Вакцины против клещевого энцефалита, бешенства и гепатита В: Разраб. высокоэффектив. технологии получения препаратов, иммунобиол. и клин. испытания тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, доктор биологических наук в форме науч. докл. Красильников, Игорь Викторович

• Красильников, Игорь Викторович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1998

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вакцины против клещевого энцефалита, бешенства и гепатита В: Разраб. высокоэффектив. технологии получения препаратов, иммунобиол. и клин. испытания»

Актуальность проблемы.

Одним из эффективных путей профилактики и лечения инфекционных заболеваний вирусной природы является вакцинация. До недавнего времени вакцины против этих заболеваний представляли собой культуральную жидкость, содержащую наряду с вирусными частицами, (инактивированного или аттенуированного штамма) как правило, большое количество посторонних примесей, наличие которых давало отрицательный эффект. Примеси вызывали аллергические реакщш, поствакцинальные осложнения и были небезопасны для жизни людей, особенно детей, так как могли провоцировать развитие инфекционных заболеваний (Воробьев A.A., 1980; Смородинцев A.A., 1984).

Во многих странах были созданы научно-технические программы, направленные на совершенствование технологии получения вирусных антигенов, что привело к созданию эффективных вакцин.

В нашей стране, в т.ч. и при нашем участии, также были начаты разработки новых эффективных вакцин против вирусных инфекционных заболеваний. Эти исследования развивались по двум направлениям. Первое - разработка более эффективных и безопасных технологий производства концентрированных и очищенных от примесей вакцин; второе - поиск и создание методов конструирования «молекулярных» вакцин.

Получение высокоэффективных вакцин, не обладающих побочными эффектами, особенно ценно, когда дело касается заболеваний, имеющих высокую летальность или оставляющих глубокую инвалидность на длительное время, возможно, на всю жизнь. К ним относятся вирусный клещевой энцефалит (КЭ), бешенство, гепатит В и другие заболевания.

Бреслером С.Е. и его сотрудниками (1973-1981) было обнаружено явление критической адсорбции вирусов на пористых кремнеземах. Это открытие послужило толчком к развитию методов хроматографии для концентрирования и очистки вирусов. На основе адсорбции вирусных частиц были впервые получены концентрированные и очищенные препараты вирусов гриппа, полиомиелита и клещевого энцефалита.

В это же время появилась еще одна технологическая новинка, созданная Флеровьм Г.И. и сотрудниками (1979) - полиядерные мембраны. На их основе был разработан метод ультрафильтрации, который дал возможность разделять частицы с незначительной разницей в размерах. Эта разработка также нашла место в биотехнологии и была использована для концентрирования вирусов гриппа, клещевого энцефалита и бешенства .

Указанные выше технологические методы-новшества получили интенсивное развитие и дали реальную возможность для создания новой технологии производства вакцин против перечисленных выше заболеваний. Приготовленные с применением этих методов вакцины содержали частицы инактивированных вирусов и незначительное количество посторонних белковых примесей. Наряду с высокой иммуногенной активностью такие вакцины практически не вызывали поствакцинальных осложнений. Их применение позволило значительно повысить эффективность прививок и уменьшить их количество.

Наряду с созданием высокоочшценных вакцин из цельных вирусов, получило развитие другое направление - конструирование так называемых «молекулярных» вакцин, в которых практически нет посторонних примесей. В связи с этим был получен ряд высокоактивных ПАВ-детергентов, которые позволили избирательно солюбилизировать поверхностные антигены оболочки вирусов гриппа, клещевого энцефалита и бешенства. Следует подчеркнуть, что использование некоторых нрионных детергентов дало возможность получать вакцинные препараты в мицеллярной форме, которые отличались высокой иммуногенной активностью.

Такие вакцины содержали лишь необходимые поверхностные антигены возбудителя, способные вызвать иммунный ответ, не уступающий таковому при введении самого возбудителя или высокоочищенных вакцин из инактивированных вирусов.

Молекулярные» вакцины крайне необходимы, прежде всего, для вакцинации лиц с ослабленной иммунной системой, в т.ч. детей и лиц пожилого возраста.

Внедрение генной инженерии в разработку вакцинных штаммов сделало реальным использование микробиологического синтеза для получения протективных вирусных антигенов. Так, в нашей стране был получен штамм пекарских дрожжей, содержащих плазмиду с геном поверхностного антигена вируса гепатита В и продуцирующий этот антиген в виде субьединиц.

Однако, в любом случае, получен ли этот вирусный антиген путем наработки рекомбинантным штаммом-продуцентом или посредством извлечения субьединиц антигена из вируса, необходимо разработать эффективные методы выделения и очистки индивидуальных вирусов и их антигенов. Такие методы были созданы на основе препаративной хроматографии. В настоящее время нами получены серии вакцин, содержащие субъединицы антигенов возбудителей КЭ, бешенства и гепатита В.

При создании «молекулярных» вакцин возникли трудности в получении препаратов с высокой иммуногенной активностью. Это было преодолено с помощью адьювантов, что позволило снизить вакцинирующую дозу и сделать препарат более дешевым, что также имеет большое экономическое значение.

Одним из перспективных путей повышения эффективности «молекулярных» вакцин является применение полимерных адьювантов, которые обладают иммуномодулирующим действием (Петров Р.В. и др., 1983, 1988).

Лабораторные разработки вакцин на основе протективных вирусных антигенов и полимерных иммуномодуляторов показали целесообразность развития этого направления. В экспериментальных вакцинах, содержащих полимерные адьюванты, удалось достичь более низких доз вирусного антигена, достаточных для получения иммунитета высокой степени напряженности.

Результаты исследований по созданию высокоэффективных противовирусных препаратов обобщены в монографиях, обзорах (Бреслер С.Е., 1979; Коликов В.М., Мчедлишвили Б.В., 1986) и ряде диссертаций (Мчедлишвили Б.В., 1980, 1991; Первиков Ю.В., 1982; Хотлубей Л.И., 1986; Грановский Н.Н.,1988; Курбатова И.Ю., 1992), а также отражены в учебниках по вирусологии и иммунологии.

Из вышеизложенного ясно, что за последние годы создан ряд новых эффективных вакцин на основе концентрированных и очищенных препаратов из инактивированных вирусов. Разработаны препараты «молекулярных» вакцин на основе рекомбинантного антигена вируса гепатита В, выделенного из дрожжей, поверхностных антигенов вируса гриппа и вируса КЭ. Чрезвычайно важным и актуальным является создание препаратов с применением полимерных адьювантов и индивидуальных протективных антигенов различных вирусов.

Цель работы.

Создание эффективных вакцин на основе вирусов КЭ, бешенства и рекомбинантного антигена вируса гепатита В (rHBsAg), с использованием методов хроматографии на пористых кремнеземах и ультрафильтрации, а также разработка «молекулярных» вакцин из поверхностных антигенов вирусов.

Задачи исследования.

1.Выявление закономерностей процесса хроматографического разделения вирусов на модифицированных пористых кремнеземах.

2.Разработка методов очистки и концентрирования вирусов ультрафильтрацией.

3.Разработка технологии получения вакцин на основе концентрированных и очищенных вирусных препаратов.

4.Создание методов получения субьединичных вакцин из вирусных частиц.

5. Разработка технологии получения рекомбинантного антигена вируса гепатита В из дрожжей ЗасИаготусев сеге\таае и создание вакцины на его основе.

6. Создание вакцинных препаратов нового типа, состоящих из протективных вирусных антигенов с использованием полимерных иммуномодуляторов.

7. Изучение особенностей иммунного ответа организма на введение вакцин, полученных вышеуказанными методами.

Научная новизна работы.

•Сформулированы принципы хроматографии вирусов на отечественных модифицированных кремнеземах, что позволило реально получать препараты с высокой концентрацией вирусов при полном сохранении их биологических свойств.

•Путем многочисленных экспериментов получен ряд носителей для гель-проникающей хроматографии вирусов.

•Описан процесс адсорбционной хроматографии вируса бешенства на гидроксилкремнеземе, полученном нами.

•Разработана и экспериментально обоснована универсальная технология получения вакцин на основе концентрированных и очищенных вирусных препаратов против КЭ и бешенства.

•Изучены свойства ряда неионных детергентов с целью использования их для выделения поверхностных вирусных антигенов.

•Установлены особенности иммунного ответа на введение новых вакцин.

•Разработана оригинальная технологическая схема выделения рекомбинантного НВзА§ из дрожжей и получения на его основе эффективных вакцинных препаратов.

•Выявлена корреляция между ферментативной (супероксидцисмутазной) и иммуногенной активностью вирусных антигенов, используемых для получения «молекулярных» вакцин.

Практическая ценность и промышленная реализация результатов иследования.

Материалы исследований, которые проводились более 20 лет, дали возможность разработать новую технологию получения высокоэффективных вакцин. В основу технологии взяты: отечественные макропористые кремнеземы, подвергнутые нами химической модификации, ультрафильтрация вирусов на полиядерных мембранах, неионные детергенты для выделения поверхностных вирусных антигенов , а также штамм дрожжей Sacharomyces cereviseae, продуцирующий поверхностный антиген вируса гепатита В.

Для проведения гель-проникающей хроматографии вирусов получен один из видов модифицированного кремнезема, который внедрен в качестве сорбента в технологию производства на НПО «Биолар».

Результаты исследований положены в основу подготовки нормативно-технической документации на технологию вакцинных препаратов, три из них внедрены в производство.

На проведение клинических испытаний вакцин на добровольцах и внедрение их в практику здравоохранения получены разрешения Министерства здравоохранения.

Вакцины против клещевого энцефалита и бешенства выпускаются на предприятии по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова; вакцина против гепатита В - научно-производственной компанией «Комбиотех».

Изучение иммунного ответа на введение разработанных нами вакцин (концентрированных и очищенных) дало возможность снизить количество прививок. При вакцинации против КЭ - с 7 (культуральной вакциной) до 3, против бешенства - с 32 (культуральной вакциной) до 6-9 . При этом уровень напряженности иммунитета достаточно высок.

Материалы по хроматографии и ультрафильтрации вирусов, и получение в результате этого высокоэффективных и безвредных вакцинных препаратов представляют большую научную и практическую ценность. Они зарегистрированы в качестве изобретений и подтверждены: 5 патентами в России и за рубежом, получением 21 авторского свидетельства на способы получения сорбентов и вакцин.

Вакцинные штаммы вирусов КЭ и бешенства хранятся в музее ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Рекомбинантные штаммы пекарских дрожжей депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Гос. НИИ «Генетика» ).

Публикации. Апробация работы.

Основные материалы диссертации опубликованы в 86 работах: 5 патентах, 21 авторском свидетельстве на изобретения, 32 статьях в ведущих отечественных и зарубежных журналах и собраниях научных трудов, 22 тезисах национальных и 6 тезисах международных научных съездов, конференций и симпозиумов.

Материалы диссертации получены совместно с другими авторами.

Исследования по технологии и испытанию вакцин против клещевого энцефалита проведены совместно с Эльбертом Л.Б., Семеновым Б.Ф., Дроздовым С.Г., Первиковым Ю.В., Крутянской Г.Л., Погодиной В.В., Грачевым В.П., Ханиной М.К., Воробьевой М.С., Ефимовой В.Ф.; против гепатита В - совместно с Петровым Р.В., Ждановым В.М., Хаитовым P.M., Грановским H.H., Арман И.П., Борисовой В.Н., Будановым М.В., Яковлевой И.Н., Курбатовой И.Ю.; против бешенства - с Аксеновой Т.А., Мчедлишвили Б.В., Селимовым М.А., Кротовой Л.И., Грибенчей Л.Ф.

Методология хроматографии вирусов и методы выделения, очистки и концентрирования вирусных суспензий, а также получения вирусных препаратов разработаны совместно с Флеровым Г.Н., Бреслером С.Е., Коликовым В.М., Мчедлишвили Б.В., Борисовой В.Н.

