Включение антигенов и ДНК в биосовместимые полимерные микросферы для применения в биомедицине тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Селина, Оксана Евгеньевна

• Селина, Оксана Евгеньевна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Селина, Оксана Евгеньевна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Способы удаления антиуглеводных антител.

1.1.1. Лекарственная терапия.

1.1.2. Инфузия анти-aGal антител.

1.1.3. Экстракорпоральная терапия.

1.1.4. Поиск новых аффинных сорбентов.

1.2. Способы доставки ДНК в клетку для разработки ДНК-вакцин.

1.2.1. Электропорация.

1.2.2. Введение ДНК с помощью микроинъекции.

1.2.3. Метод "генной пушки".

1.2.4. Введение нативной ДНК с помощью прямых инъекций.

1.2.5. Введение ДНК с помощью различных транспортных систем.

1.2.5.1. Вирусные векторы.

1.2.5.2. Белковые и пептидные векторы.

1.2.5.3. Введение ДНК с использованием липосом.

1.2.5.4. Введение ДНК, включенной в полимерных микрочастицы и микрокапсулы.

1.3.Капсулировани е.

1.3.1. Микрокапсулы.

1.3.2. Полимерные носители.

1.3.2.1. Природные полисахариды.

1.3.3. Методы микрокапсулирования.

1.3.3.1. Химические методы микрокапсулирования.

1.3.3.2. Физические методы микрокапсулирования.

1.3.3.3. Физико-механические методы микрокапсулирования.

1.3.4. Полиэлекролитные микрокапсулы.

1.3.4.1. Метод послойной адсорбции полиэлектролитов.

1.3.4.2. Получение микрокапсул с помощью гелеобразования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Включение антигенов и ДНК в биосовместимые полимерные микросферы для применения в биомедицине»

Включение различных биоактивных макромолекул (белков, ДНК, олигонуклеотидов и др.) в биосовместимые полимерные матрицы (в нано- и микрочастицы, нано- и микрокапсулы) является одним из перспективных направлений биотехнологии и биомедицины. Спектр областей применения таких носителей постоянно расширяется и включает в себя разработку новых эффективных систем доставки лекарств с их контролируемым высвобождением, новых методов диагностики рака и других заболеваний, новых способов доставки в клетки ДНК для разработки вакцин, соматической генной терапии и др. [1]. В данной работе рассматриваются две области возможного применения иммобилизованных в биосовместимые полиэлектролитные (ПЭ) микросферы макромолекул - синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК:

• создание новых биосовместимых иммуносорбентов (на основе микрокапсул и микрочастиц размером 700-900 мкм);

• разработка новых ДНК-вакцин с использованием инкапсулированных плазмидных ДНК (размер микрокапсул 1-3 мкм).

Стоит особо отметить, что, несмотря на разные области применения микросфер, задача иммобилизации (включения) биоактивных молекул решается с использованием одних и тех же подходов и биоматериалов.

Создание новых иммуносорбентов является перспективным подходом для решения ряда медицинских проблем, связанных с заболеваниями и осложнениями, провоцируемых антиуглеводными антителами [2-4]. Существуют различные специфические и неспецифические способы решения проблемы удаления из крови патологических антител [5]. К последним относится гемодиализ, при проведение которого вместе с патологическими антителами из крови тотально удаляются все белки. Недостатком этого подхода, кроме потери пациентом важнейших для его здоровья белков, также является высокая стоимость метода.

Среди прочих способов удаления из крови патологических антител особое внимание уделяется специфической сорбции антител на соответствующем сорбенте, представляющем собой антиген, ковалентно пришитый к твердой фазе (сефарозе, агарозе, силикагелю). Применение таких сорбентов требует предварительной процедуры разделения крови на плазму и клетки крови (плазмаферез), во избежание контакта клеток крови с сорбентом, а затем пропускание плазмы через сорбент (плазмосорбция) с последующим возвращением клеток и плазмы в кровоток. Такая необходимость обусловлена тем, что при пропускании через колонку с сорбентом цельной крови, взаимодействие частиц сорбента, с клетками, сопоставимыми с ними по размерам, приводит к повреждению тромбоцитов, эритроцитов и других клеток крови. Существенным недостатком такого подхода являются еще и потери в объеме крови, что требует заместительной терапии. Поэтому более привлекательным представляется метод удаления патогенных антител непосредственно из цельной крови (гемосорбция). При этом особую значимость приобретает задача создания биосовместимой полимерной матрицы (носителя антигена), которая бы позволила сохранить сорбционную емкость традиционных сорбентов или даже увеличить ее и при этом не травмировать клетки крови за счет применения частиц большего размера.

Разработка новых методов доставки ДНК в клетки является одним из актуальных направлений в биотехнологии и основной предпосылкой для создания новых ДНК-вакцин. Для разработки эффективных вакцин требуется доставка белков антигена в цитоплазму антигенпредставляющих клеток (АПК), к которым относятся дендритные клетки (ДК), а также макрофаги и моноциты. В этом случае АПК способны индуцировать не только гуморальный иммунный ответ, то есть продукцию антител, но и цитотоксический клеточный ответ, необходимый для элиминации зараженных патогеном клеток организма.

