Влияние CpG динуклеотидов на кинетику экспрессии трансгенов плазмидными векторами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Брутер Александра Владимировна

• Брутер Александра Владимировна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Брутер Александра Владимировна

Оглавление

Список использованных сокращений

Введение

Актуальность темы

Цели и задачи исследования

Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Вклад автора

Апробация работы

Структура работы

Благодарности

1. Обзор литературы

1.1 Разработка плазмидных векторов

1.1.1 Плазмидные векторы in vitro

1.1.2 Плазмидные векторы in vivo

1.2. Элементы, влияющие на эффективность плазмидных векторов

1.2.1 CG-островки и CpG-динуклеотиды

1.2.1.1 Основные механизмы метилирования CpG

1.2.1.2 Основные механизмы деметилирования CpG

1.2.1.3 Общие сведения о CG-островках

1.2.1.4 Механизмы гипометилирования CG-островков

1.2.1.5 Дифференциальное метилирование CG островков

1.2.1.6 Метилирование CG-островков и транскрипция

1.2.2 S/MAR элементы

1.3. Заключение

2. Материалы и методы

2.1. Получение, наработка и выделение плазмид

2.2. Культивирование клеток

2.3. Электропорация мезенхимальных стволовых клеток

2.4. Определение концентрации плазмиды в клетках после электропорации с помощью ПЦР в реальном времени

2.5. Измерение люциферазной активности светлячковой (Firefly) люциферазы и секретируемой (Lucia) люциферазы

2.6. Анализ экспрессии ß-галактозидазы и eGFP

2.7. Лабораторные животные

2.8. Введение плазмид в задние конечности и в печень мышей

2.9. Забор крови и измерение mSEAP

2.10. Статистический анализ

3. Результаты

3.1. Создание генетических конструкций

3.2 Тестирование конструкций in vitro

3.2.1 Выбор между вектором pMBR1 и pMBR2

3.2.2 Влияние содержания CpG-динуклеотидов в векторе и трансгене на начальный уровень экспрессии трансгена

3.2.3 Измерение количества плазмиды в клетках после электропорации

3.2.4 Кинетика экспресии конструкций, кодирующих люциферазу, в МСК

3.2.5 Влияние единичных CpG-динуклеотидов на кинетику экспрессии

3.2.6 Влияние RG108 на кинетику экспрессии трансгенов

3.2.7 Влияние ДМСО на кинетику экспрессии трансгенов

3.2.8 Влияние содержания CpG-динуклеотидов в векторе на экспрессию Р-галактозидазы и EGFP

3.3. Тестирование конструкций in vivo

3.3.1 Введение конструкций в скелетные мышцы

3.3.2 Введение конструкций в печень

4. Обсуждение результатов

4.1 Обсуждение результатов, полученных в системе in vitro

4.2 Обсуждение результатов, полученных в системе in vivo

5. Заключение

6. Выводы

Библиография

Список использованных сокращений

CGBP - CpG-binding protein; CpG-связывающий белок CMV - cytomegalovirus; цитомегаловирус DNMT - DNA methyltransferase; ДНК-метилтрансфераза DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium

dsRED - discocoma red fluorescent protein; красный флуоресцентный белок дискосом ES - embryonic stem [cells]; эмбриональные стволовые [клетки] GFP - green fluorescent protein; зеленый флуоресцентный белок

eGFP - enhanced green fluorescent protein; улучшенный зеленый флуоресцентный белок LB - lysogeny broth; лизогенная среда

MGC - Mammalian Gene Collection; Коллекция Генов Млекопитающих;

https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/ MSC, МСК - mesenchymal stem cells; мезенхимальные стволовые клетки mSEAP - mouse secreted embryonic alkaline phosphatase; мышиная секретируемая

эмбриональная щелочная фосфатаза PBS - Phosphate buffered saline; натрий-фосфатный буфер PLB - passive lysis buffer; пассивный лизирующий буфер

S/MAR - scaffold/matrix attachment region; область прикрепления к скаффолду/матриксу

TLR9 - toll-like receptor 9; toll-подобный рецептор

ДМСО - диметилсульфоксид

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ОРС - открытая рамка считывания

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние CpG динуклеотидов на кинетику экспрессии трансгенов плазмидными векторами»

Актуальность темы

Достижения в области молекулярного клонирования в конце 1980-х годов привели к появлению генной терапии - нового направления молекулярной медицины, задачей которого является разработка новых, основанных на молекулярно-генетических подходах, методов лечения многих наследственных и приобретенных заболеваний. Сама по себе концепция генной терапии наследственных заболеваний проста: вместо дефектного гена, неспособного выполнять свою функцию, ввести в организм его исправную копию. С этой целью могут использоваться собственные клетки пациента (в этом случае клетки пациента модифицируют ex vivo и снова вводят пациенту) или же различные векторы, несущие функциональную копию гена, которые вводится пациенту непосредственно [1]. Реализация этой концепции, однако, на практике оказывается затруднена, главным образом, из-за наличия у животных систем, препятствующих внедрению чужеродного генетического материала. К таким системам относятся, в первую очередь, системы противовирусного и противобактериального иммунитета.

Тем не менее, за минувшие 20 лет генная терапия достигла определенных успехов. Улучшения состояния здоровья пациентов удалось добиться, например, при лечении Р-талассемии с использованием лентивирусных векторов [2], врожденной слепоты с использованием аденоассоциированных векторов [3], некоторых разновидностей тяжелого комбинированного иммунодефицита с использованием ретровирусных векторов [4, 5].

За два десятилетия клинических испытаний обнаружилось, однако, что использование вирусных векторов не вполне безопасно. Например, ретро- и лентивирусные векторы могут встраивать свой геном в произвольные места ДНК клеток, подвергающихся генетической модификации. При этом могут происходить снижение или рост активности генов поблизости от места встраивания. Если изменения затрагивают

экспрессию генов, вовлеченных в контроль пролиферации, вероятность злокачественного перерождения зараженной клетки значительно повышается. Около 20 лет назад во Франции прошли клинические испытания генной терапии тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с Х-хромосомой, с использованием вектора, полученного на основе вируса, вызывающего лейкемию у мышей. В качестве терапевтического гена использовалась общая у-цепь рецепторов интерлейкинов. У девяти из десяти пациентов, подвергшихся терапии, развилась функциональная иммунная система, однако в течение трех лет клинических испытаний у троих из них развилась также лейкемия, приведшая к смерти одного пациента [6, 7]. К настоящему времени инсерционный мутагенез был также обнаружен на животных моделях при использовании рекомбинантных векторов на основе аденоассоциированных вирусов. Такой мутагенез приводил, например, к гепатоцеллюлярной карциноме у неонатальных мышей [8, 9].

Аденовирусные векторы не встраивают свой геном в геном зараженной клетки [10, 11], но при введении в организм могут вызывать сильный иммунный ответ, вплоть до анафилактического шока и смерти [12]. Иммунный ответ против этого и других типов вирусов создает помехи не только безопасности, но и эффективности опосредованной вирусами генной терапии. Иммунный ответ может ускорять элиминацию зараженных клеток [13]. Этот эффект особенно выражен при последовательных введениях. Кроме того, недавно была обнаружена нейротоксичность высоких доз аденоассоциированных вирусов [14]. Еще одно неудобство, возникающее при использовании аденоассоциированных вирусов - ограничения, налагаемые на размер трансгена [10].

Ввиду намного более низкой вероятности встраивания в геном невирусные векторы обычно рассматриваются как самый безопасный вариант для доставки терапевтических генов. Однако низкий уровень экспрессии, достигаемый на сегодняшний день при использовании плазмидной ДНК [15], ограничивает применение таких векторов небольшим количеством клинических ситуаций, в которых достаточно транзиентной

экспрессии трансгена на невысоком уровне. В настоящее время предпринимается ряд усилий, направленных на оптимизацию плазмидных векторов путем встраивания в них S/MAR элементов [16] и предотвращения преждевременного сайленсинга трансгена путем элиминации CpG-динуклеотидов [17].

В данной работе была предпринята попытка, объединив два упомянутых выше подхода, создать плазмидный вектор, способный продолжительное время экспрессировать трансген на высоком уровне в системах in vitro и in vivo. Кроме того, был проведен ряд экспериментов, имеющий своей целью выяснить, какие именно модификации и в какой степени необходимы для создания такого вектора.

Цели и задачи исследования

Данная работа имеет как фундаментальную, так и прикладную цель. Прикладной целью работы стало создание плазмидного вектора, успешно экспрессирующего трансген в ситуациях, в которых до сих пор не удавалось добиться длительной эффективной экспрессии трансгена с использованием плазмидных векторов: в стволовых клетках (in vitro) и в печени (in vivo). Фундаментальной целью работы стала оценка влияния, оказываемого в разных ситуациях CpG-динуклеотидами, содержащимися в векторе и кодирующей экспрессируемый белок последовательности, на кинетику экспрессии трансгена данным вектором.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать плазмидные векторы со сниженным содержанием CpG-динуклеотидов и S/MAR элементами и провести их сравнительный анализ для выбора оптимального варианта.

2. Оценить уровень и продолжительность экспрессии трансгена оптимальным вариантом вектора в мезенхимальных стволовых клетках (МСК) in vitro в сравнении с обычным контрольным вектором.

