Усовершенствование технологии изготовления и применения иммунологического препарата для диагностики стельности коров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Хлынов Дмитрий Николаевич

• Хлынов Дмитрий Николаевич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Хлынов Дмитрий Николаевич

2. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

2.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1.1. Методы определения стельности у крупного рогатого скота

2.1.2. Методы лиофилизации биопрепаратов

2.1.2.1. Основы процесса лиофилизации

2.1.2.2. Вспомогательные вещества, применяемые

в процессе лиофилизации

2.2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.3.1. Разработка технологии изготовления лиофилизированной модификации иммунологического биопрепарата для диагностики стельности коров

2.3.2. Выбор условий замораживания экспресс-теста

2.3.3. Разработка режима сублимационной сушки биопрепарата

2.3.4. Изучение влияния толщины слоя раствора на качество лиофилизата экспресс-теста

2.3.5. Подбор параметров для стандартизации лиофилизиро-ванного иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров

2.3.6. Изучение диагностической эффективности модифицированного биопрепарата для определения стельности коров

2.3.7. Экономическое обоснование результатов исследования

2.3.7.1. Учет затрат на диагностику стельности коров стандартным и новым способами

2.3.7.2. Определение экономической эффективности профилактики бесплодия коров за счет ранней его диагностики с использованием иммунологического теста

2.3.8. Обсуждение полученных результатов

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

3.1. Выводы

3.2. Практические предложения

3.3. Перспективы дальнейшей разработки темы

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1 - Акт испытания модифицированного экспресс-теста

Приложение 2 - Опытно-промышленный регламент производства модифицированной формы биопрепарата

Приложение 3 - Технические условия модифицированного иммунологического экспресс теста для определения стельности коров

Приложение 4 - Справка о внедрении

Приложение 5 - Сертификат соответствия лиофилизированной формы

биопрепарата

Приложение 6 - Государственная регистрация продукта

Приложение 7 - Инструкция по применению экспресс-теста

Приложение 8 - Документы, подтверждающие апробацию результатов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Усовершенствование технологии изготовления и применения иммунологического препарата для диагностики стельности коров»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Увеличение продуктивности коров напрямую зависит от условий содержания, кормления и правильной работы по воспроизводству.

Без строгого ветеринарно-зоотехнического надзора, позволяющего планировать на протяжении календарного года запуск, роды, осеменение животных и текущую внутрифермерскую работу, своевременно пополнять стадо молодняком, квалифицированно осуществлять выбраковку животных, непригодных к воспроизводству, невозможно осуществлять мероприятия по борьбе с бесплодием крупного рогатого скота на животноводческих фермах. Для достижения этих целей требуются регулярные диагностические исследования на стельность и бесплодие, а также постоянный учет в маточном стаде основных групп коров: стельных, в послеродовом периоде, осемененных, но не проверенных на беременность и бесплодных.

Существуют лабораторные диагностические методы исследований, такие как радиоиммунологический (РИА) и иммуноферментный анализ (ИФА), при помощи которых можно определить в биологических жидкостях (моча, плазма, ам-ниотическая жидкость, сыворотка и т. п.) количественное содержание гормонов-регуляторов репродуктивной функции [76, 69, 70, 67, 113, 162, 171].

Используя метод ИФА для ранней диагностики беременности сельскохозяйственных животных можно избежать от 10 до 40% экономических потерь от яловости [104].

Учеными Оксфордского университета разработаны тест-полоски (P4 Rapid Milk Progesterone Test) для определения беременности по уровню прогестерона в молоке. Однако данное диагностическое средство не получило широкого применения в животноводстве страны [145].

Широкое применение в медицине получили тесты на беременность, основанные на определении хорионического гонадотропина в моче или в сыворотке крови. Тесты отличаются простотой применения, достоверностью, высокой вос-

производимостью результатов и диагностической точностью, которая составляет до 98% [27].

Степень разработанности темы исследований. В настоящее время существуют различные методы определения беременности. Все они неравноценны и различаются рядом особенностей, меньшей или большей специфичностью и достоверностью. Эти методы в разной степени сложны по технике выполнения и отличаются также скоростью наступления реакции, что имеет большое практическое значение [22, 21, 54, 73, 75, 74, 80, 97, 100].

Учитывая успешный опыт применения тестов на беременность женщин в медицине, для ветеринарной практики был разработан иммунологический экспресс-тест, определяющий стельность и бесплодие крупного рогатого скота [10].

Данный препарат показал себя как высокоэффективное диагностическое средство, позволяющее устанавливать беременность в достаточно ранние сроки [8].

При этом следует отметить, что география потребителей препарата достаточно широка и включает регионы России и зарубежные страны с различными климатическими условиями, неблагоприятно отражающимися на качестве биопрепарата при его пересылке, транспортировке и хранении. Жидкие препараты требуют определенного температурного режима хранения и транспортирования -от +2 до +4ОС, нарушение которого как в сторону повышения, так и в сторону понижения температуры приводят к снижению их активности. В связи с этим возникает необходимость совершенствования формы выпуска экспресс-теста, позволяющей исключить вышеуказанные отрицательные воздействия. В данном аспекте одним из решений проблемы является разработка лиофилизированной формы диагностикума.

Цели и задачи исследований. Цель исследований - усовершенствование технологии получения экспресс-теста для диагностики беременности коров путем разработки лиофилизированной формы препарата.

Для решения данной цели мы поставили следующие задачи:

- подобрать оптимальные параметры лиофилизации иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров;

- определить диагностическую точность иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров в лиофилизированной форме и экономическую эффективность его применения;

- разработать нормативно-техническую документацию, регламентирующую изготовление и применение иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров в лиофилизированной форме.

Научная новизна. Впервые получены данные об оптимальных режимах лиофилизации биологического препарата для диагностики беременности коров.

Получены данные о влиянии лиофилизации на качество и диагностическую эффективность иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров.

Усовершенствована технология получения иммунологического биопрепарата для диагностики беременности коров.

Теоретическая и практическая значимость работы. Для ветеринарных и зоотехнических служб разработана новая форма биопрепарата, позволяющего в кратчайшие сроки на ранних стадиях с высокой степенью достоверности устанавливать стельность.

Разработаны нормативно-технические документы, регламентирующие производство и применение экспресс-теста в лиофилизированной форме для диагностики беременности коров в условиях животноводческих ферм и частных подворий, и требования к качеству биопрепарата с учетом интересов заказчиков, требований к продукции для жизни, здоровья людей и животных, окружающей среды.

Анализ технико-экономической эффективности внедрения лиофилизированной формы экспресс-теста показал, что экономическая эффективность диагно-

стики беременности коров достаточно высокая и составляет до 13,30 руб. в расчете на каждый рубль затрат.

Методология и методы исследований. Исследования были проведены в период 2010-2017 гг. в рамках плановых научных исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГОУ ВО Ульяновской ГСХА (тема НИР: «Изучение нарушения гормональной регуляции репродуктивной функции животных и разработка методов определения ее патологии» (номер госрегистрации АААА-А16-116041110204-1), а также тематических планов-заданий на выполнение научно-исследовательских работ федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А.Столыпина» по заказу Минсельхоза России за счет средств федерального бюджета на 2014 и 2015 гг. (№ госрегистрации: 01201460234; 115042810002).

Работа выполнялась на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА, ООО «НТЦ «ПромТехЭнерго», ООО «НТЦ «Биотек».

Изучение диагностической эффективности разработанного метода проводили в животноводческих хозяйствах Ульяновской области.

Полученные цифровые данные лабораторных исследований обрабатывали методом вариационной статистики на ПК с использованием программ «Microsoft Exel» и Sstat. Достоверность сравниваемых показателей определялась по критерию Стьюдента и критерию Фишера.

Основные положения, выносимые на защиту:

- параметры лиофилизации иммунологического теста для определения беременности коров;

- результаты производственных испытаний лиофилизированной модификации иммунологического теста для определения беременности коров;

- нормативно-техническая документация, регламентирующая изготовление и применение препарата.

Степень достоверности и апробация материалов исследований.

