Визуализация и мониторинг активности цитохрома Р450 ВМЗ с использованием атомно-силовой микроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Бухарина, Наталья Сергеевна

• Бухарина, Наталья Сергеевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Бухарина, Наталья Сергеевна

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Цитохром Р450 ВМЗ

1.2 Энзимология единичных молекул ферментов

1.2.1 Методы измерения каталитической активности единичных молекул ферментов

1.2.2 Уравнение Михаэлиса-Ментен для единичных молекул ферментов

1.3 АСМ-визуализация с использованием стандартных и сверхтонких зондов

1.3.1 АСМ для исследования активности отдельных

молекул ферментов

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Использованные реактивы и материалы

2.2 Характеристика исследуемого белка

2.3 Методика приготовления образцов для АСМ-измерений

2.4 Методика АСМ-визуализации ВМЗ с использованием стандартных и сверхтонких зондов

2.4.1 Обработка АСМ-изображений

2.5 Методика АСМ-мониторинга колебаний высоты единичных молекул ВМЗ в процессе каталитического цикла фермента

2.6 Дополнительные методы

2.6.1 Масс-спектрометрический анализ

2.6.2 Фотонная корреляционная спектроскопия

2.7 Методика АСМ-мониторинга температурной денатурации ВМЗ

2.8 Флуоресцентный анализ

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 АСМ-визуализация и определение олигомерного состояния ВМЗ с использованием стандартных и сверхтонких зондов

3.1.1 Исследование олигомерного состояния ВМЗ методом фотонной корреляционной спектроскопии

3.1.2 АСМ-визуализация ВМЗ в жидкости, вакууме и воздухе с использованием стандартных зондов

3.1.3 АСМ-визуализация ВМЗ в воздухе и в вакууме с использованием сверхтонких зондов

3.1.4 Определение олигомерного состояния ВМЗ из данных АСМ-экспериментов

3.2 Мониторинг активности единичных молекул ВМЗ с использованием АСМ

3.2.1 АСМ-измерения колебаний высоты ВМЗ на разных стадиях каталитического цикла фермента

3.2.2 Температурная зависимость средней амплитуды колебаний высоты молекул ВМЗ

3.2.3 Обсуждение результатов АСМ-мониторинга активности единичных молекул ВМЗ

3.3 Исследование температурной денатурации ВМЗ методами АСМ и флуоресцентного анализа

3.3.1 Флуоресцентный анализ температурной денатурации

ВМЗ

3.3.2 АСМ-исследование зависимости олигомерного состояния ВМЗ от температуры

3.3.3 Обсуждение полученных результатов исследования температурной денатурации ВМЗ 92 Заключение

Выводы

Благодарности

Литература

Список используемых сокращений

АСМ - атомно-силовой микроскоп, атомно-силовая микроскопия

МС - масс-спектрометрия

RH - относительная влажность

PBSD - фосфатно-солевой буфер Дульбекко

FAD - флавинадениндинуклеотид

FMN - флавинмононуклеотид

ММ - уравнение Михаэлиса-Ментен

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Визуализация и мониторинг активности цитохрома Р450 ВМЗ с использованием атомно-силовой микроскопии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Изучение единичных молекул ферментов, их физико-химических свойств и активности является одним из приоритетных направлений в биохимии, которое называется энзимологией единичных молекул. Преимущество такого подхода состоит в получении информации о свойствах отдельных биомолекул, а не об усредненных по ансамблю величинах. Например, это позволяет проводить прямой мониторинг стадий (ан)фолдинга белка, наличие которых в стандартных экспериментах лишь предполагается, или наблюдать за работой единичных ферментов на различных стадиях каталитического цикла, характеризовать их промежуточные переходные состояния [1].

Помимо того, что традиционные методы исследования дают возможность получить только усредненные характеристики систем, они обладают также более низкой чувствительностью по сравнению с методами изучения единичных молекул. Это приводит к тому, что в традиционных методах приходится проводить исследования при достаточно высоких концентрациях растворов белков. Использование высоких концентраций растворов приводит к тому, что биомолекулы, склонные к агрегации, находятся в олигомерном состоянии. Работа же с малыми концентрациями позволяет сместить равновесие в сторону мономерной формы белков и следить за свойствами мономеров и олигомеров.

Также манипуляции с единичными молекулами, в том числе с иммобилизованными единичными молекулами, позволяют напрямую измерять молекулярные силы, структуру и функциональный отклик отдельных молекул на механическое воздействие.

В настоящей работе метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) используется для исследования иммобилизованных на подложке отдельных молекул белков в условиях, близких нативным [2], в том числе, для визуализации и изучения физико-химических свойств единичных

макромолекул и макромолекулярных комплексов [3]. Субнанометровое вертикальное разрешение этого метода и полуконтактный режим АСМ-измерений позволяют с высокой точностью определять высоту белка с минимальным воздействием на него со стороны АСМ-зонда. Таким образом, АСМ можно использовать для визуализации белков, их идентификации по высотам и, соответственно, определения их степени олигомеризации, а также для мониторинга конформационной динамики фермента в процессе осуществления ферментативной реакции. Эти возможности метода АСМ были продемонстрированы в данной работе на примере изучения свойств фермента цитохрома Р450 ВМЗ (ВМЗ), катализирующего монооксигенацию жирных кислот [4]. ВМЗ принадлежит к суперсемейству гем-содержащих цитохромов Р450 и играет важную роль в метаболических путях в организме. Этот белок является самодостаточным ферментом, который не требует наличия дополнительных белков-партнеров для реализации каталитического цикла. В структуре этого фермента редуктазный и гемовый домены объединены в единую полипептидную цепь [5], что обуславливает интерес к нему как к удобной упрощенной модели цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем, а также позволило упростить схему измерения активности фермента с помощью АСМ. Ранее было также показано, что полноразмерный ВМЗ может существовать в мономерной и олигомерной формах, главным образом в виде димерной (>50%) [6]. Причем димеры проявляют большую активность, нежели мономеры: кса, =50 s"1 и kcat =10 s"1 для димеров и мономеров, соответственно [7].