Идея конструирования ДНК-вакцины основана на том, что определенный ген или участок генома патогена встраивается в бактериальные или вирусные 8 векторы. Созданная таким образом ДНК-вакцина потенциально способна индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ [6]. Если рассматривать существующие способы введения ДНК в клетки, то большинство из них применимо только в условиях in vitro, например, метод электропорации и метод "генной пушки". В условиях in vivo пригодными остаются только липид-опосредованное введение ДНК и иммунизация нативной ДНК. Эффективность таких методов остается крайне невысокой, так как количество введенной ДНК, попадающее в АПК клетки, оказывается слишком низким для индукции иммунного ответа. Микрокапсулирование ДНК позволяет не только защитить ДНК от быстрого разрушения в организме нуклеазами, но также обеспечить адресную доставку и взаимодействие с клеточными рецепторами. Как правило, для микрокапсулирования ДНК используют метод распылительной сушки и метод двойной эмульсии (вода/масло/вода). Эффективность включения ДНК последним методом обычно не превышает 30-50%. Метод распылительной сушки более эффективен, однако, использование органических растворителей (например, дихлорметана, диметилсульфоксида), а также различных ПАВ может снижать биологическую активность инкапсулированных биоактивных молекул. Кроме этого метод распылительной сушки требует наличия специального дорогостоящего оборудования. Поэтому актуальной задачей является разработка новых простых и универсальных методов включения ДНК в микрокапсулы для ее доставки в клетки в условиях in vivo.

Целью настоящей работы являлось включение синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК, кодирующих белок-антиген, в биосовместимые полимерные микросферы на основе природных полисахаридов; исследование свойств полученных микросфер и возможности их применения в биомедицине для создания новых биосовместимых иммуносорбентов и ДНК-вакцин.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: 1. Выбрать биодеградируемые полиэлектролиты для получения микросфер.

2. Разработать и оптимизировать методы включения синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК в полиэлектролитные микросферы (микрочастицы и микрокапсулы) различного композиционного состава.

3. Исследовать способность полученных микросфер с включенными антигенами сорбировать антиуглеводные антитела.

4. Сравнить сорбционные свойства полученных микросфер и сефарозы.

5. Изучить гемосовместимость матрицы-носителя антигена на примере пустых полиэлектролитных микросфер различного композиционного состава.

6. Изучить эффективность доставки в клетки микрокапсулированной вирусной ДНК в условиях in vitro и in vivo.

7. Исследовать в модели in vivo индукцию антител на введение микрокапсулированных плазмидных ДНК двух типов, изучить влияние различного композиционного состава микросфер на иммунный ответ.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Селина, Оксана Евгеньевна

Выводы

1. Предложены и оптимизированы метод экструзии для включения антигенов (синтетических гликоконъюгатов, содержащих олигосахариды Atri и Bdi) и метод послойной адсорбции полиэлектролитов для включения плазмидных ДНК (плазмиды pTKShi и plnfNP) в полиэлектролитные микрокапсулы различного размера и полимерного состава.

2. Методом экструзии получены АЛГ/ХИТ микросферы со средним размером 900 мкм (микрочастицы и микрокапсулы, покрытые полупроницаемой полиэлектролитной мембраной), с включенными в них гликоконъюгатами Atri-РАА и Bdi-PAA. Показано, что разработанный метод позволяет включать не менее 45% гликоконъюгатов в микрочастицы и не менее 25% в микрокапсулы.

3. Изучена способность АЛГ/ХИТ микросфер, содержащих синтетические антигены (гликоконъюгаты), специфически связывать IgG и IgM антитела. Показано, что полученные носители по сорбционной емкости не уступают традиционному сорбенту - сефарозе, модифицированной теми же олигосахаридами.

4. Комплексное исследование гемосовместимости полученных микросфер (на основе альгината натрия, хитозана, ДЭАЭ-декстрана и четвертичного аммониевого основания хитозана) показало, что они не вызывают повреждений тромбоцитов и эритроцитов и не активируют систему комплемента.

5. Методом послойной адсорбции полиэлектролитов получены мультислойные биодеградируемые микрокапсулы различного полимерного состава (со средним диаметром 1 -3 мкм) с включенными в них плазмидными ДНК (плазмида pTKShi и plnfNP) и вирусной ДНК (вирус болезни Ауески). Показано, что эффективность включения ДНК в микрокапсулы составляет более 90 %.

6. На примере вируса болезни Ауески показана эффективность доставки ДНК, включенной в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы, в модели in vitro (культура клеток почки сибирского горного козерога ПСГК - 60) и в модели in vivo (на мышах и кроликах).

7. Показано, что введение мышам (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсул с включенными плазмидными ДНК (плазмида pTKShi или плазмида plnfNP) индуцировало иммунный ответ. При этом оптимальная доза плазмидной ДНК для иммунизации мышей составила 20 мкг на особь.

