Вирусные сообщества в оз. Байкал тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.08, кандидат наук Потапов Сергей Анатольевич

• Потапов Сергей Анатольевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Потапов Сергей Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика вирусов

1.2 Вирусы в водоёмах

1.2.1 Вирусы в морских экосистемах

1.2.2 Вирусы в пресноводных экосистемах

1.2.3 Вирусы - активные компоненты трофических цепей водных экосистем

1.3 История изучения вирусов на Байкале

1.4 Молекулярно-генетические исследования водных бактериофагов

1.5 Исследование гена g23 с использованием высокопроизводительного секвенирования

1.6 Метагеномные исследования вирусных сообществ

1.7 Анализ Р-разнообразия сообществ

1.8 Проточная цитометрия

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Химический анализ воды

2.2.2 Определение концентрации хлорофилла

2.2.3 Эпифлуоресцентная микроскопия, трансмиссионная электронная микроскопия, проточная цитометрия

2.2.4 Секвенирование гена g23 Т4-подобных бактериофагов в биоплёнках методом Сенгера

2.2.5 Таргетное секвенирование фрагмента гена g23 с использованием высокопроизводительного секвенирования

2.2.6 Метагеномное секвенирование вирусного сообщества в оз. Байкал (виром)

ГЛАВА 3. ЧИСЛЕННОСТЬ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ И БАКТЕРИЙ В ОЗЕРЕ БАЙКАЛ

3.1 Оценка численности бактерий и вирусных частиц методами проточной

цитометрии и эпифлуоресцентной микроскопии

3.2 Оценка вертикального распределения вирусных частиц, бактерий, пикоцианобактерий в разные периоды термальной стратификации

3.3 Сезонная динамика численности вирусных частиц и бактерий, метод ЭФМ

3.4 Межгодовая динамика численности вирусных частиц и бактерий, метод ЭФМ

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ РАЗНООБРАЗИЯ ^-СООБЩЕСТВ БАКТЕРИОФАГОВ В БИОПЛЁНКАХ ОЗ. БАЙКАЛ

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ G23 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ БАКТЕРИОФАГОВ ОЗ. БАЙКАЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

ГЛАВА 6. МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ ВИРИОПЛАНКТОНА ПЕЛАГИАЛИ ОЗ. БАЙКАЛ

6.1 Химический анализ воды

6.2 Таксономический состав виромов

6.3 Анализ последовательностей на уровне вида

6.4 Функциональное аннотирование генов

6.5 Анализ скаффолдов

6.6 Сравнительный анализ виромов

6.7 Анализ массивов многомерных данных физико-химических и микробиологических показателей

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вирусные сообщества в оз. Байкал»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Вирусы - облигатные внутриклеточные паразиты, состоящие из одной или двух молекул РНК или ДНК, заключенных в белковую оболочку (капсид), некоторые из них имеют дополнительную липидную мембранную оболочку. Вирусные сообщества водных экосистем представлены вирусами эукариот, бактерий и архей; вирусы последних двух доменов обычно называют фагами. В водной среде вирусы присутствуют как в виде свободных частиц, так и внутри клетки хозяина. Среди водных вирусов преобладают ДНК-содержащие хвостатые бактериофаги (Tapper, Hicks, 1998; Yan-Ming, Xiu-Ping, Qi-Ya, 2006).

Вирусы являются наиболее многочисленным компонентом биоты водных экосистем, их количество достигает 106-108 частиц/мл. Они играют ключевую роль в регулировании численности и состава микробных сообществ, вызывая инфицирование и гибель микроорганизмов (Klut, Stockner, 1990; Bergh et al., 1989; Noble, Fuhrman, 1999; Proctor, Fuhrman, 1990; Weitz, Wilhelm, 2012; Wilhelm, Suttle, 1999). Вирусы принимают активное участие в биогеохимических циклах, изменяя потоки вещества и энергии. В результате «вирусного шунта» в «микробной петле» происходит отклонение части потока органического вещества от направления вверх по пищевым цепям к основанию пищевой пирамиды (Fuhrman, 1999; Weitz, Wilhelm, 2012; Wilhelm, Suttle, 1999). Велико влияние вирусов на генетическое разнообразие и эволюцию прокариот (Schwalbach, Hewson, Fuhrman, 2004).

Несмотря на признание факта, что вирусы являются важной и неотъемлемой частью микробиоценозов водных экосистем, в настоящий период имеется лишь небольшое количество работ, направленных на изучение разнообразия и структуры пресноводных вирусных сообществ, особенно в различных экотопах. В последние годы значительно возрос интерес к изучению микробных биопленок, формирующихся на различных

субстратах, на границах раздела фаз, что обусловлено их огромной ролью в биомедицинских и биотехнологических процессах. Установлено, что бактериофаги способны эффективно разрушать микробные биопленки (Harper et al., 2014; Lewis, 2007).

Первые данные о высокой концентрации вирусных частиц в воде оз. Байкал получены благодаря методу эпифлуоресцентной микроскопии (ЭФМ) (Белых, Беликов, 2000). В дальнейшем, используя электронную микроскопию, описана морфология фагов, произведена оценка их численности, сезонной и межгодовой динамики (Дрюккер, Дутова, 2006; Дрюккер, Дутова, 2009). Разнообразие клонированных последовательностей Т4-подобных бактериофагов в планктоне северной и южной котловин оз. Байкал впервые описано в 2008 г. с использованием маркеров к гену капсидного белка (Бутина, Белых, Беликов, 2010).

Отсутствие универсального генетического маркера для поиска и идентификации вирусов, чрезвычайно затрудняющее изучение вирусных сообществ, вызвало необходимость использования разнообразных специфических праймеров для различных таксономических групп (Breitbart, Miyake, Rohwer, 2004; Filée et al., 2005; Fuller et al., 1998; Schroeder et al., 2002; Zhong et al., 2002).

В последние годы применение метода высокопроизводительного секвенирования позволило решить многие методические проблемы и значительно расширило возможности изучения биоразнообразия, структуры и функционального потенциала вирусных сообществ как в морских, так и в пресных водах (Gong et al., 2018; Skvortsov et al., 2016; Watkins et al., 2015).

До настоящего исследования не было сведений не только о виромах пелагиали оз. Байкал, но и о виромах других древнейших озер мира, как и о влиянии на состав и структуру вирусных сообществ абиотических и биотических факторов среды.

Цель работы - установление генетического разнообразия и структуры вирусных сообществ планктона, нейстона и перифитона оз. Байкал, а также количественных показателей и динамики развития планктонных вирусов в пелагиали с учетом абиотических и биотических факторов среды.

Задачи исследования:

1. Определить численность вирусных частиц и бактерий в планктоне пелагиали оз. Байкал методом эпифлуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии (ПЦ).

2. Охарактеризовать разнообразие Т4-подобных бактериофагов в различных экотопах оз. Байкал: поверхностном микрослое воды, биоплёнках каменистых субстратов и губок на основе анализа генов капсидного белка gp23 методом секвенирования по Сэнгеру, сравнить их состав с бактериофагами других природных местообитаний.

3. Определить альфа- и бетаразнообразие сообществ планктонных бактериофагов на основе метода высокопроизводительного секвенирования.

4. Установить состав, структуру и функциональный потенциал ДНК-содержащих виромов оз. Байкал и оценить их в биогеографическом аспекте.

5. Оценить экологические факторы, влияющие на количественные и качественные характеристики вирусных сообществ.

Научная новизна работы. Впервые проведена количественная оценка вирусных частиц и бактерий в оз. Байкал методом проточной цитометрии, определены экологические факторы, влияющие на численность микробных сообществ. Впервые выполнен анализ виромов по гену g23 методом высокопроизводительного секвенирования. Впервые дана сравнительная характеристика генетического разнообразия g23-сообществ поверхностного микрослоя воды, воды и биоплёнок, сформированных на камнях и губках. Получены данные о высоком разнообразии семейства Myoviridae. Выявлена группа байкальских Т4-цианофагов, поражающих пикопланктонные

цианобактерии. Впервые выполнено метагеномное секвенирование вирусных сообществ в пелагической зоне оз. Байкал, установлены состав и структура виромов, проведена функциональная аннотация генов. С помощью методов статистического анализа вирусных сообществ ряда водных экосистем показано, что морфометрические показатели и трофический статус водоёмов влияют на состав виромов. Установлена клада «великих озер мира». Сравнительный анализ виромов выявил их существенные различия в зависимости от физико-химических условий среды и состава бактериопланктона. Методом многомерного неметрического шкалирования показано, что наибольшее влияние на численность вирусных частиц оказывает количество бактерий и температура воды.

Теоретическая и практическая значимость полученных результатов. Результаты диссертационной работы существенно дополняют и расширяют имеющиеся в литературе сведения о таксономическом составе вирусных сообществ в пресноводных экосистемах и, в частности, о биоразнообразии T4-подобных вирусов семейства Myoviridae. Полученные в работе последовательности и массивы данных NGS зарегистрированы в базах MG-RAST, NCBI, они находятся в открытом доступе и могут быть использованы при сравнительном анализе других водоёмов. Метод проточной цитометрии, примененный для учета вирусных частиц и бактерий, а также качественного анализа проб, дал возможность с меньшими затратами времени произвести достоверную оценку микробных сообществ оз. Байкал, что позволяет рекомендовать его для мониторинга ультрамикропланктона водных экосистем.

Использованные в работе методы и подходы могут быть востребованы государственными органами РФ для биоконтроля вод оз. Байкал, выявления патогенных вирусов человека и животных. Присутствие T4-подобных фагов является косвенным подтверждением наличия условно-патогенных и патогенных бактерий, их идентификация и исследование биоразнообразия имеют значимость для санитарных служб.

Степень обоснованности и достоверности полученных научных результатов подтверждена использованием в качестве теоретической и методической базы трудов отечественных и зарубежных исследователей, а также воспроизводимостью полученных данных. В исследовании использованы современные методы и подходы с отработанными методиками: электронная микроскопия, выделение ДНК, амплификация со специфичными праймерами, лигирование, трансформация, секвенирование и биоинформатический анализ. Полученные нуклеотидные

последовательности по методу Сенгера (85 шт.) зарегистрированы в международной БД GenBank. «Сырые» данные, полученные в результате высокопроизводительного секвенирования, депонированы в архив SRA (NCBI) под номером SRR5469168 (g23 сообщества) и PRJNA547700 (виромы) и в базу MG-RAST (виром): mgm4814173.3 (подлёдное сообщество), mgm4816981.3, mgm4821571.3, mgm4816982.3 (поздневесеннее сообщество). Анализ последовательностей выполнен с помощью онлайн-серверов и стандартных пакетов программ для работы с последовательностями: BLAST, Mega 7, MrBayes v. 3.2.1., QIIME v. 1.9.1, Tracer v. 1.6, CD-HIT v. 4.8.1., MG-RAST, R v. 3.5.1, SPAdes v. 3.5.0. Полученные в работе данные корректно соотносятся с результатами других авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Вирусные сообщества различных экотопов оз. Байкал характеризуются высоким генетическим и таксономическим разнообразием. Численность вирусов в пелагиали, их сезонная изменчивость и соотношение численности вирусов к бактериям в эпилимнионе и гиполимнионе соответствуют показателям характерным для олиготрофных озёр. Численность и состав вирусных сообществ находятся в прямой зависимости от температуры воды и численности бактерий.

2. В составе ДНК-содержащих вирусных сообществ оз. Байкал доминируют бактериофаги, принадлежащие хвостатым фагам семейств

Myoviridae, Podoviridae и Siphoviridae, среди них преобладают вирусы семейства Myoviridae, в том числе присутствует значительное количество литических Т4-подобных бактериофагов, что свидетельствует о высокой потенциальной способности воды озера к самоочищению от бактериального загрязнения.

Реализация и внедрение результатов исследования. Теоретические положения и результаты исследования использованы при подготовке научных отчетов по базовому бюджетному проекту ЛИН СО РАН «Микробные и вирусные сообщества в биопленках пресноводных экосистем: таксономическое разнообразие, особенности функционирования и биотехнологический потенциал» № 0345-2019-0003 (АААА-А16-116122110061-6), а также грантам РФФИ № 10-04-01613 «а» (2010-2013 гг.), № 11-04-92220-Монг «а» (2011-2012 г.), № 14-04-90421-Укр «а» (2014-2015 гг.), № 15-34-51048 «мол_нр» (2015-2016 гг.), № 16-54-44035. Монг_«а» (2016-2017гг.), № 18-34-00513 «мол_а» (2018-2019 гг.).

Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований автора, выполненных согласно планам научно -исследовательских работ в лаборатории водной микробиологии ЛИН СО РАН в рамках базовых проектов и грантов РФФИ. Фактические данные получены автором при его непосредственном участии в экспедиционных и лабораторных работах, включая анализ и обобщение полученных результатов в течение 2008-2019 гг.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на научно-практической конференции с международным участием «Питьевая вода в XXI веке» (Иркутск, 2013), на всероссийской научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (г. Улан-Удэ, 2016), международной научно-технической конференции «Системы контроля окружающей среды» (г. Севастополь, 2016), Научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Социально-экологические проблемы

байкальского региона и сопредельных территорий» (г. Иркутск, 2018), международной конференции «Пресноводные экосистемы - современные вызовы» (г. Иркутск, 2018), международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Социально-экологические проблемы байкальского региона и сопредельных территорий» (г. Иркутск, 2019), 2-м Российском микробиологическом конгрессе (г. Саранск, 2019), V Международном Байкальском Микробиологическом Симпозиуме «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах» (г. Иркутск, 2020).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 27 научных работ, из них одна монография, 12 - входящих в действующий список BAK, 6 - статьи в рецензируемых изданиях, включённых в систему цитирования Web of Science, 14 - тезисы конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 156 страницах, содержит 11 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 298 источников, из которых 24 на русском языке и 270 на иностранных языках и 4 источника интернет ресурсов.

Благодарности. Выражаю искреннюю признательность и благодарность научному руководителю к.б.н., доценту Ольге Ивановне Белых. Благодарю к.б.н. Т.В. Бутину, к.б.н. И.В. Тихонову, д.б.н. В.В. Дрюккера, к.б.н. А.С. Гладких, к.б.н. В.С. Муханова, А.Ю. Краснопеева, Г.В. Подлесную за ценные советы, рекомендации и неоценимую помощь при подготовке диссертации, д.г-м.н. А.П. Федотова и Н.А. Жученко за предоставленную возможность использовать данные по гидрохимическому анализу воды. Выражаю благодарность сотрудникам лаборатории водной микробиологии за помощь в организации работы, предоставление реактивов и консультации, а также сотрудникам приборного центра ЛИН СО РАН «Электронная микроскопия» и ЦКП «Геномика» (г. Новосибирск),

сотрудникам лаборатории микропланктона ФИЦ ИнБЮМ (г. Севастополь) и сотрудникам ЦКП ИСКЦ СО РАН (кластер «Академик В.М. Матросов»).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика вирусов

Термин «вирус» (лат. virus - «яд») широко использовался ещё в средневековой медицине, им обозначали всё опасное. Симптомы, характеризующие вирусную инфекцию, упоминаются с античности (симптомы бешенства, кори, оспы, паралитического полиомиелита и т.д.). В специальной биологической литературе патологические явления, связанные с вирусами, отражены начиная с эпохи Возрождения, главным образом, они приведены в ботанических работах, например, описание пятнистости лепестков тюльпана (Пиневич и др., 2012).

Начальной датой развития вирусологии считаются 90-е годы XIX века. В 1892 г. появилась статья Д.И. Ивановского о болезни табака, вызванной, по мнению автора, фильтрующейся бактерией либо бактериальным токсином, в 1898 г. произошло повторное открытие вируса табачной мозаики М. Бейеринком. Позднее выяснилось, что гипотеза Д.И. Ивановского о бактериальной природе возбудителя оказалась ошибочной, концепция М. Бейеринка была ближе к истине, но он сделал неверный вывод из своих работ, указав, что возбудитель табачной мозаики представляет собой «заразную живую жидкость», т.е. имеет химическую природу.

В экспериментах, приведших к косвенным открытиям вирусов табачной мозаики, ящура, желтой лихорадки, была установлена их основная характеристика - маленький размер, благодаря которому они способны проходить через фильтры, задерживающие бактерии (Waterson, Wilkinson, 1978). Вследствие методических возможностей того времени самые ранние исследования и попытки классификации вирусов были направлены на изучение их патогенных свойств, тропизма, вирулентности и т.д.

Формальной датой открытия вирусов можно считать 1939 г., когда благодаря изобретению электронного микроскопа появились первые изображения вирусов, и вышла публикация немецких вирусологов Г. Кауше, Э. Пфанкух и Х. Руска (Kausche, Pfankuch, Ruska, 1939) с описанием

морфологии палочковидного вируса табачной мозаики. В 1930-х годах с применением ТЭМ начали активно проводиться исследования ультраструктуры вирионов. В 1950-х и 1960-х годах произошел «взрыв» открытия новых вирусов. Из-за растущего количества данных по инициативе нескольких учёных и комитетов независимо друг от друга были разработаны разнообразные, нередко запутанные и противоречивые схемы классификации, которые не позволили разрешить проблемы таксономии вирусов, однако остро поставили вопрос о необходимости создания современной и единой универсальной таксономической схемы.

Бактериофаги описали несколько позднее вирусов эукариот. В 1915 г. английский бактериолог Ф. Туорт обнаружил инфицирование стафилококков неизвестным агентом, проходящим через фильтры, и показал, что им можно заражать бактерии путем переноса от одной колонии к другой (Twort, Lond, 1915). Ф. Туорт опубликовал первую научную статью по бактериофагам, однако он не был уверен, что инфицирующим агентом является вирус и высказывал предположения о живой протоплазме, либо ферменте с возможностью роста и размножения.

Ф. дЭрель был первым кто назвал вирусы, атакующие бактерии, «бактериофагами». Он полагал, что существует только один вид бактериофага, названный Bacteriophagum intestinale с многочисленными расами (D'Herelle, 1918). Впоследствии бактериофаги, поражающие большое количество разнообразных бактерий, были найдены в различных местообитаниях, и концепция существования единственного вида бактериофага оказалась несостоятельной. В дальнейшем показали разнообразие фагов и возможность их дифференцировки серологическими, фильтрационными методами, по диапазону чувствительности к фагу хозяев и тестами на устойчивость к различным разрушающим воздействиям (Burnet, 1933).

Э. Руска - создатель электронного микроскопа - в 1938 г. получил изображение вируса эктромелии мышей (семейство Poxviridae) и описал,

основываясь на морфологии и ультраструктуре вирионов, три типа фагов (Ruska, 1940, 1943; Ackermann, Ackermann, 2011). Позднее бактериофаги сгруппировали в отряд Virales, где они составили подотряд Phagineae, содержащий единственное семейство Phagaceae и один род Phagus (Holmes, 1948). Впервые предложил классифицировать вирусы на основе общих свойств вирионов, в частности, по морфологическим признакам Ф. Бауден (Bawden, 1950). Среди первых таксономических групп были герпесвирусы (Andrewes, 1954), миксовирусы (Andrewes, Bang, Burnet, 1955), поксвирусы (Fenner, Burnet, 1957) и несколько групп вирусов растений с палочковидными или нитевидными вирионами (Brandes, Wetter, 1959).

В первой классификации было 46 видов фагов, которые выделяли по их принадлежности к хозяину, характеру образуемой фагом бляшки и размеру вирусной частицы, а также по устойчивости к воздействию мочевины и нагреву. Однако предложенная система не была принята научным сообществом. В 1962 г. П. Турнье, А. Львов и Р. Хорн предложили классификацию, основанную на природе нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), форме капсида вируса, присутствии или отсутствии оболочки и числе капсомеров; их система, названная системой LHT, включала фага фХ174 и двух хвостатых фагов. Далее А. Львов с соавторами выступили за принятие общей схемы классификации вирусов по субфилам, классам, отрядам, подотрядам и семействам (Lwoff, Horne, Tournier, 1962). Нисходящие иерархические деления должны выполняться произвольно и монотетически на основе вышеназванных признаков. Альтернативное предложение в 1966 г. выдвинули А. Гиббс с соавторами, разделение в их системе основывалось на нескольких критериях (политетические критерии) (Gibbs et al., 1966).

Предложенная система предполагала использование «криптограмм» (кодированные обозначения восьми вирусных признаков). В 1990-х годах, стало ясно, что семейства и роды лучше всего определять монотетически (или всего несколькими признаками), но виды лучше определять политетически (Regenmorlel Van, 1990).

В 1965 г. систему классификации, предложенную А. Львовым с соавторами, принял Временный Комитет по Номенклатуре Вирусов (PCNV), кроме того, в нее добавили фаги, содержащие одноцепочечную РНК, а также нитчатые фаги. Хвостатым фагам присвоили ранг отряда, названный Urovirales (Anonymous, 1965). Некоторые вирусологи критиковали PCNV и были против иерархической структуры и латинских названий (Gibbs et al., 1966). В качестве альтернативы предложили давать вирусам два названия, обиходное и английское и сопровождать их «криптограммой», однако название было трудно употребляемым и идею отвергли. Почти одновременно Д. Бредли предложил классификацию фагов, основанную на типе геномной нуклеиновой кислоты и общей морфологии (Bradley, 1967). Он разделил фаги на шесть основных типов (от А до F): с сократимыми, длинными несократимыми и короткими хвостами; сфероидных ДНК- или РНК-содержащих фагов, нитчатых фагов. А. Тихоненко впоследствии предложила похожую классификацию и расширила схему Бредли, включив в неё сфероидных, нитчатых и плеоморфных фагов (Тихоненко, 1968).

В 1966 г. PCNV превратился в Международный Комитет по Номенклатуре Вирусов (International Committee for Nomenclature of Viruses -ICNV) и при нём был создан Подкомитет вирусов бактерий. Хотя ICTV не принял старую схему классификации LHT, он сохранил большинство установленных ею таксонов.

Первые предложения вирусологов-систематиков стимулировали интерес к разработке универсальной системы таксономии (Matthews, 1983; Wildy, 1971). В схеме, разработанной ICTV, признаки вирионов рассматриваются в качестве критериев для разделения на семейства, в некоторых случаях на подсемейства и роды. В 1970 г. утвердили шесть родов фагов, соответствующих T-чётным фагам и группам фагов X, PM2, фХ174, MS2 и fd (Wildy, 1971). Таксономический статус существующих родов повысили до семейств и добавили ещё семь новых семейств фагов. В 1998 г. хвостатые фаги получили ранг отдельного отряда Caudovirales (Ackermann, 1998).

В настоящее время таксономическая классификация вирусов и названия вирусных таксонов находятся в ведении Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) (King et al., 2012). ICTV установлено 9 таксономических рангов: реалм, царство, филум, класс, порядок, семейство, подсемейство, род и вид.

С другой стороны, существует классификация вирусов по Дэвиду Балтимору (Baltimore, 1971), которая формально не признаётся ICTV, в ней вирусы подразделяются на семь «классов» в соответствие с типом геномной нуклеиновой кислоты: 1 - содержащие дцДНК, 2 - содержащие оцДНК, 3 -содержащие дцРНК, 4 - содержащие оцРНК(+), 5 - содержащие оцРНК(-), 6 - содержащие оцРНК(+) (геном реплицируется через стадию ДНК), 7 -содержащие дцДНК (геном реплицируется через стадию РНК).

Морфология вирусов очень разнообразна, встречаются оболочечные, безоболочечные, с хвостовым отростком, многогранные, нитчатые, плеоморфные морфотипы вирусов. По данным ICTV общее количество видов вирусов превышает 6 тыс. Примерно половина из них содержит ДНК, остальные РНК. Самой многочисленной группой являются бактериофаги (2,7 тыс. видов).

Хвостатые бактериофаги, вероятно, самые древние вирусы на Земле, их появление датировано 3,5 млрд. лет назад - приблизительным возрастом самых старых известных микробных окаменелостей (Ackermann, 2007b; Schopf, 1993). Все хвостатые фаги, принадлежащие порядку Caudovirales, классифицируют по морфологии и структуре хвостового отростка на пять семейств (по состоянию на 2019 г.): 1) Myoviridae с длинными, сократимыми хвостами; 2) Siphoviridae с длинными несократимыми хвостами; 3) Podoviridae с короткими несократимыми хвостами; 4) Ackermannviridae с икосаэдрической головкой, диаметром около 93 нм и сократимым хвостовым отростком шириной около 20 нм и длиной 140 нм; 5) Herelleviridae имеют морфологию миовируса, поражают представителей филума Firmicutes, ранее группа была родом SPd-подобных вирусов, длина дцДНК геномов

составляет 125-170 т.п.н. Семейства порядка Caudovirales представлены 671 родом (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) [Electronic resource]. - URL: https://talk.ictvonline.org/taxonomy). Семейства Ackermannviridae и Herelleviridae добавлены в 2018 году.