Цель работы

Цель настоящей работы - визуализация и измерение активности отдельных молекул фермента цитохрома Р450 ВМЗ с использованием АСМ.

Задачи

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Подбор условий нековалентной иммобилизации фермента на АСМ-подложку для визуализации отдельных молекул.

2. АСМ-визуализация иммобилизованного фермента в различных средах, определение его олигомерного состояния на основе данных измерений с использованием стандартных и сверхтонких зондов.

3. Исследование влияния температуры на олигомерное состояние ВМЗ методами АСМ и флуоресцентного анализа.

4. АСМ-измерение амплитуды колебаний высоты молекул ВМЗ на отдельных стадиях каталитического цикла (при добавлении субстрата, донора электронов, ингибитора) при разных температурах и разработка методики определения каталитической активности ферментов из полученных АСМ-данных.

Научная новизна работы

1. Разработана методика определения олигомерного состояния иммобилизованного фермента ВМЗ с помощью АСМ с двумя типами зондов: стандартным и сверхтонким. Исследовано влияние среды АСМ-измерений (жидкость, воздух, вакуум) и типов АСМ-зондов на высоты изображений ВМЗ и на его олигомерное состояние. С использованием АСМ-измерений стандартным зондом получено подтверждение, что ВМЗ в жидкости может находиться как в мономерном, так и в олигомерном состоянии, а с использованием сверхтонкого зонда в вакууме удалось разрешить более детально олигомерное состояние ВМЗ.

2. Разработана методика определения каталитической активности фермента с помощью АСМ по изменению амплитуды колебаний высоты его

отдельных молекул. Показана зависимость амплитуды колебаний высоты отдельных молекул ВМЗ, иммобилизованных на подложке, от температуры с помощью АСМ.

3. Проведено исследование температурной денатурации цитохрома Р450 ВМЗ методами АСМ и флуоресцентного анализа. Предложен подход для выяснения взаимоотношения зависимости активности фермента от температуры и его температурной денатурацией, который объединяет мониторинг плавления фермента и АСМ-исследование его агрегации в процессе температурной денатурации. В низкотемпературной области 10-33°С с помощью флуоресцентного анализа было обнаружено 3-й кооперативных перехода, а с помощью АСМ-анализа для ВМЗ продемонстрировано сохранение его глобулярной формы при изменении степени олигомеризации в этой области.

Научно-практическая ценность работы

Результаты диссертации носят в первую очередь фундаментальный характер. По мнению автора, наиболее интересны следующие полученные результаты: детальное разрешение олигомерного состояния ВМЗ с помощью сверхтонкой АСМ-иглы, определение особенностей колебаний высоты отдельных молекул фермента ВМЗ, иммобилизованных на подложке, и обнаружение 3-х кооперативных переходов в низкотемпературной области на кривой плавления ВМЗ.

Важным методологическим результатом диссертации является разработанный алгоритм связи каталитической активности единичного фермента и амплитуды колебаний его высоты, полученной из АСМ-данных. Таким образом, настоящая работа вносит как практический, так и теоретический вклад в развитие методов определения каталитической активности единичных молекул ферментов. Этот подход может быть использован для других ферментативных систем.

Предложен подход совмещения АСМ с флуоресцентным анализом для исследования температурной денатурации ферментов.

Фундаментальные результаты, полученные в диссертационной работе, могут быть использованы в прикладных исследованиях, посвященных разработке новых биокаталитических технологий на основе иммобилизованных ферментов для решения задач фармацевтической, пищевой и энергетической промышленности.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих научных конференциях и школах:

• Первая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» 2010, Москва, Россия;

• 25th International Symposium on Microscale BioSeparations MSB 2010, Prague, Czech;

• 4-я международная конференция «Современные достижения бионаноскопии» 2010, Москва, Россия;

• VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 2011, Москва, Россия;

• 17th International Conference on Cytochrome P450 2011, Manchester,

UK

• European Proteomics Association 2012 Scientific Congress, Glasgow, Scotland.

Личный вклад автора

Все экспериментальные АСМ-измерения и подготовка образцов к сканированию выполнены автором лично. Эксперименты по флуоресцентному анализу проведены соискателем лично под руководством к.б.н, Петушковой H.A.

Эксперименты по масс-спектрометрии проведены совместно с к.б.н. Кайшевой А.Л. под руководством д.б.н. Згоды В.Г. Эксперименты по электронной микроскопии проведены совместно с Канашенко С.Л. Разработка программного обеспечения для получения траекторий изменения высоты

молекул из АСМ-кадров проведена совместно с Крохиным Н.В. Эксперименты по фотонно-корреляционной спектроскопии проведены совместно с к.ф.-м.н. Медведевой Н.В.

Планирование всех экспериментов, анализ и интерпретация экспериментальных данных, формулировка теоретических положений выполнены Бухариной Н.С. лично под руководством д.б.н., профессора Иванова Ю.Д.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи, 3 из которых - в ведущих журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.

Структура и объем работы

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 101 источник.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Цитохром Р450 ВМЗ

Цитохромы Р450 - суперсемейство гемсодержащих монооксигеназных ферментов, играющих важную роль в окислении как эндогенных соединений (стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты и др.), так и экзогенных (лекарства, яды, пестициды и др.), последние из которых называют ксенобиотиками [8]. Монооксигеназы катализируют реакции внедрения одного атома кислорода в различные субстраты, другой атом кислорода восстанавливается до воды. Общая схема каталитического механизма может быть представлена как [9]:

RH + 02 + 2е + 2Н+ -» ROH + Н20, где RH - субстрат, (2ё+2Н+) - донор электронов, которым может быть как NADPH, так и NADH.