8. Исследована зависимость индукции антител у мышей в ответ на введение микрокапсулированной плазмиды pTKShi от полимерного состава микрокапсул. Самые высокие титры антител сыворотки крови были получены при иммунизации микрокапсулами (ХИТ-2М/КАР)з и (ДЭАЭ-декстран/КАР)3 и были в 3-4 раза выше, чем в случае иммунизации нативной плазмидой pTKShi или плазмидой pTKShi, включенной в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы.

Благодарности

Автор выражает благодарность проф. Бартковиаку А. (Западнопомеранский университет, г. Щецин, Польша) за предоставленную возможность выполнения части экспериментальной работы в его лаборатории, проф. Кристиану Грандфису (Университет г. Льеж, Бельгия) за помощь в проведении исследования гемосовместимости образцов микрокапсул, проф. Г. Сухорукову (университет Королевы Марии, Лондон) за сотрудничество и помощь в освоении метода послойной адсорбции электролитов, д.х.н. Балышевой В.И и аспиранту Белову С. (ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г. Покров) за помощь в проведении иммунологических исследований, проф. Бовину Н.В., м.н.с. Чинареву А.А. и м.н.с. Обуховой П.С. (ИБХ РАН, г. Москва) за предоставление гликоконъюгатов, плодотворное сотрудничество и постоянную помощь в обсуждении результатов работы, (ИБХ РАН, г. Москва), также руководителю диссертанционной работы д.х.н. Марквичевой Е.А. за постоянную поддержку и помощь.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Селина, Оксана Евгеньевна, 2009 год

1. Markvicheva Е. Bioencapsulation in polmer micro- and nanocarriers and applications in biomedical fields, In: Finely dispersed particles: micro-, nano-, and atto-engineering (Eds. Spasic A., Hsu J-P.) New-York: Marcel Dekker Inc., 2005. -P.853-868.

2. Galili U. Immune response, accommodation, and tolerance to transplantation carbohydrate antigens // Transplantation. 2004. - V.78. - P. 1093-1098.

3. Hughes R.A.C. Pathogenesis of Guillain-Barre syndrome / Hughes R.A.C., Hadden R.D.M., Gregson N.A., Smith K.J. // Journal of Neuroimmunology. 1999. - V.100. -P.74-97.

4. Лопаткин H.A., Лопухин Ю.М. Эфферентные методы в медицине. М.: Медицина, 1989.-352с.

5. Encke J. Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural protein of the hepatitis С virus in murine model / Encke J., Putlitz J., Geissler M. //Journal of Immunology. 1998. - V.161. - P.4917-4923.

6. Неотложная медицинская помощь / Под ред. Тинтиналли Дж.Э., Кроума Р.Л., Руиза Э. -М.: Медицина, 2001. 1016 с.

7. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.:Мир, 2000. - 529 с.

8. Малая медицинская энциклопедия / Под ред. Покровского В.И. М.: Медицина, 1996. - Т.4. - С.576.

9. Пирадов M.A. Синдром Гийена-Барре. M.: Интермедика, 2003. - 240 с.

10. Неврология / Под ред. Самуэльса М. М.: Практика, 1997. - 640 с.

11. Romano E.L. Neutralization of ABO blood group antibodies by specific oligosaccharides / Romano E.L., Soyano A., Linares J., Lauzon G.J. // Transplantation Proceedings. 1987. - V.19. - P.4426.

12. Neethling F.A. Delay of antibody-mediated rejection of pig heart transplants in baboons by continuos intravenous infusion with a-galactosyl oligosaccharide /

13. Neethling F.A., Simon P. M., Zopf D., Cooper D.K.C. // The Journal of Heart and Lung Transplantation. 1997. - V. 16. - P.59.

14. Koren E. Monoclonal anti-idiotypic antibodies neutralize cytotoxic effects of anti-aGal antibodies / Koren E., Milotec F., Neethling F.A., Koscec M., Fei D., Kobayashi Т., Taniguchi S., Cooper D.K.C. // Transplantation. 1996. - V.62. -P.837.

15. Abel J.J. On the removal of diffusible substances from the circulating blood living animals by dialysis / Abel J.J., Rowntree L.G., Turner B.B. // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1913-1914. - V.5 - P.275.

16. Abel J.J. Plasma removal with return of corpuscles (plasmapheresis) / Abel J.J., Rowntree L.G., Turner B.B. // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1913-1914. - Vol.5 -P.625.

17. Кирковский B.B., Мерзляков A.E., Ровдо И.М., Лабань Ф.Н. и др. Экстра- и интракорпоральные методы коррекции гомеостаза в клинической практике. Методические рекомендации. Минск, 1999. - 32 с.

18. М. Schneider. Plasmapheresis and immunoadsorption: Different techniq ies and their current role in medical therapy // Kidney International. Supplement. 1998. - V.64. -P.61-65

19. Chang T.M.S. Artificial Cells: Biotechnology, Nanomedicine, Regenerative Medicine, Blood Substitutes, Bioencapsulation, and Cell/Stem Cell Therapy. New Jersey: World Scientific, 2007. - 455 p.

20. Лопухин Ю.М., Молоденков M.H. Гемосорбция. М.: Медицина, 1978. - 288 с.

21. Костюченко А.Л. Эфферентная терапия. СПб.: ИКФ "Фолиант", 2000. - 432 с.