3. Оценить влияние деметилирующих агентов на эффективность и продолжительность экспрессии трансгена различными векторами.

4. Провести в системе in vivo оценку уровня и продолжительность экспрессии трансгена выбранным вектором в сравнении с обычным контрольным вектором.

5. Сравнивая между собой соответствующие плазмиды, оценить влияние различного числа CpG-динуклеотидов, содержащихся в векторе и кодирующей белок последовательности, на кинетику экспрессии трансгена.

Научная новизна, теоретическое и практическое значение работы

Созданный нами плазмидный вектор pMBR2 обеспечивает эффективную и продолжительную экспрессию целевого трансгена в мезенхимальных стволовых клетках человека, в скелетных мышцах и печени мышей. Ранее настолько продолжительной экспрессии трансгена в мезенхимальных (и других) стволовых клетках с использованием плазмидных векторов добиться не удавалось. Не удавалось также добиться продолжительной экспрессии целевого трансгена плазмидными векторами в печени.

Показано, что удаление всех CpG-динуклеотидов не является обязательной процедурой для создания эффективного вектора. Это имеет важное практическое значение, поскольку удаление CpG-динуклеотидов из части плазмиды, ответственной за репликацию, может значительно усложнить ее получение в терапевтических количествах.

Вектор pMBR2 способен также поддерживать экспрессию генов, содержащих CpG-динуклеотиды в кодирующей последовательности. Это важное преимущество данного вектора, т.к. удаление CpG-динуклеотидов из открытых рамок считывания некоторых генов может приводить к снижению активности белков, кодируемых этими генами.

Продемонстрировано, что полное удаление бактериальных последовательностей, превращающее плазмиды в миникольца, не является обязательным для эффективной длительной экспрессии трансгена in vivo. С практической точки зрения получение

миниколец - трудоемкая и дорогостоящая процедура, и возможность ее избежать -важное преимущество вектора pMBR2.

Таким образом, созданный в ходе данной работы плазмидный вектор pMBR2 является эффективным, удобным и безопасным инструментом для генной терапии и ex vivo модификации клеток при их использовании в клинической практике.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием широкого спектра современных методов молекулярной и клеточной биологии. Проведен ряд экспериментов с использованием лабораторных животных. Вектор pMBR2, плазмиды на его основе и контрольные плазмиды для сравнения были созданы при помощи стандартных методов молекулярного клонирования. Для экспериментов in vitro были использованы мезенхимальные стволовые клетки человека, плазмиды вводились в них с помощью метода электропорации. Уровень экспрессии трансгена оценивали путем измерения люциферазной активности, проточной цитометрии и окрашивания на ß-галактозидазу. Эксперименты in vivo проводили с использованием мышей C57BL/6. Введение плазмид в мышцы задних конечностей мышей осуществлялось путем электропорации, в печень мышей - путем гидродинамического введения. Оценку уровня экспрессии трансгена производили путем измерения количества секретируемой щелочной фосфатазы в крови животных.

Положения, выносимые на защиту

1. Создан плазмидный вектор pMBR2, обеспечивающий эффективную и пролонгированную экспрессию трансгенов, что продемонстрировано на мезенхимальных стволовых клетках в системе in vitro, а также в мышцах и печени мышей в системе in vivo.

2. Введение S/MAR элементов внутрь экспрессионной кассеты (между открытой рамкой считывания и сигналом полиаденилирования) снижает эффективность экспрессии вектором секретируемых белков: люциферазы Lucia и щелочной фосфатазы.

3. Долговременная эффективная экспрессии светлячковой люциферазы in vitro в мезенхимальных стволовых клетках достигается сокращением числа CpG-динуклеотидов как в векторе, так и в кодирующей белок последовательности. Вектор pMBR2 также позволяет реализовывать в МСК относительно эффективную экспрессию люциферазы дикого типа, кодируемой CpG-богатым вариантом гена.

4. В мышцах вектор pMBR2 обеспечивает стабильно высокий уровень экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы, кодируемой геном, лишенным CpG. По эффективности экспрессии щелочной фосфатазы данная плазмида существенно превосходит другие плазмиды, использованные в эксперименте. При этом в мышцах данный вектор обеспечивает также достаточно высокий уровень экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы, кодируемой CpG богатым геном дикого типа. Более того, CpG богатый вектор pcDNA3.1 также обеспечивает в мышцах достаточно высокий уровень экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы, кодируемой геном, лишенным CpG.

5. Использование вектора pMBR2 в сочетании с лишенным CpG динуклеотидов геном щелочной фосфатазы позволяет добиться стабильной экспрессии фосфатазы в печени в течение длительного времени. В то же время замена лишенного CpG динуклеотидов гена фосфатазы на CpG-богатый ген дикого типа обеспечивает только минимально превосходящий фоновый уровень экспрессии щелочной фосфатазы, а при использовании вектора pcDNA3.1 уровень экспрессии щелочной фосфатазы снижается до фонового в первые недели эксперимента.

Вклад автора

Основные результаты (получение плазмидных конструкций, эксперименты in vitro, получение результатов в экспериментах in vivo, обработка результатов) получены автором самостоятельно. Мезенхимальные стволовые клетки человека предоставлены Е.В. Соловьевой (Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»).

Манипуляции с животными проводились при участии и под руководством М.В. Калашниковой (ИМБ РАН). Прибор для проведения электропорации был сконструирован Притыко А.П. (научно-производственное предприятие «Монитор»).

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на межлабораторном коллоквиуме ИМБ имени Энгельгардта РАН 5 марта 2019 года.

По теме научного исследования было опубликовано 3 научные работы. В том числе, 2 в рекомендованном ВАК РФ журнале «Молекулярная биология» и 1 в журнале «Journal of Gene Medicine», официальном журнале Японского общества генной терапии (Japan Society of Gene Therapy) и Австралийского общества генной терапии (Australasian Gene Therapy Society), индексируемого базами данных Web of Science и Scopus. Подана 1 заявка и получено решение о выдаче патента на изобретение РФ, .

1. Брутер А. В., Авдеев А. В., Белявский А. В. Регулируемые системы экспрессии для генной терапии. Молекулярная биология 2013; 3: 363-387.

2. Bruter AV, Kandarakov OF, Belyavsky AV. Persistence of plasmid-mediated expression of transgenes in human mesenchymal stem cells depends primarily on CpG levels of both vector and transgene. J Gene Med 2018 Feb; 20: e3009.

3. Кандараков О. Ф., Брутер А. В., Белявский А. В. Модуляция продукции люциферазы клетками меланомы in vitro. Молекулярная биология 2018; 5: 826-835.

4. Решение о выдаче патента РФ на изобретение от 07.08.2018. Рекомбинантный вектор для создания плазмидных генетических конструкий, обладающий повышенной длительностью экспрессии целевых генов. А.В. Белявский, А.В. Брутер. Регистрационный № 2018128932/04(046347).

Структура работы

Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, выводы и список используемой литературы (211 источников).

Работа содержит 16 рисунков.

В обзоре литературы описываются задачи, возникающие при создании невирусных векторов, и предлагаемые на сегодняшний день решения этих задач. Кроме того, описывается структура, функции и механизмы функционирования CG островков, отдельных CpG-динуклеотидов и S/MAR элементов и их роль в разработке и создании наиболее перспективных плазмидных векторов.

Благодарности

Данная работа проводилась под руководством д.б.н. Александра Вадимовича Белявского. Мезенхимальные стволовые клетки человека были предоставлены к.б.н. Еленой Владимировной Соловьевой. Экспреименты in vivo проводились под руководством и при участии Марии Владимировны Калашниковой. Всем названным людям я хочу выразить свою глубокую признательность.

1. Обзор литературы 1.1 Разработка плазмидных векторов

В настоящее время создание новых плазмидных векторов имеет большую практическую актуальность, поскольку вирусные вектора не вполне отвечают требованиям безопасности, предъявляемым применением в клинике, а уже существующие плазмидные векторы недостаточно эффективны. В последние годы был создан и протестирован in vivo и in vitro ряд оптимизированных плазмидных векторов. В некоторых случаях удалось достичь их эписомального поддержания за счет встраивания разных модификаций S/MAR элементов. Также предпринималось множество попыток путем частичной или полной элиминации CpG-динуклеотидов, или даже полной элиминации бактериальных последовательностей, избежать преждевременного сайленсинга трансгена.

1.1.1 Плазмидные векторы in vitro

Для варианта генной терапии, подразумевающего введение пациенту экспрессирующих терапевтический ген клеток, очень важно разработать безопасный и эффективный способ генетической модификации человеческих клеток ex vivo. Определенный прогресс в невирусной модификации клеток ex vivo уже был достигнут. Например, iPS клетки были получены с использованием плазмид, миниколец и РНК-трансфекции [18-20], хотя для достижения результата при этом требовалась лишь кратковременная экспрессия генов в репрограммируемых клетках.

Большой интерес для дальнейшего клинического применения в регенеративной медицине представляет модификация мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Аутологичные МСК сравнительно легко доступны (могут быть получены, например, из жировой ткани) и обладают широким спектром дифференцировки. Было показано, что экспрессия определенных генов в результате ex vivo модификации МСК улучшает их выживаемость после трансплантации [21-23], а также помогает клеткам мигрировать в

нужном направлении и задерживаться в местах повреждения тканей [21, 22, 24]. Кроме того, МСК перспективны как средства доставки терапевтических генов [25-30].

