Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат медицинских наук Ушачёв, Дмитрий Владимирович

• Ушачёв, Дмитрий Владимирович
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Ушачёв, Дмитрий Владимирович

Список сокращений.4

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. Литературный обзор

1.1. Современные взгляды на этиологию и патогенез гипертонической болезни.13

1.2. Мембранная концепция гипертонической болезни.17

1.3. Белки клеточных мембран и их возможная вовлеченность в формирование патогенеза гипертонической болезни.24

1.4. Роль генетических факторов в детерминации мембранных нарушений при гипертонической болезни.35

Глава И. Материалы и методы исследования

II. 1 Общая характеристика материала исследования.40

II.2 Характеристика методов исследования.41

II.3.Статистические методы.48

Глава III. Результаты собственных исследований

III. 1 Общая характеристика и вариабельность количественного содержания мембранных белков эритроцитов у человека в норме и при гипертонической болезни.52

111.2 Изучение влияния наследственной отягощенности по гипертонической болезни на количественную представительность мембранных белков эритроцитов.59

111.3 Исследование характера взаимного варьирования количественного содержания белков мембран эритроцитов при гипертонической болезни.62

111.4 Анализ взаимосвязи полиморфизма генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний с количественным содержанием мембранных белков эритроцитов.74

Ш.5 Анализ ассоциаций полиморфизмов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний и их парных сочетаний с мембранными белками эритроцитов с помощью дисперсионного анализа. 87

111.6 Компонентное разложение общей фенотипической дисперсии количественного содержания белков мембран эритроцитов, обусловленной изменчивостью комплекса полиморфных геновкандидатов сердечно-сосудистых заболеваний. 91

111.7 Прогнозирование риска возникновения гипертонической болезни с использованием биохимических и молекулярно-генетических маркеров. 100

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 106

ВЫВОДЫ. 125

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вклад полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков клеточных мембран при гипертонической болезни»

Гипертоническая болезнь (ГБ) в настоящее время признана пандемией, определяющей большую часть заболеваемости в большинстве стран мира [Гогин Е. Е., 2003]. По данным обследования, проведенного в рамках целевой Федеральной программы «Профилактика и лечение АГ в Российской Федерации», распространённость АГ среди населения нашей страны составляет 39,5%. По данным обследования репрезентативной выборки, стандартизированной по возрасту, распространённость АГ в России составляет среди мужчин 37,2%, а среди женщин - 40,4% [Шальнова С.А. и др., 2006]. Общеизвестно, что артериальная гипертензия (АГ) является важнейшим фактором риска распространенных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) - острого инфаркта миокарда (ОИМ) и мозгового инсульта (МИ) [Гринштейн А. В., 2002], которые определяют высокую смертность населения во всем мире. Существует прямая связь между уровнем артериального давления (АД) и риском развития инсульта [В.И.Скворцова, 2006]. Кроме того, ГБ способствует развитию атеросклероза и ишемической болезни сердца (ИБС), лежит в основе развития хронической сердечной недостаточности [Ланг Г.Ф., 1950; Мясников А. Л., 1965; Чазов Е. И., 1997]. Доказано, что опасность возникновения ИБС более велика у больных АГ, причем она увеличивается параллельно нарастанию АД. В качестве примера можно привести данные проспективного Фремингемского исследования, показавшего, что у обследованных с систолическим АД выше 180 мм.рт.ст. ИБС возникала в 8 раз чаще, чем у лиц, у которых оно было ниже 120 мм.рт.ст. [Саппе1 ег а1., 1961]. Подобная же зависимость установлена и в отношении диастолического АД. Хотя и отсутствует специфический уровень давления, выше которого резко возрастали бы показатели летальности, тем не менее, взаимосвязь уровня АД с заболеваемостью и смертностью населения фактически носит линейный характер зависимости.