В первом обзоре, посвященным фагам, упоминалось 111 представителей, 99 из них были хвостатыми, три изометрическими и 9 нитчатыми (Eisenstark, 1967). Более 5500 фагов открыто с 1959 года, 96 % из них хвостатые. Оставшиеся представлены полиэдрическими, нитчатыми и плеоморфными морфотипами и принадлежат 10 семействам (Ackermann, 2007a). На рисунке 1 показана морфология 3-х основных семейств бактериофагов Caudovirales.

Рисунок 1 - Семейства хвостатых фагов: a - Myoviridae, b - Siphoviridae, c -

Podoviridae (Ackermann, 2007a)

Фаг Т4, инфицирующий E. coli, является одним из основных модельных объектов молекулярной и структурной биологии. Капсид («головка») фага Т4 содержит геномную ДНК размером около 172 тысяч пар оснований. Капсид представляет собой удлинённый икосаэдр шириной 860 А и длиной 1200 А, он построен из 960 копий белка gp23, 55 копий gp24, 160 копий белка hoc («highly antigenic outer capsid protein») и 840 копий белка soc («small outer capsid protein») (рис. 2).

26.28.48.54

Рисунок 2 - Строение бактериофага Т4. Белки, составляющие вирион, помечены соответствующим номером или названием гена (Leiman и др.,

2003)

Хвосты фагов имеют спиральную структуру или состоят из сложенных стопкой дисков из белковых субъединиц; они обычно обладают специализированными терминальными структурами, такими как базальная пластинка, шипы или фибриллы, составляющими адсорбционный аппарат вириона (Ackermann, 2007b). Диаметр капсида и длина хвоста сильно варьируют. Вирионы (фаговые частицы) хвостатых фагов чаще всего состоят только из ДНК и белка. Хвостатые фаги семейств Siphoviridae и Podoviridae обычно содержат от 6 до 10 структурных белков. Myoviridae, как правило, более сложные, например, колифаг T4 и Bacillus фаг SP01 включает 42 составных белка, около половины из них локализовано в базальной пластинке. У некоторых фагов белки присутствуют внутри капсида и, вероятно, играют роль в инжекции ДНК. Геном хвостатого фага представлен одной молекулой линейной двухцепочечной ДНК.

Бактериофаги характеризуются двумя основными способами инфицирования бактерий: литическим (вирулентным) и лизогенным (умеренным) (Ackermann, 2007b). Кроме того, некоторые хвостатые фаги

иногда вызывают стойкие инфекции в гетерогенных бактериальных популяциях (частично восприимчивых и частично резистентных), такой тип носит название хронической инфекции.

Литический цикл развития включает следующие этапы: адсорбция фаговых частиц, инжекция ДНК, репликация и транскрипция, сборка фаговых частиц, выход новых вирионов. Внутри клетки различные фаги используют разные способы репликации своего генетического материала. Наиболее часто РНК-полимераза клетки транскрибирует ДНК бактериофага в мРНК, которая транслируется в ферменты (необходимые для репликации фагового генома, транскрипции и иногда разрушения ДНК хозяйской клетки), регуляторные белки (контролируют время активации фаговых белков) и структурные белки (образуют белковую часть новых копий фага). Результатом литического цикла всегда является лизис и смерть клетки-хозяина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Потапов Сергей Анатольевич, 2021 год

- А

/ •

— •

-

•

—

I | 1

0 2 4 6 8 К-М, Вирусы/ПЦБ

4 2 О

= 0.80

—■ #

Р = 1

у = - 0.48+0.72Х

-

У»

_ л

9 4

У

— /

п 1 1 1 1 |

О

8

Рисунок 5 - Регрессионный анализ вирусы/гетеротрофные бактерии и вирусы/ПЦБ, метод ПЦ. М-С - ц. ст. пос. Маритуй - пос. Солзан, Л-Т - ц. ст. пос. Листвянка - пос. Танхой, К-М - ц. ст. м. Кадильный - пос. Мишиха

Высокую положительную корреляционную связь между количеством ВЧ и гетеротрофных бактерий также наблюдали в олигомезотрофном озере

Павин, Франция (Bettarel et al., 2003), подобная взаимосвязь выявлена и в других исследованиях пресноводных (Hennes, Simon, 1995; Tuomi, Torsvik, Heldal, 1997) и морских (Alonso et al., 2001) экосистем. Вирусы, как известно, являются важным фактором регуляции численности и структуры микробных сообществ, поражая автотрофные и гетеротрофные бактерии - основной компонент планктона морских и пресных экосистем (Kutter, Sulakvelidze, 2005).

Трофический статус озера Байкал по данным многолетних гидрохимических наблюдений (Khodzher et al., 2017), является олиготрофным, не смотря на значительные негативные изменения в экосистеме озера в 2013-2019 гг. (Timoshkin et al., 2016). Наши результаты подтверждают олиготрофный статус озера, основываясь на результатах определения хлорофилла а и прозрачности воды. Концентрация хлорофилла а на 3-х станциях в сентябре достигала 1,9±1,7 мкг/л (табл. 2). Прозрачность воды по диску Секки составляла 7-8 м, что, согласно Р. Волленвейдеру (Vollenweider, Kerekes, 1982), соответствует олитрофному статусу.

Для молекулярно-генетических исследований проведена оценка вирусной фракции на наличие других гидробионтов, клеточного дебриса и т.д. с помощью ТЭМ. При ТЭМ-наблюдении обнаружено несколько морфологических типов свободных вирусных частиц. Большинство вирусов представлены хвостатыми бактериофагами, среди них доминировали представители семейства Myoviridae. Размеры фаговых частиц варьировали: капсиды - 76-126 нм, хвосты - 25-619 нм. Все бактериофаги имели полиэдральную форму головки (рис. 6).

Таблица 2 - Температура, концентрация хлорофилла а и содержание кислорода на различных глубинах оз. Байкал (сентябрь, 2012 г.)

Глубина, м Маритуй-Солзан Листвянка-Танхой Кадильный-Мишиха

О О н Кислород, мг/л Хлорофилл а, кг/л О О н Кислород, мг/л Хлорофилл а, мкг/л О О н Кислород, мг/л Хлорофилл а, мкг/л

0 11,69 10,73 1,51 11,30 10,37 1,66 9,64 10,73 1,79

5 11,19 10,92 1,38 10,50 10,44 2,71 9,29 10,92 2,16

10 4,83 11,31 3,42 8,35 11,06 3,3 7,25 11,31 2,27

15 4,36 11,09 3,39 7,11 11,11 - 6,26 11,09 2,52

25 4,05 11,31 1,66 5,28 11,14 1,7 5,46 11,31 1,22

50 3,90 11,40 0,75 3,93 11,35 0,78 3,93 11,40 0,30

100 3,80 11,38 3,83 11,37 3,80 11,38

150 3,69 11,35 3,73 11,34 3,69 11,35

200 3,64 11,27 3,66 11,31 3,62 11,27

400 3,48 10,80 3,47 10,89 3,45 10,80

600 3,40 10,36 3,39 10,37 3,40 10,36

800 3,38 10,23 3,38 10,23 3,38 10,23

1000 3,36 10,08 3,36 10,13 3,36 10,08

1200 3,35 10,01 3,35 10,04 3,35 10,01

а

Ш

200 нм

Г

200 нм

Ж

200 нм

К

100 нм

б

*

200 нм

д

100 нм

3

т

100 нм

Л

200 нм

В

200 нм

Рисунок 6 - Морфология вирусов озера Байкал по данным ТЭМ: а, г, д, е, ж, з - вирусы семейства Myoviridae; б, в - Siphoviridae; к - Podoviridae; и, л -вирусные частицы без хвостового отростка; м - лизированная клетка

3.2 Оценка вертикального распределения вирусных частиц, бактерий, пикоцианобактерий в разные периоды термальной стратификации

Вертикальные профили численности вирусных частиц, бактерий, пикоцианобактерий исследованы в периоды положительной стратификации вод и весеннего перемешивания.

В условиях гомотермии (диапазон изменения температуры воды +3,2-3,5°С) в июне 2015 г. вертикальное распределение исследуемых показателей на центральной станции разреза пос. Листвянка - пос. Танхой было неравномерным (рис. 7). Наиболее высокая численность бактерий с максимумом 0,75 *106 кл/мл на глубине 5 м и вириопланктона с пиком 2,5*106 частиц/мл на глубине 15 м отмечена в верхнем 50-метровом слое, соотношение численности вирусов к численности бактерий (VBR, virus to bacteria ratio) достигало 20 (на 15 м). В более глубоких слоях, ниже 50 м, количество вирусных частиц и бактерий уменьшалось до минимальных показателей: 0,07х106 частиц/мл (1000 м) и 0,003х106 кл/мл (1200 м), соответственно, при этом их соотношение составило в среднем 10. Максимальное значение VBR выявлено на глубине 1200 м и составило 44.

Рисунок 7 - Профили вертикального распределения компонентов вирусной «петли», на глубоководной станции в южной части оз. Байкал (июнь 2015 г.). BN - численность бактерий (кл/мл), VN - численность вириопланктона (частиц/мл), PN - численность пикоцианобактерий (кл/мл),

T - температура

В период положительной стратификации в августе 2015 г. температура поверхности достигала 17,7-18°С, снижаясь до 3,2°С на глубине 20 м (рис. 8). Среднее значение градиента было равным 0,6°С на метр. По литературным данным летом при T > 3,96°C конвекция прекращается, формируется неглубокий (до 5-10 м) прогретый эпилимнион с залегающим под ним термоклином (Троицкая, Шимараев, 2005). В эпилимнионе наибольшую численность вирусов наблюдали на поверхности и глубине 15 м, VBR в слое 0-50 м достигало 11,8. В гиполимнионе численность вирусов и бактерий резко снижалась до 0,47±0,1х106 частиц/мл и 0,04±0,01х106 кл/мл, соответственно, значения VBR варьировали по горизонтам, пик (21) найден на глубине 800 м.

Увеличение VBR на больших глубинах в водах оз. Байкал согласуется с похожими наблюдениями в глубоководной зоне Атлантического океана (VBR > 100) (Parada et al., 2007), однако достоверных объяснений пока не имеет (Suttle, 2007).

Полученные в данной работе профили вертикального распределения численности вирусов, гетеротрофного бактериопланктона и ПЦБ оз. Байкал сопоставимы с описанными ранее другими авторами (Белькова и др., 2003; Дрюккер, Дутова, 2009; Belykh, Sorokovikova, 2003; Katano et al., 2008).

0-50 м 0-1200 м

| 11111Н1| 111111И| ||||||||| 1111 1111111 | I | I | I | I | I |

0.01 0.1 1 10 О 8 16 0 8 16

х106 |—|—|—|—|—| °С | I 111 ИН| |11М1П| 1|1111П| "С

0.001 1 0.01 0.1 1 10 хЮ5 *106

Рисунок 8 - Профили вертикального распределения компонентов вирусной «петли», на глубоководной станции в южной части оз. Байкал (август 2015 г.). BN - численность бактерий (кл/мл), VN - численность вириопланктона (частиц/мл), PN - численность пикоцианобактерий (кл/мл), Т - температура

Осенью, в период понижения температуры в верхнем слое воды, наибольшую численность бактерио- и вириопланктона в пелагиали южной котловины оз. Байкал отмечали в эпилимнионе, наименьшую - в гиполимнионе. Так, на центральной станции разреза пос. Маритуй - пос.

Солзан ВЧ были наиболее многочисленными на глубине 15 м (8,3х106 частиц/мл), наименее - на глубине ниже 800 метров (до 0,4 х106 частиц/мл). Максимальная концентрация ПЦБ, обнаруженная на глубине 15 м, составляла 4,8х105 кл/мл (ПЦ), 8,1х105 кл/мл (ЭФМ). Пик численности гетеротрофных бактерий на глубине 15 м достигал 3,9х106 кл/мл (ПЦ) и 3,3х106 кл/мл (ЭФМ).

На центральной станции разреза пос. Листвянка - пос. Танхой максимум численности ВЧ зарегистрирован на глубине 10 метров - 5,6х106 частиц/мл (ПЦ), 4,9х106 частиц/мл (ЭФМ); наибольшее количество ПЦБ найдено на 15 метрах - до 3,1 х105 кл/мл (ПЦ), 3,5х105 кл/мл (ЭФМ); гетеротрофные бактерии в массе присутствовали в поверхностных слоях воды (0 м) - до 3,3х106 кл/мл (ПЦ), 3,5х106 кл/мл (ЭФМ).