Клинические испытания разработанных вакцин проводились сотрудниками ГИСК им. Л.А.Тарасевича: Бекгемировым Т.А., Горбуновым М.А., Павловой Л.И., Воробьевой М.С., Медунициным Н.В. и др. при активном участии автора.

Автор выражает всем перечисленным выше лицам глубокую благодарность за взаимопонимание в работе, тесную поддержку и неоценимый вклад в такие важные проблемы, имеющие не только государственное, но и международное значение.

Работы вьдтолнены по государственной программе 0.19.07.

Объем и структура научного доклада.

Работа изложена на 35 страницах, иллюстрирована 4 рисунками и 7 таблицами. В первом разделе описаны материалы, методы и модели, используемые в исследованиях; во втором - хроматография, очистка, и выделение вирусов и их поверхностных антигенов. В третьем, четвертом и пятом - представлены технологии получения вакцинных препаратов, результаты изучения их физико-химических и иммунологических свойств, а также клинические испытания вакцин против КЭ, бешенства и гепатита В.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментальные данные, свидетельствующие об особенности условий хроматографии вирусов на модифицированных пористых кремнеземах. Обоснование подбора сорбентов для адсорбционной и гель-проникающей хроматографии вирусов.

2. Опытные данные, показывающие эффективность препаративной очистки и концентрирования вирусов и вирусных антигенов посредством хроматографии на химически модифицированных сорбентах.

3. Обоснование целесообразности применения полиядерных мембран для концентрирования и частичной очистки вирусов.

4. Универсальная технологическая схема концентрирования и очистки вирусов на основе ультрафильтрации и хроматографии на пористых кремнеземах. С помощью этой технологии получены высокоиммуногенные вакцины против КЭ и бешенства.

Вакцинные препараты против КЭ, гепатита В и бешенства, которые по своему иммуногенному действию превосходят существующие аналоги в т.ч. по уменьшению кратности прививок.

6. Универсальный метод выделения поверхностных антигенов оболочечных вирусов с использованием ряда неионных детергентов для получения «молекулярных» вакцин.

7. Технология производства вакцины против гепатита В на основе рекомбинантного HBsAg, выделенного из штамма дрожжей васЬаготусев сеге\1$1ае, содержащего плазмиду с последовательностью «8»-гена.

8. Опытные партии вакцинных препаратов, содержащих протективные вирусные антигены и полимерные иммуномодуляторы.

9. Результаты исследований корреляции между ферментативной (супероксидцисмутазной) активностью вирусных антигенов и их иммуногенностыо, что позволяет оценивать эффективность вакцины по найденному параметру.

1. Материалы, методы и модели.

В работе использованы вирусы КЭ ( западного типа, штамм «Софьин» ), бешенства ( штамм «Внуково 32» ). Эти штаммы культивировали в первичных клетках куриных эмбрионов и почек сирийского хомячка (соответственно).

В работе также использовали плазменный поверхностный антиген гепатита В, выделенный из плазмы крови переболевших людей.

В последующих исследованиях применяли рекомбинантные штаммы дрожжей Sacharomyces cerevisiae, содержащие плазмиду с «S» геном вируса гепатита В. Выращивание культуры дрожжей проводили в условиях, обеспечивающих максимальный синтез rHBsAg (подтип ayw).

При изучении процессов хроматографии и улмрафильтрации вирусов использовали, помимо перечисленных, препараты респираторно-синцитиального вируса, полиовируса (тип 1), Рео-вируса, вируса Сендай и различных штаммов вируса гриппа.

Для хроматографического выделения вирусов нами были получены химически модифицированные пористые кремнеземы. Ряд кремнеземов, с измененной поверхностью, был синтезирован во ВНИИ «Биотехника».

Ультрафильтрацию вирусов осуществляли на фильтрационном кассетном модуле типа «Рон пуленк» с тангенциальным потоком жидкости, в котором использовались различные типы полиядерных мембранных фильтров, изготовленных в Объединенном институте ядерных исследований (г. Дубна).

Хроматографию вирусов и вирусных антигенов проводили с применением стандартного оборудования для жидкостной хроматографии фирм LKB или Pharmacia (Швеция).

Адсорбцию вирусов исследовали на аналитических колонках наполненных модифицированным стеклом и уравновешенных буферным раствором с рН 7,7- 7,8. Пробу вируса вводили в колонки и элюировали тон же буферной системой. Фракции отбирали и анализировали на содержание вируса.

Адсорбционную хроматографию вирусов проводили на аналитических колонках, ( преимущественно размерами 2x10 см), заполненных различными модифицированными кремнеземами. Через колонки пропускали вируссодержащую жидкость, а после этого - отмывающий буферный раствор. Элкшию вирусов и вирусных антигенов осуществляли после отмывки колонки, используя буферные системы с высокими значениями рН и ионной силы.

Препаративную адсорбционную хроматографию проводили на колонках размером 5x60 или 6x60 см.

Для препаративной гель-проникающей хроматографии применяли колонки размером 5x100, 10x60 или 10x120 см, заполненные макропористым кремнеземом, модифицированным поливинилпирролидоном (ПВП). Колонки уравновешивали буферной системой (рН 7,7-7,8), затем вводили очищаемый образец вируса и элюировали тем же буферным раствором.

Содержание вируса КЭ в пробах определяли с помощью реакции гемагглютинации, вируса гепатита В - методом пассивной гемагглютинации. Контрольную проверку концентрации обоих вирусов проводили иммуно-ферментными методами (ИФА) или радио-иммунными методами (РИА). Для определения содержания других вирусов использовали методы ИФА или пассивной гемагглютинации.

Патогенную активность вирусов определяли по образованию бляшек в перевиваемых клетках, находящихся в культуре, или по гибели мышей, зараженных интрацеребрально (КЭ)или интраперитонально (бешенство).

Иммуногенную активность экспериментальных вакцин определяли по содержанию титра специфических антител, их динамике повышения концентрации и путем классификации иммуноглобулинов в крови животных, которые появились после их вакцинации. Для вакцин против КЭ и бешенства уровень иммунного профиля выявляли по протективной активности (PDS0), используя в качестве экспериментальной модели мышей линии BALB/C.

Серологические реакции выявляли путем титрования вируснейтрализующих и проявляющих гемагглютинацию антител ( после иммунизации) по стандартным методикам.

Выделение поверхностных антигенов из очищенных препаратов вирусов КЭ осуществляли с помощью неионных детергентов: МЭСК, MEGA и др., имеющих различную длину цепи ПАВ.

Сравнительное исследование действия детергентов на вирусные частицы проводили путем определения нескольких параметров. Основным критерием было количество солюбилизированного антигена и степень его чистоты. В процессе исследований изменяли концентрацию детергента, время обработки вирусных частиц, степень удаления детергента путем диализа, а также способность к мицеллообразованию.

В препаратах, содержащих поверхностные антигены вирусов, определяли концентрации лшщдов, углеводов, нуклеиновых кислот и наличие балластных белков различными физико-химическими методами: электрофорезом в полиакриламидном геле, изоэлектрофокусированием, ультрацентрифугированием, электронной микроскопией, ВЭЖХ и другими способами.

Полученные вакцинные препараты анализировали путем применения традиционных серологических и иммунологических реакций.

Полимерсубьединичные вакцины получали, используя полимеры-иммуномодуляторы в соотношениях, определенных нами для препаратов антиген-полимер. В препараты вводили детергенты, которые затем удаляли диафильтрацией или диализом.

2. Хроматография, очистка, концентрирование вирусов, выделение поверхностных антигенов.

Хроматографическое разделение частиц и веществ на пористых кремнеземах -один из немногих методов, который ранее был успешно использован для концентрирования и очистки вирусов (Haller, 1967; Бреслер, С.Е. и др., 1969; Barton, 1977). Однако, для многих вирусов пористые кремнеземы можно использовать только после их химического модифицирования.

В таблице 1 представлены данные, иллюстрирующие адсорбцию вирусов на модифицированных кремнеземах, изготовленных специально для этих целей .

Адсорбционный процесс вели в условиях максимальной стабильности биологической активности вирусов (при рН 7,7-7,8). Изучение хроматографического поведения вирусов различных семейств показало, что наиболее полная адсорбция наблюдалась на кремнеземах с гидрофобными свойствами поверхности (сорбенты № 3, 11) и на аминокремнеземах (сорбент №1). Экранирование поверхности с гидрофобными свойствами введением ОН- или СООН- групп значительно уменьшало величину адсорбции тога- и миксовирусов (сорбенты № 4,5 и 7,8). Незначительный уровень адсорбции наблюдался при использовании глицеро- и трйс- модифицированных кремнеземов. Практически полный выход большинства вирусов наблюдался на кремнеземах, поверхность которых модифицировали альбумином или белкам» плазмы крови , а также на пористых кремнеземах, модифицированных ПВП. Исключением оказался вирус гепатита В - его выход на ПВП-крёмнеземах составил около 50% (элюэнт с рН 7,8).

Эти данные показывают, что определяющим условием адсорбции вирусов на пористых кремнеземах являются гидрофобные взаимодействия, которые можно устранить, придав поверхности сорбента гидрофильные свойства, при этом на его поверхности возникает отрицательный заряд.

Таблица 1.

Адсорбция вирусов на химически модифицированных кремнеземах. я/п 1 1 2 3 4 5 6 7

8 9

10 11 12

Наименование образца МПК тога

Выход вирусов, % рабдоэнгерогепатитВ 2 3 4 5 6 7

Аминокремнезём Оксипропилкремнезем Бензоиламинопропилкремнезём Салицилоилкремнезём п-Оксибензоилкремне-зём

Трис-кремнезём Сз-карбоксилкремнезем Сю-карбоксилкремнезем ПВП-кремнезём Глицерокремнезём

Св-кремнезем Модифицированный человеческим альбумином кремнезём

0,01 50,0 0,5

5,0 30,0

80,0 90,0 10,0 95,0 90,0 0,05

90,

0,03 10,0 2,0

10,0 60,0

90,0 70,0 1,0 95,0 90,0 0,1

95,0

0 2,0 0,02

1,0 7,0

20,0 30,0 0,2 90,0 80,0 0

90,0

0 10,0 0,1

0,5 0,5

20,0

50,0

2,0

95,0

70,0 0

90,0

0.05 1,0

10,0

50,0

ОД

50,0 0

20,0 миксо

Элюент - трис-буфер 0,05 М, рН 7,7 - 7.8

Полученный вывод учитывался нами при выборе сорбентов для адсорбционной или гель-проникающей хроматографии вирусов. Кроме того, результаты по изучению адсорбции позволили определить наиболее универсальный для гель-проникающей хроматографии вирусов сорбент - ПВП-модифицированный кремнезем.

Зависимость количества выхода вирусов от рН элюента была исследована для ряда модифицированных кремнеземов.

Полная элюция вирусов КЭ на ПВП-модифицированном кремнеземе наблюдалась при использовании элюентов, имеющих рН 7,6-7,8; на ^модифицированном стекле - 8,7. Таким образом, исследования показали, что применение модифицированных кремнеземов значительно снижает рН элюента для вирусов. Их выделение происходит в условиях сохранения максимальной биологической активности, что упрощает стандартизацию процесса хроматографического выделения для многих вирусов.

Исключение составляет лишь вирус гепатита В и его поверхностный антиген, которые элюируются с поверхности ПВП-модифицированного кремнезема при более высоких значениях рН элюенга (9.0). ¡\ .

На процесс хроматографии вирусов значительное йлияние оказывают геометрические параметры макропористых кремнеземов, властности, диаметр их пор.

В ходе исследований выявлен коэффициент распределения (К<1) для различных вирусов в условиях отсутствия адсорбции на ПВП-модифицированных и немодифицированных кремнеземах с различным диаметром пор. Зависимость коэффициента распределения от отношения среднестатистического диаметра вируса к среднему размеру пор кремнезема представлена на рис. 1.