Однако до сих пор попытки длительной экспрессии трансгена в МСК с помощью плазмидных конструкций были не очень успешными. Уровень экспрессии трансгена резко снижался в течение первой недели после введения конструкции [24, 25, 31]. Перспективная стратегия продления экспрессии трансгена плазмидными векторами появилась после того, как было показано, что элиминация CpG-динуклеотидов из плазмидных конструкций повышает уровень и продлевает экспрессию трансгена [32]. Снижение уровня экспрессии трансгена при этом может вызываться присутствием CpG-динуклеотидов как в промоторе [33], так и в собственно трансгене [33-36] или даже в бактериальном остове плазмиды [33, 37]. Этот эффект наблюдается как in vitro [34, 36, 37], так и in vivo [33, 34, 35, 37]. Существуют работы, показывающие, что CpG-метилирование оказывает более сильное влияние на экспрессию трансгена в эмбриональных и других стволовых, чем в терминально дифференцированных клетках [38, 39]. В то же время, именно стволовые клетки - основные кандидаты на использование в клеточной терапии и регенеративной медицине.

В связи с этим представляется перспективной попытка объединить два подхода для достижения долговременной и высокоэффективной экспрессии трансгена эписомальными векторами. Первый подход - введение S/MAR элементов - позволяет плазмидной конструкции, как было показано в ряде работ, поддерживаться в эписомальном состоянии, ассоциированном с геномом клетки, несмотря на отсутствие интеграции [37, 40-42]. Второй подход - элиминация CpG-динуклеотидов - позволяет избежать CpG-зависимого сайленсинга трансгена. Кроме того, на основании гипотезы о том, что причиной падения уровня экспрессии трансгена являются не CpG-динуклеотиды, а любые последовательности бактериального происхождения, был предложен и третий подход. Этот подход - элиминация бактериальных последовательностей путем превращения

плазмид в миникольца [40]. Хотя в работе Бролла и др. было показано, что превращение плазмиды в миникольцо может облегчать конструкциям проникновение в ядро и эписомальное поддержание [40], данный подход заметно усложняет процедуру приготовления терапевтических конструкций при том, что возможность получения высокого уровня экспрессии трансгена при нем неочевидна.

Показательна эволюция плазмиды pEPI, в отношении которой были применены все перечисленные подходы. Папапетру и ее коллеги в своем исследовании сконструировали плазмиду pEPI-eGFP, содержащую репортерный ген eGFP под контролем CMV промотора. Непосредственно после репортерного гена в этом векторе находится S/MAR элемент длиной 2000 пар оснований. В первом исследовании pEPI-eGFP вводили в клеточные линии K562 и MEL, а также в CD34+ гематопоэтические стволовые клетки с помощью электропорации. При таком подходе продолжительную экспрессию трансгена наблюдали только в клетках K562. В клетках линии MEL наступил полный транскрипиционный сайленсинг, а в гематопоэтических стволовых клетках уровень экспрессии eGFP значительно снизился, хотя и не до нуля. Кроме того, в этом исследовании было показано, что эписомальное поддержание не защищает трансген от преждевременного сайленсинга [41].

Хаасе и коллеги усовершенствовали вектор pEPI, создав вектор pEPito. Основная модификация кнструкции состояла в удалении 60% от имевшихся 305 CpG-динуклеотидов. После введения такой конструкции в клетки сравнивали способность данного вектора и исходнго к поддержанию в стабильном эписомальном состоянии путем подсчета числа образующихся колоний. Для модифицированного вектора число колоний было в 6 раз выше, а уровень экспрессии трансгена - в 7-70 раз выше, чем для CpG-богатого вектора [37].

Бролл и коллеги с помощью индуцируемой рекомбинации получили из плазмиды pEPI-eGFP миникольца, не содержащие бактериальные плазмидные компоненты. Кроме

того, они получили более короткий вариант S/MAR элемента длиной около 700 пар нуклеотидов. Анализ с помощью проточной флуориметрии показал, что удаление бактериальных последовательностей положительно сказывается на уровне экспрессии трансгена. Более удивительным оказалось положительное влияние на уровень экспрессии трансгена замены полноразмерного S/MAR элемента его коротким вариантом длиной 700 пар нуклеотидов. Биоинформатический анализ показал наличие внутри полноразмерного S/MAR элемента криптического сигнала полиаденилирования, который отсутствует в более коротком варианте [40]. Этот сигнал полиаденилирования и был случайно удален при уменьшении S/MAR элемента до 700 пар нуклеотидов.

Наконец, Йенке и коллеги модифицировали pEPI, искусственно создав более эффективный S/MAR элемент. Они заменили полноразмерный S/MAR элемент на тетрамер последовательности, ответственной в S/MAR элементе за связывание фактора SAF-A. Такого тетрамера оказалось достаточно для поддержания вектора в эписомальном состоянии [42].

1.1.2 Плазмидные векторы in vivo

Разработка плазмидного вектора, поддерживающего эффективную долговременную экспрессию терапевтических генов в печени и скелетных мышцах важна для дальнейшего развития генной терапии. В печени синтезируются многие белки, мутации в генах которых ассоциированы с тяжелыми наследственными заболеваниями: фенилаланингидроксилаза, альфа-1-антитрипсин, факторы свертываемости крови и т.д. Кроме того, поскольку клетки поджелудочной железы плохо поддаются генетической модификации, представляется перспективным использование гепатоцитов для получения секретирующих инсулин клеток при терапии сахарного диабета [43]. Введение генотерапевтических конструкций непосредственно в печень уже позволило достичь определенных успехов в лечении фенилкетонурии на мышиных моделях [44], гемофилии [45] и дефицита альфа-1-антитрипсина у людей [46].

Генетическая модификация миоцитов может применяться для лечения миопатий у детей и новорожденных [47]. У пациентов старшего возраста такая генная терапия может использоваться для восстановления кровоснабжения нижних конечностей, нарушенного из-за сахарного диабета [48]. Кроме того, мышцы легко доступны для инъекций, а в случае с плазмидными векторами - для электропорации [49] и гидродинамического введения [50, 51]. Электропорация и гидродинамическое введение - методы, которые могут значительно увеличивать уровень трансфекции клеток и экспрессии трансгена, что делает мышечную ткань удобной для экспрессии в ней белков, терапевтический эффект которых должен быть системным, например, экспрессии эритропоэтина при анемии, вызванной хронической почечной недостаточностью [52].

Дополнительное преимущество мышц и печени как мишеней для генной терапии с использованием плазмидных векторов заключается в том, что гепатоциты и миоциты долго живут, редко делятся и медленно обновляются [44,53]. В быстро обновляющихся клетках экспрессия трансгена, не интегрированного в геном, быстро падала бы из-за эффекта разведения.

В разных тканях и органах кинетика экспрессии трансгена одним и тем же плазмидным вектором может различаться. Например, задача обеспечения долговременной экспрессии трансгенов в мышцах представляется частично решенной. Даже используя обычные плазмиды, ряду авторов удалось добиться долговременной экспрессии трансгена и коррекции фенотипа в экспериментах, продолжавшихся от четырех месяцев до года [52, 54, 55]. Гораздо сложнее оказалось добиться долговременной экспрессии трансгена в печени. Обычные плазмиды были не в состоянии справиться с этой задачей [54, 56-58]. Даже при использовании специально адаптированных конструкций (линейных кассет, миниколец, плазмид со сниженным содержанием CpG-динуклеотидов, плазмид с инсуляторами) уровень экспрессии трансгена падал на порядок или больше в первые же недели после введения [16, 44, 59-64].

Причины сайленсинга экспрессии трансгена при экспрессии плазмидными конструкциями до сих пор остаются предметом дискуссии. Выдвигалось предположение, что причиной сайленсинга может быть иммунный ответ против плазмидной ДНК из-за ее сходства с бактериальной ДНК. У млекопитающих ДНК, содержащая неметилированные CpG-динуклеотиды (характерные для бактериальной ДНК), вызывает иммунный ответ, опосредованный TLR9 рецептором, присутствующим на поверхности дендритных клеток, макрофагов, естественных киллеров и т.д. [17, 65]. Хайду и др. удалось показать, что даже один CpG-динуклеотид, содержащийся в векторной последовательности, может вызывать воспаление при введении в легкие in vivo [17]. Было показано, что сильный иммунный ответ в некоторых случаях коррелирует с быстрым падением уровня экспрессии трансгенов [66]. И, хотя у нокаутных мышей TLR9-- после введения содержащей неметилировнанные CpG-динуклеотиды ДНК действительно не наблюдается признаков иммунного ответа [65], в качестве основной причины падения уровня экспрессии трансгена он выступать не может. Отсутствие TLR9 рецепторов не оказывает заметного влияния на кинетику экспрессии трансгена [67]. Кроме того, было показано, что элиминации плазмиды или селективной элиминации клеток, содержащих плазмиду, со временем не происходит [62, 68]. Из этого следует, что должны быть и другие механизмы, ответственные за падение уровня экспрессии трансгена.