На центральной станции разреза м. Кадильный - пос. Мишиха пик численности ВЧ обнаружен на глубине 5 м. Наибольшее количество ПЦБ отмечено на глубине 15 м - 4,9х105 кл/мл (ПЦ) и 6,1х105 кл/мл (ЭФМ), как и гетеротрофных бактерий - 3,6х106 кл/мл (ПЦ) и 4,3х106 кл/мл (ЭФМ). Соотношение VBR на трёх станциях в слое 0-50 варьировало от 1 до 2,8, в гиполимнионе этот показатель доходил до 7,8.

В целом численность вирусных частиц в эпилимнионе во все сезоны выше, чем в гиполимнионе. VBR было наибольшим в гиполимнионе, с максимальными значениями на глубинах ниже 600 м.

В летний и осенний сезоны наблюдали значимую корреляционную связь между численностью вирусов и бактерий (ККП, г = 0,9, р<0,05) и между численностью вирусов и температурой воды (ККП, г = 0,8, р<0,05). Исключение составил период обратной стратификации, во время которого не выявлено значимой корреляционной связи между численностью вирусов, температурой воды и численностью бактерий.

3.3 Сезонная динамика численности вирусных частиц и бактерий, метод ЭФМ

Сезонная динамика численности вирусных частиц, гетеротрофных бактерий и ПЦБ определена на центральной станции разреза пос. Листвянка - пос. Танхой в июне и сентябре 2015 и 2016 гг. с использованием ЭФМ, расчёт произведён для слоя 0-25 м (рис. 9).

Рисунок 9 - Сезонная динамика численности бактерий, пикопланктонных

цианобактерий и вирусных частиц на станции середина разреза пос. Листвянка - пос. Танхой в слое 0-25 м в 2015 и 2016 гг. Т - температура

поверхности воды (0 м)

За два года наблюдений выявлено, что численность ПЦБ и ОЧБ в июне значительно ниже, чем в сентябре, при этом она почти не различалась по годам, составляя в среднем 0,02х106 кл/мл и 0,24-0,32х106 кл/мл,

соответственно. В сентябре наблюдали увеличение численности бактерий: ПЦБ в 3 раза, ОЧБ в 13 раз. Максимальная концентрация вирусных частиц отмечена осенью 2015 г. (6,75х106 частиц/мл) - в период сезонного пика развития ПЦБ и в год высокоурожайный по пикопланктону. В сентябре 2016 г. количество ВЧ составило 4,62х106 частиц/мл. Минимальная численность ВЧ выявлена в июне, при этом самое низкое количество ВЧ обнаружено в 2016 г. - 0,9х106 частиц/мл. Величина VBR в слое 0-25 м достигала 20, что входит в диапазон значений, найденных в других пресных водоемах (Bettarel et al., 2003; Hofer, Sommaruga, 2001).

Выявленная зависимость между ростом численности пикоцианобактерий и повышением количества вирусных частиц свидетельствует о том, что в сентябре в вирусном сообществе увеличилась доля цианофагов - вирусов, поражающих цианобактерии. Увеличение количества вирусов неоднократно наблюдали при массовом развитии цианобактерий, в том числе и токсичных (Laybourn-Parry, Hofer, Sommaruga, 2001; Yoshida et al., 2008).

3.4 Межгодовая динамика численности вирусных частиц и бактерий, метод ЭФМ

C 2011 по 2016 г. проводили ежегодную количественную оценку ОЧБ, ВЧ и ПЦБ на центральной станции разреза пос. Листвянка - пос. Танхой. Динамика численности ВЧ и бактерий приведена на рисунке 10. Слой 0-25 м взят как наиболее показательный, т.к. он составляет «трофогенный» слой водоёма. Именно здесь происходит максимальная продукция органического вещества фотоавтотрофными организмами. Анализируя полученные данные, можно отметить тренды увеличения численности ключевых компонентов «микробной» петли: гетеротрофных бактерий, пикоцианобактерий и вирусных частиц в исследуемые годы.

2011 2012 2013 2014 2015 2016

Рисунок 10 - Межгодовая динамика численности вирусных частиц, пикопланктонных цианобактерий и гетеротрофных бактерий на станции пос.

Листвянка - пос. Танхой в слое 0-25 м в сентябре 2011-2016 гг. оз. Байкал

Корреляционный анализ обнаружил зависимость численности исследуемых компонентов планктона от температуры воды (г = 0,50-0,75) с уровнем значимости р < 0,05. Как уже указывали, наибольшее количество ВЧ в осенний период выявлено в 2015 г., самое низкое - в 2011 г.

За период исследований установлена положительная корреляция между численностью вирусов и гетеротрофных бактерий (г = 0,92-0,97, р < 0,05), вирусов и пикоцианобактерий (г = 0,79-0,95, р < 0,05). В межгодовом аспекте результаты показали большую зависимость количества вирусов от численности гетеротрофных бактерий, чем вирусов от пикоцианобактерий.

За весь период наблюдений установлено преобладание численности вирусных частиц над гетеротрофными бактериями и ПЦБ.

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ РАЗНООБРАЗИЯ ^-СООБЩЕСТВ БАКТЕРИОФАГОВ В БИОПЛЁНКАХ ОЗ. БАЙКАЛ

Микроскопическое исследование биоплёнок, сформированных на поверхности камней в урезовой зоне на глубине 1 м около пос. Листвянка, выявило, что в них доминировали зелёные и харофитовые водоросли. В биоплёнках бордово-фиолетового цвета, отобранных с камней в районе пос. Большие Коты (2а), в районе м. Толстый (1D3Tp, 2D1) с глубин 6 м, 9 м, 36 м, соответственно, преобладали нитчатые цианобактерии порядка Oscillatoriales: Symplocastrum sp., Tychonema sp. и порядка Nostocales -Tolypothrix sp. На поверхности губок Rezinkovia sp. (2D 4-1) и Swartschewskia papyracea (2D 2-1) обнаружены диатомовые водоросли, нитчатые цианобактерии не найдены. В теле губок присутствовали зеленые водоросли, принадлежащие к классу Trebouxiophyceae, и коккоидные цианобактерии родов Synechococcus и Cyanobium (рис. 11). Метаданные образцов представлены в таблице 3.

Из проб биоплёнок получено 85 уникальных нуклеотидных последовательностей фрагмента гена g23: 37 из губок, 10 из биоплёнок, образованных на камнях в урезовой зоне, 25 из цианобактериальных обрастаний камней и 13 из поверхностного микрослоя воды. Длина нуклеотидных последовательностей варьировала от 342 до 459 п.н. (без учёта праймеров). Последовательности g23 депонированы в базу данных GenBank под номерами: MH576490-MH576574.

Нуклеотидные последовательности имели некультивированных ближайших родственников: из водной толщи оз. Байкал (Butina et al., 2010), оз. Бурже и Анси (Франция) (Zhong, Jacquet, 2014), оз. Восточное (Китай) (Huang, Cheng, Xu, 2011), криоконитовых отверстий (архипелаг Шпицберген) и ледникового озера (Bellas, Anesio, 2013), рисовых полей Японии (Jia et al., 2007; Wang et al., 2009b) и Китая (Zheng et al., 2013), сточных вод (Ирландия)

(Knapik, Prentice, 2012) и осадков эстуария р. Жемчужной (Китай) (He et al., 2017).

Рисунок 11 - Общий вид биопленок и субстратов: 1 - зелёные водоросли на каменистом субстрате (LS), 2 - обрастания, сформированные цианобактерией Tychonema sp. на каменистом субстрате (2D1), 3 -эндемичная губка Rezinkovia sp. (2D 4-1), 4 - кустистые дерновинки Tolypothrix sp. на каменистом субстрате (Ш3Тр), 5 - эндемичная губка Swartschewskia papyracea (2D 2-1). Шкала - 3 см

Из культивируемых фагов наибольшее сходство (77% на аминокислотном уровне) было с изолятом Synechococcus фаг S-CAM1 (ТР_007673099), выделенным на штамме Synechococcus sp. WH7803 (Тихий океан) (Непп et б!., 2013). Наибольшее количество последовательностей на нуклеотидном уровне имело сходство с последовательностями из оз. Байкал (38,8%), 25,8% с последовательностями из озер Бурже и Анси, 12,9% с последовательностями из оз. Восточное, с остальными - 22,5% (каждый

менее 5,8%). Сходство последовательностей с ближайшими соседями из базы данных NCBI (на нуклеотидном уровне) варьировало от 70% до 99,7%. Сходство на нуклеотидном уровне байкальских последовательностей из биоплёнок и планктона, полученных ранее, изменялось от 68 до 99%.

Таблица 3 - Метаданные образцов

Образец Место отбора Имя сообщества Субстрат Глубина, м Количество g23 послед. Доминирующие водоросли/бактерии в сообществе

LS 2, около пос. Листвянка GreenStone Камень 1 10 Нитчатые, зелёные

1D3Tp 1, м. Толстый CyaStone Камень 9 6 Tolypothrix sp.

2а 3, около пос. Б.Коты Камень 6 13 Symplocastrum sp.

2D1 1, м. Толстый Камень 36 6 Tychonema sp.

2D 4-1 1, м. Толстый Sponges Губка (Rezinkovia sp.) 20 27 Диатомовые, Trebouxiophyceae, Synechococcus, Cyanobium

2D 2-1 1, м. Толстый Губка (Swartschewski a papyracea) 35 10 Диатомовые, Trebouxiophyceae, Synechococcus, Cyanobium

1H 4, напротив м. Хобой Neuston - 0 13 Actinobacteria ^а1аЛ'уаШъ и др., 2017)

Филогенетический анализ показал, что ни одна из последовательностей не кластеризовалась с представителями группы Near T4 (рис. 12). Семь последовательностей вошли в группу Far T4, содержащую культивированные фаги Escherichia фаг 121Q и RM378.

Группа Cyano T4 объединила остальную часть последовательностей (78 последовательностей), 65 из них образовало 14 кластеров. Сформировавшимся считали кластер при наличии более одной последовательности из биоплёнок Байкала. Четыре кластера (Cluster 2, 5, 9, 11) включали последовательности планктонных бактериофагов из двух котловин оз. Байкал (Butina et al., 2010), (один кластер с байкальской группой B4 и три кластера с последовательностями, которые не образовали группу B), девять кластеров (Cluster 1, 3, 4, 7, 8, 10, 12, 13, 14) содержали последовательности байкальских биоплёнок, причём кластеры 1 и 14

состояли только из нейстонных последовательностей, кластеры 3 и 12 из последовательностей фагов из губки, кластеры 4 и 8 были сформированы последовательностями из цианобактериальных обрастаний. Остальные кластеры (7, 10, 13) содержали как последовательности из байкальских биоплёнок, так и последовательности из других экотопов и водоемов. Кластер 6 представлен последовательностями из озер Бурже и Анси, сходство последовательностей из этого кластера варьировало от 92 до 98,5%. Остальные 13 последовательностей внутри группы Суапо Т4 не формировали кластеры.

Рисунок 12 - Таксономическое дерево, сформированное на основе g23 последовательностей Т4-подобных фагов. Последовательности из этого исследования выделены жирным, точками обозначены культивируемые

представители

Иерархический кластерный анализ, который включал последовательности из различных местообитаний, доступных в базе NCBI:

заливов, почв, озёр, гидротермальных источников, рек, сточных вод, болот, показал, что сообщества вирусов из биоплёнок Байкала располагаются на дендрограмме ближе к планктонным сообществам из северной и южной котловины озера (рис. 13). Характер распределения отражает наиболее близкое родство вирусных сообществ различных экотопов оз. Байкал и меньшее сходство с другими экосистемами.

Рисунок 13 - иРОМЛ-дендрограмма, построенная с помощью иерархического кластерного анализа (Ьс1ш1:). Сообщества из байкальских

биоплёнок выделены жирным

При этом по характеру ветвления на дендрограмме можно проследить тенденцию кластеризации сообществ в зависимости от физико-химических параметров среды. Так, бактериофаги из морей и эстуариев рек формируют «морскую» кладу. Как следует из анализа, последовательности бактериофагов биоплёнок и водной толщи оз. Байкал группируются вместе, а

не с последовательностями фагов из других водоемов, формируя «байкальский» кластер.