Монооксигеназная система цитохрома Р450 широко распространена в природе, и в общем случае состоит из трех ферментов: это цитохром Р450, флавопротеин, передающий на него электрон и редуктаза, участвующая в окислении NADH (NADPH) [10,11]. Однако, известны и двухкомпонентные системы, включающие, только два фермента: монооксигеназная система микросом печени эукариот состоит из флавопротеина, содержащего FAD и FMN (NADPH-зависимая Р450-редуктаза), и цитохром Р450. Все компоненты этой системы - истинные мембранные белки, что затрудняет их детальное изучение, так как они не водорастворимые. Хотя и известна атомарная структура некоторых Р450 млекопитающих и NADPH-зависимой Р450-редуктазы крысы [12-14], но она модифицирована - удалением N-концевого фрагмента пептидной цепи, выполняющего роль якорного пептида с сигнальной последовательностью, ответственной за встраивание белка в мембрану [15]. Этот участок важен для продуктивного электронного переноса между NADPH-зависимой Р450-редуктазой и цитохромом Р450 [7]. Поэтому особый интерес для изучения представляет уникальный цитохром Р450 ВМЗ

(ВМЗ) с молекулярной массой 119 кДа [4], который содержит редуктазный (FMN/FAD) и гемовый домены, объединенные в единую полипептидную цепь, что обуславливает интерес к нему как к удобной упрощенной модели цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем [16]. Это придает изучению фермента стратегическое значение: исследование структурных факторов, определяющих субстратную селективность и электронный перенос в цитохромах Р450.

Флавоцитохром Р450 ВМЗ (ВМЗ), изолированный из почвенной бактерии Bacillus megateriwn в 1974 году Miura и Fulco [17], принадлежит к суперсемейству гемсодержащих ферментов цитохромов Р450. Он занимает особенное место в суперсемействе цитохромов Р450 как первый открытый бактериальный цитохром Р450, использующий редокс-партнер подобно эукориотическим Р450 (FAD/FMN-редуктаза^ NADPH-зависимая цитохром Р450 редуктаза, CPR) и как первый найденный фермент Р450, объединенный (fused) со своим редокс-партнером [4, 8].

ВМЗ катализирует гидроксилирование (в основном, (со-1), (ш-2) и (со-3) -гидроксилирование) насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с различной длиной цепи [18], спиртов и амидов [8]. Точная физиологическая функция ВМЗ остается пока неизвестной (2002 г.), хотя предполагается, что его роль -удаление токсичных жирных кислот из окружающей среды, то есть защита бактерии В. Megateriwn [19]. Он обладает максимально известной для цитохромов Р450 монооксигеназной активностью: скорость окисления арахидоновой кислоты -250 с"1 [20]. Каталитическая активность ВМЗ обусловлена переносом электронов с NADPH кофактора через флавиновый домен на гем [21]. Исследования кинетики переходных процессов показали, что быстрые скорости электронного переноса в флавиновом домене и между флавиновым доменом и Р450 лежат в основе каталитической эффективности фермента [21].

ВМЗ - водорастворимый белок, но его полная структура неизвестна (возможно, кристаллизация осложняется из-за наличия нескольких доменов и

гибких линкеров между ними [22]). Поэтому ключом к пониманию механизма его работы стала информация об атомарной структуре гемового домена без субстрата и в комплексе с субстратом (пальмитиновая кислота), полученная с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) [23, 24], а также проведен РСА части белка, содержащей два связанных домена: БМЫ- и гемсодержащий [5]. Атомарные структуры гемового домена выявили [23, 24], что аминокислотный остаток (а.о.) W96 (Тгр96, филогенетически консервативная аминокислота) вовлечен в водородные связи с гемовым пропионатом. Также было показано, что гемовый домен имеет длинный гидрофобный субстрат-связывающий канал, ведущий к гему, а при связывании с субстратом происходит соответствующая структурная перестройка так, что со-конец жирной кислоты остается на расстоянии 7 А от гемового железа. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) подтвердил наличие большого расстояния между субстратом и гемом, и что восстановление гема является триггером для секундного конформационного изменения, при котором жирная кислота оказывается в положении ближе к железу гема для осуществления окислительной реакции [25]. Таким образом, эти атомарные структуры обеспечили основу исследований роли различных аминокислот в ВМЗ. Имеются данные и по вторичной структуре ВМЗ (часть последовательности 13-628 а.о. [26]), основной вклад в эту структуру вносит а-спираль (56%), а доля Р-листов и поворотов составляет 31% и 13% соответственно.

ВМЗ является важной модельной системой для изучения и понимания структурно-функциональных механизмов в суперсемействе цитохромов Р450. К тому же исследование ВМЗ имеет биотехнологический потенциал. Несмотря на успехи структурной биологии в исследовании цитохромов Р450 млекопитающих и их редуктазных систем, ВМЗ является гибкой моделью благодаря его удобной модульной конструкции и растворимой природе. Изучение этого фермента может внести ясность как в вопросы по конформационной динамике, так и по термодинамическому контролю электронного переноса.

Таким образом, очевидным становится целесообразность усилий различных научных групп, направленных на изучение структуры и функций ВМЗ. Так, в работе [6] (20°С) на основе методов гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования было показано, что полноразмерный ВМЗ может существовать в мономерной и олигомерной формах, главным образом в виде димерной (>50%). В работе [7] была измерена Ка димеризации мономеров ВМЗ, которая составила 1.1±0.2 пМ. Авторами было продемонстрировано, что местом агрегации белка является главным образом редуктазный домен, и что даже мономер ВМЗ проявляет значительную конформационную подвижность. В ряде работ была измерена активность ВМЗ по гидроксилированию лауриновой кислоты в растворе, значения которой имеют большой разброс: кса, = от 80 б"1 до 2 б"1 (53 б"1 [7], 46 б"1 [27], 86 в"1 [20], 26 б" [28] и 2 б"1 [29]), а время оборота фермента, соответственно, находится в миллисекундном-секундном диапазоне. Причем, димеры проявляли большую активность, нежели мономеры: так согласно данным [7] - ксШ =50 б"1 и ксаI ~ Ю б"1, соответственно для димеров и мономеров (25°С). Также из исследований ВМЗ, содержащих аминокислотные замены (мутантные формы белка), в работе был сделан вывод, что электронный перенос происходит от КАХ)РН к РАБ, затем к БМЫ в пределах одного мономера (мутант А264Н), а от БМЫ к гему второго мономера (мутант С570Б) в пределах димера. Было показано, что ВМЗ каталитически активен только в димерной форме, а при разбавлении теряет свою активность [30]. Перечисленные выше методы являются косвенными методами определения олигомерного состояния белка, а уточнение олигомерного состояния ВМЗ представляется важной задачей для понимания механизма и создания модели его функционирования.