Достоверность результатов диссертационного исследования подтверждается достаточным количеством наблюдений, современными методами исследования, которые соответствуют поставленным в работе целям и задачам. Научные положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, подкреплены убедительными фактическими данными, наглядно представленными в приведенных таблицах и рисунках. Подготовка, статистический анализ и интерпретация полученных результатов проведены с использованием современных методов обработки информации.

Основные материалы диссертации апробированы с 2010 по 2017 г.г. и представлялись на следующих научных конференциях и конкурсах:

- V международная научно-практическая конференция "Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения" (Ульяновск, УГСХА им. П.А.Столыпина, 2012);

- VI международная научно-практическая конференция "Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения" (Ульяновск, УГСХА им. П.А.Столыпина, 2013);

- международная научно-практическая конференци "Молодежь и наука XXI века" (Ульяновск, УГСХА им. П.А.Столыпина, 2014);

- выставка инновационных достижений международного инновационного форума молодых учёных "U-NOVUS" (Томск, 2014);

- международная специализированная выставка племенного дела и технологий для производства и переработки продукции животноводства «АгроФарм-2017» (Москва, 2017).

Результаты научных исследований отмечены призовыми местами следующих конкурсов:

- первое место по итогам конкурса "Я - Инноватор", состоявшегося в рамках Международного молодежного научного аграрного форума (Ульяновск, 2014);

- прохождение в международную группу "100 инноваторов" Московского международного форума инновационного развития "Открытые инновации" (Ульяновск, 2014).

- гран-при в номинации «Лучшая научная разработка - АгроФарм-2017» (Москва, 2017)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 6 научных статей, из которых 3 - в изданиях, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, заключение, практические предложения, список использованной литературы и 8 приложений.

Работа иллюстрирована 8 таблицами, 13 рисунками. Список использованной литературы включает 179 источник, из которых 72 иностранных.

2. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 2.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1.1. Методы определения беременности у крупного рогатого скота

Анализ информационных источников по состоянию исследований в данном направлении, в том числе по проблемам контроля воспроизводства животных показал, что существующие методы диагностики стельности коров неравноценны и отличаются рядом особенностей, большей или меньшей специфичностью и достоверностью.

В арсенале ветеринарных специалистов имеется большое количество различных методов диагностики беременности у самок сельскохозяйственных животных:

- клинические методы исследования - рефлексологический (основанный на учете реакции самки на самца), наружный (осмотр самки, пальпация брюшной стенки и аускультация), внутренний (вагинальный и ректальный).

- лабораторные методы - определение беременности по изменению физико-химических свойств цервикальной слизи, по концентрации половых гормонов в крови или молоке, и др. [23, 25, 40, 92, 93, 94, 95].

Разработанные отечественными [36, 49, 107] и зарубежными учеными [158] клинические методы исследования позволили ветеринарным специалистам диагностировать беременность или ее отсутствие у самок сельскохозяйственных животных.

Клинические методы диагностики беременности у животных основываются на комплексе анатомо-топографических и физиологических изменений, возникающих в организме и в половых органах коров в связи с плодоношением. Эти изменения сопровождаются характерными симптомами, которые могут быть легко обнаружены общепринятыми методами клинического исследования - осмотром, пальпацией и аускультацией.

Метод осмотра является большей частью общим клиническим способом исследования беременного животного для объективного изучения его состояния перед родами. Метод пальпации позволяет диагностировать беременность только с 5-6 месяцев [26].

Следует отметить, что осмотром, пальпацией не всегда точно можно установить бесплодие, а также сроки беременности, но они могут быть использованы в отдельных случаях как вспомогательные способы [42, 43, 60].

Существует клинико-рефлексологическая диагностика беременности у коров, основоположником которой является Н.Н. Гавриленко [17]. Принцип ее заключается в том, что у беременных животных после 20-25 дней от начала оплодотворения не проявляется половая охота (положительная реакция на быка). У небеременных коров половая охота периодически повторяется через каждые 20-25 дней. В дальнейшем данный прием получил глубокое научное обоснование в работах В.С. Шипилова и др. [106]. Появилась система учета и контроля на основе «Календаря техника по искусственному осеменению животных», давшая возможность ставить диагноз на стельность или бесплодие в течение первых 30 дней после осеменения. Точность этого способа диагностики составляет 92-100% [69, 70, 67, 92]. Однако и он не лишен недостатков. Во-первых, в хозяйстве необходимо держать специальных «быков - пробников», которые выявляют в стаде коров с половой охотой (повышенной сексуальной активностью), а это сопровождается дополнительными затратами на содержание, кормление и обслуживание пробников. Во-вторых, при акушерско-гинекологических заболеваниях у коров половая охота может не проявляться, и это приводит к ошибочному мнению, что данная корова беременна.

В.П. Попков предлагает исследование кожно-висцеральных рефлексов как один из методов рефлексологической диагностики беременности [68]. Этот метод основан на изменении электрочувствительности кожи в связи с беременностью. У беременных животных возникают и постоянно поступают в область поясницы биотоки, в результате чего понижается электрочувствительность кожи и повышается порог возбудимости нервно-мышечных элементов в этой области. Автор

предлагает использовать гальванический аппарат, способный давать на выходе электродов при нагрузке 1200 Ом, 60 В и 50 Ма. Один электрод является активным, точечным. Второй - в виде пластины Точечный активный электрод, идущий от отрицательного полюса аппарата, накладывают между 1 и 2 поясничными позвонками, а второй - на область крестца. Затем включают аппарат и потенциометром подают ток силой до 40 Ма. По данным автора, реакция на действие тока такой силы у беременных отсутствует, а у небеременных возникает сокращение мышц и прогибается поясница. Достоверность метода составляет 58-73%.

В.В. Руденко предлагает комплекс моделей и алгоритмов для автоматизированной диагностики ранних сроков беременности животных методами рефлексодиагностики [75]. Объектом исследования - энергетические характеристики информативных проекционных зон и в частности биологически активных точек, полученных с помощью специально разработанного алгоритма.

В практике скотоводства в качестве контроля воспроизводства широко используется ректальный метод исследования, впервые предложенный Ларсеном в 1895 году и усовершенствованный Н.Ф. Мышкиным [51, 52, 53].

Мышкин Н.Ф. внес кардинальные изменения в методику ректального исследования животных, сущность которых заключалась не в отыскании плода, как это делалось прежде, а в исследовании состояния самого органа - матки, в которой может быть или не быть плод. Тем самым была обеспечена возможность точного установления сроков беременности, чего при прежних способах нельзя было достигнуть.

Этот метод не является техническим приемом, который может быть легко выполнен животноводом; такую работу должен выполнять только опытный ветеринарный врач с соблюдением элементарных санитарных правил (использование одноразовых перчаток и инструментов). К тому же рассматриваемый метод трудоемок и негигиеничен, кроме того, частые ректальные манипуляции неблагоприятно сказываются на состоянии как коровы, так и плода, а при неумелом их выполнении нередко приводят к абортам. Несоблюдение правил гигиены при массо-

вом обследовании влечет за собой распространение инфекционных заболеваний [59, 69, 70, 88, 106].

К сожалению, точный диагноз, устанавливаемый даже опытным лицом, возможен только при обследовании коров с 3-4-месячной беременностью. Точность этого метода может достигать 95-100%

Высокая диагностическая эффективность усовершенствованного метода ректального исследования коров на беременность и бесплодие способствовала широкому внедрению его в практику ветеринарного акушерства многих стран [4, 24, 29, 38, 39, 85, 94, 122, 128, 151].

Висконсинские исследователи [178] сообщили о вполне удовлетворительном клиническом методе диагностики, который заключается в обнаружении в матке амниотического пузыря. Наиболее надежные результаты определения получены в период около 5 недель после искусственного осеменения, хотя была успешной и более ранняя диагностика.

А.М. Семиволос [80] разработал оригинальный способ диагностики беременности коров, основанный на радиотермометрическом зондировании тела животного. Теоретической основой этого способа является измерение интегральных температур в зависимости от интенсивности радиоизлучения тела животных с различным физиологическим состоянием внутренних органов.