22. Chang T.M.S . Blood compatible coating of synthetic immunoadsorbents. Trans Am Soc Artif Intern Organs 1980, 26:546-549

23. Kupin W.L. Removal of lymphocytotoxic antibodies by pretransplant immunoadsorption therapy in highly sensitized renal transplant recipients / Kupin W.1., Venka К. К., Hayashi H., Mozes M.F., OH H.K.,Watt R. // Transplantation. -1991. V.51. - P.324-329.

24. Rieben R. Xenotransplantation: in vitro analysis of synthetic a-galactosyl inhibitors of human anti-Gala l—>3 Gal IgM and IgG antibodies / Rieben R., Bovin N.V., ICorchagina E.Y., Oriol. R. // Glycobiology. 2000. - V. 10. - P. 141-148.

25. WO 9842750. Antigenic fusionprotein carrying Galal,3Gal epitopes / Holgersson J. 1999.

26. Дин П., Джонсон У., Мидл Ф. Аффинная хроматография. Методы. М.: Мир, 1988.-278 с.

27. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука, 1998. - 281 с.

28. М.И. Штильман. Полимеры медико-биологического назначения. М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 400 с.

29. Peppas N.A., Moyniham H.J. Structure and Physical Properties of Poly(2-Hydroxyethyl Methacrylate) Hydrogels, In: Hydrogels in Medicine and Pharmacy (Ed. Peppas N.A.). Boca Raton, Florida: CRC Press, 1987. - V.3. - P.49-64.

30. Mack E.J., Okano Т., Kim Sung Wan. In: Hydrogels in Medicine and Pharmacy (Ed. Peppas N.A.). Boca Raton, Florida: CRC Press, 1987. - V.3. - P.65-93.

31. Alarcon J.B. DNA vaccines: technology and application as anti-parasite and antimicrobial agents / Alarcon J.B., Waine G.W., McManus D.P. // Advances in Parasitology. 1999. - V.42. - P.343-410.

32. Вакцинопрофилактика. Справочник для врачей / Под ред. В.К. Таточенко, Н.А. Озерецковского. -М.: Арико, 1994. 184 с.

33. Гендон Ю.З. Молекулярная генетика вирусов человека и животных. М.: Наука, 1975.-303 с.

34. Медуницын Н.В. Побочное действие вакцин // Иммунология. 1995. - №2. - С. 6-8.

35. Ulmer J.B. Vaccine manufacturing: challenges and solutions / Ulmer J.B., Valley U., Rappuoli R. // Nature Biotechnology. 2006. - V.24. - P. 1377-1383.

36. Robinson H.L. DNA vaccines for viral infections: basic studies and applications / Robinson H.L., Pertmer T.M. // Advances In Virus Research.- 2000.- V.55 P. 1-74.

37. Tang D. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response / Tang D., Devit M., Johnston S.A. // Nature. 1992. - V.356. - P. 152-154.

38. Stiive O. DNA Plasmid Vaccination for Multiple Sclerosis / Sttive O., Eagar T.N., Frohman E.M., Cravens P.D. // Archives of Neurology. 2007. - V.64. - P.1385-1386.

39. Birnboim H.C. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA / Birnboim H.C., Doly J. // Nucleic Acids Research. 1979. - V.7. -P.1513-1523.

40. Birnboim, H.C. A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA // Methods in Enzymology. 1983. - V. 100. - P.243-255.

41. Paster W. In vivo plasmid DNA electroporation generates exceptionally high levels of epitope-specific CD8+ T-cell responses / Paster W., Zehetner M., Kalat M., Schuller S., Schweighoffer T. // Gene Therapy. 2003. - V.10. - P.717-724.

42. Weaver J.C. Theory of electroporation: A review Weaver J.C., Chizmadzhev Y. // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1996. - V.41. - P.135-160.

43. Chang D.C. Changes in membrane structure induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron microscopy // Chang D.C., Reese T.S. // Biophysical Journal.-1990.-V.58.-P.1-12.

44. Weaver J.C. Electroporation— a general phenomenon for manipulating cells and tissues//Journal of cellular biochemistry. 1993.-V.51. P.426-435.

45. Томилин H.B., Глебов O.K. Генетическая трансформация клеток млекопитающих. Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л.: Наука, 1986. — С.62-82.

46. Анализ генома. Методы / Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. - 246 с.

47. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1-3. — М.: Мир, 1994/

48. Weiner D.B. Genetic vaccines / Weiner D.B., Kennedy R.C. // Scientific American. 1999. - V.281(l). -P.34-41.

49. Wolff J.A. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo / Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner P.L. // Science. 1990. -V. 247. - P.1465-1468.

50. Mahato R.I., Takakura Y., Hashida M. Development of targeted delivery systems for nucleic acid drugs // Journal of Drug Targeting. 1997. - V.4(6). - P.337-357.

51. Lasic D.D. Liposomes: From Physics to Applications. NewYork: Elsevier Science Publishers, 1993.-555 p.

52. Saltzman W. M., Hong Shen, Brandsma J. L. DNA Vaccines, Second Edition. Methods and Protocols. Humana Press, 2006. - 384 p.