Kd

1,0 0,8 0,6 0.4 0,2 Jbr*«

0}2 (¡¡4 оГб (Н8

• - Рео-1 вирус

А - вирус клещевого энцефалита е- вирус бешенства о - вирус Сендай

- полирвирус (тип 1) о рис. 1 Универсальная калибровочная зависимость для вирусных частиц, полученная в условиях гель-проникающей хроматографииии на пористых кремнеземах (диаметр пор образцов от 0,02 до 1,6 мкм).

Элюенг: 0,05 трис-буфер, 0,15 М NaCl рН 7,7-7,8. v = 0,1 см/мин.

Анализ этой зависимости свидетельствует, что диффузия вирусов в поры твердого сорбента-кремнезема в процессе хроматографии отсутствует при А.=0,5+0,05. Свободная диффузия вирусов имеет место в случае использования кремнеземов, имеющих диаметр пор, превышающий размер вирусных частиц более чем в 10 раз. Причем, зависимос/Ть Kd=f(X), полученная для различных вирусов, на немодифицированных й модифицированных макропористых кремнеземах, оказалась универсальной. Это означает, что изменение поверхности кремнеземов не повлияло на их геометрические параметры.

Геометрические характеристики кремнеземов оказывают влияние на удельную сорбционную емкость по отношению к разным вирусам. Найден оптимальный размер пор сорбентов, обеспечивающий максимальную сорбционную емкость: для вируса КЭ он соответствует 300-400 нм, для HBsAg - 150-200 нм.

Таким образом, на основании выявленных в ходе экспериментов условий выделения вирусов стало возможным подбирать кремнеземы с определенным диаметром пор, оптимальным для проведения адсорбционной или гель-проникающей хроматографии вирусов.

При осуществлении гель-проникающей хроматографии, с целью обеспечения максимальной очистки вируса следует использовать кремнеземы с размерами пор близкими по величине к двойному размеру вирусных частиц.

Для эффективной адсорбционной хроматографии необходимо применять пористые кремнеземы, с диаметром пор, который превышает таковой размер вирусных частиц в 8-10 раз, что обеспечивает максимальную адсорбционную емкость для вирусов.

Приведенные выше результаты исследований, которые дали возможность определить закономерности хроматографии вирусов на пористых кремнеземах, были использованы для концентрирования и очистки инактивированных вирусных частиц. Это привело к созданию эффективных цельновирионных вакцин.

Концентрирование и выделение вирусов проводили не только с помощью методов хроматографии, но и с помощью ультрафильтрации. Для этих целей использовали полиядерные мембранные фильтры, установленные в аппаратах с тангенциальным потоком жидкости.

Установлено, что полиядерные мембранные фильтры имеют низкий уровень дисперсии пор, которая для большинства партий мембран с порами диаметром 0,10,5 мкм, составляет не более 7%. Кроме того, полиядерные мембраны являются достаточно индифферентными по отношению к вирусам: при проведении ультрафильтрации в условиях слабо щелочной среды (рН 7,4-7,8) адсорбция вирусов на них фактически не наблюдается.

К1-Ю

0,8 0,6 0.4 0,2 .

I л А

А - вирус клещевого энцефалита • - Рео-1 вирус ■ - вирус гриппа №N2) о - вирус Сендай Ж - РС-вирус

0 б]2

Рис.2 Калибровочная зависимость для вирусов, полученная при фильтрации на образцах полиядерных мембран.

Буферный раствор: 0,05 М трис-НСЦ 0,15 М К'аСД, рН 7,8: Д Р=0,2 атм.

С помощью многократных экспериментов получена универсальная калибровочная кривая, характеризующая процесс фильтрации на полиядерных мембранных фильтрах. Эта кривая, как и при проведении гель-проникающей хроматографии, описывает задержку вирусов мембраной (Я) как функцию от X (рис. 2).

Зависимость, которую отражает эта кривая, близка к зависимости Кё, полученной для гель-проникающей хроматографии вирусов. Отличительной особенностью ее является более резкий переход от полной задержки вирусов мембраной к их свободному прохождению через поры. .Вирусы задерживаются мембраной, если диаметр ее пор превышает размер вирусов менее чем в 2 раза, и практически полностью проходят через нее при размере пор в 7-8 раз больше, чем таковой у вирусных частиц.

В зависимости от диаметра пор полиядерные мембраны дают возможность осуществить две процедуры, осветление вируссодержащих суспензий и концентрирование вирусов с их частичной очисткой.

Осветление вирусных частиц проводили с использованием мембран, размер пор которых превышает диаметр вирусов в 10-15 раз. При этом удалялись не только крупные частицы примесей, но и шел процесс стерилизующей фильтрации.

Концентрирование вирусов с последующей диафильтрацией осуществляли на мембранах, имеющих величину пор соизмеримую с таковой вирусных частиц. В этом случае потери вирусного материала не превышали 10%.

Следующим этапом разработки методологии получения эффективных вакцин против заболеваний вирусной природы явилась разработка «молекулярных» вакцин.

В конструировании «молекулярных» вакцин против заболеваний вирусной природы сформировалось три направления, связанных с разными способами получения вирусных антигенов:

• выделение поверхностных белков из вирусной биомассы с применением детергентов и ферментов;

• наработка протективных антигенов с использованием микробиологического синтеза рекомбинантных ДНК в клетках эукариотов и прокариотов;

• химический синтез олигопептидов, являющихся основными антигенными детерминантами вируса, которые формируют иммунный ответ.

В настоящее время получили развитие два первых направления, которые и использованы нами.

Для конструирования «молекулярных» вакцин на основе поверхностных антигенов важным условием является возможность получения концентрированных и очищенных вирусных препаратов. Выше описано получение таких препаратов с помощью методов хроматографии и ультрафильтрации. В начале нарабатывали партии концентрированного и очищенного вируса из культуральной или аллантоисной жидкости ( КЭ, гриппа и бешенства), а затем полученные препараты обрабатывали различными детергентами. После обработки поверхностные белки отделяли от вирусных капсидов, содержащих нуклеиновые кислоты вируса и внутренние белки.

Основной задачей, которую мы решали на этом этапе - подбор детергентов и условий обработки вируса для наиболее полного выделения в чистом виде поверхностных антигенов.

Для вируса КЭ установлено, что выделение поверхностного гликопротеина Е осуществляется при обработке неионными детергентами: МЭСК (моноэфир сахарозы с капроновой кислотой) и р-октилглюкозидом. При обработке вирусных частиц этими детергентами наблюдали практически полный выход гликопротеина Е, при этом мембранный белок М не солюбилизировался.

Подобный эффект имел место при получении поверхностных антигенов вирусов бешенства и гриппа.

Более того, на примере вируса гриппа показано, что степень выделения поверхностных белков при обработке глюкозидными детергентами зависит от длины цепи поверхностного активного вещества (ПАВ). Например, при обработке Р-октилглюкозидом, МЕГА-8 и МЕГА-10 наиболее быстро солюбилизация гликопротеинов наблюдалась при использовании последнего, имеющего самую длинную цепь. К тому же, данное ПАВ обеспечивало и самую высокую избирательность, о чем демонстративно указывают данные, представленные в таблице 2.

Таблица 2.

Характеристика препаратов вируса гриппа, полученных при обработке детергентами.

Название Конечная Выход глико- Выход ГА Содержание детергентов концентрация протеинов активности в примесных детергентов, (% от вирусных ОРИД (%) белков, белков) (%)

МЭСК 10 5 10 3

Р-октил- 1 15 40 7 глюкозид

МЕГА-8 1 20 50 5

МЕГА-10 1 30 90 5

Время действия детергентов - 20 мин, температура - +4°С

Р-окгилглкжозвд - СмНгвОб ; МЕСА-8 - СпНз^Оо; МЕОА-Ю - Сл7Нз5Ж)б

Полученные результаты были использованы для приготовления субъединичных вакцин против КЭ и гриппа.

Технология заключалась в следующем: концентрированные и очищенные вирусные препараты обрабатывали (З-октилглюкозидом, или детергентом МЕГА-10 после чего вирусные капсиды отделяли ультрацентрифугированием или ультрафильтрацией. Гликопротеины отделяли от ПАВ диализом или гель-проникающей хроматографией.

Очищенные(от детергентов) гликопротеины сорбировали на гидроксиде алюминия, разводили до необходимой концентрации и разливали в ампулы.

Иммуногенную эффективность «молекулярной» субъединичной вакцины против гриппа изучали в лабораторных условиях и клинических испытаниях (Грипповак СЕАЖ). Показано, что вакцина обладает высокой специфичностью иммунного ответа, не вызывает побочных эффектов и поствакцинальных осложнений.

В процессе работы с вакцинными препаратами, состоящими из субьединиц вирусов КЭ, гриппа и гНВвАя, мы предприняли попытку повысить иммуногенную активность с помощью специфических иммуномодуляторов - полиэлектролитов. Нами были поставлены опыты по сравнительной оценке иммуногенной способности «субъединичных» препаратов вирусов гриппа и гепатита В после адсорбции на адьювантах полисахаридной природы (например: сополимер с дифенилхиноном, полиоксидоний, ПВП). Установлено, что титр антител в сыворотке крови мышей после иммунизации в этом случае возрастал в несколько раз.

Изучение свойств очищенных препаратов, содержащих су&ьединицы поверхностных вирусных белков, выявило еще одну закономерную связь. Наблюдалась корреляция между иммуногенностью препаратов и их ферментативной активностью. Например, при исследовании супероксиддисмутазной активности (СОД) препаратов вируса гриппа, установлено, что субъедишщы, выделенные из штаммов Нз№ имеют более выраженную ферментативную активность чем таковые из штампов H2N2. Рекомбинантный HBsAg, содержащий часть антигена из Pre S -области, имел меньшую активность СОД, чем непосредственно г HBsAg.

Таким образом, нами впервые обнаружена важнейшая закономерность -корреляция между иммуногенным эффектом препаратов, в которых содержатся субъединичные поверхностные вирусные белки, и активностью СОД. Данное свойство позволило нам в дальнейшем проводить сравнительную оценку иммуногенной способности «субьединичных» вакцинных препаратов по проявлению указанной выше ферментативной активности.

Результаты экспериментов обрабатывали методами статистического анализа. Корреляционные взаимоотношения между отдельными показателями иммунных тестов оценивали по критерию знаков Диксона и Мурра (1978). Достоверность различий между индексами антителообразования у людей, иммунизированных различными типами вакцин, оценивали по критерию Стьюдента.

Выше изложенное свидетельствует о том, что нами разработана . новая технология концентрирования и очистки вирусов для получения высокоэффективных вакцинных препаратов. Поскольку приемы и отдельные детали технологии уже были описаны, мы лишь считаем нужным подчеркнуть, что в ней использованы, в основном, отечественные материалы.

3. Клещевой энцефалит. Технология получения вакцины. Физико-химические и иммунологические свойства. Клинические испытания препарата.

В основу технологии получения новой эффективной вакцины против КЭ были положены разработанные нами указанные выше методы адсорбционной и гель-проникающей хроматографии.

Изучены процессы адсорбции вируса из культуры на модифицированных пористых кремнеземах. В процессе исследований выявлено, что сорбционная емкость кремнеземов-носителей применительно к вирусу КЭ уменьшалась при наличии в кулыуральной вируссодержащей жидкости сыворотки, используемой при культивировании. На величину удельной емкости макропористых кремнеземов также оказывали влияние концентрация вируса в суспензии и параметры носителя.

Наибольшая удельная емкость сорбента наблюдалась при наличии пор диаметром 300-400 нм и максимальной пористости.

Адсорбционная хроматография позволила получить не только концентрированные , но и частично очищенные препараты. Последнее достигалось в том случае, если перед десорбцией вирусных частиц, которыми насыщена колонка, ее отмывали от белков-примесей буферным раствором с меньшим значением рН и ионной силы, чем у системы, которую использовали для десорбцйи частиц вируса. Для вируса КЭ таким раствором был трис-HCl: буферная система 0,1 М концентрации, с рН 8,1. Отмывая колонку таким образом, мы удаляли до 95% балластных белков и теряли не более 2% вирусов. Для десорбции вирусных частиц, как показали наши эксперименты, оптимальным является буферный раствор, содержащий 0,2 М трис- НС1, с рН 8,4 и присутствием в нем 0,4 М КаС1. Используя его, удалось элюировать до 90% адсорбированного на кремнеземе вируса.