Температурная денатурация фермента и определение влияния температуры на его активность обычно исследуется для выяснения механизма функционирования фермента. Было обнаружено, что температурная зависимость каталитической активности ВМЗ имеет колоколообразный вид с максимумом при Т~25°С [31]. При этом для солюбилизированного белка

уменьшение активности при Т>25°С более выражено, чем для белка, иммобилизованного в золь-гель матрице [31]. Также работа [32] посвящена вопросу температурной зависимости каталитической активности ВМЗ, где исследовалась зависимость скорости инактивации редуктазного домена ВМЗ (BMR) от температуры (от 22°С до 36°С), энергия активации перехода BMR из активного состояния в неактивное составила 9,9±0,3 ккал/моль, что соответствует разрыву нескольких водородных связей. В этой же работе изучалась некаталитическая потеря активности BMR (30°С), и скорость инактивации составила 0,22 мин'1. Были выдвинуты предположения, что либо активные димеры BMR диссоциируют на неактивные мономеры, либо происходит его денатурация. Добавление избытка FMN в раствор ненамного уменьшало скорость инактивации с 0,22 до 0,13 мин"1, показав, что инактивация, вероятно, не связана с потерей флавина.

В работе [33] с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии были определены температуры плавления (Тт) интактного ВМЗ и его доменов. Для интактного ВМЗ значения Тт составили 48°С и 63°С. Эти значения соответствуют трем пикам на температурных профилях анфолдинга изолированного гемового домена (Тт = 58,7°С и 64,9°С) и редуктазного домена (Тт = 47,5°С).

Флуоресцентный анализ позволяет получать информацию о термодинамике белкового фолдинга с высокой чувствительностью [34]. В ВМЗ флуорофорами могут быть внутренние ароматические группы - остатки тирозина (Туг), триптофана (Тгр), фенилаланина (Phe), а также простетические флавиновые (FAD и FMN) группы. Известно, что ВМЗ имеет 12 Тгр, 35 Туг остатков (по известной структуре), в том числе в гемовом домене - 5 Тгр [35] и в редуктазном домене - 7 Тгр (в том числе флавин-связывающий Тгр 574 [36]), что делает его хорошим объектом для изучения методом флуоресцентного анализа. Наличие в ВМЗ как ароматических групп, так и флавиновых групп обуславливает возможность использования метода флуоресцентного анализа для изучения этого белка без использования меток. Интенсивность

флуоресценции ароматических остатков зависит от диэлектрической константы окружающей их среды [33]. Поэтому, наблюдая за положением спектральных полос, можно сделать вывод об изменении микроокружения ароматических остатков, то есть об изменении структуры молекулы белка. При выходе ароматических остатков на поверхность молекулы белка, например, при денатурации они оказываются в полярном, более гидрофильном окружении, что приводит к росту интенсивности флуоресценции и сдвигу максимума в длинноволновую область [37]. При разворачивании флавопротеинов под химическим или температурным воздействием флуоресценция FAD/FMN также возрастает [38]. Было показано, что при разбавлении ВМЗ теряет активность [30], при этом увеличивается интенсивность флуоресценции флавиновых групп [39].

Удобным методом исследования для исследования распределения ферментов по размерам и мониторинга активности отдельных молекул является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Для изучения процессов денатурации белков - сопряжение АСМ и флуоресцентной спектроскопии, так как они позволяют проводить измерения в условиях, близких к нативным. Поэтому, эти методы были использованы нами для исследования ВМЗ.

1.2 Энзимология единичных молекул ферментов

Изучение единичных биомолекул имеет определенные преимущества перед стандартным подходом, когда в экспериментах одновременно исследуется большое число биомолекул, и наблюдаются усредненные по ансамблю свойства. Одним из таких преимуществ является возможность получения информации о распределении молекулярных свойств биомолекул [40]. Это осуществляется посредством построения гистограммы конкретной переменной для множества молекул, распределение может быть получено из статической (различия между отдельными молекулами в нативном состоянии) или из динамической гетерогенности (медленные конформационные переходы, регулирующие катализ) [1]. Например, можно напрямую наблюдать множество стадий (ан)фолдинга белка, наличие которых в стандартных экспериментах лишь предполагается. Редкие состояния при (ан)фолдинге усредняются в ансамбле, тогда как в экспериментах исследования единичных молекул они могут быть обнаружены. Взаимосвязь и кинетические константы скорости между различными состояниями системы, имеющей дискретные состояния, могут быть напрямую измерены с помощью методов исследования единичных молекул. Так, с помощью флуоресценции единичных молекул были просчитаны разные этапы фолдинга и этапы ферментативной реакции рибозимов [43].

Также при изучении единичных молекул появляется возможность следить за биохимическими процессами в режиме реального времени и обнаружить переходные промелсуточные состояния (интермедиа™), что ранее могло быть получено только синхронизацией действия большого ансамбля молекул для наработки детектируемых концентраций интермедиатов. Этот аспект важен для прояснения механизмов ферментативных реакции [1]. Динамические характеристики систем обычно измеряются в равновесных условиях для единичных молекул (или небольших ансамблей). Это важно не только для исследования равновесной динамики, но и для динамики систем, которые не просто синхронизировать. Например, движение дезоксирибозимов

или молекулярных моторов вдоль их траекторий может быть сложным и стохастическим, что делает невозможным синхронизацию процессов для больших расстояний.

Результатом экспериментов с единичными молекулами ферментов часто являются их траектории, статистический анализ которых дает детальную информацию о динамике объекта, а результаты можно впоследствии сравнить с физическими моделями. Также манипуляции с единичными молекулами позволяют напрямую измерять молекулярные силы, структуру и их функциональный отклик на механическое воздействие.

Наконец, преимуществом методов изучения единичных молекул является их чувствительность. Некоторые биологические молекулы склонны к агрегации при высоких концентрациях, тогда как работа с малыми концентрациями или с единичными иммобилизованными молекулами позволяет следить за свойствами мономеров и олигомеров. К тому же, многие компоненты клетки находятся лишь в нескольких (или даже в одной) копии [42, 43, 44], следовательно, такие компоненты могут быть исследованы в нативной клеточной концентрации.