По данным автора, радиотермометрическим способом можно диагностировать беременность у коров с точностью 95%.

В последние годы в ветеринарной практике для определения ранних сроков беременности у крупных и мелких животных применяют метод эхографического исследования. Принцип получения эхографического изображения основан на обратном эффекте пьезоэлектрического элемента за счет возвращения в зонд аппарата пучков ультразвуковых волн, преобразующихся на экране в светящиеся серые точки разной степени интенсивности [21, 120, 127, 146].

Эффективность ранней диагностики стельности у коров и телок при использовании метода эхографического исследования, по данным разных авторов, составляет: на 16 - 20 день после осеменения - 55%, на 21 - 25 день - 68%, тогда

как на 25 - 35 день этот показатель варьирует в пределах 89 - 100%, точность негативного диагноза с 30 дня после осеменения 68 - 100%, при этом точность результатов позитивного диагноза для коров - 65%, для телок - 87% [91, 83, 109, 120, 144, 157, 162].

При беременности происходят многообразные, сложнейшие изменения не только в половых органах, но и во всем организме самок. Эта характерная особенность послужила основанием для разработки и совершенствования лабораторных методов диагностики беременности у животных, которые можно с методической точки зрения разделить на физико-химические, иммунологические и гормональные [11].

Многочисленные лабораторные способы, направленные на обнаружение некоторых изменений в организме животных в связи с беременностью: путем исследования волоса (способ Косякова в модификации Тимофеева, основан на цветной реакции при кипячении волос коров в 10%-ном растворе едкого калия, мети-леновой сини с 4%-ной соляной кислотой); крови (метод Попкова - реакция крови беременной коровы с камфорным спиртом и АСД); по методу Манойлова - Губу-ревича (после добавления в сыворотку крови исследуемого животного растворов диуретина, веронала и нильбляу). Реакция мочи с раствором хлористого бария оказалась мало специфичной.

Существуют методы диагностики беременности по исследованию молока с использованием 96% этилового спирта, после добавления спирта к молоку беременных животных оно створаживается до 10 мин., у бесплодных створаживание происходит 10 мин.

Д.Д. Логвинов описывает так называемый «капельный метод» диагностики беременности у коров [48]. Для его выполнения необходимо на расстоянии 5-10 см от поверхности воды, находящейся в сосуде, внести из пипетки каплю молока. У беременных коров капля молока, преодолевая поверхностное натяжение, опускается в воду и быстро растворяется в ней. У небеременных животных капля молока не приникает в глубь воды и создает мутное облачко на ее поверхности. Группа лабораторных способов, основанных на использовании крови, в т.ч. и сы-

воротки, обеспечила в среднем правильную диагностику в пределах 36 и 39,6%; по методу Косякова-Тимофеева - 28,26%; по моче - 44,87%; по группе методов, основанных на исследовании молока, диагностическая точность колеблется в среднем от 42,07 до 76,3%, установлено, что плотность цервикальной слизи, определяемой с помощью раствора С^О (1.008), повышается уже на ранних стадиях беременности [11].

Катеринов предложил определять беременность по цветной реакции после гидролиза слизи в 10%-ном растворе едкого натра. С 30-го дня беременности точность метода равна 98,4% [10].

Денисова использовала для данной цели 25%-ный №ОН или КОН. При проверке стельности у коров данным методом через 20 дней после осеменения было получено 85% правильных ответов [10].

Костов кипятил влагалищную слизь коров в дистиллированной воде, но точность метода оказалась на 10% ниже, чем при применении указанных выше методов [10].

К данной группе можно отнести и тест, основанный на изменении вязкости цервикальной слизи при беременности [10].

Сравнительное изучение методов диагностики беременности по шеечно-влагалищной слизи А.Н. Ахмадеевым показало, что удельный вес слизи в растворе медного купороса, изменения при кипячении в растворах 10% и 25% едкого натрия и дистиллированной воде в значительной степени зависят не от беременности животного, а от функционального состояния яичников, т.е. от степени развития фолликулов и желтого тела [4].

Другой подход к ранней характеристике беременности связан с учетом иммунной реакции самки на развивающийся в ней эмбрион. Наличие в организме самки продуктов оплодотворения, антигенов, которые могут проникать в кровь, вызывает иммунный ответ самки [34, 35]. Высокие титры гемагглютинации с 18-34-суточными эмбрионами в сыворотке крови бывают у 80% стельных животных, а преципитации - у 93%, хотя это встречается у некоторых нестельных коров [41].

Кожная аллергическая реакция многими признана достаточно специфической для выявления стельности. В качестве аллергенов испытывали экстракт ранних эмбрионов, их внезародышевых оболочек и иммунные сыворотки к ферменту гиалуронидаза, количество которого в крови возрастает в первый месяц беременности [11]. Почти все стельные коровы (15 из 16) дали положительные аллергические реакции с эмбриональным аллергеном, а также с экстрактом живчиков. Однако 20-30% нестельных коров также проявляли аллергическую реакцию. Эти данные дают основание считать реакцию кожной аллергии возможной, но недостаточно специфической для суждения о наступлении стельности [85].

В настоящее время существует ряд методов гормональной ранней диагностики беременности. Эти методы неравноценны и отличаются рядом особенностей, большей или меньшей специфичностью и достоверностью Они в разной степени сложны по технике выполнения и разнятся также по времени наступления реакций, что, без сомнения, имеет большое практическое значение [33, 41].

Первыми классическими пробами ранней диагностики беременности является биологические реакции Ашгейм - Цондека, Фридмана, Галли - Майнини с использованием лабораторных животных [59]. Несмотря на высокую чувствительность, специфичность и надежность результатов (до 90%), существенным недостатком является относительная длительность биологических проб и физиологические особенности подопытных животных, что является главной причиной поисков других, более эффективных способов диагностики беременности [41].

Целесообразнее определять в крови сульфат эстрона, секретируемый плацентой в больших количествах, начиная со 120 дня беременности. Установлено, что через 23 дня после оплодотворения содержание эстрона сульфата составляет 80 нг/мл, а перед отелом достигает 4262 нг/мл, позволяя правильно устанавливать стельность у 96,2% подопытных животных [166].

H.S. Choi et al. считают наиболее эффективным способом диагностики беременности у коров определение суммарного уровня неконъюгированных эстрогенов в моче и фекалиях [121].

Радиоиммунологические методы анализа биологически активных соединений нашли широкое применение в современной ветеринарной практике. Достижения в разработке очень чувствительных радиоиммунопроб в последнее десятилетие позволили определить уровень гормонов беременности не только в плазме крови и тканевой жидкости, но и в молоке [18, 81].

Ранняя диагностика стельности по прогестерону основана на периодическом повышении концентрации прогестерона в плазме периферической крови в течение полового цикла. Было установлено, что изменение концентрации прогестерона в молоке, крови носит колебательный характер, что является диагностическим показателем наличия или отсутствия беременности [35, 59, 81, 101, 102, 122, 135, 136].

Одним из первых обстоятельных исследований, охватывающих широкий круг вопросов по практическому применению радиоиммунного метода, является работа О. Gйnzler, L.Corndurfer, Н. Lonoff, относящаяся к 1975 году. В ней детально описаны принципы метода, контроль ранней беременности, практические использования способа, приемы работы в полевых условиях и целый ряд других моментов. Авторы считают, 20 день - оптимальный срок для определения ранней стельности по прогестерону [129].

В работе Чой и др., определявших концентрацию прогестерона в сыворотке крови коров, правильно были оценены 100% нестельных животных и 84,3% стельных (средняя точность оценки составила 91%) [11].

В другом исследовании определяли содержание прогестерона в кровяной плазме с контрольным выявлением стельности (ректальная пальпация). На 19-20 день после осеменения содержание прогестерона было 2,0 нг/мл - 1 с точностью оценки 67% [11].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Хлынов Дмитрий Николаевич, 2017 год

- «У.