Один из таких возможных механизмов снижения уровня экспрессии -транскрипционный сайленсинг: de novo метилирование CpG-динуклеотидов с образованием неактивного хроматина. Например, Ю и коллеги показали, что лишенная CpG-динуклеотидов плазмида может поддерживать длительную экспрессию трансгена в легких на постоянном уровне. Та же плазмида в печени показала более скромные результаты: за первый месяц уровень экспрессии трансгена упал на порядок, зато потом оставался на прежнем уровне. [64, 67]. Данные о причинно-следственной связи между de novo метилированием и падением уровня экспрессии трансгена остаются

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Брутер Александра Владимировна, 2019 год

Библиография

1. Herzog RW. Two Decades of Clinical Gene Therapy - Success Is Finally Mounting. Discovery Medicine 2010; 9(45): 105-111.

2. May C, Rivella S, Callegari J, Heller G, Gaensler KM, Luzzatto L, Sadelain M. Therapeutic haemoglobin synthesis in beta-thalassaemic mice expressing -lentivirus encoded human beta-globin. Nature 2000; 406(6791): 82-86.

3. Bainbridge JW, Smith AJ, Barker SS, Robbie S, Henderson R, Balaggan K, Viswanathan A, Holder GE, Stockman A, Tyler N, Petersen-Jones S, Bhattacharya SS, Thrasher AJ, Fitzke FW, Carter BJ, Rubin GS, Moore AT, Ali RR. Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 2008; 358(21): 2231-2239.

4. Blaese RM, Culver KW, Miller AD, Carter CS, Fleisher T, Clerici M, Shearer G, Chang L, Chiang Y, Tolstoshev P, Greenblatt JJ, Rosenberg SA, Klein H, Berger M, Mullen CA, Ramsey WJ, Muul L, Morgan RA, Anderson WF. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA-SCID: initial trial results after 4 years. Science 1995; 270(5235): 475-480.

5. Bordignon C, Notarangelo LD, Nobili N, Ferrari G, Casorati G, Panina P, Mazzolari E, Maggioni D, Rossi C, Servida P, Ugazio AG, Mavilio F. Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA- immunodeficient patients. Science 1995; 270(5235): 470-475.

6. Hacein-Bey-Abina S, Le Deist F, Carlier F, Bouneaud C, Hue C, De Villartay JP Thrasher AJ, Wulffraat N, Sorensen R, Dupuis-Girod S, Fischer A, Davies EG, Kuis W, Leiva L, Cavazzana-Calvo M. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. N Engl J Med 2002; 346: 1185-1193.

7. Cavazzana-Calvo M and Fischer A. Gene therapy for severe combined immunodeficiency: are we there yet? J Clin Invest 2007; 117: 1456-1465.

8. Donsante A, Miller DG, Li Y, Vogler C, Brunt EM, Russell DW, Sands MS. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science 2007; 317: 477.

9. Donsante, A, Vogler, C, Muzyczka, N, Crawford, JM, Barker, J, Flotte, T, CampbellThompson M, Daly T, Sands MS. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther 2001; 8: 1343-1346.

10. Skubis-Zegadlo J, Stachurska A, Malecki M. Vectrology of adeno-associated viruses (AAV). Med Wieku Rozwoj 2013; 17: 202-206.

11. Surosky RT, Urabe M, Godwin SG, McQuiston SA, Kurtzman GJ, Ozawa K, Natsoulis G. Adeno-associated virus Rep proteins target DNA sequences to a unique locus in the human genome. J Virol 1997; 71: 7951-7959.

12. Raper SE, Chirmule N, Lee FS, Wivel NA, Bagg A, Gao GP, Wilson JM, Batshaw ML. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol GenetMetab 2003; 80: 148-158.

13. Manno CS, Pierce GF, Arruda VR, Glader B, Ragni M, Rasko JJ, Ozelo MC, Hoots K, Blatt P, Konkle B, Dake M, Kaye R, Razavi M, Zajko A, Zehnder J, Rustagi PK, Nakai H, Chew A, Leonard D, Wright JF, Lessard RR, Sommer JM, Tigges M, Sabatino D, Luk A, Jiang H, Mingozzi F, Couto L, Ertl HC, High KA, Kay MA. Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med 2006; 12: 342-347.

14. Hinderer C, Katz N, Buza EL, Dyer C, Goode T, Bell P, Richman LK, Wilson JM. Severe Toxicity in Nonhuman Primates and Piglets Following High-Dose Intravenous Administration of an Adeno-Associated Virus Vector Expressing Human SMN. Hum Gene Ther. 2018; 29: 285-298.

15. Sarkar N, Blomberg P, Wardell E, Eskandarpour M, Sylven C, Drvota V, Islam KB. Nonsurgical direct delivery of plasmid DNA into rat heart: Time course, dose response, and the influence of different promoters on gene expression. J Cardiovasc Pharmacol. 2002; 39(2): 215224.

16. Argyros O, Wong SP, Niceta M, Waddington SN, Howe SJ, Coutelle C, Miller AD, Harbottle RP. Persistent episomal transgene expression in liver following delivery of a scaffold/matrix attachment region containing non-viral vector. Gene Ther 2008; 15(24): 1593— 1605.

17. Hyde SC, Pringle IA, Abdullah S, Lawton AE, Davies LA, Varathalingam A, Nunez-Alonso G, Green AM, Bazzani RP, Sumner-Jones SG, Chan M, Li H, Yew NS, Cheng SH, Boyd AC, Davies JC, Griesenbach U, Porteous DJ, Sheppard DN, Munkonge FM, Alton EW, Gill DR. CpG-free plasmids confer reduced inflammation and sustained pulmonary gene expression. Nat Biotechnol. 2008; 26(5): 549-551.

18. Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2008; 322: 949-953.

19. Narsinh KH, Jia F, Robbins RC, Kay MA, Longaker MT, Wu JC. Generation of adult human induced pluripotent stem cells using nonviral minicircle DNA vectors. Nat Protoc 2011; 6: 78-88.

20. Yoshioka N, Gros E, Li HR, Kumar S, Deacon DC, Maron C, Muotri AR, Chi NC, Fu XD, Yu BD, Dowdy SF. Efficient generation of human iPSCs by a synthetic self-replicative RNA. Cell Stem Cell 2013; 13: 246-254.

21. Nakamura Y, Ishikawa H, Kawai K, Tabata Y, Suzuki S. Enhanced wound healing by topical administration of mesenchymal stem cells transfected with stromal cell-derived factor-1. Biomaterials 2013; 34: 9393-9400.

22. Kim HW, Jiang S, Ashraf M, Haider KH. Stem cell-based delivery of Hypoxamir-210 to the infarcted heart: implications on stem cell survival and preservation of infarcted heart function. J Mol Med (Berl) 2012; 90: 997-1010.

23. Holladay CA, Duffy AM, Chen X, Sefton MV, O'Brien TD, Pandit AS. Recovery of cardiac function mediated by MSC and interleukin-10 plasmid functionalised scaffold. Biomaterials 2012; 33: 1303-1314.

24. Halum SL, McRae B, Bijangi-Vishehsaraei K, Hiatt K. Neurotrophic factor-secreting autologous muscle stem cell therapy for the treatment of laryngeal denervation injury. Laryngoscope 2012; 122: 2482-2496.

25. Ishikawa H, Jo JI, Tabata Y. Liver Anti-Fibrosis Therapy with Mesenchymal Stem Cells Secreting Hepatocyte Growth Factor. J Biomater Sci Polym Ed 2012; 23: 2259-2272.

26. Hu W, Wang J, He X, Zhang H, Yu F, Jiang L, Chen D, Chen J, Dou J. Human umbilical blood mononuclear cell-derived mesenchymal stem cells serve as interleukin-21 gene delivery vehicles for epithelial ovarian cancer therapy in nude mice. Biotechnol Appl Biochem 2011; 58: 397-404.

27. Mok PL, Cheong SK, Leong CF, Chua KH, Ainoon O. Human mesenchymal stromal cells could deliver erythropoietin and migrate to the basal layer of hair shaft when subcutaneously implanted in a murine model. Tissue Cell 2012; 44: 249-256.

28. Knippenberg S, Thau N, Dengler R, Brinker T, Petri S. Intracerebroventricular injection of encapsulated human mesenchymal cells producing glucagon-like peptide 1 prolongs survival in a mouse model of ALS. PLoS One 2012; 7: e36857.

29. Klinge PM, Harmening K, Miller MC, Heile A, Wallrapp C, Geigle P, Brinker T. Encapsulated native and glucagon-like peptide-1 transfected human mesenchymal stem cells in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurosci Lett 2011; 497: 6-10.

30. Heile AM, Wallrapp C, Klinge PM, Samii A, Kassem M, Silverberg G, Brinker T. Cerebral transplantation of encapsulated mesenchymal stem cells improves cellular pathology after experimental traumatic brain injury. Neurosci Lett 2009; 463: 176-181.

31. Mok PL, Cheong SK, Leong CF, Chua KH, Ainoon O. Extended and stable gene expression via nucleofection of MIDGE construct into adult human marrow mesenchymal stromal cells. Cytotechnology 2012; 64: 203-216.

32. de Wolf HK, Johansson N, Thong AT, Snel CJ, Mastrobattista E, Hennink WE, Storm G. Plasmid CpG depletion improves degree and duration of tumor gene expression after intravenous administration of polyplexes. G. Pharm Res 2008; 25: 1654-1662.