1.2.1 Методы измерения каталитической активности единичных молекул ферментов

К методам изучения единичных молекул относятся оптический и магнитный пинцет, метод связанной частицы (tethered particle motion) [45], флуоресцентный анализ единичных молекул [46] и атомно-силовая микроскопия (АСМ). Эти подходы могут стать инструментальным решением таких важных биологических задач, как, например, взаимодействие белок-ДНК, фолдинг белка и активность единичных белков, в том числе работа ферментов в живой клетке.

В 1961 Ротманом [47] была измерена каталитическая активность единичного фермента Р-галактозидазы. Смесь сильно разбавленного раствора фермента и сильно концентрированного флуорогенного субстрата переводилась

в мелкодисперсный аэрозоль, капли покрывались силиконовым маслом во избежание испарения. Диаметр образующихся капель составлял 0,1 - 40 мкм, фермент преобразовывал слабо флуоресцирующий субстрат в сильно флуоресцирующий продукт, а флуоресценция снималась с отдельных микрокапель после 10-15 часов инкубации. В этом подходе молекулы фермента случайно распределены по каплям, но при определенной концентрации большинство капель не будет содержать фермент, некоторые капли будут содержать 1 молекулу и совсем небольшое количество капель - по 2, 3 или более молекул. Прямое измерение числа оборотов проводилось по флуоресцентному продукту и составило 115 с"1. Флуоресценция капель мутантной формы фермента (в 57 р менее активен) не наблюдалась, а при использовании фермента, подвергшегося частичной термоинактивации снова наблюдалось распределение Пуассона для активности в каплях, показывая, что отдельные молекулы были как активными, так и неактивными, то есть некоторые молекулы сохраняли полную активность. Другими словами, продемонстрирована своего рода статическая гетерогенность [48].

Этот метод был трудоемким, поэтому группы [49] и [50] разработали капиллярный метод мониторинга за активностью ферментов: вместо аэрозоля, как в описанной выше работе, использовался кремниевый капилляр. После инкубации разбавленного раствора фермента с концентрированным раствором флуорогенного субстрата флуоресцентный продукт отделяли электрофорезом, который проходил через высокочувствительный лазер-индуцированный флуоресцентный детектор. Условия подбирались так, что в капилляре находилось 1-2 молекулы фермента. В этих работах была обнаружена статическая гетерогенность (рис. 1.2.1) в активности молекул фермента: на примере лактатдегидрогеназы [49] и щелочной фосфатазы [50] было продемонстрировано, что отдельные молекулы фермента имеют различные каталитические скорости, а энергия активации может отличаться в 3 раза для разных молекул [50, 51]. Yeung [49] предположили, что эти отличия от молекулы к молекуле подтверждают парадигму энергетического ландшафта в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бухарина, Наталья Сергеевна, 2014 год

ЛИТЕРАТУРА

1 Xie X.S. Single Molecule Approach to Enzymology // Single Molecule. 2001. V.4. P.229-236.

2 Kiselyova O., Yaminsky I. Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications / Braga P.C., Ricci D. Totowa, New Jersey. Humana Press. 2003. V. 242. P. 217-230.

3 Kuznetsov V.Yu., Ivanov Yu.D., Archakov A.I. Atomic force microscopy revelation of molecular complexes in the multiprotein cytochrome P450 2B4-containing system // Proteomics. 2004. V.4. P.2390-2396.

4 Narhi L.O., Fulco A.J. Characterization of a catalytically self-sufficient 119,000-dalton cytochrome P-450 monooxygenase induced by barbiturates in Bacillus megaterium // J. Biol. Chem. 1986. V.261(16). P.7160-7169.

5 Sevrioukova I., Li H., Zhang H., Peterson J. and T. Poulos. Structure of a cytochrome P450-redox partner electron-transfer complex // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. V.96(5). P.1863-1868.

6 Black S., Martin S. Evidence for conformational dynamics and molecular aggregation in cytochrome P450 102 (BM-3) // Biochem. 1994. V.33(40). P.12056-12062.

7 Neeli R., Girvan H.M., Lawrence A., Warren M.J., Leys D., et al. The dimeric form of flavocytochrome P450 CYP102A1 is catalytically functional as a fatty acid hydroxylase // FEBS Lett. 2005. V.579. P.5582-5588.

8 Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P450 and active oxygen / Archakov A.I., Bachmanova G.I. London, New York, Philadelphia, Taylor&Francis, 1990. p.275.

9 Ortiz de Montellano P.R. Cytochrome P450: structure, mechanism, and biochemistry / Ortiz de Montellano P.R. New York. Plenum Press. 1995.

10 Anzenbacher P. and Anzenbacherova E. Cytochromes P450 and metabolism of xenobiotics // Cell Mol Life Sci. 2001. V.58. P.737-747.

11 Munro A.W., Leys D.G., McLean K.J., Marshall K.R., Ost T.W., et al. P450 BM3: the very model of a modern Flavocytochrome // Trends Biochem Sci. 2002. V.27. P.250-257.

12 Wang M., Roberts D.L., Paschke R., Shea T.M., Masters B.S., et al. Three-dimensional structure of NADPH-cytochrome P450 reductase: prototype for FMN- and FAD-containing enzymes // PNAS. USA. 1997. V.94. P.8411-8416.

13 Williams P.A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E.F., McReee D.E. The crystallographic structure of a mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity // Mol. Cell. 2000. V.5. P.121-132.

14 Yano J.K., Wester M.R., Schoh G.A., Griffin K.J., Stout C.D., et al. The structure of human microsomal cytochrome P450 3A4 determined by X-ray crystallography to 2.05 A resolution // J. Biol. Chem. 2004. V.279. P.38091-38094.

15 http://humbio.ru/humbio/proteins/001 lc44c.htm

16Narhi L.O., Fulco A.J. Identification and characterization of two functional domains in cytochrome P-450BM-3, a catalytically self-sufficient monooxygenase induced by barbiturates in Bacillus megaterium // J. Biol. Chem. 1987. V.262(14). P.6683-6690.