У больных ГБ часто прослеживается отягощенный семейный анамнез по сердечно-сосудистым заболеваниям, в том числе и АГ, тем самым, демонстрируя важную роль наследственных факторов в её развитии [Гинтер Е.К., 2003]. Значительную роль генетических факторов в развитии ГБ продемонстрирован и близнецовыми исследованиями [Шарандак А.П. и др., 2002]. Согласно современным представлениям ГБ имеет многофакторную или мультифакториальную природу и относится к полигенным заболеваниям. К настоящему времени установлены уже сотни генов-кандидатов предрасположенности к ГБ, установлены многочисленные средовые факторы риска заболевания и описаны ранее неизвестные стороны его патогенеза [Бойцов, С. А. и др., 2003; Гуревич, М. А., 2009; Денисова Т.П., 2005; Елисеев А.О., 1987; Казеннов, A.M., 1990; Логинов В.А., 1990; Casari G. et al., 1995; Chowdhary S. et al., 2001; Corvol P., 2001; Siffert W. et al., 1998]. Однако, несмотря на прогресс молекулярной генетики, по-прежнему, в' мировом научно-медицинском сообществе отсутствует единое мнение о ведущих патогенетических механизмах, лежащих в основе стойкого хронического повышения уровня артериального давления.

Одной из подробно изученных и обоснованных является "мембранная | концепция" этиопатогенеза ГБ, в основе которого лежат структурно-функциональные изменения плазматических мембран клеток, приводящие к нарушению трансмембранного транспорта катионов, контролирующих сосудистый тонус. "Мембранная концепция" этиопатогенеза ГБ, основные положения которой были исследованы учеными Ю.В. Постновым и С.Н. Орловым и обобщены в известной монографии [Постнов Ю.В.; Орлов С.Н., 1987], оказалась способной объяснить многие противоречия различных точек зрения на молекулярные механизмы развития заболевания. За период с середины 70-х годов прошлого века до конца первого десятилетия 21 века проведено значительное количество исследований по изучению природы ионтранспортных нарушений при ГБ. В частности, была установлена взаимосвязь количественного содержания белков мембран эритроцитов с подверженностью гипертонической болезни [Емельянова О.Г., 1999]. Кроме того, было установлен значительный вклад генетических факторов в вариабельность белков клеточных мембран эритроцитов при ГБ. Однако геномный источник "мембранных нарушений", по-прежнему, не установлен. Считается маловероятным, что при ГБ нарушения в геноме относятся к участкам, кодирующим структуру таких различных белковых молекул, как Na+/Na+- и №+/К+-переносчики, переносчики Са2+"АТФаза, а также мембранных белков, вовлеченных в регуляцию катион-транспортных процессов через плазматические мембраны [Котелевцев Ю.В., Постнов Ю.В., 1986].

Учитывая вышеизложенное, наиболее целесообразной является интегрированная оценка молекулярно-генетических и биохимических исследований, направленных на поиск и установление взаимосвязей между ДНК-полиморфизмом конкретных генов предрасположенности к ГБ и изменчивостью содержания белков мембран эритроцитов. Однако, до настоящего времени исследований, направленных на оценку вклада известных генов-кандидатов4 ССЗ в вариабельность количественного содержания основных белков мембран эритроцитов, не проводилось.

Целью настоящего исследования было изучение вклада полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 в фенотипическую изменчивость количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

Задачи исследования:

1) Исследовать количественное содержание и характер взаимного варьирования основных мембранных белков эритроцитов в норме и при гипертонической болезни и установить факторы, определяющие совместное варьирование данного комплекса количественных признаков.

2) Проанализировать особенности количественного содержания белков мембран эритроцитов в зависимости от пола и наличия наследственной отягощенности по ГБ.

3) Изучить популяционные частоты полиморфизмов Т174М и М235Т гена AGT, 1166А/С гена AGTR1,1/D гена АСЕ, А4582С гена MLR, E298D и -786Т/С гена NOS3, G272S и С825Т гена GNB3, G460W гена ADD1 и R25P гена TGFB1 и исследовать их ассоциации с гипертонической болезнью.

4) Провести анализ взаимосвязи полиморфных вариантов генов AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 и их парных сочетаний с количественным содержанием мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни.

5) Оценить влияние полиморфных вариантов генов AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 на вариабельность содержания основных мембранных белков эритроцитов и установить вклад исследуемых полиморфных генов в общую фенотипическую и полигенно обусловленную дисперсию количественных показателей.

6) Оценить совместное влияние основных мембранных белков эритроцитов и ДНК-полиморфизмов на риск возникновения ГБ и исследовать предиктивный потенциал исследуемых биохимических и молекулярно-генетических маркеров в отношении прогнозирования риска развития болезни.