53. Grandfils C. Optimisation of poly(2-(dimethamino)ehtyl-methacrylate)-co-(ethylenglycol)/DNA complexes designed for cell transfection / Grandfils C., Emonds-Alt J. // Minerva Biotechnology. 2005. - P.237-243.

54. Perrie Y. Liposome-entrapped plasmid DNA: characterisation studies / Perrie Y, Gregoriadis G. // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. - V. 1475(2). - P. 125-32.

55. Perrie Y. Liposome (Lipodine)-mediated DNA vaccination by the oral route / Perrie Y, Obrenovic M, McCarthy D, Gregoriadis G. // Journal of Liposome Research. -2002. V.12(l-2). - P.185-97.

56. Curiel D.T. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery / Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., Cotten M. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1991. - V.88. - P.8850-8854.

57. Han J.S. A Method of Limited Replication for the Efficient In Vivo Delivery of Adenovirus to Cancer Cells / Han J.S., Qian D., Wicha M.S., Clarke M.F. // Human Gene Therapy. 1998. - V.9(8). - P. 1209-1216.

58. Hunter E. Retrovirus envelope glycoproteins / Hunter E., Swanstrom R. // Current Topics in Microbiology and Immunology. 1990. - V.157. - P. 187-253.

59. Vile R.G. Retroviruses as vectors / Vile R.G., Russell S.J. // British Medical Bulletin. 1995. - V.51. - P. 12-30.

60. Kremer E.J. Adenovirus and adeno-associated virus mediated gene transfer / Kremer E.J., Perricaudet M. // British Medical Bulletin. 1995. - V.51. P.31-44.

61. Glorioso J.C. Development and application, of herpes simplex virus vectors for human gene therapy / Glorioso J.C., DeLuca N.A., Fink D.J. // Annual Review of Microbiology. 1995. - V.49. -P.675-710.

62. Yeh P. Advances in adenoviral vectors: from genetic engineering to their biology / Yeh P., Perricaudet M. // Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology 1997. -V.l 1. -P.615-623.

63. Fominaya J. Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein. Novel non-viral gene delivery system / Fominaya J., Wels W. // Journal of Biological Chemistry. 1996. -V.271. - P. 10560-10568.

64. Findeis M.A. Ligand-based carrier systems for delivery of DNA to hepatocytes / Findeis M.A., Wu C.H., Wu G.Y. // Methods in Enzymology. 1994. - V.247. -P.341-351.

65. Moos T. Restricted transport of anti-transferrin receptor antibody (OX26) through the blood-brain barrier in the rat / Moos Т., Morgan E.H. // Journal of Neurochemistry. 2001. - V.79. - P. 119-129

66. Cheng P.-W. Lectin conjugate-directed gene transfer to airway epithelial cells / Cheng P.-W., Yin W. // Biochemical and Biophysical Research Communications. -1994. V.205. - P826-833.

67. Fisher K.J. The transmembrane domain of diphtheria toxin improves molecular conjugate gene transfer Fisher K.J., Wilson J.M. // Biochemical Journal. 1997. V.321. -P.49-58.

68. Morris M.C. A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier / Morris M.C., Chaloin Mery, J., Heitz F., Divita G. // Nucleic Acids Research. 1999. - V.27. P.3510-3517.

69. Budker V.G. Cell membranes as barriers for antisense constructions / Budker V.G., Knorre D.G., Vlassov V.V. // Antisense Research and Development. 1992. - V.2. -P.177-184.

70. Kaneda Y. Prevention of restenosis by gene therapy / Kaneda Y., Morishita R., Dzau V.J. //Annals of the New York Academy of Science. 1997. V.811. - P.299-308.

71. Jilek S. Composition and Surface Charge of DNA-Loaded Microparticles Determine Maturation and Cytokine Secretion in Human Dendritic Cells / Jilek S., Ulrich M., Merkle H.P., Walter E. // Pharmaceutical research. 2004. - V.21,№7. -P. 12401247.

72. Mok H. Direct plasmid DNA encapsulation within PLGA nanospheres by single oil-in-water emulsion method / Мок H, Park TG. // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008. - V.68(l). - P. 105-111.

73. Atuah K.N. Encapsulation of plasmid DNA in PLGA-stearylamine microspheres: a comparison of solvent evaporation and spray-drying methods / Atuah K.N., Walter E. Merkle H.P., Alpar H.O. // Journal of microencapsulation. 2003. - V.20, №3. -P387-399.

74. US Patent 2730456. / Schleicher L., Green B.K., 1956.

75. Seiller M., Martini M.-C., Benita S. Cosmetic applications of vesicular delivery systems, In: Microencapsulation, Methods and Industrial Applications (Ed. Benita S.). New York: Marcel Dekker Inc., 1996- Chap. 18. - P587-632.

76. Functional Coatings by Polymer Microencapsulation / Edited by Ghosh S.K. -Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co, 2006. 357 p.

77. Dutta, P.K. Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications / Dutta, P.K., Dutta, J., Tripathi, V.S. // Journal of Scientific and Industrial Research. 2004. - V.63. P.20-31.

78. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. -М.: Наука, 2002. 368 с.