17 Miura Y.3 Fulco A.J. (Omega -2) hydroxylation of fatty acids by a soluble system from bacillus megaterium // J.Biol. Chem. 1974. Y.249. P. 1880-1888.

18 Miura Y., Fulco A.J. Omega-1, Omega-2 and Omega-3 hydroxylation of long-chain fatty acids, amides and alcohols by a soluble enzyme system from Bacillus megaterium. // Biochim Biophys. Acta. 1975. V.388. P.305-317.

19 Gustafsson M.C., Palmer C.N., Wolf C.R., and von Wachenfeldt C. Fatty-acid-displaced transcriptional repressor, aconserved regulator of cytochrome P450 102 transcription in Bacillus species // Arch. Microbiol. 2001. V.176. P.459-464.

20 Noble M.A., Miles C.S., Chapman S.K., Lysek D.A., MacKay A.C., et al. Roles of key active-site residues in flavocytochrome P450 BM3 // Biochem. J. 1999. V.339. P.371-379.

21 Munro A.W., Daff S., Coggins J.R., Lindsay J.R., Chapman S.K. Probing electron transfer in flavocytochrome P-450 BM3 and its component domains // Eur. J. Biochem. 1996. V.239. P403-409.

22 Warman A.J., Roitel O., Neeli R., Girvan H.M., Seward H.E., et al. Flavocytochrome P450 BM3: an update on structure and mechanism of a biotechnologically important enzyme // Biochem Society Transactions. 2005. V.33(4). P.747-753.

23 Ravichandran K.G., Boddupalli S.S., Hasemann C.A., Peterson J.A., Deisenhofer J. Crystal structure of hemoprotein domain of P450 BM3: A prototype for microsomal P450s // Science. 1993. V.261. P. 170-176.

24 Li H., Poulos T.L. The structure of the cytochrome P450 BM-3 heme domain complexed with the fatty acid substrate, palmitoleic acid // Nat. Struct. Biol. 1997. V.4. P.140-146.

25 Modi S. The catalytic mechanism of cytochrome P450 BM3 involves a 6 Angstrom movement of the bound substrate on reduction // Nat. Struct. Biol. 1996. V.3.P.414-417.

26 http://www.unipr0t.0rg/unipr0t/p 14779

27 Girvan H.M., Toogood H.L., Littleford R.E., Seward H.E., Smith W.E., et al. Novel haem co-ordination varients of flavocytochrome P450 CYP102A1 // Biochem. J. 2009. V.417. P.65-76.

28 Oliver C.F., Modi S., Primrose W.U., Lian L. and Roberts G.C.K. Engineering the substrate specificity of Bacillus megaterium cytochrome P-450 BM3: hydroxylation of alkyl trimethylammonium compounds // Biochem. J. 1997. V.327. P.537-544.

29 Boddupalli S.S., Estabrook R.W., Peterson J.A. Fatty acid monooxegention by cytochrome P-450CYpio2ai H The Journal of Biological Chemistry. 1990. V.265(8). P.4233-4239.

30 Kitazume Т., Haines D.C., Estabrook R.W., Chen В., Peterson J.A. Obligatory intermolecular electron-transfer from FAD to FMN in dimeric P450BM-3 // Biochemistry. 2007. V.46. P. 11892-11901.

31 Maurer S.C., Schulze H., Schmid R.D., Urlacher V. Immobilisation of P450 BM-3 and an NADP+ cofactor recycling system: towards a technical appication of heme-containing monooxygenases in fine chemical synthesis // Adv. Synth. Catal. 2003. V.345.P. 802-810.

32 Jamakhandi A.P., Jeffus B.C., Dass V.R., Miller G.P. Thermal inactivation of the reductase domain of cytochrome P450 BM3 // Arch Biochem Biophys, 2005. V.439, 165-174.

33 Munro A.W., Lindsay J.G., Coggins J.R., Kelly Sh.M., Price N.C. Analysis of the structural stability of the multidomain enzyme flavocytochrome P-450 BM3 // Biochemica et Biophysica Acta. 1996. V.1296. P.127-137.

34 Eftink M.R. The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins //Biophys. J.1994. V.66. P.482-501.

35 Khan K., Mazumdar S., Modi S., Sutcliffe M., Roberts G., Mitra S. Steady-state and picosecond-time-resolved fluorescence studies on the recombinant heme domain of Bacillus megaterium cytochrome P-450 // Eur. J. Biochem. 1997. V.244. P.361-370.

36 Munro A.W., Noble M.A., Ost T., Green A.J., McLean K.J., Robledo L., Miles C.S., Murdoch J., Chapman S.K. Subcellular Biochemistry / Holzenburg and Scrutton. New York. Kluwe Academic Plenum Publishers. 2000. P.297-315.

37 Uversky V.N., Ptitsyn O.B. All-or-none solvent-induced transitions between native, molten globule and unfolded states in globular proteins // Fold. Des. 1996. V.l.P.l 17-122.

38 Shakhnovich E.I., Finkelstein A.V. Theory of cooperative transitions in protein molecules. I. Why denaturation of globular protein is a first order phase transition //Biopolymers. 1989. V.28. P.1667-1680.

39 Girvan H.M., Dunford A.J., Neeli R., Ekanem I.S., Waltham T.N., et al. Flavocytochrome P450 BM3 mutant W1046A is a NADH-dependent fatty acid hydroxylase: implications for the mechanism of electron transfer in the P450 BM3 dimer // Arch. Biochem. Biophys. 2011. V.507. P.75-85.

40 Deniz A.A., Mukhopadhyay S., Lemke E.A. Single-molecule biophysics: at the interface of biology, physics and chemistry // J. R. Soc. Interface. 2008. V.5. P.15-45.

41 Zhuang X., Kim H., Pereira M.J., Babcock H.P., Walter N.G., et al. Correlating structural dynamics and function in single ribozyme molecules // Science. 2002. V.296. P.1473-1476.

42 Deniz A.A., Mukhopadhyay S., Lemke E.A. Single-molecule biophysics: at the interface of biology, physics and chemistry // J. R. Soc. Interface. 2008. V.5, 1545.