Научная новизна. В рамках исследования впервые проведен комплексный анализ влияния полиморфизма генов-кандидатов сердечнососудистых заболеваний AGT, AGTR1, АСЕ, MLR, NOS3, GNB3, ADD1 и TGFB1 на фенотипическую вариабельность количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни. Оценена степень вклада аллелей генов-кандидатов ССЗ в фенотипическую и полигенно обусловленную дисперсию мембранных белков эритроцитов при ГБ. Установлено, что исследованные гены объясняют значительную часть фенотипической изменчивости мембранных белков эритроцитов при гипертонической болезни. Впервые показано, что существенная доля вариабельности мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена взаимодействием относительно небольшого числа факторов их совместной изменчивости, отражающих фенотипическую реализацию кодирующих их полигенных комплексов. Впервые выявлен половой диморфизм, проявляющийся не только в особенностях количественного содержания мембранных белков у мужчин и женщин, страдающих ГБ, но и значительные различия в характере генетической детерминации фенотипической изменчивости исследуемых показателей у представителей разного пола. Полученные в ходе настоящей работы результаты позволяют глубже взглянуть на молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе мембранных нарушений при ГБ, и расширяют возможности доклинической оценки риска развития заболевания.

Научно-практическая значимость работы: в связи с тем, что исследованные белки мембран эритроцитов и полиморфные гены оказались ценными предикторами при расчете индивидуального риска возникновения ГБ у мужчин и женщин, их совместная оценка с помощью разработанных статистических моделей может использоваться для прогнозирования вероятности развития болезни, как во врачебной, так и в эпидемиологической практике при формировании среди населения групп повышенного риска возникновения ГБ. В этой связи результаты исследования могут быть востребованы при организации мероприятий по раннему выявлению и профилактике гипертонической болезни в популяции. Практическое использование статистических моделей дает возможность врачам-генетикам, терапевтам и кардиологам формировать группу повышенного риска ГБ, оптимизировать и индивидуализировать мероприятия по превентивной коррекции нарушений регуляции АД, что может способствовать снижению риска формирования ГБ в популяции. Результаты, полученные в ходе исследования, не только формируют представления о роли полиморфизма генов ССЗ в детерминации изменений количественного содержания белков мембран эритроцитов при ГБ, но и создают теоретическую основу для их внедрения в образовательный процесс. В частности, результаты исследования могут быть использованы при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, биохимии, патофизиологии, терапии, кардиологии в вузах медицинского профиля и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту:

1. Значительная доля вариабельности мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена взаимодействием относительно небольшого числа факторов их совместной изменчивости, которые могут отражать фенотипическую реализацию кодирующих их полигенных комплексов, один из которых определяет почти 20% основного вектора количественных изменений белков эритроцитарных мембран при заболевании - снижение уровня а и (3 спектринов и повышение содержания глюкозного транспортера.

2. Фенотипические эффекты аллелей исследованных полиморфизмов генов-кандидатов ССЗ в отношении изменчивости уровня основных мембранных белков эритроцитов модифицируются вследствие возможных аддитивных и эпистатических взаимодействий между исследованными локусами, а также различий в величинах их пенетрантности, и характеризуются неодинаковыми проявлениями у представителей разного пола.

3. Исследованные полиморфные варианты генов в совокупности вносили существенный вклад в фенотипическую изменчивость количественного содержания белков мембран эритроцитов при ГБ: величина вклада вариации по исследованным локусам в полигенно обусловленную дисперсию признаков достигала 64% (для глюкозного транспортера) у мужчин и 50% (для а-спектрина) у женщин, свидетельствуя о значимой роли известных кандидатных генов ССЗ в детерминации количественного дисбаланса мембранных белков эритроцитов, обнаруженных при заболевании.

4. Исследованные полиморфные гены и белки мембран эритроцитов являются ценными предикторами при расчете индивидуального риска возникновения ГБ у мужчин и женщин и могут использоваться в качестве генетических и биохимических маркеров прогнозирования вероятности развития болезни при формировании среди населения групп повышенного риска возникновения ГБ.

Апробация результатов работы и публикации: материалы диссертационного исследования доложены на итоговых научных сессиях КГМУ (2006, 2007, 2011), Российском национальном конгрессе кардиологов (2008), 2-ом съезде кардиологов Сибирского федерального округа (Томск, 2007), международной (российско-японо-американской) научно-практической конференции «Современные технологии и общая концепция профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний» (Хабаровск, 2007) и ежегодной научной конференции Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2011).