I

Рис. 11. - Постановка тест-пробы с лиофилизированным биопрепаратом:

а - вид лиофилизированного иммунологического препарата для диагностики стельности коров; б - внесение образца исследуемой мочи; в - учет реакции через 15 минут - (слева) отрицательная, (справа) положительная проба; г - учет реакции через 1 час - (слева) отрицательная, (справа) положительная проба.

г

Таблица 6 - Результаты производственного испытания модифицированного биопрепарата для определения беременности домашнего скота (п=141)

Срок стельно- Количество Результаты теста Диагностическая

животных в группе

сти полож. отр. сомнит. точность, %

до 1 месяца 34 30 3 1 88,3

2 месяца 38 34 4 0 89,5

3 месяца и более 54 52 1 1 96,3

Всего стельных 126 116 8 2 92,1

бесплодные 15 0 14 1 93,3

Примечание: р>0,05

98 п

^ 96 -

и О X т о

I-

сс

(С 5£

£ 90

94 -

92 -

и О

88 -

(С

С1 86

84

1 месяц

96,3

2 месяца 3 и более месяцев

Сроки стельности

Рис. 12. - Диагностическая точность лиофилизированной формы биопрепарата в зависимости от сроков стельности

Показатели достоверности определения стельности коров в зависимости от их возраста приведены в таблице 7 и на рисунке 13.

Таким образом, результаты производственных испытаний препарата показали, что, независимо от возраста животных, максимальная точность диагностических исследований наблюдается у коров, имеющих срок стельности 3 и более месяцев (от 96,3 до 100%), минимальная - при сроке стельности до 1 месяца (от 77,9 до 88,9%). При этом в месячный срок стельности наихудший результат был зафиксирован у коров в возрасте 7 и более лет.

В связи с тем, что расчетное значение критерия Фишера меньше табличного, разница между группами недостоверна (р>0,05), а это значит, что диагностическое действие лиофилизированного препарата для определения стельности в разные периоды не отличается.

Таблица 7 - Результаты производственного испытания лиофилизированной

формы препарата для определения беременности у коров различного возраста (п=126)

Возраст животных Срок стельности Количество животных Результаты теста Диагностическая точность, %

полож отр сомнит

4 года до 1 месяца 9 8 1 0 88,9

2 месяца 11 10 1 0 90,9

3 месяца и более 15 14 0 1 93,3

5 лет до 1 месяца 8 8 0 0 88,9

2 месяца 10 9 1 0 90,0

3 месяца и более 13 13 0 0 100

6 лет до 1 месяца 8 7 1 0 87,5

2 месяца 9 8 1 0 88,9

3 месяца и более 10 10 0 0 100

7 и более лет до 1 месяца 9 7 1 1 77,9

2 месяца 8 7 1 0 87,5

3 месяца и более 16 15 1 0 93,7

Всего 126 116 8 2 92,1

Примечание: р>0,05

120 п

100 -

5?

;80 -

Ш 60

и

ш у

X

н

и

о

ЕЕ 40

ГО =1

20 -

4 года

5 лет 6 лет

Возраст коров

□ 1 месяц

□ 2 месяца

□ 3 и более месяцев

7 и более лет

Рис. 13. - Диагностическая точность лиофилизированной формы препарата

в зависимости от возраста животных

По результатам производственной апробации при оценке функциональных характеристик и потребительских свойств модифицированного препарата были установлены следующие показатели:

1) Требование к возможности использования модифицированной формы экспресс-теста в условиях животноводческих ферм и частных подворий без использования специализированного оборудования

Экспресс-тест можно использовать в условиях животноводческих ферм и частных подворий без использования специализированного оборудования.

2) Требование к безопасности процедуры диагностики стельности коров и исключению вероятности заражения ветеринарных специалистов заболеваниями инфекционного происхождения

Процедура диагностики стельности коров безопасна и при соблюдении правил асептики и антисептики исключает вероятность заражения ветеринарных спе-

0

циалистов заболеваниями инфекционного происхождения, т.к. процедура получения мочи и тестирования не предполагает манипуляций, допускающих заражение (ректальное исследование).

3) Максимальное количество флаконов с препаратом, необходимых для разовой диагностики

Не более 1;

4) Срок стельности, при котором можно использовать препарат

С 1 месяца стельности

5) Точность выполняемых диагностических мероприятий

В среднем в разные сроки стельности - 92,1%.

6) Требование к удобству и простоте использования.

Процедура постановки диагноза может быть выполнена как ветеринарными специалистами, так и вспомогательным персоналом или владельцем животного в частном подворье. Читка реакции визуально четкая, позволяющая правильно оценить результаты постановки тест-пробы.

7) Требование к длительности процедуры диагностики.

Не более 15 минут для диагностических манипуляций, не более 1 часа для оценки результатов тестирования (читки);

8) Требования к сроку хранения препарата

2 года

2.3.7.1. Учет затрат на диагностику беременности коров стандартным и новым способами

Затраты при стандартном способе диагностики беременности (ректальное исследование) в расчете на одну корову в среднем по РФ составляет 184 руб. на голову.

Расчет затрат на диагностику беременности коров с применением одностадийного иммунологического теста представлен в таблице 8.

Таблица 8 - Расчет затрат на изготовление партии лиофилизированной формы иммунологического теста диагностики беременности коров (4000 диагностических проб)

Материалы Ед. измерения Количество Цена, руб. Сумма, руб.

1 2 3 4 5

Кролик гол 1 700 700

Гормон «Гонадотропин хориони-ческий для инъекций» уп. 2 550 1100

Неполный адъювант Фрейнда 5 мл 1 675 675

Ализарин 30 г 1 200 6,7

Дистиллированная вода л 1 5 5

Борная кислота (порошок) 10 г 1,5 1,10 0,15

Физиологический раствор 0,9% 100 мл 100 10 10

Сахароза кг 0,03 180 5,4

Шприц инъекционный одноразовый с иглой, 2,5 см шт. 5 1,2 6,0

Шприц инъекционный одноразовый с иглой, 5 см3 шт. 5 1,8 9,0

1 2 3 4 5

Спирт, 96 мл 100 132,82 13,3

Вата хирургическая нестерильная 50 г 10 11,50 2,2

Расход электроэнергии кВт 83 2,6 215,0

Затраты рабочего времени час 7,11 33 234,0

Пробирка полистироловая с навинчивающейся крышкой шт. 4000 19,0 79200,0

ИТОГО (партия) 79669,5

Затраты на изготовление 1 тест-пробы 20,55

Из таблицы 8 видно, что затраты на изготовление одной партии экспресс-теста составляют 82181,75 рублей, соответственно, затраты на изготовление одной тест пробы составляют 20,55 руб.

На исследование одной пробы мочи одной коровы затрачивается 7 минут рабочего времени ветеринарного специалиста на сумму 1,32 руб. (7 мин. х 0,19 руб.).

Следовательно, подготовка одной пробы на беременность и бесплодие составляет 21,87 руб. (20,55 руб. + 1,32 руб.).

2.3.7.2. Определение экономической эффективности профилактики бесплодия коров за счет ранней его диагностики с использованием иммунологического теста

При определении эффективности профилактики бесплодия коров при применении лиофилизированного препарата нами были использованы данные, полученные Богдановой М.А. при изучении экономической эффективности жидкой формы экспресс-теста [9]. Согласно представленным данным, колебания показателя выявленных бесплодных животных в различных районах Ульяновской об-

ласти составляют от 3,51 до 38,08 %, что в среднем по региону составляет 17,4 %. Удельная величина экономического ущерба, причиненного бесплодием коров, колебалась в пределах от 42,1 руб. (Старокулаткинский район) до 457 руб. (Карсун-ский район) и в среднем составила 209 руб.

При использовании разработанного нами метода диагностики бесплодия сокращается число бесплодных коров с 17,4% до 6,7 %. За счет этого уменьшается ущерб в расчете на одну корову (209 руб. / 17,4% х 6,7%) и составляет 80,1 руб.