79. Марквичева Е.А. Хитозан и его производные в биокапсулировании, Глава 6, В кн: Хитин и хитозан: получение, свойства и применение (Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.). М: Наука, 2002. - С.315-326.

80. Nigalaye A.G. Investigation of prolonged drug release from matrix formulations of chitosan / Nigalaye A.G., Adusumilli P., Bolton A. // Drug Development and Industrial Pharmacy. 1990. - V.16. -P.449-67.

81. Chandy T. Chitosan matrix for oral sustained delivery of ampicillin / Chandy Т., Sharma C.P. // Biomaterials. 1993. - V14. -P.939-44.

82. Shu X.Z. A novel approach to prepare tripolyphosphate/chitosan complex beads for controlled release drug delivery / Shu X.Z., Zhu K.J. // International Journal of Pharmaceutics. 2000. - V.201. - P.51-8.

83. Марквичева Е.А. Культивирование клеток-продуцентов эндостатина в микрокапсулах на основе природных полисахаридов / Марквичева Е.А., Купцова С.В., Яровинский Ф.О., Суровой А.Ю. // Цитология. Т.43(9). -С.876-877.

84. Chang P.L. The in vivo delivery of heterologous proteins by microencapsulated recombinant cells / Chang P.L., Van Raamsdonk J.M., Hortelano G., Barsoum S.C., MacDonald N.C., Stockle T.L. // Trends in Biotechnology. 1999. - V. 2. - P. 7883.

85. Draget K.I. Alginate based new materials /Draget K.I., Skjak-Braek G., Smidsrod O. // International Journal of Biological Macromolecules- 1997 V.21. - P.47-55.

86. Glicklis R. Hepatocyte behavior within three-dimensional porous alginate scaffolds / Glicklis R., Shapiro L., Agbaria R., Merchuk J.C., Cohen S. // Biotechnology & Bioengineering. 2000. - V.67. - P.344-353.

87. Smidsrod O. Alginate as immobilization matrix for cells/ Smidsrod O., Skja'k-Вггек S. // Trends in Biotechnology. 1990. - V.8. - P.71-78.

88. Poncelet D., Markvicheva E. Microencapsuation and alginate. In: Microencapsulation of Food Ingredients (Ed. Per Vilstrup). London: Leatherhead Publishing Food RA, 2001. - P.215-223.

89. Draet K.I. Alginic acid gels-the effect of alginate chemical-composition and molecular weight/ Draet K.I., Brae G.S., Smidsrod O. // Carbohydrate Polymers. -1994.-V.25.-P.31-38.

90. Seo S.-J. Alginate microcapsules prepared with xyloglucan as a synthetic extracellular matrix for hepatocyte attachment // Seo S.-J., Akaike Т., Choi Y.-J., Shirakawa. M., Kang I.-K., Cho C.-S. // Biomaterials.- 2005.- V.26. P.3607-3615.

91. Madziva H. Alginate-pectin microcapsules as a potential for folic acid delivery in foods / Madziva H., Kailasapathy K., Phillips M. // Journal of Microencapsulation. -2005. V.22(4). - P.343-51.

92. Kulseng B. Transplantation of alginate microcapsules / Kulseng В., Skjak-Brask G., Ryan L., Andersson A., King A., Faxvaag A., Espevik T. // Transplantation. -1999.-V.67.-P.978-984.

93. George M. pH sensitive alginate-guar gum hydrogel for the controlled delivery of protein drugs / George M., Abraham Т.Е. // International Journal of Pharmaceutics. — 2007. V.335. -P.123-129.

94. Rastogi R. Alginate microspheres of isoniazid for oral sustained drug delivery / Rastogi R., Sultana Y., Aqil M., AH A., Kumar S., Chuttani K., Mishra A.K. // International Journal of Pharmaceutics. 2007. - V.334. - P.71-77.

95. Greer C.W. Enzymatic analysis of carrageenans: Structure of carrageenan from Eucheuma nudum / Greer C.W., Yaphe W. // Hydrobiologia. 1984. - V.116-117(1).-P.563-567.

96. Villanueva R.D. Fine chemical structure of carrageenan from the commercially cultivated kappaphycus striatum (sacol variety) (solieriaceae, gigartinales, rhodophyta) / Villanueva R.D., Montano M.N.E. // Journal of Phycology. 2003. -V.39. -P.513 -518.

97. Cote G.L., Ahlgren J.A. Kirk-Othmer encyclopedia of chemical technology. -New York: John Wiley & Sons, Inc., 1995 4th ed., V.16. - P.578-611.

98. Misaki A. Structure of the dextran of Leuconostoc mesenteroides B-1355 / Misaki A., Torii M., Sawai Т., Goldstein I. // Carbohydrate Research. 1980. -V.84. - P.272—285.

99. Jorgensen P.S. The Use of Dextran 70 as a Plasma Expander Increases the Intraoperative Bleeding in Total Hip Replacement // Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 1997. - V.3, №4, P.267-269.

100. Kapitulnik J. Clinical evaluation of Sephadex gel filtration in estimation of bilirubin binding in serum in neonatal jaundice / Kapitulnik J., Valaes Т., Kaufmann N.A., Blondheim S.H. // Archives Disease Child. 1974. - V.49(l 1). - P.886-894.