33. Mitsui M, Nishikawa M, Zang L, Ando M, Hattori K, Takahashi Y, Watanabe Y, Takakura Y. Effect of the content of unmethylated CpG dinucleotides in plasmid DNA on the sustainability of transgene expression. J Gene Med 2009; 11: 435-443.

34. Dalle B, Rubin JE, Alkan O, Sukonnik T, Pasceri P, Yao S, Pawliuk R, Leboulch P, Ellis J. eGFP reporter genes silence LCR beta-globin transgene expression via CpG dinucleotides. Mol Ther 2005; 11: 591-599.

35. Chevalier-Mariette C, Henry I, Montfort L, Capgras S, Forlani S, Muschler J, Nicolas JF. CpG content affects gene silencing in mice: evidence from novel transgenes. Genome Biol 2003; 4: R53.

36. Graessmann A, Sandberg G, Guhl E, Graessmann M. Methylation of single sites within the herpes simplex virus tk coding region and the simian virus 40 T-antigen intron causes gene inactivation. Mol Cell Biol 1994; 14: 2004-2010.

37. Haase R, Argyros O, Wong SP, Harbottle RP, Lipps HJ, Ogris M, Magnusson T, Vizoso Pinto MG, Haas J, Baiker A. pEPito: a significantly improved non-viral episomal expression vector for mammalian cells. BMC Biotechnol 2010; 10: 20.

38. Singh RP, Shiue K, Schomberg D, Zhou FC. Cellular epigenetic modifications of neural stem cell differentiation. Cell Transplant 2009; 18: 1197-1211.

39. Enver T, Soneji S, Joshi C, Brown J, Iborra F, Orntoft T, Thykjaer T, Maltby E, Smith K, Abu Dawud R, Jones M, Matin M, Gokhale P, Draper J, Andrews PW. Cellular differentiation hierarchies in normal and culture-adapted human embryonic stem cells. Hum Mol Genet 2005; 14: 3129-3140.

40. Broll S, Oumard A, Hahn K, Schambach A, Bode J. Minicircle Performance Depending on S/MAR-Nuclear Matrix Interactions. J Mol Biol 2010; 395: 950-965.

41. Papapetrou EP, Ziros PG, Micheva ID, Zoumbos NC, Athanassiadou A. Gene transfer into human hematopoietic progenitor cells with an episomal vector carrying an S/MAR element. Gene Ther 2006; 13: 40-51.

42. Jenke AC, Stehle IM, Herrmann F, Eisenberger T, Baiker A, Bode J, Fackelmayer FO, Lipps HJ. Nuclear scaffold/matrix attached region modules linked to a transcription unit are sufficient for replication and maintenance of a mammalian episome. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 11322-11327.

43. Handorf AM, Sollinger HW, Alam T. Insulin gene therapy for type 1 diabetes mellitus. Exp Clin Transplant 2015; 13 Suppl 1: 37-45.

44. Viecelli HM, Harbottle RP, Wong SP, Schlegel A, Chuah MK, VandenDriessche T, Harding CO, Thöny B. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology 2014; 60(3): 1035-1043.

45. High KA. Gene therapy for haemophilia: a long and winding road. J Thromb Haemost 2011; 9 Suppl 1: 2-11.

46. Gruntman AM, Flotte TR. Therapeutics: Gene Therapy for Alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Methods Mol Biol 2017; 1639: 267-275.

47. Robinson-Hamm JN, Gersbach CA. Gene therapies that restore dystrophin expression for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Hum Genet 2016; 135: 1029-1040.

48. Rissanen TT, Vajanto I, Ylä-Herttuala S. Gene therapy for therapeutic angiogenesis in critically ischaemic lower limb - on the way to the clinic. Eur J Clin Invest 2001; 31: 651-666.

49. Murakami T, Sunada Y. Plasmid DNA gene therapy by electroporation: principles and recent advances. Curr Gene Ther 2011; 11: 447-56.

50. Herweijer H, Wolff JA. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther 2007; 14: 99-107.

51. Wells DJ. Opening the floodgates: clinically applicable hydrodynamic delivery of plasmid DNA to skeletal muscle. Mol Ther 2004; 10: 207-208.

52. Sun J, Wang Y, Yang J, Du D, Li Z, Wei J, Yang A. Long-term and stable correction of uremic anemia by intramuscular injection of plasmids containing hypoxia-regulated system of erythropoietin expression. Exp Mol Med 2012; 44: 674-83.

53. Ding Z, Harding CO, Rebuffat A, Elzaouk L, Wolff JA, Thöny B. Correction of murine PKU following AAV-mediated intramuscular expression of a complete phenylalanine hydroxylating system. Mol Ther 2008; 16: 673-681.

54. Morrissey D, van Pijkeren JP, Rajendran S, Collins SA, Casey G, O'Sullivan GC, Tangney M. Control and augmentation of long-term plasmid transgene expression in vivo in murine muscle tissue and ex vivo in patient mesenchymal tissue. J Biomed Biotechnol 2012; 2012: 379845.

55. Yamano S, Dai J, Hanatani S, Haku K, Yamanaka T, Ishioka M, Takayama T, Yuvienco C, Khapli S, Moursi AM, Montclare JK. Long-term efficient gene delivery using polyethylenimine with modified Tat peptide. Biomaterials 2014; 35: 1705-1715.

56. Yokoo T, Kamimura K, Suda T, Kanefuji T, Oda M, Zhang G, Liu D, Aoyagi Y. Novel electric power-driven hydrodynamic injection system for gene delivery: safety and efficacy of human factor IX delivery in rats. Gene Ther 2013; 20: 816-823.

57. Pergolizzi RG, Jin G, Chan D, Pierre L, Bussel J, Ferris B, Leopold PL, Crystal RG. Correction of a murine model of von Willebrand disease by gene transfer. Blood 2006; 108: 862869.

58. De Meyer SF, Vandeputte N, Pareyn I, Petrus I, Lenting PJ, Chuah MK, VandenDriessche T, Deckmyn H, Vanhoorelbeke K. Restoration of plasma von Willebrand factor deficiency is sufficient to correct thrombus formation after gene therapy for severe von Willebrand disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008; 28: 1621-1626.

59. Magnusson T, Haase R, Schleef M, Wagner E, Ogris M. Sustained, high transgene expression in liver with plasmid vectors using optimized promoter-enhancer combinations. J Gene Med 2011; 13: 382-391.

60. Cim A, Sawyer GJ, Zhang X, Su H, Collins L, Jones P, Antoniou M, Reynes JP, Lipps HJ, Fabre JW. In vivo studies on non-viral transdifferentiation of liver cells towards pancreatic P cells. J Endocrinol 2012; 214: 277-288.

61 Wong SP, Argyros O, Coutelle C, Harbottle RP. Non-viral S/MAR vectors replicate episomally in vivo when provided with a selective advantage. Gene Ther 2011; 18: 82-87.

62. Chen ZY, Yant SR, He CY, Meuse L, Shen S, Kay MA. Linear DNAs concatemerize in vivo and result in sustained transgene expression in mouse liver. Mol Ther 2001; 3:403-410.

63. Gracey Maniar LE, Maniar JM, Chen ZY, Lu J, Fire AZ, Kay MA. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther 2013; 21: 131-138.

64. Yew NS, Zhao H, Przybylska M, Wu IH, Tousignant JD, Scheule RK, Cheng SH. CpG-depleted plasmid DNA vectors with enhanced safety and long-term gene expression in vivo. Mol Ther 2002; 5: 731-738.

65. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, Kaisho T, Sato S, Sanjo H, Matsumoto M, Hoshino K, Wagner H, Takeda K, Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 2000; 408: 740-745.

66. Tan Y, Liu F, Li Z, Li S, Huang L. Sequential injection of cationic liposome and plasmid DNA effectively transfects the lung with minimal inflammatory toxicity. Mol Ther 2001; 3:673-682.

67. Bazzani RP, Pringle IA, Connolly MM, Davies LA, Sumner-Jones SG, Schleef M, Hyde SC, Gill DR. Transgene sequences free of CG dinucleotides lead to high level, long-term expression in the lung independent of plasmid backbone design. Biomaterials 2016; 93: 20-26.

68. Pringle IA, Raman S, Sharp WW, Cheng SH, Hyde SC, Gill DR. Detection of plasmid DNA vectors following gene transfer to the murine airways. Gene Ther 2005; 12: 1206-1214.

69. Chen ZY, He CY, Ehrhardt A, Kay MA. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol Ther 2003; 8: 495500.

70. Chen ZY, He CY, Kay MA. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Hum Gene Ther 2005; 16: 126-131.

71. Chen ZY, Riu E, He CY, Xu H, Kay MA. Silencing of episomal transgene expression in liver by plasmid bacterial backbone DNA is independent of CpG methylation. Mol Ther 2008; 16: 548-556.

72. Argyros O, Wong SP, Fedonidis C, Tolmachov O, Waddington SN, Howe SJ, Niceta M, Coutelle C, Harbottle RP. Development of S/MAR minicircles for enhanced and persistent transgene expression in the mouse liver. J Mol Med (Berl) 2011; 89: 515-529.

73. Turek-Plewa J, Jagodzinski PP. The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression. Cell Mol Biol Lett 2005; 10(4): 631-647.