Совокупность перечисленных выше условий проведения хроматографии на МПК позволила получать препараты, в которых концентрация вирусных частиц превышала в 10-50 раз таковую в исходной суспензии и обеспечивала удаление из нее 91-95% белковых примесей.

Изучение антигенных и иммуногенных свойств препаратов из вируса КЭ до и после адсорбционной хроматографии показало, что метод является достаточно щадящим и сохраняет высокую биологическую, в частности, иммуногенную активность вирусных частиц.

Окончательную и достаточно полную очистку концентрированой и очищенной суспензии вируса КЭ осуществляли с помощью гель-проникающей хроматографии на МПК, полученном путем химической модификации сорбента с помощью ПВП. В оптимальном для вируса режиме проведения хроматографии на МПК (размер пор около 100 нм, рН элюента 7,7-7,8) получали полный выход вирусных частиц из колонки со степенью очистки более 99%. Высокую степень чистоты препарата достигали в случае применения для концентрирования вируса, вместо адсорбционной хроматографии, метода ультрафильтрации на полиядерных мембранах. Концентрирование проводили с применением мембран, диаметр пор которых равнялся 50-60 нм. Вируссодержащую жидкость концентрировали в 20-40 раз и промывали в режиме диафильтрации трис-НС1 буферным раствором с рН 7,8. Полученный концентрат затем очищали гель-проникающей хроматографией.

Вирусные препараты, полученные путем последовательного применения адсорбционной и гель-проникающей хроматографии или ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии, практически не отличались по физико-химическим и иммунологическим характеристикам. Они и являются готовым материалом для создания эффективной вакцины против КЭ на основе инактивированного вируса. Для получения вакцины к указанным препаратам после проведения стерилизующей фильтрации лишь добавляют щдроксид алюминия.

Приготовленный описанным способом препарат мы и назвали концентрированной очищенной вакциной (КОВ) против КЭ.

Далее мы провели исследование разработанной нами вакцины посредством различных иммунологических реакций в сравнении с известной коммерческой неконцентрированной вакциной (НВ).

Роль клеточного и гуморального иммунитета в формировании поствакцинальной резистентности к вирусу КЭ изучали на мышах линии ВАЬВ / С. С этой целью житвотных иммунизировали трижды, проводя каждое введение вакцины через 28 суток. Протективную активность сравнивали на 4, 7, 14 и 21 сутки после каждой иммунизации.

Показано, что КОВ значительно превосходит по протективным свойствам НВ. Максимальный эффект наблюдался через 2, 3 недели после третьего введения вакцинного препарата. Так, для защиты 50% мышей от десятикратной дозы 1ЛЭ50 вируса КЭ КОВ требовалось в 20-30 раз меньше, чем НВ. Полученные данные соответствуют известной иммунологической зависимости степени иммуного ответа от количества вводимого антигена (Петров Р.В. и др., 1982). Следует подчеркнуть, что после второго и третьего введения КОВ, уровень антител, частота выявления, а также длительность их нахождения в сыворотке крови животных были достоверно выше, чем у животных, которых иммунизировали НВ.

В экспериментах с использованием метода адаптивного переноса установлено, что на ранних этапах вакцинального процесса защитные свойства проявляют спленоциты, активируемые только КОВ (НВ не влияет). В этот период протективное действие оказывают как В- так и Т- лимфоциты. В более поздние сроки этот эффект проявляют преимущественно В-лимфоциты.

В опытах на мышах различных линий и гибридных линиях животных первого поколения выявлены различия в чувствительности к возбудителю КЭ, прямо коррелируемые с интенсивностью гуморального ответа . Иммунизация КОВ защищала мышей высокочувствительных линий от патогенного действия вируса, что не проявилось при иммунизации коммерческой вакциной (НВ).

Далее были проведены клинические испытания на добровольцах: одна группа иммунизировалась КОВ, другая - НВ. Нами доказано, что КОВ значительно превосходит НВ по иммуногенным свойствам. Уже после однократного введения первая из вакцин индуцирует синтез антител, нейтрализующих вирус - у 50 - 70% испытуемых и тормозящих гемагппотинацию - у 30 - 40%. НВ вызывала у 10% привитых людей образование нейтрализующих антител и совсем не обеспечивала синтез гемагглютининов. После вторичной иммунизации (с интервалом в 1 месяц) КОВ стимулировала продукцию нейтрализующих вирус антител у 70 - 100% лиц, а коммерческая вакцина - лишь в 15% случаев.

В последующем мы попытались сравнить иммунизирующую активность КОВ и живой вакцины на основе аттенуированного штамма « Еланцев» вируса Лангат. По способности стимулировать антителообразование после однократной иммунизации разработанная нами вакцина уступала живой. А вот после реиммунизации показатели титра специфических антител и частота индуцируемой сероконверсии у привитых КОВ намного превышала индексы у ревакцинйрованных аттенуированным вирусом. Антитела, которые синтезируются у лиц, привитых однократно КОВ, относятся не только к классу М, но и к ^ в - глобулинам, что свидетельствует о высокой иммуногенности разработанной нами вакцины.

В дальнейших исследованиях определяли влияние КОВ на способность привитых людей сохранять иммунологическую память. Добровольцев вакцинировали этим препаратом и следили за титром антител к вирусу КЭ. Антитела элиминировались из организма в течение 4-6 месяцев. Реиммунизация приводила к появлению антител, причем титр их был достаточно высок по сравнению с таковым у людей, серопозитивных в отношении КЭ, которым повторную вакцинацию осуществляли через 4 месяца после первой.

Антитела, синтезируемые после реиммунизации, являлись ^О-глобулинами.

Для изучения иммуногенных свойств примесных компонентов, содержащихся в КОВ и НВ, а также эффективности очистки новой вакцины использовали реакцию бласттрансформации (РБТ) лимфоцитов вакцинированных людей. Установили, что КОВ вызывает значительно меньшую сенсибилизацию человека к антителам куриных фибробластов - клеток, которые используются при культивировании вируса для приготовления вакцины. Например, после одно- и двухкратного применения КОВ положительную РБТ зарегистрировали у 16 и 21% лиц (соответственно), а после инъекций НВ позитивную РБТ выявили у 37 и 59% людей.

Эти данные согласуются с результатами исследований иммунохимического анализа вакцинных препаратов: в НВ содержится в 50-70 раз (средние показатели) больше белков среды культивирования по сравнению с КОВ.

Производственные серии КОВ существенно не отличаются как по иммуногенности, так и по физико-химическим характеристикам (см. табл. 3 ).

Таблица 3.

Характеристика 4 экспериментальных серий концентрированной и очищенной вакцины против КЭ.

Технолог» ческая схема изгоговлб ния Иммуно-генность (протект-■ ивная активность) МИД® Белки сыворотки коров, мкг/ мл Оваль -бумин, мкг/мл -'Белковый азот, мкг/ мл Вирус КЭ Реактогенность в опытах на Стерильность мышах морских свинках

УФ+ГХ 0,006 <1 0,03 2,9 нет нет нет Стерильна

АХ+ГФ 0,004 <1 <0,015 4,4 нет нет нет Стерильна

АХ+ГФ 0,004 <1 <0,015 3,1 нет нет нет Стерильна

АХ+ГФ 0,004 ¿1 <0,015 2,3 нет нет нет Стерильна

Примечание. Представлены результаты по данным ГИСК им М.А.Тарасевича. УФ -ультрафильтрация, АХ - адсорбционная хроматография, ГХ - гель-проникающая хроматография. МИД» минимальная иммунизирующая доза - количество вакцины (в мл), защищающее при троекратном введении без гидроксида алюминия 50% белых мышей от заражения в брюшную полоста вирусом КЭ, пггамм Абсеттаров, в количестве 100 - 1000 ЛД». Вирус КЭ(инфекционный) -в материале до концентрирования ( после инактивации) и в готовой вакцине.

Двукратная вакцинация с интервалом 1-2 месяца с последующей ревакцинацией через 5-6 месяцев обеспечивает антителообразование практически у всех людей. Такая высокая степень реакции яа введение антигена возможна только в том случае, если среди населения отсутствует иммунологически некомпетентная группа лиц, организм которых не способен к синтезу антител в ответ на введение вакцины против КЭ. С нашей точки зрения, высокую эффективность вакцины определяет то, что в развитии иммунного ответа основную роль играют В-лимфоциты.

Анализ степени сероконверсии у привитых указывает также на то, что, несмотря на различие в механизмах иммунитета, индуцированного аттенуированным вирусом и КОВ , эта вакцина вызывает иммунный ответ у большинства людей, если содержание инактивированных вирионов составляет более Ю10 частиц в 1 см.3

По методике, разработанной на основе клинических испытаний, прививку следует производить дважды с интервалом около двух месяцев, ревакцинацию -через 6-12 месяцев. ,

При применении НВ происходит более длительный процесс вакцинации. Полный курс прививок состоит из 7 инъекций вакцины: 3 инъекции с интервалом в 2 недели, ревакцинация - через 6 месяцев, последующая ревакцинация ежегодно в течение трех лет. Такая иммунизация против КЭ достигает достаточной напряженности иммунитета.

Разработанная нами вакцина значительно повышает эффективность иммунизации, что самое главное, а также существенно сокращает сроки вакцинации и финансовые затраты на ее проведение.

Таким образом, нами разработана новая технология получения вакцин против КЭ, которая по своей иммуногенной эффективности и безопасности значительно превосходит все существующие вакцинные препарат

4. Бешенство. Разработка технологии получения вакцин. Физико-химические свойства, иммунобиологические и клинические испытания.

Основными проблемами получения вакцины против бешенства, с которыми сталкиваются исследователи, являются высокая патогенность вирусных вакцинных штаммов и низкое содержание вируса в кулыуральной вируссодержащей жидкости. Проблема патогенности вакцинного штамма была решена ранее (Селимов М.А., 1973) . Путем многократных пассажей атгенуированного вируса в культуре клеток почек хомяков при низких температурах ( 32° С) был получен производственный штамм - Внуково-32. Этот штамм используется в производстве инактивированной кулыуральной антирабической вакцины. Вторая проблема (повышения содержания вируса в вакцине) решалась нами с помощью изложенных выше методов: ультрафильтрации на полиядерных мембранах и хроматографии на пористых кремнеземах.

Исходную культуральную вируссодержащую жидкость осветляли микрофильтрацией через полиядерные мембраны с диаметром пор 1,8-2,2 мкм для удаления белковых конгломератов и обломков клеток. Осветленный препарат инактивировали, добавляя раствор формальдегида до конечной его концентрации 0,005 %. Далее инактивированную вируссодержащую жидкость концентрировали ультрафильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,1-0,15 мкм с последующей диафильтрацией трис-HCL буфером pH 7,7. В результате последней процедуры концентрация вируса возрастала в 10-20 раз, а содержание белковых примесей уменьшалось с 2-3 мг/мл до 150-200 мкг/мл. Причем, иммуногенная активность препаратов вируса бешенства возрастала пропорционально кратности уменьшения объема, что свидетельствует о сохранении биологических свойств вируса и минимальных потерях в процессе ультрафильтрации.

Нами также разработан метод концентрирования вируса бешенства адсорбционной хроматографией на пористом гидроксил-кремнеземе. Оказалось, что вирус бешенства возможно эгаоировать с поверхности такого сорбента практически без потерь его иммуногенных свойств. Немодифицированный кремнезем сорбировал вирус безвозвратно. В результате адсорбционной хроматографии на оксипропилкремнеземе вирус концентрировался в 10-20 раз, содержание примесных белков уменьшалось на 90 %.