101. Elaine Т. Schenborn, Goiffon V. DEAE-Dextran Transfection of Mammalian Cultured Cells. In: Transcription Factor Protocols (Methods in Molecular Biology) (Ed. Tymms M.J.). New Jersey: Humana Press, 2008. - V. 130. - P. 147-153.

102. Benoit J.-P., Marchais H., Rolland H., Velde, V.V. Biodegradable microspheres, In: Advances in production technology (Eds. Benita S.). New York: Marcel Dekker, Inc., 1996. - P.35-72.

103. Thies C. A survey of microencapsulation processes, In: Advances in production technology (Eds. Benita S.). New York: Marcel Dekker, Inc., 1996. - P. 1-19.

104. Arshady R. Microspheres, microcapsules and liposomes, In: General concepts and criteria (Eds. Arshady R.). London: Citrus Books, 1999. - P.l 1-45.

105. Zyl A.J.P. Core/Shell particles containing liquid cores: Morphology prediction, synthesis and characterization / Zyl A.J.P., Sanderson R.D., de Wet-Roos D., Klumperman B. // Macromolecules. 2003. - V.36(23). - P.8621-8629.

106. Chambard G. Peculiarities in atom transfer radical copolymerization / Chambard G., Klumperman В., Brinkhuis R.H.G. // ACS Symposium Series. 2003. - V.854. P.180-192.

107. Chang T.M.S. Enzymes immobilized by microencapsulation: preparation and biomedical applications, In: Insolubilized Enzymes (Eds. Salmona M., Saronio C., Garattini S.). New York: Raven Press, 1974. - P.l5-27.

108. Bungenberg de Jong H.G. Crystallisation-coacervation-flocculation, In: Colloid Science, (Ed. Kruyt H.R.). Elsevier, 1949. - P.232-258.

109. De Kruif C.G. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides / De Kruif C.G., Weinbreck F., de Vries R. // Current Opinion in Colloid & Interface Science . 2004. - V.9. - P.340-349.

110. Benoit J.-P. Method for encapsulating active substances by coacervation of polymers in non-chlorinated organic solvent / Benoit J.-P., Richard J., Fournier E., Liu S. // PCT Internatinal Application. 0,115,799. 2001.

111. Winters M.A. Precipitation of Proteins in Supercritical Carbon Dioxide / Winters M.A., Knutson B.L., Debenedetti P.G., Sparks H.G., Przybycien T.M., Stevenson C.L., Prestrelski S.J. // Journal of Pharmaceutical Sciences. 1996. - V.85. - P.586.

112. Brandenberger Н. Monodisperse particle production: a method to prevent dropcoalescence using electrostatic forces / Brandenberger H., Nussli D., Piech V., Widmer F. // Journal of Electrostatics. 1999. - V.45. - P.227-238.

113. Mumenthaler M. Feasibility study on spray-drying protein pharmaceuticals: Rhgh and t-pa / Mumenthaler M., Hsu C.C., Pearlman R. // Pharmaceutical Research. -1994. — V.l 1. — P.12-20.

114. Maa Y.-F. Spray-drying of air-liquid interface sensitive recombinant human growth hormone / Maa Y.-F., Nguyen P.-A.T., Hsu S.W. // Journal of Pharmaceutical Sciences. 1998. - V.87. - P. 152-159.

115. Lehmann K. In: Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy (Ed. M. Donbrow). Boca Raton: CRC Press, 1992. -P.73-97.

116. US Patent 4,675,140. Method for coating particles or liquid droplets / Sparks R.E., Norbert M. 1987.

117. Fuoss R.M. Mutual Interaction of Polyelectrolytes / Fuoss R.M. Sadek H. // Science. 1949. - V.l 10, №2865. - P.552 - 554.

118. Michaels A.S. Polycation-polyanion complexes preparation and properties of poly-(vinylbenzyltrimethylammonium) poly-(styrenesulfonate) / Michaels A.S., Miekka R.G. //Journal of Physical Chemistry. 1961. - V.65. - P. 1765-1773.

119. Radtchenko I.L. Inorganic Particle Synthesis in Confined Micron-Sized Polyelectrolyte Capsules / Radtchenko I.L., Giersig M., Sukhorukov G.B. // Langmuir. -2002. V.l8(21). -P.8204-8202.

120. Gaponik N. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals / Gaponik N., Radtchenko I.L., Gerstenberger M.R., Fedutik Y.A., Sukhorukov G.B., Rogach A.L. // Nano Letters. 2003. - V.3(3). -P.369-372.

121. Sukhorukov G.B. Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design / Sukhorukov G.B., Donath E., Davis S., Lichtenfeld H.,

122. Caruso F., Popov V.I., Mohwald H. // Polymers for Advanced Technologies. 1998.- V.9(10-l 1). P.759-767.

123. Volodkin D.V. Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Macromolecule Encapsulation / Volodkin D.V., Petrov A.I., Prevot M., Sukhorukov G.B. // Langmuir. 2004. - V.20. - P.3398-3406.