74. Margot JB, Ehrenhofer-Murray, AE, Leonhardt H. Interactions within the mammalian DNA methyltransferase family. J Mol Biol 2003; 4: 7.

75. Bestor TH. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet 2000; 9: 23952402.

76. Goll MG, Kirpekar F, Maggert KA, Yoder JA, Hsieh CL, Zhang X, Golic KG Jacobsen SE, Bestor TH. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2. Science 2006; 311: 395-398.

77. Yoder JA, Yen RW, Vertino PM, Bestor TH, Baylin SB. New 5' regions of the murine and human genes for DNA (cytosine-5)-methyltransferase. J Biol Chem 1996; 271: 3109231097.

78. Song J, Rechkoblit O, Bestor TH, Patel DJ. Structure of DNMT1-DNA complex reveals a role for autoinhibition in maintenance DNA methylation. Science 2011; 331: 10361040.

79. Rountree MR, Bachman KE, Baylin SB. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat Genet 2000; 25: 269-277.

80. Cardoso MC, Leonhardt H. DNA methyltransferase is actively retained in the cytoplasm during early development. J Cell Biol 1999; 147: 25-32.

81. Inano K, Suetake I, Ueda T, Miyake Y, Nakamura M, Okada M, Tajima S. Maintenance-type DNA methyltransferase is highly expressed in post-mitotic neurons and localized in the cytoplasmic compartment. JBiochem 2000; 128: 315-321.

82. Schermelleh L, Haemmer A, Spada F, Rosing N, Meilinger D, Rothbauer U, Cardoso MC, Leonhardt H. Dynamics of Dnmt1 interaction with the replication machinery and its role in postreplicative maintenance of DNA methylation. Nucleic Acids Res 2007; 35: 4301-4312.

83. Schneider K, Fuchs C, Dobay A, Rottach A, Qin W, Wolf P, Alvarez-Castro JM, Nalaskowski MM, Kremmer E, Schmid V, Leonhardt H, Schermelleh L. Dissection of cell cycle-dependent dynamics of Dnmt1 by FRAP and diffusion-coupled modeling. Nucleic Acids Res 2013; 41:4860-4876.

84. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 1999; 99: 247-257.

85. Chen T, Ueda Y, Xie S, Li E. A novel Dnmt3a isoform produced from an alternative promoter localizes to euchromatin and its expression correlates with active de novo methylation. J Biol Chem 2002; 277: 38746-38754.

86. Watanabe D, Suetake I, Tada T, Tajima S. Stage- and cell-specific expression of Dnmt3a and Dnmt3b during embryogenesis. Mech Dev 2002; 118: 187-190.

87. Watanabe D, Suetake I, Tajima S, Hanaoka K. Expression of Dnmt3b in mouse hematopoietic progenitor cells and spermatogonia at specific stages. Gene Expr Patterns 2004; 5: 43-49.

88. Bourc'his D, Xu GL, Lin CS, Bollman B, Bestor TH. Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. Science 2001; 294: 2536-2539.

89. Suetake I, Shinozaki F, Miyagawa J, Takeshima H, Tajima S. DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. J Biol Chem 2004; 279:27816-27823.

90. Mayer W, Niveleau A, Walter J, Fundele R, Haaf T. Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature 2000; 403: 501-502.

91. Hajkova P, Erhardt S, Lane N, Haaf T, El-Maarri O, Reik W, Walter J, Surani MA. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells. Mech Dev 2002; 117: 15-23.

92. Lorsbach RB, Moore J, Mathew S, Raimondi SC, Mukatira ST, Downing JR. TET1, a member of a novel protein family, is fused to MLL in acute myeloid leukemia containing the t(10;11)(q22;q23). Leukemia 2003; 17: 637-641.

93. Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, Brudno Y, Agarwal S, Iyer LM, Liu DR, Aravind L, Rao A. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 2009; 324: 930-935.

94. Ito S, D'Alessio AC, Taranova OV, Hong K, Sowers LC, Zhang Y. Role of tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature 2010; 466: 1129-1133.

95. Ito S, Shen L, Dai Q, Wu SC, Collins LB, Swenberg JA, He C, Zhang Y. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science 2011; 333: 1300-1303.

96. Guo JU, Su Y, Zhong C, Ming GL, Song H. Hydroxylation of 5-methylcytosine by TET1 promotes active DNA demethylation in the adult brain. Cell 2011; 145: 423-434.

97. Drohat AC, Coey CT. Role of Base Excision "Repair" Enzymes in Erasing Epigenetic Marks from DNA. Chem Rev 2016; 116(20): 12711-12729.

98. Maiti A, Drohat AC. Thymine DNA Glycosylase Can Rapidly Excise 5-Formylcytosine and 5-Carboxylcytosine: Potential Implications for Active Demethylation of Cpg Sites. J Biol Chem 2011; 286: 35334-35338.

99. Muller U, Bauer C, Siegl M, Rottach A, Leonhardt H. TET-mediated oxidation of methylcytosine causes TDG or NEIL glycosylase dependent gene reactivation. Nucleic Acids Res 2014; 42:8592-8604.

100. He YF, Li BZ, Li Z, Liu P, Wang Y, Tang Q, Ding J, Jia Y, Chen Z, Li L, Sun Y, Li X, Dai Q, Song CX, Zhang K, He C, Xu GL. Tet-Mediated Formation of 5-Carboxylcytosine and Its Excision by Tdg in Mammalian DNA. Science 2011; 333: 1303-1307.

101. Bhutani N, Brady JJ, Damian M, Sacco A, Corbel SY, Blau HM. Reprogramming Towards Pluripotency Requires Aid-Dependent DNA Demethylation. Nature 2010; 463: 10421047.

102. Rai K, Huggins IJ, James SR, Karpf AR, Jones DA, Cairns BR. DNA Demethylation in Zebrafish Involves the Coupling of a Deaminase, a Glycosylase, and Gadd45. Cell 2008; 135: 1201-1212.

103. Eckhardt F, Lewin J, Cortese R, Rakyan VK, Attwood J, Burger M, Burton J, Cox TV, Davies R, Down TA, Haefliger C, Horton R, Howe K, Jackson DK, Kunde J, Koenig C, Liddle J, Niblett D, Otto T, Pettett R, Seemann S, Thompson C, West T, Rogers J, Olek A, Berlin K, Beck S. DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet 2006; 38:1378-1385.

104. Weber M, Davies JJ, Wittig D, Oakeley EJ, Haase M, Lam WL, Schubeler D. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet 2005; 37: 853-862.

105. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 2002; 16: 621.

106. Cooper DN, Taggart MH, Bird AP. Unmethylated domains in vertebrate DNA. Nucleic Acids Res 1983; 11: 647-658.

107. Bird A, Taggart M, Frommer M, Miller OJ, Macleod D. A fraction of the mouse genome that is derived from islands of nonmethylated, CpG-rich DNA. Cell 1985; 40: 91-99.

108. Bird AP. CpG Islands as gene markers in the Vertebrate Nucleus. TIG 1987; 3: 342347.

109. Antequera F, Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 11995-11999.

110. Ewing B, Green P. Analysis of expressed sequence tags indicates 35,000 human genes. Nat Genet 2000; 25: 232-234.

111. Larsen F, Gundersen G, Lopez R, Prydz H. CpG islands as gene markers in the human genome. Genomics 1992; 13: 1095-1107.

112. Saxonov S, Berg P, Brutlag DL. A genome-wide analysis of CpG dinucleotides in the human genome distinguishes two distinct classes of promoters. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:1412-1417.

113. Zhu J, He F, Hu S, Yu J. On the nature of human housekeeping genes. Trends Genet 2008; 24: 481-484.

114. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon K, Dewar K, Doyle M, FitzHugh W, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001; 409: 860-921.

115. Macleod D, Ali RR, Bird A. An alternative promoter in the mouse major histocompatibility complex class II I-Abeta gene: implications for the origin of CpG islands. Mol Cell Biol 1998; 18: 4433-4443.

116. Kleinjan DA, Seawright A, Childs AJ, van Heyningen V. Conserved elements in Pax6 intron 7 involved in (auto)regulation and alternative transcription. Dev Biol 2004; 265: 462-477.

117. Weber M, Hellmann I, Stadler MB, Ramos L, Paabo S, Rebhan M, Schubeler D. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet 2007; 39: 457-466.

118. Guenther MG, Levine SS, Boyer LA, Jaenisch R, Young RA. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell 2007; 130: 77-88.

119. Tazi J, Bird A. Alternative chromatin structure at CpG islands. Cell 1990; 60: 909920.

120. Prestridge DS, Burks C. The density of transcriptional elements in promoter and nonpromoter sequences. Hum Mol Genet 1993; 2: 1449-1453.

121. Bird AP. Gene number, noise reduction and biological complexity. Trends Genet 1995; 11: 94-100.

122. Antequera F. Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol Life Sci 2003; 60: 1647-1658.

123. Antequera F, Bird A. CpG islands as genomic footprints of promoters that are associated with replication origins. Curr Biol 1999; 9: R661-R667.

124. Ramsahoye BH, Biniszkiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird AP, Jaenisch R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 5237-5242.