Окончательную очистку вирусных концентратов осуществляли гель-проникающей хроматографией на модифицированных пористых кремнеземах. В процессе производства вакцины применяли «препаративные хроматографические колонки, которые заполняли ПВП-модифицированным кремнеземом с порами размером 0,15 - 0,2 мкм.

Использование модифицированных кремнеземов с указанными выше порами позволяло практически без потерь достигать наиболее полной очистки вируса. На рисунке 3 представлена хроматограмма очистки одного из концентрированных препаратов инактивированного вируса бешенства. Степень очисмтки довольно существенна. Если в исходном вирусном концентрате содержалось около 300 мкг/мл примесных белков, то после очистки содержание белка в вируссодержащих фракциях составляло 10-20 мкг/мл.

Рис.3 Препаративная очистка вируса бешенства методом гель -проникающей хроматографии.

Колонка 10x120 см; у=2 см/мин; V = 700 мл.; элюент - 0.1 М трис-НС1, рН 7,8 Р[) - протективная активность.

Концентрированные очищенные препараты, содержащие инактивированный вирус бешенства являются основой для получения новой эффективной вакцины. Чтобы приготовить вакцину, эти препараты стерилизуют фильтрацией, добавляют в них смесь для лиофилизации, содержащую альбумин человека в качестве стабилизатора, разливают в ампулы, лиофшшзируют и запаивают.

Исследование концентрированной антирабической вакцины из инактивированного вируса показали ее стерильность, безвредность, и отсутствие активного вируса. Изучение иммуногенных свойств по сравнению с культуральной референс-вакциной ГИСК им. Л.А.Тарасевича и концентрированной вакциной производства Института Мерье, Франция (серия 0312) показало ее более высокую иммунизирующую активность.

Мы достигли высоких показателей иммуногенности концентрированной вакцины против бешенства - индекс иммуногенности не ниже 6. Эта вакцина -высокостабильный препарат, сохраняет активность в течение 30 дней при прогревании до 32° С, хранение при 1=+4° С до 6 месяцев не снижает иммунизирующей активности.

Иммуногенная способность вакцины изучена на мелких лабораторных животных, и обезьянах. Особенно показательны опыты, проведенные на обезьянах, которые представлены в таблице 4.

После внутримышечной двукратной иммунизации обезьян наблюдали очень высокие титры антител на 36 и 52 дни иммунизации, превосходящие таковые при использовании нативной и референс вакцины. Результаты титрования сывороток подтверждены опытами института Мерье.

В завершение исследований мы провели клинические испытания на добровольцах в возрасте 16-45 лет. Пробы крови брали из вены до вакцинации, на 20-й день перед второй прививкой и 40-й день от начала иммунизации. Сыворотку титровали на мышах по стандартной методике. Реакция нейтрализации была поставлены со всеми пробами сывороток против 126 LD50 вируса бешенства, штамм С VS.

Первой группе добровольцев (10) вакцину внутримышечно вводили на 0-20 дни. Двукратная вакцинация вызывала у половины испытуемых высокие накопления антител (от 1/2786 до 1/6250), у четырех он был значительно ниже, а у одного -очень низкий. Среднее значение титра антител составляло 1/1067.

Таблица 4.

Антигенная активность концентрированной вакцины против бешенства (серия 1) в опыте на обезьянах в сравнении с производственной культуральной (серия 245) и французской (S-0312) сериями антирабической вакцины.

Опыт Серия Кол-во живот- Путь Дни взятия крови и средние титрь: вируснейтрализующих антител ных введения 0 20 36 52

1 х) Серия 245 4 в/мышеч. по 1,5 мл 0 36,3 68,8 36,3

Серия 245 4 в/кожно по 0,25 мл 0 30,4 30,9 16,2

2 хх) Концентриро ванная серия 4 в/мышеч. по 1,5 мл 0 250,0 1927,5 7679,0

Концентриро ванная серия 4 в/кожно по 0,25 мл 0 131,2 558,4 706,7

3 хх) 8-0312 (Институт Мерье, Фр.) 8-0312 4 4 в/мышеч. по 1,0 мл в/кожно по 0,25 мл 0 0 328 26,3 656,1 92,0 729,9 62,3 х) 245 серию вакцины вводили 6 раз в течение 6 дней (ежедневно). хх) Вакцины концентрированную и Института Мерье вводили на 0 и 20 дни.

Второй группе (10) вакцину вводили 2 дня подряд и на 20-й день. Высокое накопление антител у всех привитых отмечалось на 40-й день после 3-й инъекции -от1/1117 до 1/3273 в среднем он составлял 1/1508. У лиц, которые получали по 3-5 мл (доз) неконцентрированной культуральной вакцины, титры были существенно ниже.

У 4-х добровольцев после первой прививки КОВ была отмечена легкая реакция в виде местной гиперемии, которая проходила через 3 дня.

Далее мы провели сравнительное исследование иммуногенной активности концентрированной антирабической вакцины (КАВ) с вакциной Института Мерье серия 8-0312) и референс-вакциной, интернациональной (ВОЗ). Эти результаты представлены в таблице 5.

Анализ этих данных ярко демонстрирует весьма высокую эффективность разработанной нами КАВ по сравнению с указанными препаратами. Так разведение КАВ, защищающее 50% мышей от летального эффекта, в 4 раза ниже, чем таковое у вакцины Института Мерье, и в 66 раз ниже, чем у вакцины ВОЗ. Об этом же свидетельствуеют показатели ОИ, ЭД50 и индекс иммуногенности.

Таблица S.

Иммуногенная активность концентрированной инактивированной культуральной антирабической вакцины (метод NIH). пп х) Вакцина, серия Разведение вакцины, защищающее 50 % мышей Относительная иммуно-генносгь (ОИ) ЭД50 Индекс иммуногенности (метод NIH) хх) Доза вируса CVS вЛД»

1 КАВ, концентрированная, серия 2 1 : 1188,4 х) 32,5 0,036 65 63,2

2 КАВ, серия 8-0312 (Институт Мерье) 1 : 283,0 х) 7,5 0,17 14 63,2

3 Референс вакцина интернациональная (ВОЗ) 1: 18,1 2,36 63,2 х) Одна доза испытуемой вакцины для человека -1,5 мл, одна доза референс-вакцины - 3 мл. хх) CVS - 2 6, NOV 67 (ВОЗ)

Оценивая результаты иммуногенной активности КАВ, можно сделать твердое заключение, что 2-3 кратное введение препарата индуцирует высокую продукцию вируснейтрализукнцих антител , намного превышающую таковую при введении нативной культуральной вакцины. Все выше изложенное свидетельствует о том, что нами получена эффективная антирабическая вакцина.

По схеме, разработанной на основе клинических испытаний, КАВ вводится внутримышечно по 1 мл в день укуса, затем на 3, 7, 14, 30 дни с последующей ревакцинацией через два месяца (90 день). В зависимости от тяжести укуса и применения гаммаглобулина количество вакцинаций может возрастать до 9 и более.

Таким образом, разработанная нами вакцина обладает высокой эффективностью при вакцинациях и практически не вызывает побочных реакций. С ее помощью удалось сократить время и количество вакцинаций с 32 (культуральной вакциной) до 6-9 (в зависимости от тяжести укуса).

5. Вирусный гепатит. Разработка технологии получения вакцины. Физико-химические свойства, иммунологические и клинические испытания.

В предыдущих разделах работы нами обсуждались особенности получения антигенов для «субьединичных» вакцин. В частнсзти, говорилось о возможности наработки антигена для ряда возбудителей микробиологическим синтезом. Особенно актуальным вопрос наработки поверхностного антигена возник при конструировании вакцины против гепатита В.

Вирус гепатита В практически не культивируется в клетках животных и перевиваемых культурах. Однако, с помощью конструирования рекомбинантных ДНК удалось получить микроорганизмы, способные синтезировать поверхностный антиген вируса (Уа1епгие1а,1982). В нашей стране первоначально были получены рекомбинантные штаммы пекарских дрожжей, синтезирующие гНВзА§ с несколькими дополнительными аминокислотами, кодируемыми пре-8 областью генома вируса ( Грановский Н.Н., 1987). Нами, путем использования метода точечных мутаций с последующей гибридизацией и клонированием удалось получить штаммы, синтезирующие последовательность, полностью соответствующую НВв подтип ау\у. Один из них ( ДАН-041/р 20) был использован в производстве рекомбинантной вакцины.

Особенностью синтеза rHBsAg в дрожжевых клетках является способность его накопления внутри клетки, а не в культуральной среде. Поэтому первым этапом получения вакцины является извлечение rHBsAg из клеток рекомбинантного штамма и удаление обломков клеток (осветление). После многократных экспериментов с использованием различных методов разрушения был выбран метод дезинтеграции рекомбинантных дрожжевых клеток в протоке под давлением. При его использовании с последующим прохождением экстракта клеток через проточный сепаратор удавалось получать наиболее очищенную от обломков клеток антигенсодержащую жидкость. Эта субстанция являлась основой для получения вакцины и нуждалась в дальнейшей тщательной очистке.

Для разработки методов выделения и очистки рекомбинантного антигена в первую очередь нами были изучены процессы адсорбции-десорбции на различных пористых кремнеземах. Установлено, что наиболее полная адсорбция гHBsAg из осветленного дрожжевого экстракта имела место на немодифицированных кремнеземах МПС-2000 ВГХ. 90-98% рекомбинантного антигена сорбировалось на нем в условиях перемешивания при температуре +4° С в течение 1-3 часов. Далее производили отмывку антигена от посторонних белковых примесей бикарбонатным буфером с рН до 8,0, затем элюировали такой же буферной системой с рН 9,0 и выше. В результате указанных манипуляций средний выход очищенного антигена составил 80-90%.

Адсорбция rHBsAg наблюдалась и на модифицированных кремнеземах. Наибольшей емкостью по отношению к антигену обладали МПС - 2000 ВГХ , модифицированные капролактамом или бензойной кислотой (80 и 90 %, соответственно). Однако при изучении процесса элюции антигена выяснилось, что выход активной субстанции намного ниже, чем таковой при применении немодифицированного МПС.

Таким образом, адсобционная хроматография на природном кремнеземе является высокоспецифическим и весьма эффективным методом получения концентрированного и очищенного rHBsAg из дрожжей. Препарат после адсорбционной хроматографии' содержал 80-85% антигена (от исходного количества), при степени очистки от белковых примесей в 50-60 раз.

Предварительные результаты исследований показали, что гНВ»^ хорошо сорбируется на силохроме С-80, который модифицирован ПВП или N -винилпирролидоном. Элюцию успешно проводили 0,05 М бикарбонатным буферным раствором или 0,05 М трис - НС1 системой (оба с рН 9,1), при этом наблюдался высокий выход поверхностного антигена (более 90%).

Эти данные были использованы нами для проведения процесса гель-проникающей хроматографии rHBsAg. Оптимальный выход антигена наблюдался при рН элюирукяцего раствора 9,1-9,3. И, что весьма примечательно, гНВвА§ практически не терял своей иммуногенной активности.

Гель-проникающая хроматография являлась последней стадией очистки и мы убедились, что она позволяет быстро и эффективно очистить антиген от различных примесей с минимальными потерями и полным сохранением свойств антигена.

Однако, исходя из требований Всемирной организации здравоохранения к рекомбинантным вакцинам (Бюллетень ВОЗ, №4, 1993), необходимо было проводить дополнительную очистку гНВзА§, чтобы добиться 95 % его чистоты. Окончательную очистку rHBsAg обеспечивало ультрацентрифугирование в градиенте концентрации сахарозы. Для этой процедуры антиген сначала концентрировали ультрафильтрацией на мембранах с порами диаметром 0,03-0,04 мкм, а затем центрифугировали в зональном роторе. Для приготовления градиентных растворов использовали бикарбонатный буферный раствор (рН 9,1).

Рис 4. Технологическая схема получения рекомбинантной вакцины против гепатита В.