Множество работ, появившихся в последнее время по исследованию биоразнообразия вирусов в морских и пресных экосистемах, в той или иной мере предполагают их анализ с точки зрения биогеографии. Понимание распределения природных бактериофагов имеет большое значение для выяснения их влияния на популяции клеток-хозяев, для анализа структуры микробного сообщества и, следовательно, для прогнозирования крупномасштабных планетарных процессов. Существует четыре модели биогеографии микробов (Chow, Suttle, 2015), также применимые к вирусам:

1) состав сообщества не определен местными или региональными факторами,

2) структура сообщества обусловлена условиями в местной среде обитания, где изменения в структуре сообщества определяются различиями в таксонах (все есть везде, но среда отбирает), 3) структура сообщества определяется тем, в какой степени таксоны могут перемещаться в это конкретное место (т. е. ограничение распространения), 4) ограничение распространения и условия окружающей среды определяют состав сообщества.

Очевидно, вирусное сообщество Байкала можно рассматривать в свете четвёртой модели, основываясь на том, что оно формировалось многие миллионы лет обособленно, в условиях низких температур, малого количества питательных веществ, как продемонстирировано на примере байкальских рыб и губок (Efremova et al., 2002; Kontula, Kirilchik, Vâinôlâ, 2003), что, в свою очередь, и подтверждает кластерный анализ вирусных сообществ озера.

Древние озёра представляют собой уникальные обособленные экосистемы, формировавшиеся на протяжении миллионов лет. До наших исследований информации о вирусах древних озёр не было. Первые сведения о генетическом разнообразии бактериофагов озёр Байкал (Butina и др., 2010; Butina et al., 2012; Butina et al., 2015b; Potapov et al., 2018; Potapov et al., 2013) и Хубсугул (Butina et al., 2014) появились в последнее десятилетие.

В данной работе с использованием праймеров, фланкирующих фрагмент гена основного капсидного белка gp23, исследованы Т4-подобные бактериофаги в биоплёнках, сформированных на биогенных и абиогенных субстратах, и в поверхностном микрослое воды оз. Байкал.

По результатам BLAST-анализа большинство полученных нами последовательностей на нуклеотидном уровне имело наибольшее сходство с последовательностями из озер Байкал, Бурже, Анси, Восточное, а не с последовательностями из других экосистем и биотопов. Вероятно, подобное родство можно объяснить сходством в составе бактерий - хозяев бактериофагов - в этих озёрах.

Филогенетический анализ показал, что девять кластеров содержали только последовательности из биоплёнок, что может свидетельствовать об уникальности этих генотипов, присущих только байкальским биоплёнкам (обособленность формирования), 28 последовательностей группировалось с ранее полученными последовательностями из планктона.

Очевидно, часть планктонных вирусов попадает на дно прибрежной зоны озера и оседает на камнях и губках. Кроме того, возможна и инфекция бактерий, обитающих в биоплёнках камней, губок и ПМС, планктонными бактериофагами. В целом, большая часть последовательностей (91,8%) фагов вошла в группу Суапо Т4, которая включает культивированные цианофаги.

По данным, полученным ранее (Timoshkin et я!., 2016; Belykh et б!, 2017) и в настоящей работе, цианобактерии доминируют по биомассе в донных биоплёнках литоральной зоны оз. Байкал, а в поверхностном микрослое озера, напротив, зафиксирована очень малая доля цианобактерий, но выявлено доминирование филотипов порядка Ре^ШаСега^ (SAR11) (Оа1асЬ'уаШз et а1., 2017). Фаги, поражающие микроорганизмы данного таксона, также находятся в группе Суапо Т4.

В этой связи, возможно, некоторые последовательности бактериофагов из биоплёнок принадлежат цианофагам, но об этом можно судить только по кластеру, где есть культивированные цианофаги. В остальном группа Суапо

T4, не оправдывает своего названия, имея в своём составе культивированных бактериофагов, не относящихся к цианофагам (например, Pelagibacter phage и Smp14).

Наиболее представительным является кластер 9, в нём находится 12 последовательностей биоплёнок и последовательность из планктона южной котловины оз. Байкал, которая не сформировала байкальскую группу в предыдущем исследовании. Вероятно, представители этого кластера - одни из наиболее встречаемых генотипов в биопленках южной котловины Байкала.

Ни одна из последовательностей не попала в группу Near T4. В Far T4 находится бактериофаг Escherichia 121Q, выделенный из E. coli, очевидно, что Т4-бактериофаги из Байкала, входящие в эту группу, также поражают патогенные и/или условно-патогенные бактерии. Примечательно, что все 7 последовательностей, вошедшие в Far T4, получены из губок.

Ранее в исследовании цианофагов по гену g20 в оз. Байкал из выжимки тела губки L. baicalensis показано, что четыре кластера содержали гены цианофагов как из губки, так и из планктона озера (Butina et al, 2015b). Присутствие в губках вирусов, сходных с планктонными, объяснено естественной биофильтрацией губок. В составе губки выявлено шесть генотипов цианофагов, два из которых в воде оз. Байкал не обнаружены, что свидетельствует в пользу действительного участия цианофагов в функционировании сообщества губок.

В нескольких исследованиях с использованием таргетного секвенирования по Сенгеру гена g23 продемонстрировано наличие для морей, пресных водоёмов, почв, эстуариев как собственных «эндемичных» кластеров, так и сходных последовательностей некультивированных T4-подобных фагов, распространенных во многих экосистемах. Данный факт привел к предположению о том, что некоторые вирусы являются космополитами и поражают аналогичные виды хозяев, а часть их обладает уникальным происхождением (Breitbart, Miyake, Rohwer, 2004; Short, Suttle,

2005). К тому же фаги способны поражать хозяев из различных биомов, как это было установлено ранее в экспериментах (Bellas, Anesio, 2013; Bonilla-Findji et al., 2009; Sano et al., 2004).

Иерархический кластерный анализ показал, что сообщества вирусов из биоплёнок Байкала располагаются на дендрограмме ближе к планктонным сообществам из северной и южной котловины озера. Характер распределения отражает наиболее близкое родство вирусных сообществ различных экотопов оз. Байкал между собой и меньшее сходство с другими экосистемами, что может определяться, как физико-химическими параметрами среды обитания, так и зависеть от происхождения водоемов, времени его образования и обособленностью. Следует отметить, что сообщества Т4-подобных бактериофагов, последовательности которых получены ранее из близко расположенных к оз. Байкал водоемов: р. Селенга (Butina et al., 2015a) и оз. Котокельское (Butina et al., 2013) не группируются с байкальскими. В настоящее время экологическое состояние р. Селенга - крупнейшего притока оз. Байкал - ухудшается вследствие антропогенного загрязнения, трофический статус вод реки продолжает увеличиваться (Sorokovikova et al., 2019). Озеро Котокельское находится от оз. Байкал на расстоянии 2 км и сообщается с ним через систему мелких рек. Ранее показано, что оз. Котокельское является эвтрофным водоемом, где регулярно происходят цианобактериальные цветения (Belykh et al., 2011). Возможно, поэтому последовательности из этих водоемов не группируются с последовательностями бактериофагов из бентоса, планктона и нейстона оз. Байкал.

Сообщества вирусов из губки расположились на графике ближе к точке с планктонными последовательностями из южной котловины Байкала. Наблюдаемый факт может быть вызван тем, что большая часть вирусов проникает в губку из водной толщи в результате фильтрационного питания животных. Известно, что губки способны прогонять через свое тело в сутки до 5520 л воды на 1 кг массы (Казаринова и др., 1994).

Последовательности из обрастаний камней имели отличие от таковых в планктоне, нейстоне и биоплёнках губок, что можно объяснить значительным различием состава гетеротрофных бактерий планктона и бентоса/перифитона, как показано в ранних работах (Parfenova, 01аёИкЪ, Be1ykh, 2013), наличием в биоплёнках камней большого количества нитчатых цианобактерий и водорослей (Timoshkin et а1., 2016; Ве1у^ et а1., 2017). Кроме того, сообщества вирусов биоплёнок камней с преобладанием водорослей и цианобактерий отличались друг от друга, что является отражением разного видового состава, как доминирующих групп, так и минорных видов. В первом случае камни отобраны в урезовой зоне на глубине не более 1 м, а цианобактериальные биоплёнки подняты с глубины 6, 9 и 36 м.

Сообщество бактериофагов поверхностного микрослоя воды заметно отличается от других вирусных сообществ оз. Байкал, что подтверждается обособленностью и уникальностью этого экотопа, влиянием на нейстон гидрофизических факторов, таких как ветер, солнечная радиация, температура, а также своеобразным составом бактерионейстона, как показано ранее (Галачьянц и др., 2018). К тому же g23-сообщества нейстонных и планктонных фагов Малого Моря формируют отдельный кластер (неопубликованные данные), очевидно, в связи с тем, что мелководный пролив Малое Море, как и поверхностный микрослой воды подвержены влиянию аэрозольных переносов, которые могут определять распространение вирусов и обособленное формирование сообществ бактериофагов в проливе Малое Море.

Таким образом, впервые получены нуклеотидные последовательности Т4-подобных бактериофагов из биоплёнок, сформированных на абиотических и биотических субстратах и из поверхностного микрослоя воды оз. Байкал.

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ G23 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ БАКТЕРИОФАГОВ ОЗ. БАЙКАЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Максимальная длина перекрытых парных ридов составила 490 нуклеотидов (нк) без учета праймеров. Несколько последовательностей было более чем 490 нк, но они исключены после контроля качества и удаления химерных последовательностей. Кривая насыщения (уровень кластерного анализа 97% сходства) показала, что проба проанализирована в достаточном объёме, как видно по выходу кривой «плато» (рис. 14).

О 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

Количество последовательностей

Рисунок 14 - Кривые насыщения при разных порогах сходства, без учета

синглетонов

В результате высокопроизводительного секвенирования и обработки первичных данных получена 33701 последовательность фрагмента гена g23. Кластерный анализ позволил идентифицировать 1244 ОТЕ. После удаления синглетонов и даблтонов (88,6% ОТЕ), осталась 141 ОТЕ (11,3% ОТЕ). 86 ОТЕ (60,9%) имело ближайших родственников среди репрезентативных последовательностей некультивированных вирусов из озёр Бурже и Анси (Zhong, Jacquet, 2014). Однако, 28 ОТЕ (19,8%) характеризовались высоким

сходством с байкальскими g23 клонами, которые ранее идентифицированы в северной и южной котловине озера методом Сенгера (Butina et al., 2010). Остальные ОТЕ были сходны с клонами из озера Восточное (Китай) (Wang et al., 2015), рисовых полей Китая и Японии (неопубликованные данные), Чесапикского залива (Jamindar et al., 2012), вод болотных угодий Китая (Zheng et al., 2013), донных осадков дельты Жемчужной реки (Китай), озера Котокельское (Россия) (Butina et al., 2013), Саргассового моря (неопубликованные данные) (табл. 4).

Таблица 4 - Количество ОТЕ BS OTU и число последовательностей наиболее схожих с клонами из различных экосистем

Местоположение Количество BS OTU Количество последовательностей Ссылка

Бурже и Анси (Франция) 86 (60,9%) 20549 (Zhong, Jacquet, 2014)

Байкал, север (Россия) 14 (9,9%) 4371 (Butina et al., 2010)

Байкал, юг (Россия) 14 (9,9%) 3078 (Butina et al., 2010)

Восточное (Китай) 10 (7,1%) 2454 (Wang et al., 2015)

Почва рисовых полей (Китай) 7 (4,9%) 1112 (Li et al., 2017 неопубликованные данные)

река Жемчужная (Китай) 3 (2,1%) 44 (He, 2016 ^опубликованые данные)

Водно-болотные угодья (Китай) 3 (2,1%) 20 (Zheng et al., 2013)

Чесапикский залив (США) 1 (0,7%) 654 (Jamindar et al., 2012)

Почва рисовых полей (Япония) 1 (0,7%) 100 (Cahyani et al., 2007 неопубликованные данные)

Саргассово море (Атлантический океан) 1 (0,7%) 29 (Goldsmith et al., 2015 неопубликованные данные)

Котокель (Россия) 1 (0,7%) 3 (Butina et al., 2013)

Распределение последовательностей в ОТЕ было неравномерным. Количество ОТЕ с более чем 100 последовательностями составило 14,8%. Гистограмма показывает только наиболее многочисленные ОТЕ (рис. 15).