По материалы диссертации опубликовано 11 печатных работ, в т. ч. 2 - в рецензируемых журналах (Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Терапевтический архив), рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Объем и структура диссертационной работы:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 6 рисунками, содержит 9 приложений. Список литературы включает 253 источника: 88 отечественных и 165 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Ушачёв, Дмитрий Владимирович

ВЫВОДЫ

1. У больных гипертонической болезнью, в отличие от здоровых индивидов, установлены отклонения в количественном содержании, а также в характере взаимного варьирования главных периферических (спектринов, актина, дематина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) и интегральных белков (глюкозотранспортного белка) плазматических мембран эритроцитов, которые имели различную степень фенотипического выражения у мужчин и женщин. У женщин, страдающих ГБ, в отличие от мужчин, а также у пациентов с наследственной отягощенностью по ГБ обнаружены наиболее глубокие изменения анализируемых показателей количественного характера.

2. С помощью факторного анализа, проведенного методом главных компонент, показано, что значительная доля совместной изменчивости мембранных белков эритроцитов у больных ГБ обусловлена действием пяти факторов. При этом, несмотря на сходные величины объясняемой влиянием данных факторов совместной изменчивости изучаемых признаков (72% у мужчин и 71% у женщин), структура и направленность фенотипических эффектов главных компонент в отношении вариабельности мембранных белков эритроцитов существенно отличалась у мужчин и женщин.

3. Установлено, что все исследованные нами полиморфные варианты генов-кандидатов ССЗ в той или иной степени оказывали влияние на количественное содержание белков мембран эритроцитов. В большинстве случаев фенотипические эффекты аллелей исследованных генов на вариабельность мембранных белков оказались умеренно выраженными и в ряде случаев (для 0460\У гена АОй1, -786Т/С гена N033, М235Т и Т174М гена ЛОТ, 1/Е) гена АСЕ) характеризовались разнонаправленностью действия у мужчин и женщин, о чем свидетельствовали степень и направление отклонений величин анализируемых признаков в группах носителей альтернативных аллелей от средних в популяции значений.

4. Применение одно- и двухфакторного дисперсионного анализа позволило выявить особенности эффектов изолированного и совместного действия аллелей исследуемых ДНК-маркеров на вариабельность белков мембран эритроцитов при ГБ. Доля дисперсии, объясненная сочетаниями полиморфных генов и оцененная величинами коэффициентов детерминации В2, варьировала от 9.7% до 26.1% у мужчин и от 5.8% до 10.7% у женщин. В парных сочетаниях отдельные полиморфизмы оказывали влияние на содержание мембранных белков эритроцитов, с которыми они не были связаны по отдельности, а в некоторых случаях действие одного полиморфизма в сочетании с другим локусом нивелировалось

5. Было установлено, что доля общей фенотипической изменчивости белков мембран эритроцитов у больных ГБ, объясненная аллельным разнообразием комплекса изученных полиморфных генов, варьировала в широком диапазоне и составляла от 3.1% (дематин) до 47.6% (глюкозный транспортер) у мужчин и от 0.7% (анкирин 2.3) до 27.0% (а-спектрин) у женщин. Величина вклада вариации по исследованным локусам в полигенно обусловленную дисперсию признаков составляла от 3.9% (дематин) до 64,4% (глюкозный транспортер) у мужчин и от 1,1% (белок п. 4.1) до 50,3% (а-спектрин) у женщин с наибольшим вкладом исследованных ДНК-маркеров в изменчивость мембранных белков, характеризующихся отклонениями в количественном содержании при ГБ.

6. Результаты логистического регрессионного анализа показали, что исследованные полиморфные гены и мембранные белки эритроцитов являются прогностически ценными предикторами для расчета вероятности возникновения заболевания в популяции. Несмотря на определенные различия разработанных нами статистических моделей прогнозирования ГБ у мужчин и женщин, в целом, используемые в качестве предикторов болезни биохимические и генетические маркеры обладали достаточно высоким прогностическим потенциалом, о чем свидетельствовало качество классифицирования пациентов на группы риска: вероятность правильного установления возможности развития ГБ составляло 73% среди мужчин и 91% - среди женщин.