После центрифугирования выделенную фракцию гНВэАя освобождали от сахарозы и возможных инородных включений гель-проникающей хроматографией,, разводили до необходимой концентрации, добавляли гидроксид алюминия в качестве адьюванта и разливали по дозам.

В результате многочисленных экспериментов разработана технология получения вакцины на основе гНВ8А§, которая представлена на рис.4.

Вакцинные препараты, полученные на основе представленной схемы, были исследованы в сравнении с препаратами плазменного НВвА§, очищенного аналогичным способом. Сравнение гНВзА§ и плазменного НВвА§ показало, что оба антигена сорбировались и десорбировались при одинаковых условиях, имели равную плавучую плотность в градиенте концентрации КЫа-тартрата и хлорида цезия. Электронная и иммуноэлектронная микроскопия показали близость морфологической и иммуноспецифической характеристик рекомбинантного и плазменного HBsAg. Рекомбинантный антиген представляет собой субьединицы размером 18-21 км, реагирует практически со всеми моноклональными антителами, полученными к плазменному НВ8А§.

Оба антигена имеют подобные по величине плавучую плотность и УФ-спектр.

Нами также изучены иммуногенные свойства обоих антигенов. Исследование иммуногенности препаратов имело принципиальное значение для обоснования создания вакцины против гепатита В, т.к. иммунитет к этому заболеванию обусловлен специфическими антителами к поверхностному антигену (2искеппап, 1986). Основным критерием оценки этого свойства являлось наличие анти-НВ5-антител в сыворотке крови морских свинок после иммунизации. Животным вводили препараты обоих антигенов с адьювантом (гидроксидом алюминия) и без него. Плазменный и рекомбинантный HBsAg стимулировали образование анти-НВБ в одинаковой степени. При введении их с адьювантом уровень специфических антител в обоих случаях увеличивался в равной мере в 5-7 раз.

Нами также показано, что количество антител в сыворотке крови морских свинок возрастает с увеличением дозы вводимого антигена. Динамика синтеза антител также существенно не отличалась при введении обоих антигенов. Устойчивый рост титра анти-НВв у животных происходил в течение 5-6 месяцев, после чего наступало его снижение. 100%-ую сероконверсию наблюдали через 2 недели после инъекции обоих антигенов.

Исследования, перечисленные выше, показали, что микробиологическим синтезом рекомбинантных ДНК реально получить антигены вирусов, в частности возбудителя гепатита В, которые по своим иммуногенным свойствам не отличаются от природных. Эти антигены способны защитить макроорганизмы от возникновения заболеваний, обусловленных вирусом, что дает твердое основание для получения с их применением «молекулярных» субъединичных вакцин.

Далее нами была проведена оценка серий рекомбинантной вакцины, полученных в производственных условиях на предприятии «НПК «Комбиотех» см. Табл. 6 ).

Из данных, представленных в этой таблице 6, видно, что «молекулярная» вакцина, полученная нами, вполне соответствует требованиям, предъявленным ВОЗ.

Для окончательного убеждения в пригодности и высокой эффективности вакцины, разработанной по нашей методике, проведены испытания на добровольцах. Испытания проводили в два этапа. На первом этапе вакцину испытали на 32 волонтерах, в крови которых не выявлялись признаки наличия маркеров гепатита В. После трехкратного введения вакцины по схеме 0, 1 и 6 месяцев была выявлена 92% сероконверсия. Концентрация антител против вируса гепатита в сыворотке крови (по данным ИФА) составляла 361 - 764 мг/л. Эти сведения подтверждают высокую иммуногенность нашего препарата, что согласуется с данными других авторов (Kuwert, 1987; Howard et al., 1988 и др.)

Нами также выявлен существенно выраженный бустерный эффект. Когда 8 человекам, имевшим до вакцинации в сыворотке крови анти-HBs, вводили однократно вакцину, у 7 из них обнаружен значительный рост уровня антител.

Таблица б.

Характеристика рекомбинантной вакцины против гепатита В.

ПОКАЗАТЕЛИ НОРМА ПО СПЕЦИФИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА

Внешний вид мутная жидкость при встряхиваю» соответствует рН 6,4 - 7,4 6,9

Гель гидрооксида 0,35 - 0,65 мг/мл 0,5 мг/мл алюминия (А13+)

Тиомерсал 0,03 - 0,07 мг/мл 0,041 мг/мл

0,004%), соотв.

Стерильность отсутствие посторонней микрофлоры при 30-35°С, 20-25 °С соответствует

Пирогенность не пирогенна на кроликах соответствует

Безвредность не токсична на мышах и свинках соответствует

Иммуногенность относительная потенция >1 ЕО50 0,203 мкг

ОП 1,2)

Второй этап заключался в проведении Государственных испытаний вакцины, полученной в производственных условиях, для изучения ее безвредности, реактогенности и иммунологической активности.

234 человека в возрасте 20-22 года иммунизировали производственными сериями вакцины трехкратно с интервалом между введениями один месяц. Наблюдалось незначительное проявление температурных реакций (3-4 %) при практическом отсутствии местных проявлений на первую и вторую прививки. После завершения курса иммунизации иммуногенность рекомбинантной отечественной вакцины составила 92,544,0 %. Причем, наблюдался высокий уровень образования антител к HBsAg.

Данные по сравнительному изучению разработанной нами вакцины против гепатита В с лучшими зарубежными аналогами представлены в таблице 7.

Из сведений, приведенных в таблице 7, следует, что по величине дозы, необходимой для вакцинации, иммуногенности, безвредности и др. показателям отечественная вакцина не уступает современным зарубежным препаратам.

Таблица 7.

Сравнительная характеристика основных показателей вакцины гепатита В ( рекомбинантной дрожжевой НПК «Комбиотех») и лучших зарубежных аналогов.

Наименование показателя н единица измерения Вакцина НПК «Комбиотех» Engerix-B (SB, Бельгия) H-B-Vaxll (VSD, США) Кубинская вакцина (Центр генной инженерии и биотехнологии)

Штамм-продуцент S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevisiae Р. pastoris

Доза (по антигену), мкг/мл -взрослая -детская 20,0 10,0 20,0 10,0 10,0 5,0 и 2,5 20,0 10,0

Консервант, % мертиолят -формальдегид 0,005 0,005 0,005 0,008-0,012 0,005

А1+3, мг/мл 0,5 0,5 -1,25 0,5 0,5

Липиды, мкг/ на 20 мкг белка следы >20 определен» отсутствует в нтд >25

Полисахариды мкг/ иа 20 мкг белка <20 <20 определен» отсутствует в НТД <210

Безвредность на мышах безвредна безвредна безвредна безвредна

Иммуногенность на мышах (ЕВяь иг) 30-60 200 - 300 1500 1500

Таким образом, нами создана отечественная вакцина против гепатита В на основе рекомбинантного штамма пекарских дрожжей. Она соответствует требованиям ВОЗ, имеет высокую степень иммуногенности, низкую реактогенность, отсутствие поствакцинальных осложнений, т.е. не уступает по своим параметрам зарубежным аналогам.

Выводы.

1. Разработаны теоретические основы и новая технология получения эффективных вакцин против заболеваний вызванных вирусами, в основу которой положены достижения отечественных ученых и наши разработки.

1.1 Экспериментально обоснованы сорбенты и условия хроматографии вирусов. Для большинства вирусов наиболее подходящими являются пористые кремнеземы после их химической модификации. Наибольшей сорбционной емкостью обладали кремнеземы с гидрофобными свойствами поверхности (бензоиламинопропилкремнеземы, С-8- кремнеземы) и аминокремнеземы . Экранирование поверхности введением ОН - или С ООН - групп значительно уменьшало величину адсорбции тога- и миксовирусов.

1.2 Определяющим условием адсорбции вирусов на пористых кремнеземах являются гидрофобные взаимодействия, которые устраняются приданием

1.2 Определяющим условием адсорбции вирусов на пористых кремнеземах являются гидрофобные взаимодействия, которые устраняются приданием поверхности гидрофильных свойств, при этом на поверхности возникает отрицательный заряд.

1.3 Наиболее универсальный сорбент для адсорбционной и гель- проникающей хроматографии вирусов - кремнезем, модифицированный ПВП, а наиболее подходящий элюент, имеющий рН 7,6 -7,8 . Для вируса гепатита В оптимум рН элюента соответствовал 9,0.

1.4 Найдено оптимальное соотношение размера пор сорбента и диаметра вирусных частиц. При осуществлении гель-проникающей хроматографии размер пор кремнезема в 2 раза превышает диаметр вирусных частиц, при адсорбционной хроматографии диаметр пор сорбента в 8-10 раз больше размера вирусных частиц (приведены в качестве примера).

1.5 Концентрирование и выделение вирусных частиц проведенные с помощью ультрафильтрации на полиядерных мембранных фильтрах- показало, что вирусы задерживаются мембраной, если размер ее пор в 2 раза превышает диаметр частиц и практически полностью проходят, если диаметр пор выше такового у вируса в 7-8 раз.

2. Разработана технология получения «молекулярных» вакцин на основе поверхностных антигенов вирусов КЭ и гриппа с помощью неионных детергентов. Показано, что вакцинные препараты, полученные этим методом, обладают высокой специфичностью и высокой степенью иммунного ответа, не вызывают побочных эффектов и поствакцинальных осложнений

3. Выявлена важнейшая закономерность - корреляция между иммуногенной активностью вакцинных препаратов, состоящих из субьединиц поверхностных вирусных белков, и их супероксиддисмутазной активностью. Чем выше иммуногенные свойства препаратов, тем выше активность СОД.

4. Разработан процесс сорбции вируса КЭ на МПК. С помощью адсорбционной хроматографии получали концентрированные и очищенные препараты вируса, содержащие в 10-50 раз больше вирусных частиц, чем в культуральной вируссодержащей жидкости. Окончательную и достаточно полную очистку таких препаратов осуществляли с помощью гель-проникающей хроматографии на МПК, модифицированном ПВП. Концентрирование вируса проводили также методом ультрафильтрации на полиядерных мембранах с последующей очисткой гель-проникающей хроматографией. Оба препарата не отличались по физико-химическим и иммунологическим характеристикам.

5. Эти препараты стали основой для получения эффективной вакцины против КЭ. После стерилизующей фильтрации и добавления гидроксида алюминия получили препарат, названный нами концентрированной и очищенной вакциной (КОВ) против КЭ.

6. Протекгивная активность КОВ на 4, 7, 14, и 21 сутки по введению намного превышала таковую НВ. Для защиты 50% мышей от десятикратной дозы LDso вируса КЭ КОВ требовалось в 20-30 раз меньше, чем НВ. Длительность нахождения антител после введения первой вакцины намного превышала таковую у НВ.

7. Клинические испытания на добровольцах подтвердили, что КОВ значительно превосходит НВ по иммуногенным свойствам. После двух иммунизаций КОВ стимулировала продукцию нейтрализующих вирус антител у 70 - 100% лиц, а НВ -лишь в 15% случаев. Сравнение КОВ с живой вакциной на основе аттенуированного штамма вируса КЭ «Лангат» также показало более высокую иммуиогенную активность КОВ. Нами также установлено, что КОВ имеет очень низкую по сравнению с НВ реактогенность, что объясняется крайне малым содержанием в ней балластных белков.

8. Очитска вируса бешенства предствляет собой более сложный процесс. Осветление суспензии вируса от балластных примесей осуществлялась с помощью фильтрации на полиядерных мембранах, не задерживающих вирусные частицы, с последующим концентрированием вируса на мембранах с величиной пор 0,02-0,04 мкм .Далее использовали методику гель-проникающей хроматографии на колонках с модифицированным ПВП кремнеземом. В результате этих сложных процедур содержание белковых примесей составило менее 10-20 мкг/мл, что превышает степень чистоты культуральных вирусных препаратов. В ряде случаев для концентрирования вируса и его очистки применяли адсорбционную хроматографию на гидроксил-модифицированных кремнеземах с последующей гель-проникающей хроматографией, в результате чего получили препараты с содержанием иммунного белка в 10-20 раз выше, чем в культуральной антирабической вакцине.