125. Antequera F, Boyes J, Bird A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell 1990; 62: 503-514.

126. Frank D, Keshet I, Shani M, Levine A, Razin A, Cedar H. Demethylation of CpG islands in embryonic cells. Nature 1991; 351: 239-241.

127. Voo KS, Carlone DL, Jacobsen BM, Flodin A, Skalnik DG. Cloning of a mammalian transcriptional activator that binds unmethylated CpG motifs and shares a CXXC domain with

DNA methyltransferase, human trithorax, and methyl-CpG binding domain protein 1. Mol Cell Biol 2000; 20: 2108-2121.

128. Carlone DL, Hart SR, Ladd PD, Skalnik DG. Cloning and characterization of the gene encoding the mouse homologue of CpG binding protein. Gene 2002; 295: 71-77.

129. Ansari KI, Mishra BP, Mandal SS. Human CpG binding protein interacts with MLL1, MLL2 and hSet1 and regulates Hox gene expression. Biochim Biophys Acta 2008; 1779: 66-73.

130. Cuadrado M, Sacristan M, Antequera F. Species-specific organization of CpG island promoters at mammalian homologous genes. EMBO Rep 2001; 2: 586-592.

131. Brandeis M, Frank D, Keshet I, Siegfried Z, Mendelsohn M, Nemes A, Temper V, Razin A, Cedar H. Sp1 elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature 1994; 371: 435-438.

132. Macleod D, Charlton J, Mullins J, Bird AP. Sp1 sites in the mouse aprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island. Genes Dev 1994; 8: 2282-2292.

133. Daniels R, Lowell S, Bolton V, and Monk M. Transcription of tissuespecific genes in human preimplantation embryos. Hum Reprod 1997; 12: 2251-2256.

134. Antequera F, Macleod D, Bird AP. Specific protection of methylated CpGs in mammalian nuclei. Cell 1989; 58: 509-517.

135. Ooi SK, Qiu C, Bernstein E, Li K, Jia D, Yang Z, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Lin SP, Allis CD, Cheng X, Bestor TH. DNMT3L connects unmethylated lysine 4 of histone H3 to de novo methylation of DNA. Nature 2007; 448: 714-717.

136. Mikkelsen TS, Ku M, Jaffe DB, Issac B, Lieberman E, Giannoukos G, Alvarez P, Brockman W, Kim TK, Koche RP, Lee W, Mendenhall E, O'Donovan A, Presser A, Russ C, Xie X, Meissner A, Wernig M, Jaenisch R, Nusbaum C, Lander ES, Bernstein BE. Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature 2007; 448: 553-560.

137. Fouse SD, Shen Y, Pellegrini M, Cole S, Meissner A, Van Neste L, Jaenisch R, Fan G. Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with

Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell 2008; 2: 160169.

138. Reik W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature 2007; 447: 425-432.

139. Edwards CA, Ferguson-Smith AC. Mechanisms regulating imprinted genes in clusters. Curr Opin Cell Biol 2007; 19: 281-289.

140. Esteller M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone modification maps. Nat Rev Genet 2007; 8: 286-298.

141. Meissner A, Mikkelsen TS, Gu H, Wernig M, Hanna J, Sivachenko A, Zhang X, Bernstein BE, Nusbaum C, Jaffe DB, Gnirke A, Jaenisch R, Lander ES. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature 2008; 454: 766-770.

142. Shen L, Kondo Y, Guo Y, Zhang J, Zhang L, Ahmed S, Shu J, Chen X, Waterland RA, Issa JP. Genome-wide profiling of DNA methylation reveals a class of normally methylated CpG island promoters. PLoS Genet 2007; 3: 2023-2036.

143. Rauch TA, Wu X, Zhong X, Riggs AD, Pfeifer GP. A human B cell methylome at 100-base pair resolution. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 671-678.

144. Yamada Y, Watanabe H, Miura F, Soejima H, Uchiyama M, Iwasaka T, Mukai T, Sakaki Y, Ito T. A comprehensive analysis of allelic methylation status of CpG islands on human chromosome 21q. Genome Res 2004; 14: 247-266.

145. Futscher BW, Oshiro MM, Wozniak RJ, Holtan N, Hanigan CL, Duan H, Domann FE. Role for DNA methylation in the control of cell type specific maspin expression. Nat Genet 2002; 31: 175-179.

146. Schilling E, Rehli M. Global, comparative analysis of tissuespecific promoter CpG methylation. Genomics 2007; 90: 314-323.

147. Imamura T, Ohgane J, Ito S, Ogawa T, Hattori N, Tanaka S, Shiota K. CpG island of rat sphingosine kinase-1 gene: tissue-dependent DNA methylation status and multiple alternative first exons. Genomics 2001; 76: 117-125.

148. Irizarry RA, Ladd-Acosta C, Wen B, Wu Z, Montano C, Onyango P, Cui H, Gabo K, Rongione M, Webster M, Ji H, Potash J, Sabunciyan S, Feinberg AP. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nat Genet 2009; 41: 178-186.

149. Shiota K, Kogo Y, Ohgane J, Imamura T, Urano A, Nishino K, Tanaka S, Hattori N. Epigenetic marks by DNA methylation specific to stem, germ and somatic cells in mice. Genes Cells 2002; 7: 961-969.

150. Ladd-Acosta C, Pevsner J, Sabunciyan S, Yolken RH, Webster MJ, Dinkins T, Callinan PA, Fan JB, Potash JB, Feinberg AP. DNA methylation signatures within the human brain. Am J Hum Genet 2007; 81: 1304-1315.

151. De Smet C, Lurquin C, Lethe B, Martelange V, Boon T. DNA methylation is the primary silencing mechanism for a set of germ line- and tumor-specific genes with a CpG-rich promoter. Mol Cell Biol 1999; 19: 7327-7335.

152. Song F, Smith JF, Kimura MT, Morrow AD, Matsuyama T, Nagase H, Held WA. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 3336-3341.

153. Honda T, Tamura G, Waki T, Kawata S, Terashima M, Nishizuka S, Motoyama T. Demethylation of MAGE promoters during gastric cancer progression. Br J Cancer 2004; 90: 838-843.

154. Oda M, Yamagiwa A, Yamamoto S, Nakayama T, Tsumura A, Sasaki H, Nakao K, Li E, Okano M. DNA methylation regulates long-range gene silencing of an X-linked homeobox gene cluster in a lineage-specific manner. Genes Dev 2006; 20: 3382-3394.

155. Bloushtain-Qimron N, Yao J, Snyder EL, Shipitsin M, Campbell LL, Mani SA, Hu M, Chen H, Ustyansky V, Antosiewicz JE, Argani P, Halushka MK, Thomson JA, Pharoah P, Porgador A, Sukumar S, Parsons R, Richardson AL, Stampfer MR, Gelman RS, Nikolskaya T, Nikolsky Y, Polyak K. Cell type-specific DNA methylation patterns in the human breast. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 14076-14081.

156. Li E. Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nat Rev Genet 2002; 3: 662-673.

157. Espada J, Ballestar E, Fraga MF, Villar-Garea A, Juarranz A, Stockert JC, Robertson KD, Fuks F, Esteller M. Human DNA methyltransferase 1 is required for maintenance of the histone H3 modification pattern. J Biol Chem 2004; 279: 37175-37184.

158. Milutinovic S, Brown SE, Zhuang Q, Szyf M. DNA methyltransferase 1 knock down induces gene expression by a mechanism independent of DNA methylation and histone deacetylation. J Biol Chem 2004; 279: 27915-27927.

159. Hendrich B, Bird A. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins. Mol Cell Biol 1998; 18: 6538-6547.

160. Lewis JD, Meehan RR, Henzel WJ, Maurer-Fogy I, Jeppesen P, Klein F, Bird A. Purification, sequence, and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA. Cell 1992; 69: 905-914.

161. Hendrich B, Tweedie S. The methyl-CpG binding domain and the evolving role of DNA methylation in animals. Trends Genet 2003; 19: 269-277.

162. Kass SU, Pruss D, Wolffe AP. How does DNA methylation repress transcription? Trends Genet 1997; 13: 444-449.

163. Choy MK, Movassagh M, Goh HG, Bennett MR, Down TA, Foo RS. Genome-wide conserved consensus transcription factor binding motifs are hyper-methylated. BMC Genomics 2010; 11: 519.

164. Stein R, Razin A, Cedar H. In vitro methylation of the hamster adenine phosphoribosyltransferase gene inhibits its expression in mouse L cells. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79: 3418-3422.

165. Oakes CC, La Salle S, Smiraglia DJ, Robaire B, Trasler JM. A unique configuration of genome-wide DNA methylation patterns in the testis. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 228-233.

166. Illingworth RS, Bird AP. CpG islands - 'A rough guide'. FEBS Letters 2009; 583: 1713-1720.

167. Panning B, Jaenisch R. DNA hypomethylation can activate Xist expression and silence X-linked genes. Genes Dev 1996; 10: 1991-2002.

168. Sleutels F, Zwart R, Barlow DP. The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes. Nature 2002; 415: 810-813.

169. Wutz A, Smrzka OW, Schweifer N, Schellander K, Wagner EF, Barlow DP. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island. Nature 1997; 389: 745-749.

170. Mermoud JE, Popova B, Peters AH, Jenuwein T, Brockdorff N. Histone H3 lysine 9 methylation occurs rapidly at the onset of random X chromosome inactivation. Curr Biol 2002; 12: 247-251.