Рисунок 15 - Гистограмма соотношения BS OTU к количеству последовательностей в них входящих. Показаны 60 ОТЕ. Наибольшая численность последовательностей соответствует BS OTU 1 (7698). После BS OTU 21 (111 последовательностей) идёт спад до минимальных значений

Таблица 5 иллюстрирует наиболее распространенные (доминирующие) OTE (> 100 последовательности в каждой).

Таблица 5 - Результаты BLAST анализа репрезентативных последовательностей фрагмента гена g23 Т4-подобных бактериофагов из планктона южного Байкала. Представлены наиболее многочисленные (доминантные) ОТЕ (>100 последовательностей в каждой).

ОТЕ Количество (доля) последователь ностей Источник изоляции ближайшего родственника Номер в GenBank Сходство (%) Ссылка

1 2 3 4 5 6

BS OTU 1 7698 (22,8%) Бурже и Анси (Франция) AHU87124 94 (Zhong, Jacquet, 2014)

BS OTU 2 3487 (10,3%) Бурже и Анси (Франция) AHU87260 98 (Zhong, Jacquet, 2014)

1 2 3 4 5 6

BS OTU 3 3241(9,6%) Байкал, север (Россия) ADA61149 100 (Butina et al., 2010)

BS OTU 4 3116 (9,2%) Бурже и Анси (Франция) AHU87216 98 (Zhong, Jacquet, 2014)

BS OTU 5 2822 (8,3%) Бурже и Анси (Франция) AHU87232 95 (Zhong, Jacquet, 2014)

BS OTU 6 1840 (5,4%) Восточное (Китай) AKZ31894 80 (Wang et al., 2015)

BS OTU 7 1123 (3,3%) Байкал, юг (Россия) ADJ57322 81 (Butina et al., 2010)

BS OTU 8 1053 (3,1%) Почва рисовых полей (Китай) BAW82038 77 неопубликованные данные

BS OTU 9 999 (2,9%) Бурже и Анси (Франция) AHU87144 89 (Zhong, Jacquet, 2014)

BS OTU 10 959 (2,8%) Байкал, север (Россия) ADA61143 96 (Butina et al., 2010)

BS OTU 11 874 (2,5%) Байкал, юг (Россия) ADJ57323 99 (Butina et al., 2010)

BS OTU 12 679 (2,0%) Байкал, юг (Россия) ADJ57320 98 (Butina et al., 2010)

BS OTU 13 654 (1,9%) Чесапикский залив (США) AFV99098 72 (Jamindar et al., 2012)

BS OTU 14 472 (1,4%) Бурже и Анси (Франция) AHU87275 99 (Zhong, Jacquet, 2014)

BS OTU 15 309 (0,91%) Байкал, юг (Россия) ADJ57323 82 (Butina et al., 2010)

BS OTU 16 270 (0,80%) Бурже и Анси (Франция) (France) AHU87190 93 (Zhong, Jacquet, 2014)

BS OTU 17 205 (0,60%) Восточное (Китай) ADI87617 89 неопубликованные данные

BS OTU 18 193 (0,57%) Бурже и Анси (Франция) AHU87216 94 (Zhong, Jacquet, 2014)

BS OTU 19 145 (0,43%) Восточное (Китай) AKZ31853 74 (Wang et al., 2015)

BS OTU 20 130 (0,38%) Восточное (Китай) AKZ31906 62 (Wang et al., 2015)

BS OTU 21 111 (0,32%) Бурже и Анси (Франция) AHU87165 93 (Zhong, Jacquet, 2014)

Ближайшими родственниками из культивированных бактериофагов оказались Synechococcus фаг S-CAM1 (NC_020837) (79% сходства) (Henn et al. 2001, неопубликованные данные), хозяином которого является штамм Synechococcus sp. WH7803 (Тихий океан), и цианофаг Synechococcus S-SM2 (YP_004322275) (71% сходства) (Sullivan et al., 2010), изолированный из штамма Synechococcus sp. WH8017 (Атлантический океан).

Филогенетический анализ (рис. 16) показал, что BS OTU последовательности распределились по двум группам Cyano-T4 (95,8%) и Far-T4 (4,2%), демонстрируя высокое разнообразие Т4-подобных бактериофагов в оз. Байкал. Ни одна последовательность не вошла в группу Near-T4. Большая часть BS OTU из группы Cyano-T4 сформировало два больших кластера: один «байкальский» и один «смешанный», два кластера с культивированными цианофагами и несколько мелких кластеров, кроме того, на дереве присутствовали отдельные ветви.

Рисунок 16 - Древо, построенное на основе фрагментов гена g23 бактериофагов. Кружком отмечены культивированные бактериофаги, звёздочкой - байкальские последовательности, полученные ранее методом

Сенгера. Жирным выделены BS OTU. Источник изоляции: LB - озеро Байкал, EL - озеро Восточное, CB - Чесапикский залив, BA - озёра Бурже и Анси, DL - озеро Дунху, DB - залив Делавэр, AG - арктические льды

Байкальский кластер состоял из 52 ОТЕ (7704 последовательности, 22,8%). Смешанный кластер представлен 9 ОТЕ (7765 последовательностями, 23,0%) и g23 фрагментами из других экосистем. Два мелких кластера, содержащие культивированные цианобактерии, были смешанными - 18 BS OTU (4637 последовательностей, 13,7%) и 3 BS OTU (706 последовательностей, 2,1%).

Сходство между последовательностями оз. Байкал, определенными ранее (Butina et al., 2010) и полученными в данном исследовании, составило от 15 до 100%.

Микроразнообразие (нуклеотидное разнообразие, п) составило 0,38, что выше, чем разнообразие из образцов других пресных водоёмов, кроме оз. Лимнополар. Для озера Котокельское оно составило - 0,36, ледникового озера (Шпицберген) - 0,35, Восточного (Китай) - 0,28, Лимнополар (Антарктика) - 0,42.

C помощью метрики дистанций UniFrac и метода главных компонент (PCA) определено бета-разнообразие сообществ и продемонстрировано отличие сообществ бактериофагов из пресноводных и морских экосистем (рис. 17).

o

es о

<N

О

Оч о о

о

Байкал (Ce • вер)

Чес апикский залив • Байкал (Юг) •

BS OTU •

Бурже и Анси Котокель Арктические льды •

Лимнополар

Восточное •

-0.2

0.0

0.2

0.4

PC 1: 17.62%

Рисунок 17 - UniFrac анализ g23-сообществ бактериофагов. Метод

главных компонент (PCA)

Высокое родство последовательностей из Байкала с последовательностями гена g23 бактериофагов из альпийских озёр Бурже и Анси связано, вероятно, со значительным сходством озёр по гидрохимическим и гидрофизическим показателям (высота над уровнем моря, общий фосфор, общий азот, нитраты, pH) (Jacquet et al., 2008; Perga et al., 2016; Zhong, Jacquet, 2014), а также обусловлено близким составом планктона. В метагеномных исследованиях 16S рРНК-ампликонов показано, что филы Actinobacteria, Proteobacteria и Bacteroidetes доминируют в планктоне озёр Бурже и Анси (Debroas et al., 2009; Humbert et al., 2009). В оз. Байкал доминирующими филами являются Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia и Acidobacteria, среди многочисленных представителей которых найдены близкие родственники из озера Бурже (Kurilkina et al., 2016; Mikhailov et al., 2015; Parfenova, Gladkikh, Belykh, 2013).

Значительное число ОТЕ, имеющих большее сходство с последовательностями из альпийских озёр, чем из озера Байкал может быть объяснено разным количеством последовательностей, полученных из этих озёр: 190 последовательностей из Бурже и Анси и 41 последовательность из Байкала.

Бактериофаг Escherichia 121Q, изолированный из E. coli, принадлежит группе Far-T4 (Lapin et al. неопубликованные данные). T4-подобные бактериофаги из озера Байкал, вошедшие в эту группу, весьма вероятно, способны инфицировать представителей семейства Enterobacteriaceae, которое включает множество патогенных и условно патогенных представителей.

Фагов из группы Near-T4, куда входят вирусы колиформных бактерий (например, фаг Т4), не удалось идентифицировать. По последним данным численность Enterobacteriaceae в оз. Байкал низкая (Shtykova et al., 2019). Как правило, энтеробактерии обитают в поверхностном слое воды, а чаще всего локально - в литоральной зоне, около населенных пунктов. Поэтому, вероятно, что численность T4-энтерофагов, даже если они присутствовали в образце, была экстремально низкой. В связи с этим необходимо детально с применением специфических маркеров изучить Т4-подобные вирусы прибрежных районов Байкала, особенно в местах с интенсивной туристической и рекреационной активностью.

Группа Cyano-T4, предположительно, состоит не только из цианофагов, несмотря на своё историческое название, согласно А. Комео и Г. Криш, но и содержит также бактериофаги, инфицирующие Proteobacteria (например, Pelagibacter фаг и Smp14). Исследуемый период отличается максимумом развития пикоцианобактерий, так, в предыдущие годы в августе их численность достигала 3 млн. кл/мл (Belykh, Sorokovikova, 2003; Belykh et al., 2006), следовательно можно предположить, что в это время присутствовало большое количество фагов, поражающих цианобактерии. Однако нельзя утверждать о доминировании цианофагов, т.к. только последовательности,

которые вошли в кластер с культивированными цианофагами, могут принадлежать с большой долей вероятности к цианофагам. Максимальное количество цианобактерий обнаружено в эуфотическом слое, на глубине 0 -25 м, тогда как в этом исследовании пробы отбирали до 100 м, поэтому доля «нецианобактериальных» фагов, вероятно, увеличивалась. В то же время в микробиомах байкальского нейстона и планктона обнаружена значительная доля альфапротеобактерий методом пиросеквенирования 16S рРНК-ампликонов (Galach'yants et al., 2017; Kurilkina et al., 2016), что также может указывать на наличие фагов гетеротрофных бактерий в группе Cyano-T4.

Ранее байкальские последовательности вирусов, полученные методом Сенгера, сформировали 9 кластеров (B1-B9) на филогенетическом дереве. BS OTU дополнили и сформировали новые кластеры, что указывает на более глубокое секвенирование и наиболее полную оценку вирусного разнообразия.

Озёра Бурже и Анси являются олигомезотрофным и олиготрофным, соответственно (Zhong, Jacquet, 2014). На графике пул генов BS OTU занимает промежуточное положение между ранее полученными байкальскими сообществами и фаговыми сообществами из озёр Бурже и Анси. Расположение на дендрограмме байкальских сообществ из северной и южной котловины рядом с сообществом из Чесапикского залива можно объяснить тем, что воды залива разбавлены притоком рек. Из-за градиента солености сообщества бактерий меняются от пресноводных до морских видов, как сообщается в предыдущих исследованиях (Bouvier, Giorgio del, 2002; Xia et al., 2017). В Чесапикском заливе бактерии класса Betaproteobacteria преобладают в пресноводной зоне (Bouvier, Giorgio del, 2002). В Байкале они занимают также доминирующую позицию (Parfenova, Gladkikh, Belykh, 2013). Поскольку вирусы неразрывно связаны со своими хозяевами, подобный бактериальный состав предполагает сходство фагов.

Примечательно, что данные из других экосистем получены методом Сенгера и содержали несколько последовательностей (от 18 до 190), то есть

глубина выборки в этих наборах значительно ниже, чем в полученных методом высокопроизводительного секвенирования в настоящем исследовании.

Предположительно, основная причина отделения BS OTU от образцов Байкала, определенных ранее, заключалась в том, что BS OTU отобран с глубины 0-100 м, а образцы, полученные в 2010 г. - на горизонтах от 5 до 10 м. Другие образцы, представленные на рисунке 17, также взяты на глубине 20 м.

В целом, таргетное секвенирования с использованием высокопроизводительного секвенирования позволило наиболее полно оценить разнообразие Т4-подобных вирусов в водоемах, как показано ранее (Tian, 2015) и продемонстрировано в этом исследовании.

ГЛАВА 6. МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ ВИРИОПЛАНКТОНА ПЕЛАГИАЛИ ОЗ. БАЙКАЛ

Для анализа виромов использовали онлайн сервис MG-RAST (https://www.mg-rast.org/). Так как MG-RAST имеет свою собственную предобработку прочтений, на сервер были загружены «сырые» данные. Последовательности левых и правых ридов, объединённые на стадии обработки MG-RAST, имели среднюю длину 493-506 п.н. Информация по образцам, обработанным на сайте MG-RAST, отражена в таблице (табл. 6).

Таблица 6 - Суммарные данные секвенирования каждого вирома

Образец GC-состав,% «Сырые» данные Загружено в MG-RAST Аннотировано как вирусные Содержание 16S рРНК последов.