124. Volodkin D.V. Protein Encapsulation via Porous СаСОз Microparticles Templating / Volodkin D.V., Larionova N.I., Sukhorukov G.B. // Biomacromolecules -2004. V.5. -P.l962-1972.

125. Borodina T. Controlled Release of DNA from Self-Degrading Microcapsules / Borodina Т., Marcvicheva E., Kunizhev S., Mohwald H., Sukhorukov G., Kreft O. // Macromolecular Rapid Communications. 2007. - V.28. - P. 1894-1899.

126. Funduenanu G. Physico-chemical characterization of Ca-alginate microparticles produced by different methods / Funduenanu G, Nastruzzi C, Carpov A, Desbrieres J, Rinaudo M. // Biomaterials. 1999. - V.20. - P. 1427-35.

127. Draget K.I. Alginate based new materials / Draget K.I., Skjak-Braek G., Smidsrod O. // International Journal of Biological Macromolecules. 1997. - V.21.- P.47-55.

128. Taqieddin E. Enzyme immobilization in novel alginate-chitosan core-shell microcapsules / Taqieddin E., Amiji M. // Biomaterials. 2004. - V.25. - P.1937-1945.

129. Lee K.H. Immobilization of aminoacylase by encapsulation in poly 1-lysine-stabilized calcium alginate beads / Lee K.H., Lee P.M., Siaw Y.S. // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 1993. - V.57. - P.27-32.

130. Albarghouthi M. Immobilization of antibodies on alginate-chitosan beads / Albarghouthi M., Abu Fara D., Saleem M., El-Taher Т., Matalka K., Badwan A. // International Journal of Pharmaceutics. 2000. - V.206. - P.23-34.

131. Coppi G. Protein immobilization in crosslinked alginate microparticles / Coppi G., Iannuccelli V., Leo E., Bernabei M.T., Cameroni R. // Journal of Microencapsulation. 2002. - V.19. - P.37-44.

132. Smidsrod O. Alginate as immobilization matrix for cells / Smidsrod O., Skjak-Braek G. // Trends in Biotechnology. 1990. - V.8. - P.71-78.

133. Huguet M.L. Hemoglobin encapsulation in chitosan/calcium alginate beads / Huguet M.L., Groboillot A., Neufeld R.J., Poncelet D., Dellacherie E. // Journal of Applied Polymer Science. 1994. - V.51. - P. 1427-1432.

134. Rosen J.M. Preparation and preliminary characterization of purified ovalbumin messenger RNA from the hen oviduct / Rosen J.M., Woo S.L.O., Holder J.W., Means A.R., O'Malley B.W. // Biochemistry. 1975. - V. 14, № 1. -P.69-78.

135. Khraltsova L.S. An enzyme-linked lectin assay for al,3-galactosyltransferase / Khraltsova L.S., Sablina M.A., Melikhova T.D., Joziasse D.H., Gabius H.-J., Bovin N.V. // Analytical Biochemistry. 2000. - V 280. - P. 250-257.

136. Shilova N.V. High molecular weight neoglycoconjugates for solid phase assays / Shilova N.V., Galanina O.E., Pochechueva T.V., Chinarev A.A., Kadykov V.A., Tuzikov A.B., Bovin N.V. // Glycoconjugate Journal. 2005. - V.22. - P.43-51.

137. Bartkowiak A. // Hydrogel microcapsules containing natural and chemically modified oligochitosan mechanical properties and porosity / Bartkowiak A., Brylak W. // Polimery. - 2006. - V.51(7-8). - P.547-554.

138. Бовин H.B. Гликоконъюгаты на основе полиакриламида инструменты для изучения лектинов, антител, гликозилтрансфераз в гликобиологии, цитохимии и гистологии // Биоорганическая химия. - 1996. - Т.22, №9. - С.643-663.

139. Rieben R. Xenotransplantation: in vitro analysis of synthetic-galactosyl inhibitors of human anti-Gall3Gal IgM and IgG antibodies / Rieben R., Bovin N. V., Korchagina E. Y., Oriol. R. // Glycobiology. 2000. - V.10. - P. 141-148.

140. Zipfel P.F. The role of defective complement control in hemolytic uremic syndrome / Zipfel P.F., Misselwitz J., Licht C., Skerka C. // Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 2006. - T.32, № 2. - С. 146-54.

141. ASTM: F 756-00. Standard practice for assessment of haemolytic properties of materials, American Society for Testing and Materials Designation.

142. Сюрин B.H., Б ел oy сова P.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. — М.: Агропромиздат, 1991. 528 с.

143. Nishimura К. Immunological activity of chitin and its derivatives / Nishimura K., Nishimura S., Nishi N., Saiki I., Tokura S., Azuma I.//Vaccine.-1984.-V.2.-P.93-99.

144. Takashi M. Mechanism of macrophage activation by chitin derivatives // The Journal of veterinary medical science. 2005. — V.67. — P.51-56.

145. Chena C.-L. The effect of water-soluble chitosan on macrophage activation and the attenuation of mite allergen-induced airway inflammation / Chena C.-L., Wang Y.-M., Liu C.-F., Wang J.-Y. // Biomaterials. 2008. - V.29. - P.2173-2182.