Экономический эффект, полученный за счет внедрения нового метода диагностики, определяли по формуле:

Эв = (У1 - У2) + (Зв1 - Зв2) где У1 - ущерб в расчете на одну корову при обычном методе диагностики беременности и бесплодии, руб.;

У2 - ущерб в расчете на одну корову при новом методе диагностики, руб.; Зв1 - затраты на диагностику беременности коров при обычном методе,

руб.;

Зв2 - затраты на диагностику беременности коров при использовании иммунологического теста, руб.

Экономический эффект от профилактики бесплодия коров с использованием иммунологического теста составляет:

Эв = (209 - 80,1) + (184 - 21,87) = 291,03 руб.

Таким образом, внедрение модифицированного иммунологического теста для диагностики беременности коров позволяет сократить значительные экономические потери сельскохозяйственных товаропроизводителей и получить высокий экономический эффект, который составляет 13,3 руб. на 1 руб. затрат.

Увеличение продуктивности коров напрямую зависит от условий содержания, кормления и правильной работы по воспроизводству.

Без строгого ветеринарно-зоотехнического надзора, позволяющего планировать на протяжении календарного года запуск, роды, осеменение животных и текущую внутрифермерскую работу; своевременно пополнять стадо молодняком, квалифицированно осуществлять выбраковку животных, непригодных к воспроизводству, невозможно осуществлять мероприятия по борьбе с бесплодием крупного рогатого скота на животноводческих фермах. Для достижения этих целей требуются регулярные диагностические исследования на стельность и бесплодие, а также постоянный учет в маточном стаде основных групп коров: стельных, в послеродовом периоде, осемененных, но не проверенных на беременность и бесплодных.

В настоящее время существуют различные методы определения беременности. Анализ информационных источников по состоянию исследований в данном направлении, в том числе проблемам контроля воспроизводства животных показал, что существующие методы диагностики стельности коров неравноценны и отличаются рядом особенностей, большей или меньшей специфичностью и достоверностью. Эти методы в разной степени сложны по технике выполнения и отличаются также скоростью наступления реакции, что имеет большое практическое значение [21, 54, 73, 80, 97, 100].

Существуют лабораторные диагностические методы исследований, такие как радиоиммунологический (РИА) и иммуноферментный анализ (ИФА), при помощи которых можно определить в биологических жидкостях (моча, плазма, ам-ниотическая жидкость, сыворотка и т. п.) количественное содержание гормонов регуляторов репродуктивной функции [76, 69, 113, 162, 171].

Используя метод ИФА для ранней диагностики беременности сельскохозяйственных животных, можно избежать от 10 до 40% экономических потерь от яловости [104].

Ведутся широкие исследования по усовершенствованию существующих стандартных наборов для иммуноферментного анализа (EIA), а также по разработке новых: Progestassay, Accufirm™ and RPTTM (Kamar Inc.,Steamboat Springs Co); RPT (Gist - Brocades Inc., Charlotte, NC). C помощью этих наборов можно одновременно проанализировать 7 образцов посредством колориметрического сравнения. Анализ проводится визуально или с помощью электронного сканера. Также известны тесты: B.E.S.T.™ (West Agro Inc. Kansas Sity, MO), который базируется на реакции между латексными гнездами, покрытыми молекулами прогестерона и антителами; Calfcheck™ (Noctech Ltd., Dublin, Ireland), основанный на использовании восьмилуночной микротитровальной полоски; EnzygnostTM (Hoechst-Roussel Agrivet Comp., Summerville, NJ) с использованием 96-луночной пластины (по 8 лунок в 2 ряда; с помощью серии стандартов усиливается чувствительность и интенсивность цвета); EstruCHEK™, OvuSureTM (Elanco Products Co., Indianapolis, IN) - при помощи этих наборов можно одновременно исследовать 5 образцов; Open Alert™ and BoviPro 21TM (An - Tech International, Proenix, AD), базирующийся на сравнении прогестеронового стандарта и исследуемых образцов; TargetTM (BioMetallics, Princeton, NJ), основанный на окраске диска при концентрации прогестерона свыше 10 нг/мл [156].

Разработан тест «Прогитор» фирмы Farmos Diagnostica (Финляндия) для определения стельности коров по концентрации прогестерона в молоке на 19-22-й дни после осеменения, с 85% определенностью [136].

Учеными Оксфордского университета разработаны тест-полоски (P4 Rapid Milk Progesterone Test) для определения беременности по уровню прогестерона в молоке. Однако данное диагностическое средство не получило широкого применения в животноводстве страны [145].

Нами, в рамках диссертационной работы, были проведены патентные исследования, объектом которых являлись методы диагностики стельности коров и телок, применяемые в условиях животноводческих ферм без специального оборудования, и тест-системы для диагностики стельности коров, не требующие специального оборудования.

Патентный поиск проводился по следующим странам: Россия, Украина, США, Япония, Франция, Германия, Великобритания и Швейцария, Австрия, Италия, Австралия, Корея, Канада, Израиль. Глубина поиска - 25 лет.

Были использованы информационные базы: 1. Сервер Роспатента -http://www.fips.ru; 2. База Патентов - США - http://www.uspto.gov/sitesearch.jsp; 3. База патентов Японии PAJ - http://www.ipdl.inpit.go.jp/homepg_e.ipdl; 4. Европейская патентная организация - http://www.epo.org/; 5. Международные и национальные патентные фонды - http://www.wipo.int/patentscope/.

По итогам патентных исследований можно сделать основной вывод - в настоящее время в мире отсутствуют охранные документы на метод диагностики стельности коров и телок, а также тест-системы для диагностики стельности коров, которые:

- основаны на качественном определении плацентарного гормона - хорио-нического гонадотропина в моче животных;

- не требовали бы в условиях животноводческих ферм использования специального аналитического оборудования и привлечения ветеринарных специалистов.

Можно отметить, что ближайшим аналогом по функциональным свойствам является тест-система BioPRYN, производимая компанией BioTracking, LLC (США, https://www.biotracking.com/). Однако есть принципиальное отличие данной тест-системы от разрабатываемого экспериментального экспресс-теста для определения стельности коров: BioPRYN диагностирует стельность по наличию в сыворотке или плазме крови коров животного белка B (PSPB). PSPB вырабатывается плацентой, и поэтому он появляется в крови стельных коров. Для его диагностики необходим иммуноферментный анализ (ИФА), следовательно, проба должна быть отправлена в лабораторию, имеющую специализированное аналитическое оборудование. Кроме того, розничная стоимость одной такой тест-системы составляет от $5 до $5,5 (от 140 до 160 рублей), что является высокой по сравнению со стоимостью ректального метода определения беременности коров.

Широкое применение в медицине получили тесты на беременность, основанные на определении хорионического гонадотропина в моче или в сыворотке крови. Тесты отличаются простотой применения, достоверностью, высокой воспроизводимостью результатов и диагностической точностью, которая составляет до 98%. [27, 28].

Есть сведения, что ХГ обнаружен у всех до сих пор исследованных видов млекопитающихся E.C. Amorosa, I.S. Perry (1975) (цит. по И.М. Солопаевой, 2000) [86].

В экстрактах плаценты одиннадцати видов высших приматов с помощью биологических и иммунологических методов определяли концентрацию ХГ. Оказалось, что хорионический гонадотропин всех этих видов приматов по строению и концентрации в плаценте сходны между собой и ХГ человека поздних стадий беременности. Сходные гонадотропины были обнаружены в плаценте крыс, мышей и морских свинок (Hobson и Wide, цит. по (К. Остин, Р. Шорт, 1987))[62]. Эти авторы предполагают, что в ближайшем будущем будут обнаружены плацентарные гонадотропины и у других млекопитающих (И.Н. Солопаева, Н.И. Шаро-ва,1988) [86].

