеном в механизме реализации цитопротекторного действия дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина.

Эндотелиальная N0 синтаза задействована в механизме реализации цитопротекторного эффекта рекомбинантного эритропоэтина, блокада ее не влияет на возможность стимуляции им неоваскулогенеза.

Научная новизна подтверждается получением патента на полезную модель РФ № 97615 от 20.09.2010 г. «Устройство для дистантного прекондиционирования»; положительного решения о выдаче патента РФ на изобретение по заявке №2009140096/14(056915) «Способ коррекции эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином при Ь-ЫАМЕ индуцированном дефиците оксида азота» от 03.08.2010 г.

Практическая значимость

В работе экспериментально обоснована эффективность применения дистантного ишемического прекондиционирования для профилактики и коррекции ишемических повреждений тканей, развивающихся при различных хирургических вмешательствах, а также возможность инициации процесса прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания дистантного прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе для профилактики и коррекции ишемических повреждений тканей.

Экспериментально обоснованная возможность применения рекомбинантного эритропоэтина для фармакологического прекондиционирования позволяет проводить экспериментальное изучение временного параметра инициируемого им периода толерантности к ишемии и возможностей управления им.

Внедрение результатов научного исследования

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе ряда кафедр Курского государственного медицинского университета, Российского государственного медицинского университета им. Н.И. Пирогова, Белгородского государственного университета, Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» (Курск 2009), 75 юбилейной итоговой Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2010), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010).

Апробация диссертации проведена на расширенном научно-практическом заседании кафедр фармакологии; хирургических болезней ФПО; хирургических болезней №1; хирургических болезней №2; общей хирургии; оперативной хирургии и топографической анатомии; онкологии; травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; инфекционных болезней и эпидемиологии; внутренних болезней ФПО; акушерства и гинекологии ФПО; акушерства и гинекологии; патофизиологии; микробиологии, вирусологии и иммунологии; анатомии; биоорганической химии; общей химии; кафедры мобилизационной подготовки, здравоохранения и медицины катастроф; НИИ Экологической медицины ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (Курск, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту:

1. Дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин увеличивают выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке;

2. Дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин стимулируют неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс;

3. Блокада АТФ зависимых калиевых каналов глибенкламидом полностью нивелирует цитопротекторный эффект дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке;

4. Блокада эндотелиальной N0 синтазы нивелирует цитопротекторный эффект рекомбинантного эритропоэтина, не оказывая влияния на возможность стимуляции им неоваскулогенеза.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Колесник, Инга Михайловна

выводы

1. Дистантное ишемическое прекондиционирование, осуществляемое 10 минутным пережатием бедренной артерии с последующей 30 минутной реперфузией'непосредственно перед моделированием патологии, на третьи и пятые сутки эксперимента увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке в 1,5 раз и стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени контрлатеральной конечности крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28 сутки ишемии в 2 раза.

2. Рекомбинантный эритропоэтин, вводимый подкожно в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг на первые (за 12 часов до моделирования патологии), третьи и пятые сутки эксперимента, увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке в 1,6 раз и стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28 сутки ишемии в 2 раза.

3. Сочетанное применение дистантного прекондиционировния и рекомбинантного эритропоэтина увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на- питающей ножке в 1,7 раза и стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28 сутки ишемии в 2 раза.

4. АТФ зависимые калиевые каналы являются эффекторным звеном в механизме цитопротекторного действия как дистантного ишемического прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке.

5. Блокада эндотелиальной N0 синтазы нивелирует цитопротекторный эффект рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке, не оказывая влияния на возможность стимуляции им неоваскулогенеза в ишемизированной мышце голени крыс.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Экспериментально обоснованные данные о возможности применения дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе для оптимизации выживаемости ишемизированных тканей и стимуляции неоваскулогенеза могут использоваться в учебном процессе на кафедрах фармакологии и хирургии медицинских вузов.

2. Провести доклинические исследования рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента как препарата для фармакологического прекондиционирования с последующей рекомендацией клинических испытаний у больных хирургического профиля.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Колесник, Инга Михайловна, 2010 год

1. Автандилов, Г.Г. Основы патологоанатомической практики / Г.Г. Автандилов. М.: РМАПО, 1994. - 512 с.