9. Разработанная нами концентрированная антирабическая вакцина стерильна, безвредна, имеет низкую токсичность и наличие в достаточном количестве активной субстанции. Ее иммуногенная активность превышала таковую интернациональной референс-вакцины (ВОЗ) и вакцины серии 0312 (Институт Мерье, Франция).

Исследование вакцины на обезьянах и добровольцах подтвердили ее высокую эффективность, 2-3 кратное введение КАВ индуцирует высокую продукцию вируснейтрализующих антител. К тому же .количество прививок при введении КАВ снизилось до 6-9 против 32 (культуральной вакциной).

10. Разработана технологическая схема получения вакцины против гепатита В на основе рекомбинантного поверхностного антигена (гНВзА§). Наиболее полная адсорбция антигена вируса из осветленного экстракта дрожжей васИагошусев 5еге\таае имела место на немодифицированном кремнеземе МПС - 2000 ВПС (9098%). В результате промывки колонки от посторонних примесей и элюирования антигена бикарбонатной буферной системой выход очищенного антигена составил 80-90%, а степень очистки от примесей - на 93-97 %.

11. Дальнейшая очистка гНВзА§ с помощью ультрацентрифугирования и гель-проникающей хроматографии привело к более глубокой очистке антигена с минимальными потерями и полным сохранением иммунной активности. После стерилизующей фильтрации и добавления адъюваята получалась окончательная форма вакцинного препарата. Физико-химические свойства тНВ$А§ и плазменного поверхностного антигенов весьма близки. Оба антигена проявляют и одинаковую иммуногенностъ. Испытания на добровольцах показало, что после трехкратного введения вакцины на основе гНВвА^ сероконверсия наблюдалась у 92% людей, концентрация антител достигала 361-764 МЕ/л. Вакцина обладает низкой реактогенностью, не вызывает поствакцинальных осложнений, что свидетельствует о высокой эффективности и безопасности разработанной нами вакцины против гепатита В.

12. На основании результатов исследований подготовлена техническая документация и внедрено в производство 3 вакцинных препарата. Вакцины против КЭ и бешенства выпускаются на экспериментально- производственном предприятии по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова, вакцина против гепатита В - научно-производственной компанией «Комбиотех ».

Список основных работ по теме диссертации.

1. А.с. 475957 СССР, МКИ2 А 61 К 39/29/54. Способ получения молекулярных вакцин/ И.В. Красильников, В.Н. Борисова, М.В. Буданов и др. (СССР) -12с.

2. А.с. 671385 СССР, МКИ2 С 12 К 7/00 /54. Способ приготовления сорбента/ В.Н.Борисова, С.Е.Бреслер, И.В.Красилышков и др. (СССР).-7с.

3. А.с. 811554 СССР, МКИ3 В 01 ] 20/10/54. Способ получения сорбента для очистки вирусных суспензий/ В.Н. Борисова, В.М. Коликов, И.В.Красилышков и др. (СССР).-бс.

4. А.с. 850203 СССР, МКИ2 В 01 I 20/10/54. Способ получения сорбента/

A.В.Киселев, В.М.Коликов, И.В.Красилышков и др.(СССР).-2с.

5. А.с. 1040658 СССР, МКИ2 В 01 } 20/10/54. Способ получения сорбента/

B.Н.Борисова, В.М.Коликов, И.В.Красилышков и др (СССР).-2с.

6. А.с. 1040659 СССР, МКИ2 С 12 К 7/00/54. Способ получения сорбента

B.Н.Борисова, В.М.Коликов, И.В.Красилышков и др. (СССР).-2с.

7. А.с. 1071306 СССР, МКИ3 В 01 .1 20/10/54. Способ получения сорбента для вирусных суспензий/ В.Н.Борисова, И.В.Красильников, Б.В.Мчедлишвили и др.(СССР).-Зс.

8. А.с. 1124483 СССР, МКИ3 А 61 К 39/12/54. Способ получения вакцин против клещевого энцефалита (его варианты)/ Л.Б.Эльберт, , И.В.Красилышков,

C.Е.Бреслер и др. (СССР).-8с.

9. А.с. 1332589 СССР, МКИ4 А 61 К 39/29/54. Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В на дрожжевых клетках/ Р.М.Хаитов, В.М.Жданов, И.В.Красильников и др (СССР).-бс.

10. А.с. 1367487 СССР, МКИ4 А 61 К 39/12/54. Способ получения антирабической вакцины/ Т.А.Аксенова, Л.Б.Эльберт, И.В.Красильников и др. (СССР).-2с.

11.А.С. 1372686 СССР, МКИ4 А 61 К 39/395/54. Способ разделения иммуноглобулинов 1§М, / И.В.Красильников, В.Н.Борисова, Л.Б.Эльберт и др (СССР).-2с

12.А.С. 1387232 СССР, МКИ4 А 61 К 39/12/54. Способ получения вакцин против клещевого энцефалита /Л.Б.Эльберт, И.В.Красильников, В.Ф.Ефимова и др (СССР).-Зс.

13.А.С. 1389060 СССР, МКИ4 А 61 К 39/29/54. Способ получения рекомбинантной вакцины к гепатиту В/ И.В.Красильников, Н.Н.Грановский, В.М.Жданов и др (СССР).-бс.

14.А.С. 1483903 СССР, МКИ4 С 07 К 7/06/54. Гидрохлорид гексапентида, обладающий иммуностимулирующей и супероксиддисмутазной активностью/ Р.П.Евстигнеева, Е.Н.Звонкова, И.В.Красильников и др. (СССР).-4с: ил.

15.А.С. 1515465 СССР, МКИ4 В 01 } 20/10/54. Способ получения сорбента для разделения вирусов и белков/ В.Н.Борисова, Н А.Ворона, И.В.Красильников и др (СССР).-Зс: ил.

16.А.С. 1561687 СССР, МКИ5 в 01 N 33/531/54. Состав для определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях/ Э.А.Макарян, И.В.Красильников, В.А.Дроженндаов и др (СССр).-Зс: цп.

17.А.С. 1596252 СССР, МКИ5 G 01 N 33/53/54. Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов/ Э.А.Макарян, И.В.Красильников, В.А.Дроженников и др (СССР).-Зс.

18. А.с. 1655983 СССР, МКИ5 12 N 7/00/54. Способ культивирования респираторно-синцитиального вируса/ Э.А.Макарян, И.В.Красильников (СССР).-Зс.: ил.

19.А.С. 1666531 СССР, МКИ5 12N 5/00/54. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L. - продуцент моноклональных антител к гликопротеину Е (V3) вируса клещевого энцефалита/ С.Н.Атанадзе, В.И.Новиков, И.В.Красильников и др (СССР).-Зс.

20. А.с. 1785660 СССР, МКИ5 А 61 В 10/00/54. Способ определения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции/ Э.А.Макарян, В.А.Дроженников, И.В.Красильников (СССР).-Зс.: ил.

21.А.с. 4456827 СССР, МКИ5 G 01 33/53/54. Способ определения миграционной активности макрофагов и лейкоцитов/ Э.А Макарян, И.В.Красильников, В.А.Дроженников и др. (СССР) -4с.

22.Аксенова Т.А., Мчедлишвили Б.В.', Красильников И.В. и др . Эксперименты по концентрированию и очистке культурального вируса бешенства (шт Внуково -32) // Вирусы и вирусные инфекции: Тез. докл. научн. конф. М.,-1981.-С. 140.

23.Аксенова Т.А., Мчедлишвили Б.В., Красильников И.В. и др. Препаративное концентрирование и очистка рабического вируса// Актуальные проблемы медицинской вирусологии/-М., 1985.-С. 156-157.

24.Бреслер С.Е., Коликов В.М., Красильников И.В. и др. Очистка и концентрирование вируса клещевого энцефалита путем адсорбционной хроматографии// Докл. АНСССР.-1977.-т.-234.-№4 -С.940-942.

25.Грановский Н.Н., Красильников И.В. Микробиологический синтез HBs-антигена. Подход к созданию рекомбинантных вакцин и диагностикумов// Актуальные вопросы биотехнологии: Тез. докл. Всесоюзн. научн. конф.-Ленинград, 1987.-с.9.

26.Грачев В.М., Ханина М.К., Красильников И.В. и др. Гетероплоидная линия клеток почки зеленой мартышки как субстрат для размножения вируса клещевого энцефалита// Вопросы вирусологии.-1985.-№3.-С.373-377.

27.Жданов В.М., Иванов C.B., Красильников И.В. и др. Сравнительная характеристика свойств рекомбинантного и плазменного HBs-антигена// Межвузовский, сб.Горьковского университета: Иммуноология и биотехнология.-1989.-С. 13-17.

28.Красильников И.В. Очистка и концентрирование вируса клещевого энцефалита методом хроматографии на макропористых стеклах: Дисс. канд. биол. наук.-М., 1980-134 с.

29.Красильников И.В. Очистка и концентрирование вируса клещевого энцефалита методом хроматографии на макропористых стеклах: Автореферат дисс. канд. биол. наук.-М.,1980.-29с.

30.Красильников И.В. Физико-химические и антигенные характеристики частиц вируса клещевого энцефалита// Конф. мол. специалистов по медиц. вирусологии: Тез. докл.-М., 1981 -С.4.

31.Красильников И.В. Вирохром-МПС-1000/т-сорбент для гель-хроматографии вирусных суспензий.-М., 1983-С.2.-Деп. в ОНТИТЭИ микробиопром 5.04.83, №197.

32.Красильников И.В., Аксенова Т.А., Мчедлишвили Б.В. Инфекционные фильтры и иммуногенная активность культурального вируса бешенства очищенного методом гель-хроматографии на макропористом стекле// Симпозиум по бешенству: Тез. докл.-Потсдам, 1977.-С.14-15.

33.Красильников И.В., Борисова В.Н. Влияние поверхности модифицированных кремнеземов на адсорбцию вирусов// Хроматография в биологии и медицине: Тез. докл. междунар.симп.-М., 1986.-С. 194-195.

34.Красильников И.В., Борисова Н.В., Буданова М.В. и др. Отечественная рекомбинантная вакцина против гепатита (разработка и внедрение)// Гепатит В, С и Д - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. научн.-практ. конф. 20-22 июня 1995г.-М., 1995.-С.159.

35.Красилышков И.В., Грановский H.H., Коткова Ю.И. и др. Разработка эффективной молекулярной вакцины против гепатита В// Иммунобиологические препараты нового поколения и методы их контроля/ Сб.научн. тр.-М.,1988.-С.66-70.

36.КрасилышковИ.В., Киселев A.B., Коликов В.М. и др. Глицерокремнеземы в адсорбции и хроматографии белков и вирусов// Жидкостная хроматография: Тез. докл. 1-го Всесоюзн. симп.-Черноголовка, 1982.-С. 80-81.

37.КрасилышковИ.В., Мчедлишвили Б.В. Аксенова Т.А. и др. Препаративная хроматография вируса бешенства// Там же -С.499-500.

38.Красильников И.В., Мчедлишвили Б.В. Коликов В.М. Исследование зависимости объемов удерживания вирусов от размера пор носителя в гель-хроматографии на макропористых стеклах// Вопросы медицинской вирусологии/ Под ред. М.П.Чумакова М.Д975.-С.20-21.

39.Красилышков И.В., Осташевский В.В., Крутянская Г.Л. и др. Некоторые показатели чистых вакцинных препаратов// Научные основы вакцинно-сывороточного дела: Матер, конф., посвященной 60-летию Ташкентского НИИВС. Ташкент, 1979.-С.95-96.

40.Красильников И.В., Сидельникова А.Н., Финогенова E.H. Некоторые аспекты изготовления концентрированной вакцины против клещевого энцефалита// 3 Всесоюзн. симп. по мол. жидкостной хроматогр.: Тез. докл.-М.,1984.-С.218-219.