Колектив авторов во главе с Багмановым М.А. провели исследования по изучению концентрации хорионического гонадотропина в сыворотке крови стельных коров методом твердофазного иммуноферментного анализа в клинико-диагностической лаборатории родильного дома г. Ульяновска. Результаты исследования показали наличие хорионического гонадотропина, концентрация которого менялась в зависимости от срока стельности. Среднее содержание ХГ в первый месяц стельности составило 4,6±0,83 МЕ/л. На второй месяц стельности концентрация сохранялась на уровне 4,1 - 5,0 МЕ/л (средний показатель - 4,47±0,15 МЕ/л). В третий месяц регистрировалось увеличение количества ХГ до уровня 8,4±1,36 МЕ/л. В дальнейшем уровень гормона снижался до 6,2±0,21 МЕ/л в четыре месяца. Начиная с пятого месяца, отмечено изменение содержание гормона, выраженное в уменьшении его концентрации до 5,92±0,21 МЕ/л. В дальнейшем количество хориогонина сохранялось на уровне 5,68±0,12 МЕ/л. С седьмого меся-

ца стельности концентрация постепенно снижалась и перед отелом зафиксирован показатель 3,30±0,19 МЕ/л. В пробах сыворотки от бесплодных коров ХГ не был обнаружен [5].

При изучении состава препарата «Хорио-фаг», исходным материалом, для которого служила плацента, были обнаружены гормоны в следующих количествах: эстрадиол - 3078-4086 пг/мл, ФСГ - 9,23-15,50 мме/мл, ЛГ - 5,97-8,54 мме/мл, хорионический гонадотропин - 5,09-13,0 мме/мл, пролактин - 92,6-123,7 мме/мл [5].

Таким образом, вопрос о наличии и концентрации ХГ в организме млекопитающих, и в частности, коров остается открытым и требует глубокого изучения. Возможно, в организме беременных коров обнаруживаются белковые вещества, сходные по антигенной структре с хорионическим гонадотропином, что позволяет их обнаруживать в иммунологической реакции.

Учитывая успешный опыт применения тестов на беременность женщин в медицине, для ветеринарной практики был разработан иммунологический экспресс-тест, определяющий стельность и бесплодие крупного рогатого скота [10].

Данный препарат показал себя как высокоэффективное диагностическое средство, позволяющее устанавливать беременность в достаточно ранние сроки [8].

При этом следует отметить, что география потребителей препарата достаточно широка и включает регионы России и зарубежные страны с различными климатическими условиями, неблагоприятно отражающимися на качестве биопрепарата при его пересылке, транспортировке и хранении. Жидкие препараты требуют определенного температурного режима хранения и транспортирования -от +2 до +4ОС, нарушение которого как в сторону повышения, так и в сторону понижения температуры может привести к снижению активности. В связи с этим возникает необходимость совершенствования формы выпуска экспресс-теста, позволяющей исключить вышеуказанные отрицательные воздействия. В данном аспекте одним из решений проблемы является разработка лиофилизированной формы диагностикума.

Лиофилизация — способ щадящего высушивания веществ, при котором образец предварительно замораживается, а затем переносится в вакуумную камеру, где происходит сублимация растворителя. Сухие вещества, полученные при помощи лиофилизации, не теряют присущих им свойств, химически не изменяются при долговременном хранении в положительных температурах, вследствие чего упрощаются условия хранения, транспортировки и увеличивается срок годности. При лиофилизации белки не подвергаются денатурации и могут длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 °С). Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства.

Лиофилизации, как правило, подвергаются микроорганизмы и бактериофаги. Она широко применяется для получения способной к долговременному хранению плазмы крови (сухая плазма) и ее отдельных фракций, иммунных сывороток, иммуноглобулинов, вакцин, антибиотиков, гормонов, трансплантатов тканей, поэтому для них отработаны разнообразные режимы замораживания и высушивания [2, 103, 138, 141, 146].

Основные превосходства лиофилизационного высушивания проявляются:

- в отсутствии действия высоких перепадов температур на биопрепарат;

- в сохранении биологической активности и структурной целостности материалов;

- в высокой достижимости быстрого восстановления исходных свойств высушенного биопрепарата до первоначального состояния, при добавлении определенного растворителя;

- в снижении объема и веса препарата;

- в стерильном изготовлении;

- в повышении срока годности.

Отсутствие стандартной методики лиофилизации биопрепаратов вызывает необходимость проведения исследований по подбору оптимальных параметров для каждого конкретного препарата.

Лиофилизация - это процесс устранения воды из предварительно замороженного материала методом сублимации льда, который переходит в парообразную форму, исключая жидкую форму.

Вышеуказанную методику можно разделить на три основных стадии: замораживание, возгонка льда и досушивание остаточной влаги при положительной температуре.

В производстве лиофильновысушенных биопрепаратов используют вспомогательные вещества: наполнители, соединения, выравнивающие значение рН, растворители, криопротекторы, солюбилизаторы, консерванты, стабилизаторы [167]. Все они должны обеспечить сохранение надлежащего качества и высокой эффективности биопрепаратов, а также продлить сроки хранения.

Мы усовершенствовали разработанную М.А.Богдановой технологию получения препарата иммунологического экспресс-теста для диагностики стельности коров. Это усовершенствование заключается в лиофилизации [10].

В соответствии с рекомендациями, изложенными в литературных источниках, в исходный препарат были внесены криопротекторы, формообразующие и стабилизирующие компоненты.

В качестве формообразующего компонента, криопротектора и стабилизатора в биопрепарат добавляли 6% раствор сахарозы.

Последующие исследования были направлены на отработку различных способов заморозки, сублимации и досушивания. При этом использовали методики, использованные Аршиновой О.Ю. [2].

При выборе условий замораживания экспресс-теста осуществляли: выбор способа заморозки препаратов; определение температуры заморозки; изучение воздействия длительности заморозки на качественные свойства экспресс-теста. Влияние метода заморозки на показатели лиофилизата иммунологического экспресс-теста оценивали по следующим критериям: внешний вид биопрепарата, количественное содержание лиофилизата, остаточное влагосодержание, растворимость, показатель рН.

Нами установлено, что для получения лиофилизированной формы иммунологического препарата для диагностики беременности коров можно применять метод как медленной, так и быстрой заморозки. В целях экономии времени и электроэнергии при изготовлении лиофилизированной формы биопрепарата в дальнейшем использовали быструю заморозку в течение 7 ч от +20 °С до -50 °С в сублимационной камере аппарата FreeZone Щ Labconco.

При отработке режима сублимационной сушки биопрепарата нами были получены результаты, свидетельствующие о том, что из испытанных способов сублимации только два способа соответствуют требуемым характеристикам. Исходя из того, что для 2-ого способа сублимации необходимо меньше времени, а следовательно, и меньше затрат электроэнергии, этот способ применяли в производстве лиофилизированного иммунологического препарата. Способ заключался в том, что в течение 3 часов образцы выдерживали в сублимационной камере при -50 °С с наименьшим давлением (5,0 х 10-2 мБар), после чего со скоростью 4 °С/ч повышали температуру от -50 °С до -10 °С. Далее температуру в камере повышали от -10 °С до +4 °С при скорости 2°С /ч, и от +4 °С до +20 °С при скорости 5 °С/ч. Затем препарат досушивали 3 часа при температуре +20 °С. Общее время лиофилизации составило 26 часов.

Исследования по изучению влияния толщины слоя раствора на качество лиофилизата экспресс-теста показали, что заполнение пробирки 2 мл биопрепарата является оптимальным.

При контроле качества и стандартизации лиофилизированных биопрепаратов необходимо учитывать следующие показатели: внешний вид, растворимость, значение рН, средняя масса содержимого в пробирке, точность дозирования, остаточная влажность.

Нами были проведены исследования по подбору оптимальных параметров для контроля характеристик лиофилизированного иммунологического препарата. Была проведена оценка препарата по следующим показателям:

• Внешний вид

• Растворимость и время растворения в моче не беременной коровы

• Точность дозирования

• Срок годности

• Хранение

• Упаковка. Маркировка

Проведенные исследования также показали, что качество лиофилизирован-ной модификации иммунологического препарата, произведенного по разработанной технологии, не снижается на протяжении 2 лет, что значительно выше жидкой формы диагностикума, активность которого утрачивается по истечении 1 года хранения.

В результате проведенных исследований подобраны оптимальные режимы заморозки, сублимации и досушивания, позволяющие получать препарат с высокими показателями диагностической точности и длительным сроком хранения.