171. Heng HH, Goetze S, Ye CJ, Liu G, Stevens JB, Bremer SW, Wykes SM, Bode J, Krawetz SA. Chromatin loops are selectively anchored using scaffold/matrix-attachment regions. J Cell Sci 2004; 117: 999-1008.

172. Vogelstein B, Pardoll DM, Coffey DS. Supercoiled loops and eukaryotic DNA replicaton. Cell 1980; 22: 79-85.

173. Brylawski BP, Tsongalis GJ, Cordeiro-Stone M, May, WT, Comeau LD, Kaufman, DG. Association of putative origins of replication with the nuclear matrix in normal human fibroblasts. Cancer Res 1993; 53: 3865-3868.

174. Dijkwel PA, Hamlin JL. Matrix attachment regions are positioned near replication initiation sites, genes, and an interamplicon junction in the amplified dihydrofolate reductase domain of Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol 1988; 8: 5398-5409.

175. Jenke BH, Fetzer CP, Stehle IM, Jonsson F, Fackelmayer FO, Conradt H, Bode J, Lipps HJ. An episomally replicating vector binds to the nuclear matrix protein SAF-A in vivo. EMBO Rep 2002; 3: 349-354.

176. Bode J, Benham C, Knopp A, Mielke C. Transcriptional augmentation: modulation of gene expression by scaffold/matrix-attached regions (S/MAR elements). Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2000; 10: 73-90.

177. Phi-Van L, von Kries JP, Ostertag W, Stratling, WH. The chicken lysozyme 5' matrix attachment region increases transcription from a heterologous promoter in heterologous cells and dampens position effects on the expression of transfected genes. Mol Cell Biol 1990; 10: 23022307.

178. Zahn-Zabal M, Kobr M, Girod PA, Imhof M, Chatellard P, de Jesus M, Wurm F, Mermod N. Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions. J Biotechnol 2001; 87: 29-42.

179. McKnight RA, Shamay A, Sankaran L, Wall RJ, Hennighausen L. Matrixattachment regions can impart position-independent regulation of a tissue-specific gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 6943-6947.

180. Schaarschmidt D, Baltin J, Stehle IM, Lipps HJ, Knippers R. An episomal mammalian replicon: sequence-independent binding of the origin recognition complex. EMBO J 2004; 23: 191-201.

181. Piechaczek C, Fetzer C, Baiker A, Bode J, Lipps HJ. A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res 1999; 27: 426-428.

182. Stehle IM, Scinteie MF, Baiker A, Jenke AC, Lipps HJ. Exploiting a minimal system to study the epigenetic control of DNA replication: the interplay between transcription and replication. Chromosome Res 2003; 11: 413-421.

183. Stehle IM, Postberg J, Rupprecht S, Cremer T, Jackson DA, Lipps HJ. Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicons. BMC Cell Biol 2007; 8: 33.

184. Baiker A, Maercker C, Piechaczek C, Schmidt SB, Bode J, Benham C, Lipps HJ. Mitotic stability of an episomal vector containing a human scaffold/matrixattached region is provided by association with nuclear matrix. Nat Cell Biol 2000; 2: 182-184.

185. Manzini S, Vargiolu A, Stehle IM, Bacci ML, Cerrito MG, Giovannoni R, Zannoni A, Bianco MR, Forni M, Donini P, Papa M, Lipps HJ, Lavitrano M. Genetically modified pigs produced with a nonviral episomal vector. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 17672-17677.

186. Maelandsmo GM, Ross PJ, Pavliv M, Meulenbroek RA, Evelegh C, Muruve DA, Graham FL, Parks RJ. Use of a murine secreted alkaline phosphatase as a non-immunogenic reporter gene in mice. J Gene Med 2005; 7:307-315.

187. Akef A, Zhang H, Masuda S, Palazzo AF. Trafficking of mRNAs containing ALREX-promoting elements through nuclear speckles. Nucleus. 2013 Jul-Aug; 4: 326-340.

188. Brueckner B, Garcia Boy R, Siedlecki P, Musch T, Kliem HC, Zielenkiewicz P, Suhai S, Wiessler M, Lyko F. Epigenetic Reactivation of Tumor Suppressor Genes by a Novel Small-Molecule Inhibitor of Human DNA Methyltransferases. Cancer Res 2005; 65: 6305-6311.

189. Gra9a I, Sousa EJ, Baptista T, Almeida M, Ramalho-Carvalho J, Palmeira C, Henrique R, Jerónimo C. Anti-tumoral effect of the non-nucleoside DNMT inhibitor RG108 in human prostate cancer cells. Curr Pharm Des 2014; 20: 1803-1811.

190. Thaler R, Spitzer S, Karlic H, Klaushofer K, Varga F. DMSO is a strong inducer of DNA hydroxymethylation in pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells. Epigenetics 2012; 7: 635-651.

191. Radhakrishnan P, Basma H, Klinkebiel D, Christman J, Cheng PW. Cell Type-Specific Activation of the Cytomegalovirus Promoter by Dimethylsulfoxide and 5-Aza-2'-deoxycytidine. Int J Biochem Cell Biol 2008; 40: 1944-1955.

192. Bauer AP, Leikam D, Krinner S, Notka F, Ludwig C, Längst G, Wagner R. The impact of intragenic CpG content on gene expression. Nucleic Acids Res 2010; 38: 3891-3908.

193. Kosovac D, Wild J, Ludwig C, Meissner S, Bauer AP, Wagner R. Minimal doses of a sequence-optimized transgene mediate high-level and long-term EPO expression in vivo: challenging CpG-free gene design. Gene Ther 2011; 18: 189-198.

194. Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, Sauna ZE, Calcagno AM, Ambudkar SV, Gottesman MM. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science 2007; 315: 525-528.

195. Chamary JV, Parmley JL, Hurst LD. Hearing silence: non-neutral evolution at synonymous sites in mammals. Nat Rev Genet 2006; 7: 98-108.

196. Pinney SE. Mammalian Non-CpG Methylation: Stem Cells and Beyond. Biology (Basel) 2014; 3: 739-751.

197. Patil V, Ward RL, Hesson LB. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics 2014; 9: 823-828.

198. Butcher LM, Ito M, Brimpari M, Morris TJ, Soares FA, Ährlund-Richter L, Carey N, Vallier L, Ferguson-Smith AC, Beck S. Non-CG DNA methylation is a biomarker for assessing endodermal differentiation capacity in pluripotent stem cells. Nat Commun 2016; 7: 10458.

199. Madeira C, Rodrigues CA, Reis MS, Ferreira FF, Correia RE, Diogo MM, Cabral JM. Nonviral gene delivery to neural stem cells with minicircles by microporation. Biomacromolecules 2013; 14: 1379-1387.

200. Elsler S, Schetting S, Schmitt G, Kohn D, Madry H, Cucchiarini M. Effective, safe nonviral gene transfer to preserve the chondrogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. J Gene Med 2012; 14: 501-511.

201. Hoare M, Greiser U, Schu S, Mashayekhi K, Aydogan E, Murphy M, Barry F, Ritter T, O'Brien T. Enhanced lipoplex-mediated gene expression in mesenchymal stem cells using reiterated nuclear localization sequence peptides. J Gene Med 2010; 12: 207-218.

202. Hoelters J, Ciccarella M, Drechsel M, Geissler C, Gülkan H, Böcker W, Schieker M, Jochum M, Neth P. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. J Gene Med 2005; 7: 718-728.

203. Madeira C, Mendes RD, Ribeiro SC, Boura JS, Aires-Barros MR, da Silva CL, Cabral JM. Nonviral Gene Delivery to Mesenchymal Stem Cells Using Cationic Liposomes for Gene and Cell Therapy. JBiomedBiotechnol 2010; 2010: 735349.

204. Helledie T, Nurcombe V, Cool SM. A Simple and Reliable Electroporation Method for Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev 2008; 17: 837-848.

205. Verkhusha VV, Kuznetsova IM, Stepanenko OV, Zaraisky AG, Shavlovsky MM, Turoverov KK, Uversky VN. High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. Biochemistry 2003; 42: 7879-7884.

206. Darquet AM, Rangara R, Kreiss P, Schwartz B, Naimi S, Delaere P, Crouzet J, Scherman D. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther 1999; 6: 209-218.

207. Kameda T, Smuga-Otto K, Thomson JA. A severe de novo methylation of episomal vectors by human ES cells. Biochem Biophys Res Commun 2006; 349: 1269-1277.

208. Jenke AC, Eisenberger T, Baiker A, Stehle IM, Wirth S, Lipps HJ. The Nonviral Episomal Replicating Vector pEPI-1 Allows Long-Term Inhibition of bcr-abl Expression by shRNA. Hum Gene Ther 2005; 16: 533-539.

209. Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immunol 2001; 2: 675-680.

210. Bauer S, Kirschning CJ, Hacker H, Redecke V, Hausmann S, Akira S, Wagner H, Lipford GB. Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 9237-9242.

211. Goetze S, Baer A, Winkelmann S, Nehlsen K, Seibler J, Maass K, Bode J. Performance of genomic bordering elements at predefined genomic loci. Mol Cell Biol 2005; 25: 2260-2272.