43 Ghaemmaghami S., Huh W., Bower K., Howson R. W., Belle A., Dephoure N., O'Shea E. K. and Weissman J. S. Global analysis of protein expression in yeast // Nature. 2003. V.425. P.737-741.

44 Bon M., McGowan S. J. and Cook, P. R. Many expressed genes in bacteria and yeast are transcribed only once per cell cycle// FASEB J. 2006. V.20. P. 17211723.

45 http://en.wikipedia.org/wiki/Tethered_particle_motion

46 Bai C., Wang C., Xie X. S. and Wolynes P.G. Single molecule physics and chemistry // PNAS. 1999. V. 96. P.l 1075-11076.

47 Rotman B. Measurement of activity of single molecules of beta-D-galactosidase // PNAS. 1961. V. 47. P.1981-1991.

48 Knight A.E. Single enzyme studies: a historical perspective / Methods in Molecular Biology. Springer Science and Business Media. 2011. V.778. P. 1-9.

49 Xue Q. and Yeung E. S. Differences in the chemical reactivity of individual molecules of an enzyme//Nature. 1995. V.373. P.681-683.

50 Craig D. B., Arriaga E., Wong J. C. Y., Lu H., and Dovichi N. J. Studies on single alkaline phosphatase molecules: Reaction rate and activation energy of a reaction catalyzed by a single molecule and the effect of thermal denaturation - the death of an enzyme //JACS. 1996. V.l 18. P.5245-5253.

51 Craig D. B., Arriaga E., Wong J. C. Y., Lu H. and Dovichi N. J. The life and death of a single enzyme molecule // Anal. Chem. 1998. V.70. P39A-43A.

52 Varki A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct // Glycobiology. 1993. V.2. P.97-130.

53 Polakowski R., Craig D., Skelley A. and Dovichi N. J. Single molecules of highly purified bacterial alkaline phosphatase // JACS. 2000. V.122. P.4853-4855.

54 Funatsu T., Harada Y., Tokunaga M., Saito K. and Yanagida T. Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution //Nature. 1995. V.374. P.555-559.

55 Lu H.P., Xun L., Xie X. S. Single-molecule enzymatic dynamics // Science. 1998. V.282. P. 1877 -1882.

56 AustinR. H., Beeson K. W., Eisenstein L., Frauenfelder H. and Gunsalus I. C. Dynamics of ligand-binding to myoglobin // Biochemistry. 1975. V.14. P.5355-5373.

57 Yang H., Luo G., Karnchanaphanurach P., Louie T.-P., Rech I.,Cova S., Xun L. Xie X. S. Protein conformational dynamics probed by single-molecule electron transfer// Science. 2003. V.302. P.262-266.

58 Min W., Luo G., Cherayil B.J., Kou S. C., Xie X.S. Observation of a power-law memory kernel for fluctuations within a single protein molecule // Phys. Rev. Lett. 2005. V.94. P.198302-198305.

59 Weiss S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules // Science. 1999. V.283. P.1676-1683.

60 Xie X.S. Enzymology and Life at the Single molecule level / Single molecule spectroscopy in chemistry, physics and biology Nobel symposium. SpringerVerlag Berlin Heidelberg. 2010. P. 435-448.

61 English B.P., Min W, van Oijen A.M., Lee K.T., Luo G, Sun H", CherayilB.J., Kou S.C. and Xie X.S. Ever-fluctuating single enzyme molecules: MichaelisMenten equation revisited // Nat. Chem. Biol. 2006. V.2. P.87-94.

62 Michaelis L., Menten M.L. The Kinetics of invertase action // Biochem. Z. 1913. V.49. P.333-375.

63 Kou S.C., Cherayil B.J., Min W., English B.P., Xie X.S. Single-molecule Michaelis - Menten equations // J. Phys. Chem. B. 2005. V.109. P.19068-19081.

64 Velonia К., Flomenbom О., Loos D., Masuo S., Cotlet M., Engeelborghs Y., Hofkns J., Rown A.E., Klafter J., Nolte R., de Schryver F.C. Single-enzyme kinetics of calb-catalyzed hydrolysis // Angew. Chem. Int. Ed. 2005. V.117. P.499-501.

65 Flomenbom O., Velonia K., Loos D., Masuo S., Cotlet M., Engeelborghs Y., Hofkns J.,. Rown A.E, Nolte R., van der Auweraer M., de Schryver F.C., Klafter J. Stretched exponential decay and correlations in the catalytic activity of fluctuating single lipase molecules // PNAS. 2005. V.102. P. 2368-2372.

66 Zwanzig R. Rate processes with dynamical disorder // Acc. Chem. Res. 1990. V.23. P.148-152.

67 Yang, S., Witkoskie, J.B., Cao, J. Single-molecule dynamics of semiflexible Gaussian chains//J. Chem. Phys, 2002. V.117. P. 11010-11023.

68 van Oijen A.M., Blainey P.C., Crampton D.J., Richardson C.C., Ellenberg Т., Xie X.S. Single-molecule kinetics of X exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder// Science. 2003. V.301. P. 1235-1238.

69 Binning G., Quate C.F., Gerber C. Atomic force microscope // Phys. Rev. Lett. 1986. V. 56. P. 930-933.

70 Миронов В.JI. Основы сканирующей зондовой микроскопии. - Н. Новгород: 2004.- 110 С.

71 Kuznetsov V.Y., Ivanov Y.D., Bykov V.A., Saunin S.A., Fedorov I.A., Lemeshko S.V., Hoa H.B., Archakov A.I. Atomic force microscopy detection of molecular complexes in multiprotein P450cam containing monooxygenase system // Proteomics. 2002. V.12. P. 1699-705.

72 Kuznetsov V.Y., Ivanov Y.D., Archakov A.I. Atomic force microscopy revelation of molecular complexes in the multiprotein cytochrome P450 2B4-containing system // Proteomics. 2004. V.8. P.2390-2396.