BVP1 43 3223426 1474135 20622 929

BVP2 44 4136035 1956295 37595 2675

BVP3 48 4106007 1732119 11958 5097

BVP4 46 4177374 1897967 10452 5819

BVP5 44 5106316 3616043 40682 6563

BVP6 48 3097289 2155698 20366 5087

6.1 Химический анализ воды

Гидрофизические параметры: температура, прозрачность по диску Секки и гидрохимические показатели, такие как рН, концентрация общего фосфора и азота, кислорода, фосфатного фосфора, нитратного и нитритного азота, кремния, органического углерода, а также содержание хлорофилла а в пелагической зоне озера Байкал приведены в таблице 7. На основании полученных данных (содержание хлорофилла а, общего фосфора и азота, прозрачности по диску Секки), согласно классификации Р. Волленвейдера и Д. Керекеса, трофическое состояние озера Байкал в период исследования было определено как олиготрофное с рядом районов, имеющих мезотрофный статус (VoПenweider, Kerekes, 1982).

Таблица 7 - Физико-химические параметры воды и численность вирусов и бактерий на станциях отбора проб (средние значения в слое 0-50 м, кроме прозрачности).

Показатели BVP1 BVP2 BVP3 BVP4 BVP5 BVP6

Температура воды, °C 0,4-1,3 (0,75*) 2,7-2,8 (2,76) 2,7-2,8 (2,69) 1,9 (во всём слое) 7,66 4,2-9 (5,7)

pH 7,92-7,98 (7,95) 7,75-7,82 (7,79) 8,07 7,98 7,9 8,01

Кбщ , мг/л 0,17-0,31 (0,23) 0,20-0,34 (0,29) 0,05-0,22 (0,15) 0,10-0,19 (0,17) 0,17 0,14-0,19 (0,15)

, мкг/л 11-15 (13) 10-12 (11) 12,8 10,9 8 8,7

TOC, мг/л 0,7-1,3 (1,07) 1,7-1,9 (1,8) 1,4-2,4 (1,9) 1,33-1,52 (1,39) 2,03-2,35 (1,9) 1,67-1,84 (1,75)

NO2-, мг/л 0,001 (во всём слое) 0,001-0,003 (0,002) 0,001-0,002 (0,001) 0,0003 0,004 0,0002-0,006 (0,005)

NO3-, мг/л 0,34-0,45 (0,39) 0,37-0,40 (0,39) 0,35-0,38 (0,37) 0,44-0,47 (0,46) 0,08 0,09-0,5 (0,178)

NH+, мг/л 0,007 0,003 0,006 0,003 0,0087 0,00348

PO43 , мкг/л 24-40 (30) 22-26 (24) 20-22 (21) 27-29 (28) 14 1-32 (7,5)

Si, мг/л 0,50-0,52 (0,51) 0,46-0,48 (0,47) 0,31-0,33 (0,31) 0,68-0,69 (0,69) 0,3 0,47-0,52 (0,49)

O2, мг/л 13,5-14,8 (14,3) 12,6-12,8 (12,7) 12,5-12,6 (12,6) 13-13,1(13,03) 9,81 10,8-11,9 (11,4)

Chl a, мкг/л 0,65-3,42 (2) 1,31-1,59 (1,40) 2,5 0,61 2,32 1,26

Вирусы, частиц/мл 2 (± 0,5) х 106 1,5 (±0,8) х106 1,5 (±0,6) х106 2,2 (±0,8) х106 5 (±1,9) х106 5 (±1,2) х106

Бактерии, кл/мл 1,2 (± 0,4) х 106 0,13 (±0,3) х 106 0,15 (±0,04) х106 0,31(±0,1) х106 2,3 (±0,3) х106 1,3 (±0,5) х106

Прозрачность, м 11 16 8 16 6 8

* арифметическое среднее, n=50

6.2 Таксономический состав виромов

Большая часть последовательностей не имела какого-либо сходства с последовательностями из баз данных (Рис. 18). Очевидно, это так называемая «viral dark matter» (вирусная тёмная материя) (Reyes et al., 2012), состав и структура которой остались неизвестными во всех исследованных виромах, полученных до настоящего времени (López-Bueno et al., 2009; Mohiuddin, Schellhorn, 2015).

100

80

60

ä? af

E о

40 20 0

BVP1 BVP2 BVP3 BVP4 BVP5 BVP6

Рисунок 18 - Состав и структура виромов на уровне семейств из озера Байкал, база данных RefSeq 2019 (MG-RAST, e-value 10-5)

Доля представителей домена вирусы от всех аннотированных последовательностей в образцах различна: BVP1 - 8,8%, BVP2 - 4,5%, BVP3 - 0,7%, BVP4 - 0,5%, BVP5 - 1,9%, BVP6 - 1,6%. Большинство проанализированных последовательностей не имеют какой-либо

существенной гомологии с записями в базе данных (e-value меньше 10-5), что типично для всех виромов, известных к настоящему времени.

К домену Bacteria отнесена значительная часть последовательностей (85,1-98,0%). ДНК бактерий присутствовала в вирусной фракции в большом количестве, несмотря на префильтрацию образцов через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм и обработку ДНКазой на стадии подготовки пробы. Вероятными причинами могут являться перенос генов (GTA), неправильно сформированные вирусоподобные частицы (с бактериальной ДНК), наличие бактериальных везикул и ультрамикробактерий. Подобную картину наблюдали при анализе виромов в озере Лох-Ней (Ирландия) (Skvortsov et al., 2016) и в других водоёмах.

Всего в образцах из оз. Байкал идентифицировано 21 семейство вирусов, поражающих широкий круг хозяев: бактерий, водоросли, птиц, рыб, насекомых, людей и др. Семейства Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Phycodnaviridae, Poxviridae составили 97% от всех идентифицированных семейств (табл. 8). Основная часть идентифицированных последовательностей вирусов принадлежала хвостатым бактериофагам порядка Caudovirales, который включал в себя семейства Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae. Среди них преобладали фаги сем. Myoviridae, субдоминантами являлись фаги сем. Siphoviridae, самыми малочисленными были Podoviridae, кроме образца BVP5. В пробе BVP5 из пролива Малое Море - единственной из всех исследованных образцов - подовирусы занимали второе место, в BVP4 (3 км от м. Елохин) наблюдается большее количество неклассифицированных последовательностей, определенных до домена и меньшее количество сем. Podoviridae, по сравнению с другими виромами.

Вирусные последовательности в виромах, не смотря на значительное разнообразие, сходны по таксономическому составу, во всех доминировали бактериофаги порядка Caudovirales.

Таблица 8 - Состав вирусных сообществ на уровне семейств

Семейство ДНК Основные хозяева П юцентное содержание от всех вирусных семейств

BVP1 BVP2 BVP3 BVP4 BVP5 BVP6

Myoviridae дцДНК Бактерии 51,721 62,417 47,792 50,583 37,635 37,881

Siphoviridae дцДНК Бактерии 28,071 14,427 24,159 21,134 20,527 19,385

Podoviridae дцДНК Бактерии 9,281 12,358 15,830 5,243 25,578 18,265

Phycodnaviridae дцДНК Водоросли 6,100 6,867 7,158 9,203 9,173 16,930

Poxviridae дцДНК Птицы, животные, человек 2,017 0,547 0,894 0,641 0,784 0,942

Неклассиф. (происходят от вирусов) - 1,716 2,181 2,659 10,639 3,630 4,748

Iridoviridae дцДНК Насекомые, амфибии, рыбы, беспозвоночные 0,504 0,755 0,585 1,521 0,904 0,481

Неклассиф. (происходят от Caudovirales) дцДНК Бактерии 0,213 0,172 0,342 0,229 0,961 0,265

Baculoviridae дцДНК Насекомые 0,160 0,101 0,234 0,363 0,408 0,549

Marseillevirus family дцДНК Амёбы 0,087 0,087 0,142 0,162 0,223 0,186

Microviridae оцДНК Бактерии 0,024 0,002 0,025 0,038 0,012 0,014

Nimaviridae дцДНК Ракообразные 0,024 0,010 0,033 0,028 0,022 0,058

Herpesviridae дцДНК Животные, человек 0,019 0,042 0,016 0,076 0,049 0,083

Polydnaviridae дцДНК Насекомые 0,014 0 0 0 0,014 0

Ascoviridae дцДНК Беспозвоночные 0,009 0,002 0,025 0,0287 0,022 0,024

Asfarviridae дцДНК Насекомые, свиньи 0,009 0,013 0,025 0,047 0 0,068

Lipothrixviridae дцДНК Археи 0,009 0,002 0,016 0,028 0,012 0,068

A lloherpesviridae дцДНК Рыбы, амфибии 0,004 0,007 0,016 0,028 0,007 0,029

Circoviridae оцДНК Птицы, животные 0,004 0 0,008 0 0 0

Parvoviridae оцДНК Теплокровные животные, человек 0,004 0 0 0 0 0

Tectiviridae дцДНК Бактерии 0 0 0,025 0 0 0

Inoviridae оцДНК Бактерии 0 0 0,008 0 0,031 0

Nanoviridae оцДНК Растения 0 0 0 0 0 0,014

Пересечения видов между виромами продемонстрированы на рисунке 19. Большая часть видов имеет общий пул во всех виромах (190), наибольшим количеством пересечений (34) отличаются виромы из южной котловины озера, что говорит о локальной приуроченности видов к данному местообитанию.

200-

150-

х Ф

т ф

о ф

о. ф

с ф

т о ч:

100-

50-

300 200 100 0 Видов в образце

о-

ВУР4 ВУР1 ВУРЗ ВУР6 ВУР5 ВУР2

ч*

0\ЧК\с

II I ••••••• • II

на • • о и она • ••I• •• •

I I I II I • II II* 111111 I I I !• I >• • < >•

••IIIIII 111:

И

Ш

Рисунок 19 - График пересечения видов вирусов в вирусных сообществах оз. Байкал

Наиболее таксономически сложное сообщество вирусов по данным индексов разнообразия свойственно образцу, отобранному в сентябре в южной котловине озера на центральной станции пос. Листвянка - пос. Танхой (БУРб), наименее сложным - вирусное сообщество из пролива Малое Море (БУР5), август (табл. 9).

Таблица 9 - Индексы разнообразия по Шеннону на основе к-шегБ для виромов оз. Байкал

Образец k-mers 3 k-mers 4 k-mers 5

BVP1 4 5,31 6,55

BVP2 4,01 5,31 6,56

BVP3 4,01 5,30 6,55

BVP4 3,99 5,29 6,54

BVP5 3,99 5,28 6,53

BVP6 4,04 5,34 6,61

В вирусном сообществе из литоральной зоны озера Байкал (30 м от берега, п. Б. Коты, глубина отбора 3,5 м) выявили несколько иной состав доминирующих семейств, более 90% из всех идентифицированных последовательностей приходилось на долю Myoviridae, Poxviridae, Siphoviridae, Phycodnaviridae, Podoviridae а также Mimiviridae. Baculoviridae, Iridoviridae и Herpesviridae представляли 1,34%, 1,09% и 0,75% от всех последовательностей, соответственно. Минорные семейства содержали менее чем 0,5% от всех полученных последовательностей (Butina et al., 2019b).

В других пресных водоёмах среди вирусной фракции также преобладали вирусы порядка Caudovirales, кроме антарктического озера Лимнополар, арктических озёр архипелага Шпицберген и озёр Бурже и Павин (Франция). Как и в нашем случае, представители семейства Myoviridae наиболее многочисленны в озёрах Эри, Онтарио (Mohiuddin, Schellhorn, 2015), Восточное - (Ge et al., 2013), Мичиган (Watkins et al., 2015), в тропических водоёмах Сингапура (Gu et al., 2018) и в пресных водоёмах пустыни Сахара (Fancello et al., 2012).

Как известно, бактериофаги являются многочисленными и важными элементами в микробных сообществах водных экосистем, что свидетельствует об их высокой значимости в регуляции численности бактерий. Следует отметить, что преобладание бактериофагов в виромах также может быть вызвано их методическими «преимуществами» - фаги

легко изолируются из природных проб и по этой причине широко представлены в базах данных (Watkins et al., 2015).