2. Адаптивные эффекты гипоксического прекондиционирования нейронов мозга / М.О. Самойлов, Е.В. Лазаревич, Д.Г. Семенов и др. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2001. - Т. 87, № 6. - С. 714.

3. Алехин, Д.И. Новые возможности реваскуляризации конечностей при хронической ишемии — неоангиогенез, индуцированный воздействием высокоинтенсивного лазерного излучения / Д.И. Алехин // Ангиология и сосудистая хирургия. 2003. - Т. 9, № 4. - С. 32-36.

4. Ангиогенез: Образование, рост и развитие кровеносных сосудов / В.В. Куприянов, В.А. Миронов, A.A. Миронов, О.Ю. Турина. М.: НИО Квартет, 1993.-201 с.

5. Аргинин в медицинской практике (обзор литературы) / Ю. С. Степанов, И.Н. Кононов, А. И. Журбина, А. Ю. Филиппова // Сучасна гастроентеролопя. -2005.-№4.-С. 121-126.

6. Баркаган, З.С. Метаболически-воспалительная концепция атеротромбоза и новые подходы к терапии больных / З.С. Баркаган, Г.И. Костюченко // Бюл. СО РАМН. 2006. - №2 (120). - С. 132-138.

7. Биленко, М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов (молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения) / М.В. Биленко. М.: Медицина, 1989. - 279 с.

8. Бокерия, Л.А. Природа и клиническое значение «новых ишемических синдромов» / Л.А. Бокерия, И.Н. Чичерин. М.: НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2007. - 302 с.

9. Бокерия, JI.А.' Современное состояние и перспективы использования ангиогенеза в лечении ишемической болезни сердца / Л.А. Бокерия, М.В. Еремеева // Грудная и сердечно-сосуд. хирургия. 2000. - Т.1, № 2. -С. 57-61.

10. Бузиашвили, Ю.И. Ангиогенез как антиишемический механизм / Ю.И. Бузиашвили // Кардиология.- 2000. Т.40, № 12.- С.82-86.

11. Булгак, A.A. Вовлечение дисфункции сосудистого эндотелия в патогенез необратимых реперфузионных повреждений миокарда / A.A. Булгак, А.Г. Мрочек, A.B. Турин // Новости мед.-биол. наук.-2004.- № 3.- С. 4045.

12. Власов, Т.Д. Системные нарушения микроциркуляции как следствие органной постишемической реперфузии / Т.Д. Власов // Сб. науч. работ «Патофизиология микроциркуляции» / под ред. H.H. Петрищева. СПб., 1998.-С. 90-106.

13. Влияние ингибирования №+/Н+-обмена на метаболизм зоны риска и размеры инфаркта миокарда у собак / О.И. Писаренко, Л.И. Серебрякова, О.В. Цкитишвили и др. // Кардиология. 2003. - № 12. - С. 73-78.

14. Возможности и перспективы лечения критической ишемии с использованием генно-инженерных технологий / Б.А. Константинов, Н.П. Бочков, A.B. Гавриленко и др. // Ангиология и сосудистая хирургия. 2003. - Т. 9, № 3. - С. 14-18.

15. Возможности комбинированной фармакологической и хирургической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, А.Д. Мясников и др. // Рос. мед.-биолог, вестн. им. акад. И.П. Павлова. 2008. - № 1. - С. 8-13.

16. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, М.В. Покровский и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. 2008. - Т. 71. №3.-С. 23-25.

17. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, Б.С. Суковатых // Кубанский науч. мед. вестн. 2007. - № 1-2. - С. 19-22.

18. Гамбарян, П.П. Крыса / П.П. Гамбарян, Н.М. Дукельская. М., 1995.-254 с.

19. Гипоксическое прекондиционирование предотвращает развитие постстрессовых депрессивных состояний у крыс / Е.А. Рыбникова, В .И. Миронова, С.Г. Пивина и др. // Докл. Акад. наук. 2006. - Т. 411, № 1.-С. 122-125.

20. Голиков, П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний / П.П. Голиков. М.: ИД Медпрактика-М, 2004. - 180 с.

21. Гудырев, О.С. Остеопротективное действие эналаприла и лозартана при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне: дис. канд. мед. наук / О.С. Гудырев. Курск, 2008. - 121 с.