Полученные данные легли в основу разработанных нами нормативно-технических документов, регламентирующих производство и применение препарата.

Модифицированная технологическая схема изготовления биопрепарата включала следующие этапы (операции):

1. Изготовление жидкой формы экспресс-теста для определения беременности:

- иммунизация кроликов 5-кратно с 7-дневными интервалами (препарат «Хорионический гонадотропин для инъекций с удельной активностью 1000 МЕ/л», разовая доза - 200 МЕ/л + адъювант) (33 дня);

- забор крови через 7 дней после последней инъекции;

- определение титра гипериммунной сыворотки;

- адсорбция антихориогонин-антител на частицах индикатора - ализарина;

- стабилизация (сахароза 6%);

2. Розлив раствора по флаконам;

3. Заморозка 7 часов от +200С до -500С;

0 2

4. Сублимация 3 часа при -50 С с наименьшим давлением (5,0 х 10 мБар),

затем повышение температуры от -10 °С до +4 °С при скорости 2°С /ч, и от

+4 °С до +20 °С при скорости 5 °С/ч;

5. Досушивание 3 часа при температуре +20 °С;

6. Укупорка флаконов;

7. Контроль качества.

Последующие исследования были направлены на изучение диагностической эффективности лиофилизированного биопрепарата для определения беременности коров.

Тест-реакцию проводили путем внесения в пробирку с лиофилизатом мочи от исследуемой коровы.

Результаты производственных испытаний препарата показали, что, независимо от возраста животных, максимальная точность диагностических исследований наблюдается у коров, имеющих срок стельности 3 и более месяцев (от 96,3 до 100%), минимальная - при сроке стельности до 1 месяца (от 77,9 до 88,9%). При этом в месячный срок стельности наихудший результат был зафиксирован у коров в возрасте 7 и более лет.

У бесплодных животных точность диагностического препарата составила 93,3%.

По результатам производственной апробации при оценке функциональных характеристик и потребительских свойств разработанного препарата были установлены следующие показатели:

Требование к возможности использования экспресс-теста в условиях животноводческих ферм и частных подворий без использования специализированного оборудования

Экспресс-тест можно использовать в условиях животноводческих ферм и частных подворий без использования специализированного оборудования.

Требование к безопасности процедуры диагностики стельности коров и исключению вероятности заражения ветеринарных специалистов заболеваниями инфекционного происхождения

Процедура диагностики стельности коров безопасна и при соблюдении правил асептики и антисептики исключает вероятность заражения ветеринарных специалистов заболеваниями инфекционного происхождения, т.к. процедура получения мочи и тестирования не предполагает манипуляций, допускающих заражение (ректальное исследование).

Максимальное количество флаконов с препаратом, необходимых для разовой диагностики

Не более 1;

Минимальное значение срока стельности, при котором можно диагностировать стельность и бесплодие

Не менее 1 месяца

Точность выполняемых диагностических мероприятий

В среднем в разные сроки стельности - 92,1%.

Точность выявления бесплодия у животных - 93,3 %

Требование к удобству и простоте использования.

Процедура постановки диагноза может быть выполнена как ветеринарными специалистами, так и вспомогательным персоналом или владельцем животного в частном подворье. Читка реакции визуально четкая, позволяющая правильно оценить результаты постановки тест-пробы.

Требование к длительности процедуры диагностики.

Не более 15 минут для диагностических манипуляций, не более 1 часа для оценки результатов тестирования (читки);

Требования к сроку хранения препарата

Не менее 2-х лет

В связи со специфичностью проведенной нами работы, при статистической обработке данных, полученных в экспериментальных исследованиях, мы определяли степень соответствия разработанного и прошедшего производственные испытания одностадийного иммунологического теста с ректальным методом.

Исследования по экономическому обоснованию применения лиофилизиро-ванного препарата показали, что внедрение иммунологического теста для диагно-

стики беременности коров позволяет сократить значительные экономические потери сельскохозяйственных товара производителей и получить высокий экономический эффект. Соответственно, экономический эффект от внедрения биопрепарата на 1 руб. затрат составляет 13,3 руб.

Следовательно, внедрение иммунологического теста для диагностики беременности коров позволяет сократить значительные экономические потери сель-скохозтоваропроизводителей и получить высокий экономический эффект.

Обязательным элементом работы, связанной с разработкой нового ветеринарного препарата, является подготовка нормативно-технической документации, регламентирующей его производство и применение.

Результаты исследований по всем вышеописанным разделам диссертации легли в основу следующих разработанных документов:

• Опытно-промышленный регламент производства иммунологического теста для диагностики на ранних стадиях беременности домашнего скота (лиофилизиро-ванный препарат) COWTEST®L, (утверждены директором НТЦ «ПромТехЭнерго» от «5» июня 2015 г.);

• ТУ Иммунологический экспресс-тест для диагностики ранних стадий беременности домашнего скота (лиофилизированный препарат) COWTEST®L, (утверждены директором НТЦ «ПромТехЭнерго» от «5» июня 2015 г.);

• Инструкции по применению иммунологического экспресс-теста для диагностики на ранних стадиях беременности домашнего скота (лиофилизированный препарат) COWTEST® (утверждены директором НТЦ «ПромТехЭнерго» от «5» июня 2015 г.).

Таким образом, в целом оценивая результаты выполненной научно-исследовательской работы, можно отметить, что все задачи, вытекающие из поставленной цели, были выполнены. На основании анализа современных научных источников и проведенных исследований по разработке технологии изготовления лиофилизированного препарата для диагностики стельности коров была получена экспериментальная партия препарата. Полученный иммунологический тест про-

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 3.1. Выводы

1. При усовершенствовании технологии изготовления иммунологического препарата для диагностики беременности коров путем разработки его лиофилизи-рованной модификации установлено:

• оптимальным режимом сублимации препарата для диагностики беременности коров является способ, заключающийся в выдерживании образцов в течение 3 часов в сублимационной камере при -50 °С с наименьшим давлением (5,0 х 10 мБар), после чего со скоростью 4 °С/ч повышается температура от -50 °С до -10 °С. Далее температура в камере повышается от -10 °С до +4 °С при скорости 2°С /ч, и от +4 °С до +20 °С при скорости 5 °С/ч. Затем препарат досушивается 3 часа при температуре +20 °С. Общее время лиофилизации составляет 26 часов.

• исследования по изучению влияния толщины слоя раствора на качество лиофилизата экспресс-теста показали, что заполнение пробирки 2 мл биопрепарата является оптимальным.

• качество лиофилизированной модификации иммунологического препарата, произведенного по разработанной технологии, не снижается на протяжении 2 лет, что значительно выше жидкой формы диагностикума, активность которого утрачивается по истечении 1 года хранения.

• при контроле качества и стандартизации лиофилизированных биопрепаратов необходимо учитывать следующие показатели: внешний вид, растворимость, средняя масса содержимого в пробирке, точность дозирования, остаточная влажность.

2. Производственные испытания установили высокую диагностическую точность разработанного иммунологического метода, которая составила при определении беременности коров 1-ого месяца после осеменения от 77,9 до 88,9%, в срок 2 месяца стельности 89,5%, в срок 3 и более поздние сроки стельности - 96,3%. У бесплодных животных точность диагностического препарата составила 93,3%.

3. Разработанный метод диагностики стельности прост в исполнении, нетрудоемок и может быть успешно использован в производственных условиях.

4. Использование иммунологического теста для диагностики беременности коров позволяет сократить значительные экономические потери сельскохозяйственных товаропроизводителей и получить высокий экономический эффект, составляющий в среднем по региону 13,3 руб. на рубль затрат.