Обращает на себя внимание низкое содержание в виромах оз. Байкал вирусов с одноцепочечной ДНК, их вклад составляет 0,002% - 0,04%, что сопоставимо с таковым в озере Лох-Ней (0,5%). В вириопланктоне озёр Павин и Бурже, напротив, на долю одноцепочечных вирусов приходилось 80% и 85%, соответственно (Roux et al., 2012). В антарктическом озере Лимнополар найдены сезонные различия в составе виромов: в весенней пробе доминировали оцДНК вирусы (74%), в летней они составляли всего 10%. В арктических озёрах (Шпицберген) подавляющее большинство принадлежало оцДНК вирусам (86%), с доминированием сем-ва Circoviridae (38,1%), вирусы с дцДНК составили только 2,8%, в основном состоящие из Caudovirales (1,8%) (Carcer De et al., 2015). В девяти озёрах антарктического полуострова выявлено преобладание оцДНК вирусов, большинство из них принадлежало к неклассифицированным и сем-ву Circoviridae (Carcer de et al., 2016). Наблюдаемый факт связан с методическими особенностями в подготовке метагеномных образцов для секвенирования. Примечательно, что в работах, где преобладали оцДНК вирусы применяли ДНК полимеразу phi29, которая преимущественно амплифицирует небольшие кольцевые геномы одноцепочечных вирусов (Roux et al., 2016).

6.3 Анализ последовательностей на уровне вида

С помощью онлайн сервиса MG-RAST проведена таксономическая идентификация последовательностей из виромов до вида (e-value 10-5).

В исследуемых пробах из всех хитов, принадлежащих виду, большинство отнесено к цианофагам: BVP1 - 38,7%, BVP2 - 53,4%, BVP3 -29,6%, BVP4 - 33,2%, BVP5 - 26,4%, BVP6 - 31,6%. Они представляли фаги, инфицирующие представителей родов Synechococcus, Prochlorococcus, Phormidium и вид Microcystis aeruginosa. Среди них доминировали Prochlorococcus фаг P-SSM2, Synechococcus фаг S-PM2, Prochlorococcus фаг PSS2, Microcystis фаг Ma-LMM01, Phormidium фаг Pf-WMP3.

Цианофаг P-SSM2 (Myoviridae), выделенный из Prochlorococcus sp. NATL1A, имеет линейную дцДНК с размером генома 252401 п.н. Большое количество хитов в байкальских виромах родственных фагам поражающих морской род Prochlorococcus, может быть связано с наличием коровых генов (от англ. «core» - ядро), свойственных всем Т4-подобным бактериофагам (Sullivan et al., 2005).

Цианомиовирус Synechococcus фаг S-PM2 (Myoviridae) с длиной генома 196280 п.н. изолирован из морской воды пролива Ла-Манш на культуре Synechococcus sp. WH7803. В фаге обнаружены гены psbA и psbD, кодирующие D1 и D2 основные компоненты реакционного центра фотосистемы II (Millard et al., 2004).

Microcystis вирус Ma-LMM01 (Myoviridae) с длиной генома 162109 п.н., содержащий 184 ORF и два гена тРНК (гены, позволяющие оптимизировать трансляцию в клетке хозяина), поражает токсичную цианобактерию Microcystis aeruginosa, выделенную из озера Миката в Японии. Геном кодирует сайт-специфическую рекомбиназу и два антирепрессора профага, что позволило сделать предположение о его способности интегрироваться в геном хозяина. В геноме фага обнаружен гомолог nblA, наличие которого указывает на возможность контроля фотосинтетической деятельсности хозяина (Yoshida et al., 2008).

Наиболее многочисленными по количеству хитов после цианофагов в виромах были: Flavobacterium фаг 11b (BVP1 - 8,3%, BVP2 - 1,9% и BVP6 -3,5%), в виромах BVP3 - Staphylococcus фаг G1 (6,5%), в BVP4 - Clostridium фаг 39-O (7,5%) и в BVP5 - Pseudomonas фаг LUZ24 (7,2%). Flavobacterium фаг 11b с размером генома 36012 п.н. принадлежит семейству Siphoviridae, его хозяином является психрофильная бактерия Flavobacterium sp. из арктического морского льда (Borriss et al., 2007). Staphylococcus фаг G1 (Myoviridae) поражает бактерий рода Staphylococcus, Clostridium фаг 39-O из семейства Siphoviridae инфицирует бактерии рода Clostridium, хозяевами Pseudomonas фаг LUZ24, представляющий сем-во Podoviridae, служат бактерии рода Pseudomonas.

Аннотированные последовательности фагов энтеробактерий имели следующее процентное содержание: BVP1 - 7,1%, BVP2 - 5,3%, BVP3 -6,2%, BVP4 - 3,4%, BVP5 - 4,4%, BVP6 - 4,6%.

Большинство хитов семейства Phycodnaviridae в виромах BVP1, BVP2, BVP3 принадлежало вирусам одноклеточных водорослей Ostreococcus и Acanthocystis turfacea, в виромах BVP4 и BVP6 преобладали Ostreococcus вирус OsV5 и Micromonas sp. RCC1109 вирус MpV1, в BVP5 - Ostreococcus вирус OsV5 и Paramecium bursaria Chlorella вирус 1.

Среди представителей семейства Poxviridae, вызывающих заболевания человека и животных, большинсво хитов определены как вирусы оспы свиней Swinepox (0,3-0,9%) (Afonso et al., 2002).

Таким образом, наибольшее количество аннотированных последовательностей принадлежало Т4-подобным вирусам семейства Myoviridae, которые являются литическими бактериофагами. Данный факт указывает на значимую экологическую роль литических фагов в планктоне оз. Байкал, а превалирование среди дцДНК фагов хитов близких к цианофагам свидетельствует о большом значении в микробных сообществах оз. Байкал вирусов, поражающих цианобактерии.

В озере Мичиган найдено большое количество хитов, относящихся к референсным геномам Planktothrix фаг PaV-LD (NC_016564), Burkholderia фаг BcepBIA, и Acanthamoeba polyphaga mimivirus, а также к Prochlorococcus фаг P-SSM2. Аннотированнные последовательности родственные морским видам, скорее всего, имеют сходный состав коровых генов у морских и пресноводных представителей, что мы наблюдали и в виромах оз. Байкал. Также многочисленны были фаг-специфичные ORF, принадлежащие cro, cI-репрессор системе и HNH эндонуклеазам, которые отвечают за литическое и лизогенное развитие вирусной инфекции и латеральный перенос генов, что предполагает наличие лизогенных или потенциально лизогенных фагов в виромах озера Мичиган (Watkins et al., 2015).

Сходно с оз. Байкал, в озерах Онтарио и Эри наиболее многочисленным был порядок Caudovirales (92,4%) с преобладанием рода Т4-подобные вирусы. Наибольшее количество хитов принадлежало Prochlorococcus фагу P-SSM2 и Synechococcus фагу S-PM2. В свою очередь, в эвтрофном озере Лох-Ней преобладали хиты семейства Podoviridae (38,2%): Thalassomonas фаг BA3, Bordetella фаг BPP-1 и Myxococcus фаг Mx8 (Skvortsov et al., 2016).

Виромы реки Амазонка характеризовались доминированием оцДНК вирусов сем. Microviridae и Circoviridae, дцДНК вирусов сем. Myoviridae с наибольшим количеством хитов Chlamydia фага CPAR39, Raven circovirus и Prochlorococcus фага P-SSM2, соответственно (Silva et al., 2017).

Отличительной чертой виромов двух притоков и центральной части эвтрофного озера Матока являлось преобладание дцДНК вирусов с доминирующим сем. Podoviridae. Среди фаговых генотипов доминировали вирусы, поражающие пресноводных Flavobacteria и Proteobacteria. Авторы определяли виды вирусов с помощью набора интсрументов Genome relative Abundance and Average Size (GAAS). Согласно анализу, в пробах самыми многочисленными были штаммы Puniceispirillum фаг HMO-2011 и Persicivirga фаг P12024L, на их долю приходилось до 13% аннотированных последовательностей в каждом из виромов (Green et al., 2015).

6.4 Функциональное аннотирование генов

Для функциональной аннотации прочтений применяли базы данных MG-RAST, включая четыре базы данных, позволяющие использовать иерархическую функциональную аннотацию: KEGG Orthology (KO), COG, eggNOG и SEED Subsystems.

С помощью SEED Subsystems в исследуемых образцах идентифицировали следующее количество хитов: BVP1 - б948б, BVP2 -3б3448, BVP3 - 7б0984, BVP4 - 977039, BVP5 - 112990, BVP6 - 302353. K функциональной категории «Фаги, профаги, транспонируемые элементы и плазмиды» отнесены 27,4% классифицированных прочтений в пробе BVP1, 13,2% в BVP2, 2,04% в BVP3, 1,6% в BVP4, 5,5% в BVP5 и 3,7% в BVP6 (рис. 20). Это гены, связанные с репликацией фага и упаковкой вирусных частиц (например, терминаза, интеграза, геликаза, праймаза).

«Фаги, профаги» в вироме BVP1 представляли наибольшую часть этой группы (97% от всех классифицированных последовательностей категории), где 1,3% прочтений принадлежало агентам переноса генов (Gene Transfer Agents, GTA). Следует отметить, что в подгруппе с наибольшим количеством прочтений в категории «Фаги, профаги» 54,1% составляли «rlt-подобные стрептококковые фаги».

В других виромах основную долю составляла категория первого уровня - «^астерные подсистемы». Примечательно, что в 6 виромах процентное соотношение этой категории варьировало в небольшом диапазоне (12,613,6%). Внутри категории (т.е. второго уровня) была самая многочисленная подкатегория «NULL». Подкатегория «NULL» может содержать некоторые неправильные назначения, что указывает либо на уникальность, либо на отсутствие последовательностей с известными функциями в базе данных SEED.

Сравнительный анализ байкальских виромов по функциональным категориям показал, что в подледный период доминировала категория «Фаги, профаги, переносимые элементы, плазмиды». Преобладание этой категории,

вероятно, свидетельствует об активной репликации (размножении) вирусов подо льдом.

Из анализа можно вывести предположение, что только в подлёдный период сообщество вирусов имеет максимальные темпы репликации.

Фаги, профаги, транспозоны Кластерные подсистемы ДНК метаболизм Карбогидраты Метаболизм белков Аминокислоты и производные Смешанный

Нуклеозиды и нуклеотиды Кофакторы, витамины, протезы, пигменты Клеточная стена и капсула РНК метаболизм Мембранный транспорт Дыхание Ответ на стресс

Жирные кислоты, липиды и изопреноиды Вирулентность, болезнь и защита Подвижность и хемотаксис Деление клеток и клеточный цикл Метаболизм фосфора Регуляция и клеточная сигнализация Метаболизм азота

Метаболизм ароматических соединений Фотосинтез Метаболизм серы Спячка и споруляция Усвоение железа и обмен веществ Калийный обмен Вторичный метаболизм

Рисунок 20 - Функциональная аннотация виромов с использованием базы данных SEED Subsystems (MG-RAST)

6.5 Анализ скаффолдов

Из скаффолдов, собранных SPAdes, были отсортированы с помощью программы VIBRANT v.1.2.1. (Kieft, Zhou, Anantharaman, 2019), скаффолды, принадлежащие вирусам (минимальная длина - 5000 нк, минимальное количество ORF - 4). Далее скаффолды были аннотированы (blastn), используя базу данных RefSeq 2019 и GenBank 2019. По базе данных RefSeq

BVP1 BVP2 BVP3 BVP4 BVP5 BVP6

в виромах не идентифицируется от 41% до 53% скаффолдов, по базе данных ОепБапк - от 25,2% до 35,5%.

Наибольшее количество вирусных скаффолдов определено в пробе ВУР5 (Малое Море) (рис. 21).

Рисунок 21 - Общее количество скаффолдов, определённых как вирусные, и количество совпадений с референсными последовательностями из баз RefSeq и Genbank. uniRefSeq и uniGenbank - количество уникальных записей из аннотированных по RefSeq и Genbank, соответственно (т.е.

принадлежащих одному виду)

Сходство с референсными последовательностями по базе данных RefSeq (е-уа1ие 10-3) варьировало: ВУР1 - 63-94,4%, БУР2 - 63,4-100%, БУР3 - 64,693,9%, БУР4 - 65,9-92,1%, БУР5 - 63,6-97,1%, БУР6 - 63,1-96,9%, покрытие составляло от 0 до 100%. Следует отметить, что 0 - это не абсолютное значение, вероятно за этой цифрой скрывается 0,1-0,9%, однако программа

выдаёт только целые значения, 100% покрытие имели скаффолды, принадлежащие Staphylococcus фагу. Неклассифицированные скаффолды стоит вычислять как скаффолдов «всего» минус классифицированные по базам данных.