41.Красилышков И.В., Эльберт Л.Б., Корешкова Т.В. и др. Сравнение физико-химических характеристик штаммов вируса клещевого энцефалита// Вирусы и вирусные инфекции: Тез. докл., научн. конф.-М.,1981.-С.126.

42.Красилышков И.В. Эльберт Л.Б., Мамоненко Л.Л. и др. Гель-фильтрационная хроматография вируса клещевого энцефалита на макропористых стеклах// Вопросы вирусологии.-1977.-№5.-С.685-689.

43.Курбатова И.Ю., Красильников И.В., Борисова В.Н. и др. Хроматография дрожжевого рекомбинантного HBsAg на пористых кремнеземах// Вопр. вирусологии. -1990.-Т.35,- №4.-С.308-309.

44.Мчедлишвили Б.В., Староверов С.М., Красильников И.В. и др Хроматография суспензий вирусов на кремнеземах с привитыми гликолевыми группами// Жидкостная хроматография: Тез. докл. 1-го Всесоюзн. симп,-Черноголовка, 1982.-С.83

45.Патент на изобретение, 1367487 Р.Ф., МКИ А 61 К 39/12/54 Способ получения антирабической вакцины/ Т.А. Аксенова, Л.Б.Эльберт,. И.В.Красильников и др. Зарегистрирован в Госреестре 12 октября 1993.

46.Патент на изобретение, 204573 Р.Ф., МКИ А 61 к 39/29/54. Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В / М.А.Новиков, Л.А.Михайлова, И.В.Красилышков и др. Опубл. в Б. п., 1985 №27.

47.Патент на изобретение, 2045760 Р.Ф., МКИ А 61 К 39/29/54 Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В/

Опубл. в Б. п., 1995 №28.

48.Патент на изобретение, 8711426, Франция/ Способ приготовления рекомбинантной вакцины против гепатита В/И.В.Красильников, Р.В.Петров, В.М.Жданов и др. Зарегистрирован в Бюл. патент, права №90/20 от 18.05.90

49.(Патент) Заявка РСТ RH 92/00258, МКИ А 61 К 39/29/ Method for obtaining recombinant surface antigen of Hepatitis B, antigen and vaccine based on itI M.A.Novikov, L.A.Michailova, I.V.Krasilnikov et. al. (R.F.) NO 93/12815. Опубл. 8 июля 1993.

50.Первиков Ю.В., Крутянская Г.Л., Красильников Н.В. и др. Иммунный статус волонтеров, привитых различными типами вакцин против клещевого энцефалита// Вирусы и вирусные инфекции человека: Тез. докл. научн. конф. Института полиомиелита и вирусного энцефалита АМН СССР.-М., 1981,- С.57-58.

51.Первиков Ю.В., Эльберт Л.Б., Красильников И.В. и др. Иммунологический статус людей, привитых различными типами вакцины против клещевого энцефалита// Вопросы вирусологии.-1982.-№6.-С.56-61.

52.Петров Р.В., Новиков М.А., Красильников И.В. и др. Локализация лигандрецепторных сайтов белков// Докл. АН СССР.-т.305.-№6.-С.1506-1508.

53.Петяев И.М., Красильников И.В., Свиридов В.Д. и др. Каталиметрия полимерных иммуномодуляторов в системе, генерирующей супероксид// Иммунология.-1988.-№4.-С.37-40.

54.Погодина В.В., Мамоненко Л.Л., Красильников И.В. и др. Свойства и способности к персистенции мутантов вируса клещевого энцефалита, индуцированных супермутантом п-нитрозо-п-метилмочевиной// Вирусы и вирусные инфекции: Тез. докл. научн.конф.-М.,1981.-С.211.

55.Ханина М.К., Гагарина A.B., Красильников И.В. и др. Оптимизация условий выращивания вируса для изготовления инактивированных культуральной вакцины против клещевого энцефалита// Вирусы и вирусные инфекции: Тез. докл. научн. конф. -М., 1981. -С. 80-81.

56.Хотлубей Л.И., Первиков Ю.В., Красильников И.В. и др. Концентрированная очищенная вакцина против клещевого энцефалита, иммунологическая оценка в опытах на мышах// Вопросы вирусологии.-1982!-№3.-С.60-63.

57.Чумаков М.П., Кусов Б.Ю., Красильников И.В. и.др. Субвирионные гриппозные вакцины: субъединичный (гликопротеиновый) трехвалентный препарат Грипповак СЕАЖ для иммунизации против гриппа детей и лиц с хронической паталогией// Вестник АМН СССР.-1983.-№5.-С.21-29.

58.Эльберт Л.Б., Борисова В.Н., Красильников И.В. и др. Хроматография флавиновирусов на макропористых кремнеземах с химически модифицированной поверхностью// Хроматография в биологии и медицине: Тез. докл. 1-ой Всесоюзн.конф.-М., 1983.-С. 166.

59.Эльберт Л.Б., Дроздов С.Т., Красильников И.В. Технология изготовления противовирусных вакцин на основе препаративной колоночной хроматографии// 3 Всесоюзн. симп. по мол. жикостной хромат.: Тез. докл.-М.,-1984.-С. 192-193. бО.Эльберт Л.Б., Ефимова В.Ф., Красильииков И.В. и др. Сравнительное изучение действия различных препаратов на вирус клещевого энцефалита// Там же -С.204-205.

61.Эльберт Л.Б., Коликов В.М., Красильииков И.В.и др Препаративная хроматография вируса клещевого энцефалита на колонках с макропористыми стеклами// Актуальные вопросы иммунопрофилактики вирусных и бактериальных инфекций/Томск, 1985.-С.51-53.

62.Эльберт Л.Б., Красильииков И.В., Влияние геометрических параметров макропористых кремнеземов на адсорбционный процесс вируса клещевого энцефалита// Жидкостная хроматография: Тез. докл. 1-го Всесоюзн. симп,-Черноголовка, 1982.-С.82. бЗ.Эльберт Л.Б., Красилышков И.В., Дроздов С.Г. Физико-химические и медико-биологические особенности концентрированной и очищенной вакцины против клещевого энцефалита// Хроматогрфия в биологии и медицине: Тез. докл.1-ой Всесоюзн. конф.-М.Д983.-С.189.

64.Эльберт Л.Б., Красильииков И.В, Дроздов Л.Г. и др. Концентрированная вакцина против клещевого энцефалита, изготовленная методом ультрафильтрации и хроматографии//Вопросы вирусологии.-1985.-№1.-С.90-93.

65.Эльберт Л.Б., Красильииков И.В., Мчеддишвили Б.В. и др. Хроматография инактивированного формалином вируса клещевого энцефалита на макропористых стеклах// Вопросы вирусологии.-1981.-№1.-С.72-75. бб.Эльберт Л.Б., Красильииков И.В., Первиков Ю.В.и др. Материалы по усовершенствованию вакцины против клещевого энцефалита// Научн. конф. ИПВЭ АМН СССР: Тез. докл.-М.,1981.-С.54.

67.Эльберт Л.Б., Красильииков И.В., Ханина М.К. и др. Материалы исследований по концентрированию и очистке вируса клещевого энцефалита// Стандартизация медицинских биологических препаратов для профилактики и диагностики инфекционных болезней: Тез. докл. Всесоюзн.конф.-М.,1979.-С.47-49.

68.Эльберт Л.Б., Первиков Ю.В., Красильииков И.В. и др. Современные подходы к профилактике клещевого энцефалита// Советско-французский симп. по мед. вирусологии: Тез.докл.-М.,1980.-С.28-29.

69.Эльберт Л.Б., Первиков Ю.В., Красильииков И.В. и др. Иммунологические показатели вакцинации людей против клещевого энцефалита в зависимости от концентрации вирусного антигена в инактивированном препарате// Вирусные инфекции. Респ. сборник научн. трудов.- Свердловск, 1980.- С.40-44.

70.Эльберт Л.Б., Первиков Ю.В., Красильииков И.В. и др. Иммунологические показатели вакцинации людей против клещевого энцефалита инактивированными препаратами с разной концентрацией вирусного антигена// ЖМЭИ.-1981.-№6.-С.89-92.

71.Эльберт Л.Б., Первиков Ю.В., Красильииков И.В. и др. Механизмы вакцинального иммунитета при клещевом энцефалите, установленные на лабораторной модели// Вопросы иммунологии и мол. биологии: Тез. докл. научн. конф. -Нальчик, 1981.-С.59-71.

72.Эльберт Л.Б., Первиков Ю.В., Красильииков И.В. и др Материалы по усовершенствованию вакцин против клещевого энцефалита// Вирусы и вирусные инфекции: Тез. докл. научн. конф.-М.,1981.-С.54-55.

73.Granovsky N., Krasilnikov I., Yeast recombinant hepatitis B vaccine// The international symposium dedicated to the memory of academician V.M.Zhdanov, Suzdal, Rassia, 1988.-p.14.

74.Krasibiikov I.V., Akcenova T.A. Mchedlishvili B.V. Purification and concentration of rabies virus by chromatography on chemically modified porous silicates// Acta virology.-! 981 ,-№25.-P.205-212.

75.Krasilnikov I.V., Borisova V.N. Preparative chromatography in viral vaccines production/' The;;, of rep.-taternational conference on comparative virology: Lakeluis, Canada, 1985.-P.177.

76.1Crasilnikov i.V., Borisova V.N. Modified sorbents based on porous silica// New advances in liquid chromatography.-Ralatonszeplac, Hungary, 1986.-P.88.

77. Krasilnikov I., Borisova V. Impact of modified suiface of porous silicates on virus adsorbtion/ (CLC-87), Abstr. oi' pap.-Amsterdam, 1987.-p.89.

78 Krasilnikov 1., Borisova V. Adsorbtion and chromatographic properties of modified silica sorbents for the production of viral preparations// Journal of chromatography.-1988.-J&446.C.211-219.

79.K.rasilnikov I., Borisova V, Budanov M. Cromaiography and electrophoresis use for separation and control of viral antigenes// 10'®' International symposium: Biomedical applications of chromatography and electrophoresis'. Abst. of pap.- Pilsen, Czechoslovakia, 1988.-p.22.

80.Krasilnikov I.V., Borisova V.N., Budanov M.V. Cromatography on modified carriers in biotechnology of viral proteins// 7Ih Dunule Symposium on chromatography and analytikrefpen: Thes. of rep.-Leipzig, 1989.-P.16l.

81.Krasilnikov I., Borisova V., Novikov M., et. al. Chromatography of viral proteins in terms of ligand-reccptor interactions (CLS-89)// 13th Symposium on column liquid chromatography: Abstr. of pap.- Stockholm,-1989.-P.20.

82.KrasiInikov I.V., Elbert L.B., Borisova V.N.et.a!. Purification of tick-borne encephalitis virus in tris-modified porous glasses// Acta virology.-1985 .-№29. -P.273-278.

S3.Krasilnikov T. V., Elbert L,B., Khanma M.K. et.ai. Comparative study of infections formaldehyd-inactivated Tick-Borne encefalitis virus particles// Archives of virology.-1.984.-№79.-P.241-253.

84.Kr«s£taikov I.V., Khotlubey L.I., Granovskiy N.N. et.al. Biochemical and immunological properties of recombinant HBs-antigenes from yeast// 2-nd Peking biochemical symposium: Peking ,-1989.-№169.-P.87.

85.Krasilnikov I., Khotlubey L., Granovskiy N. et.ai Immunological properties of yeast recombinant HBsAg// IX-tli European congress of Clinical Chemistry: Abst.of pap.-Krakov, Poland, 1991.-P.14.

86.Krasilnikov I.V., Petyaev I.M., Chottabey ¡L.l. ei.ai. Immunological and catalytical properties of recombinant hepatitis B surface antigen (HBs,A.g)// 7,h International Congress of Immunology: Abstr. of pap.-Berlin (West),-19S9.-Jfel4.-P.34.