73 Ivanov Y.D., Frantsuzov P.A., Zollner A., Medvedeva N.V., Archakov A.I., Reinle W., Bernhardt R. Atomic force microscopy study of protein-protein interactions in the cytochrome CYP11A1 (P450scc)-containing steroid hydroxylase system//Nanoscale Res Lett. 2011. V.6. P. 1-13.

74 Ivanov Yu.D., Frantsuzov P.A., Pleshakova T.O., Ziborov V.S., Svetlov S.K., Krohin N.V., Konev V.A., Kovalev O.B., Uchaikin V.F., Yastrebova O.N., Sveshnikov P.G. and Archakov A.I.. Atomic force microscopy detection of serological markers of viral hepatites B and C // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2010. V.4. P.l 17-122.

75 Kaysheva A.L., Ivanov Yu.D., Zgoda V.G., Frantsuzov P.A., Pleshakova T.O., Krokhin N.V., Ziborov V.S. and Archakov A.I.. Visualization and identification of hepatitis C viral particles by atomic force microscopy combined with MS/MS analysis // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2010. V.4. P.15-24.

76 Muller D.J. and Engel A. Atomic force microscopy and spectroscopy of native membrane proteins //Nature Protocols. 2007. V.2. P.2191-2197.

77 Butt H.-J., Guckenberger R., Rabe J. P. Quantitative scanning tunneling microscopy and scanning force microscopy of organic materials // Ultramicroscopy. 1992. V.46. P.375-393.

78 Zhang Y, Sheng S, Shao Z. Imaging biological structures with the cryo atomic force microscope//Biophys J. 1996. V.71. P.2168-2176.

79 Möller C., Allen M., Elings V., Engel A., Müller D.J. Tapping-mode atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces // Biophys. J.1999. V.77, P.l 150-1158.

80 Thomson N. Imaging the substructure of antibodies with tapping-mode AFM in air: the importance of a water layer on mica // J Microsc. 2005. Y.217. P. 193-199.

81 Ivanov Yu., Frantsuzov P., Ivanov A., Bykov V., Besedin S., Hui Bon Hoa G., Archakov A. Comparative investigation of PdR by usual and ultrafine atomic force microscopy // Anal. Methods. 2010. V.2. P.688-693.

82 Radmacher M., Fritz M., Hansma H.G., Hansma P.K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope // Science. 1994. V.265. P. 1577-1579.

83 Thomson N.H., Fritz M., Radmacher M., Cleveland J.P., Schmidt Ch.F., Hansma P.K. Protein tracking and detection of protein motion using atomic force microscopy//Вiophys J. 1996. V.70. P.2421-2431.

84 Arnoldi M., Schaffer Т.Е., Fritz M., Radmacher M. Direct observation of single catalytic events of chitosanase by atomic force microscopy // J of AZoNano -Online Journal ofNanotechnology . 2005. V.l(al08). P.l-ll.

85 Soman P., Rice Z., Siedlecki C.A. Measuring the time-dependent functional activity of adsorbed fibrinogen by atomic force microscopy // Langmuir. 2008. V.24. P.8801-8806.

86 Carmichael A.B., Wong L.L. Protein engineering of Bacillus megaterium CYP102: the oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Eur. J. Biochem. 2001. V.268. P.3117-3125.

87 Omura Т., Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes: I. Evidence for its hemoprotein nature // J. Biol. Chem. 1964. V.239. P.2370-2378.

88 Boddupalli S.S., Pramanik B.C., Slaughter C.A., Estabrook R.W. and Peterson J.A. Fatty acid monooxygenation by Р450Вм-з: product identification and proposed mechanisms for the sequential hydroxylation reactions // Archives Of Biochemistry And Biophysics. 1992. V.292. P.20-28.

89 Meharenna Y.T., Oertel .P, Bhaskar В., Poulos T.L. Engineering ascorbate peroxidase activity into cytochrome с peroxidase // Biochemistry. 2008. V.47. P.10324-10332

90 Hagel L. Protein purification: principles, high-resolution methods, and applications / Janson J.-C. New Jersey. Wiley. 2011. V.54. p.62.

91 Дудин И.В., Нариманов P.K. Сопротивление при медленном движении эллипсоида // Известия Томского Политехнического Университета. 2004. Т.307. №3. С. 17-21.

92 Andries С., Clauwaert J. Photon correlation spectroscopy and light scattering of eye lens proteins at high concentrations // Biophys. J. 1985., V.47. P.591-605.

© /?

93 Santos S., Barcons V., Christenson HK^Font J. and Thomson N.H. The intrinsic resolution limit in the atomic force microscope: implications for heights of nano-scale features // PLoS One. 2011. V.6, e23821.

94 Santos S., Barcons V., Font J. and Thomson N. H. Bi-stability of amplitude modulation AFM in air: deterministic and stochastic outcomes for imaging biomolecular systems //Nanotechnology. 2010. V.21. P.225710-225720.

95 Yamada H., Kobayashi K. Applied scanning probe methods VI / B. Bhusan, S. Kawata eds. Springer. 2007. P.205-245.

96 Tamayo J., Humphris A.D., Owen R.J., Miles M.J. High-g dynamic force microscopy in liquid and its application to living cells // Biophys. J. 2001. V.81. P.526-537.

97 Forneris F., Orru R., Bonivento D., Chiarelli L.R., Mattevi A. ThermoVAD, a Thermofluor®-adapted flavin ad hoc detection system for protein folding and ligand binding // FEBS Journal. 2009. V.276. P.2833-2840.

98 Alexandrov A.I., Mileni M., Chien E., Hanson M., Stevens R. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins // Structure. 2008. V.16. P.351-359.

99 Ling G.N. Life at the cell and below-cell level. The hidden history of fundamental revolution in biology / Ling G.N. New York. Pacific Press. 2001. P. 1-724

100 Miller A.D., Tanner J. Essentials of Chemical Biology: Structure and Dynamics of Biological Macromolecules / Miller A.D., Tanner J. England John Wiley&Sons Ltd. 2008. P.196-197.

101 Day R., Bennion B.J., Ham S., Daggett V. Increasing temperature accelerates protein unfolding without changing the pathway of unfolding // J. Mol. Biol. 2002. V.322. P. 189-203.