22. Давыденко, В.В. Стимулированный ангиогенез-новое направление в лечении при ишемических состояниях / В.В. Давыденко,

23. B.М. Мачс //Вестн. хирургии, им. И. И. Грекова. 2000. - Т. 159, № 4.1. C.117-120.

24. Дисфункция эндотелия. Причины, механизмы, фармакологическая коррекция / под ред. H.H. Петрищева. СПб.: Изд-во СПбГМУ, 2003. - 184 с.

25. Захаров, Ю.М. Неэритропоэтические функции эритропоэтина / Ю.М. Захаров // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2007. - Т. 93, №6.- С. 592-608.

26. Значение Li опиоидных рецепторов в регуляции устойчивости изолированного сердца к воздействию ишемии-реперфузии / Т.Н. Ласукова, Л.Н. Маслов, Ю.Б. Лишманов, A.A. Платонов // Кардиология. 2003. - № 5. - С. 38-49.

27. Ивашкин, В.Т. Клиническое значение оксида азота и белков теплового шока / В.Т. Ивашкин, О.М. Драпкина. М.гГЭОТАР-МЕД, 2001. - 88 с.

28. Капелька, В.И. Эволюция концепций и метаболическая основа ишемической дисфункции миокарда / В.И. Капелька // Кардиология. -2005.-№ 9.-С. 55-61.

29. Кардиопротективные эффекты ишемического посткондиционирования миокарда / Е.В. Шляхто, М.М. Галагудза, A.B. Сыренский, Е.М. Нифонтов // Кардиология. 2005. - № 7. - С. 44-48.

30. Клиническая ангиология: в 2 т. / под ред. A.B. Покровского. М.: Медицина, 2004.

31. Козлов, В.И. Гистофизиология системы микроциркуляции / В.И. Козлов // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2003. - № 2. -С.79-85.

32. Крыжановский, Г.Н. Некоторые общебиологические закономерности и базовые механизмы развития патологических процессов / Г.Н. Крыжановский // Арх. патологии. 2001. - № 6. - С. 44-49.

33. Кузнецов, В.А. Действие нитроглицерина на феномен ишемической предпосылки у больных ИБС при проведении парных нагрузочных тестов / В.А. Кузнецов, В.В. Тодосийчук // Кардиология. 2001. - № 4. -С. 27-29.

34. Кулинский, В.И. Молекулярные механизмы действия гормонов Рецепторы. Нейромедиаторы. Системы со вторыми посредниками /

35. B.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 1.1. C. 33-50.

36. Лазарев, Е.В. Использование серотонина адипината для повышения эффективности консервативной терапии критической ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза: дис. канд. мед. наук / Е.В. Лазарев. Курск, 2004. - 157 с.

37. Лазаренко, В.А. Лечение критической ишемии нижних конечностей с использованием серотонина / В.А. Лазаренко, А.П. Симоненков, Е.В. Лазарев // Ангиология и сосудистая хирургия. -<2003. Т. 9, № 2. -С. 26-32.

38. Марков, Х.М. Молекулярные механизмы дисфункции сосудистого эндотелия / X. М. Марков // Кардиология. 2005. - № 12. - С. 62-72.

39. Марков, Х.М. Оксид азота и сердечно-сосудистая система / Х.М. Марков // Успехи физиолог, наук. 2001. - Т. 32, № 3. - С. 9-65.

40. Марков, Х.М. Сосудистые эффекты липопротеинов и оксид азота: клеточные и молекулярные механизмы / Х.М. Марков // Патолог, физиология и эксперим. терапия. 2006. - № 3. - С. 2-7.

41. Маслов, Л.Н. Адаптация миокарда к ишемии / Л.Н.' Маслов, Ю.Б. Лишманов, Н.В. Соленкова // Успехи физиол. наук. 2006. - Т. 37, №3.-С. 25-31.

42. Недосугова, Л.В. Препараты сульфонилмочевины в лечении сахарного диабета 2 типа / Л.В. Недлсугова // Рус. мед. журн. 2005. - Т. 13, №20/244. -С. 1346-1353.

43. Остроумова, О.С. Дисфункция эндотелия при сердечно-сосудистых заболеваниях (по материалам XIII Европейской конференции поартериальной гипертензии) / О.С. Остроумова, Р.Э. Дубинская //• Кардиология. 2005. - №2. - С. 59-62.