3.2. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для диагностики беременности коров рекомендуется использовать разработанную в Ульяновской ГСХА лиофилизированную модификацию иммунологического препарата для определения беременности коров, регламентируемую следующими нормативно-техническими документами:

1. Опытно-промышленный регламент производства иммунологического теста для диагностики на ранних стадиях беременности домашнего скота (лиофи-лизированный препарат) COWTEST®L, (утверждены директором НТЦ «Пром-ТехЭнерго» от «5» июня 2015 г.);

2. ТУ Иммунологический экспресс-тест для диагностики ранних стадий беременности домашнего скота (лиофилизированный препарат) COWTEST®L, (утверждены директором НТЦ «ПромТехЭнерго» от «5» июня 2015 г.);

3. Инструкции по применению иммунологического экспресс-теста для диагностики на ранних стадиях беременности домашнего скота (лиофилизирован-ный препарат) COWTEST® (утверждены директором НТЦ «ПромТехЭнерго» от «5» июня 2015 г.).

3.3. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Результаты проведенных исследований подтверждают необходимость дальнейшего изучения особенностей гормональной регуляции беременности у животных, в частности роли хорионического гонадотропина, разработки методов экс-прессдиагностики беременности других видов животных и поиска новых форм препарата (тест-полоски и др.).

2. Аршинова, О. Ю. и др. Особенности лиофилизации липосомальных лекарственных препаратов (обзор) / О.Ю. Аршинова и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2011. - Т. 46. - №. 4. - С. 29-34.

3. Афанасьева, А.И. Влияние уровня гормонов на продуктивные показатели коров красной степной породы при разной структуре рациона / А.И. Афанасьева, В.Г. Огуй, С.А. Галдак // Зоотехния. - 2007. - №8. - С. 17-18.

4. Ахмадеев, А.Н. Некоторые методы диагностики беременности и бесплодия и их практическое значение в организации воспроизводства скота / А.Н. Ахмадеев: Автореф. дис. ... канд. вет. наук. - Казань, 1969. - 24с.

5. Багманов, М.А. Роль микробного фактора в этиологии гинекологических болезней коров, их профилактика и терапия / М.А. Багманов: Автореф. дис. ... докт. вет. наук. - Казань, 1998, - 44 с.

6. Баковецкая, О.В. Закономерности и механизм функционирования репродуктивной системы коров и кобыл в период эструса и разработка метода определения оптимального времени осеменения / О.В. Баковецкая: Автореф. дис. докт. биол. наук. — Рязань. 2006. — 35 с.

7. Бек, У. "Хорионический гонадотропин" 2006 кйр:/^утесо^^еЬагепа. ru/endocrmology/endocrmology (5 Сентября 2007).

8. Богданов, И. И. Иммунологический экспресс-тест на беременность и

бесплодие коров / И.И. Богданов, М.А. Богданова, А.Н. Фомин //Вестник ветеринарии. - 2011. - Т. 59. - №. 4. - С. 11-12.

9. Богданова, М. А. Результаты испытания нового метода диагностики стельности / М.А. Богданова, М.А. Багманов, И.И.Богданов //Ветеринарная патология. 2007. - №3 - С. 39 - 41.

10. Богданова, М.А. Разработка технологии изготовления и применения иммунологического теста для диагностики беременности и бесплодия коров / М.А. Богданова: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Ульяновск, 2008. - 20с.

11. Братанов, К. Теория и практика воспроизведения животных / К. Братанов, Х. Бальбеж, З. Вежник и др. - М.: Колос, 1984. - 272 с.

12. Бурдов, Г.Н. Ранняя диагностика стельности методом ИФА / Г.Н. Бур-дов, Е.И. Марасинская, С.А. Селезнев, Е.А. Загрегина // Ветеринарный врач. -2001. -№3. - С. 30-31.

13. Василенко, Т.Ф. Основные итоги исследований в физиологии и биохимии продуктивных животных севера / Т.Ф. Василенко, Н.А. Чермных, А.Ф. Симаков, Т.И. Кочан, Н.П. Монгалёв // Известия Коми научного центра УРО РАН

- 2013. -№4(16). - С. 47-53.

14. Василенко, Т.Ф. Содержание общего белка, холестерина, прогестерона в крови и клеточный состав влагалищных мазков у лосих и коров в пред- и послеродовой периоды / Т.Ф. Василенко, Л.Ю. Рубцова // Зоол.журн. 2000. - Т.79. - N 8.

- С. 1000-1004.

15. Власов, С.А. Фетоплацентарная недостаточность / С.А. Власов. - Воронеж, 2001. - С. 60-69.

16. Воронин, Е.С. Иммунология / Е.С. Воронин, А.М. Петров, М.М. Серых, Д.А. Девришов // - М.: Колосс-Пресс, 2002. - 408 с.

17. Гавриленко, Н.Н. Рефлексологическая диагностика беременности и бесплодия у коров с быками-пробниками разного возраста / Н.Н. Гавриленко // Учен. зап. Казан, гос. акад. ветеринар, медицины. 2006. - т.183. - С. 51-57.

18. Гордон, А. Контроль воспроизводства сельскохозяйственных животных / А. Гордон. - М.: Агропромиздат, 1988. - 415 с.

19. Дадалова, JI.H. Оценка достоверности теста кристаллизации слюны как метода самодиагностики фертильных и бесплодных дней / Л.Н. Дадалова // Женская консультация. №9. - 2003. - С. 33-35.

20. Дегтярев, В.П. Этиопатогенез и коррекция нарушений репродукции у коров / В.П. Дегтярев, К.В. Леонов, А.И. Клименко, И.М. Дунин // Методические рекомендации. - Москва, 2006 - 15 с.

21. Дюльгер, Г.П. Ультразвуковая диагностика ранних сроков беременности и бесплодия у коров / Г.П. Дюльгер, И.В. Огородникова, П.А. Ёлкин // Ветеринар. - 2003. - №3. - С. 14-17.

22. Дюльгер, Г.П., Нежданов, А.Г. Вариабельность овариальных структур

и концентрации прогестерона в плазме периферической крови коров при рециди-

вирующей форме кистозной болезни яичников / Г.П. Дюльгер, А.Г. Нежданов //Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология растений. Серия: Биология животных. - 2006. - №. 6. - С. 62-68.

23. Ездакова, И. Ю. Динамика иммунологических показателей стельных коров / И. Ю. Ездакова // Ветеринарная патология. - 2007. - №. 2. - С. 148-151.

24. Животков, Х.И. Определение стельности у коров / Х.И. Животков // -М.: Колос, 1965. - 61 с.

25. Зимина, Е.А. Определение стельности и пола плода при помощи ультразвука / Е.А. Зимина // Практик для ветеринарных специалистов. - 2011. - №. 1. - С. 53.

26. Зипер, А.Ф. Воспроизводство и селекция сельскохозяйственных животных / А.Ф. Зипер // - М.: Издательство АСТ. - 2004. - 77 с.

27. Зяблицев, С. В. Гормонодиагностика патологии репродуктивной системы / Зяблицев, С. В. и др. //Д: Каштан. - 2010. - С. 1-38.

28. Зяблицев, С.В. Гормонодиагностика патологии беременности / С.В. Зяблицев, Э.Б. Яковлева, С.В. Арбузова, Э.В. Сорокатая, М.И. Никоненко // 2003 http://www.primer.ru (20 июня 2004).

29. Ибрагимов, Э.К. Определение стельности и причин яловости коров /

Э.К. Ибрагимов // - Фрунзе: Киргизгосиздат, 1964. - 47 с.

30. Ивашкевич, О.П., Астапова, С.А. Диагностика беременности у коров / О.П.Ивашкевич, С.А. Астапова // Ветеринария и кормление. — 2005. №1.- С. 1617.

31. Ивашкевич, О.П., Астапова, С.А. Ранняя диагностика стельности / О.П. Ивашкевич, С.А. Астапова // Ветеринарная наука — производству ин-т экс-перим. ветеринарии нац. акад. наук Беларуси. 2005. - в.38. - С. 233-237.

32. Ивашкевич, О.П., Рыбаков, Ю.А. Ультразвуковая диагностика беременности в животноводстве / О.П. Ивашкевич, Ю.А. Рыбаков // Ветеринарная наука производству ин-т эксперим. ветеринарии нац. акад. наук Беларуси. - 2007. -в.39. - С. 126-140.

33. Клинский, Ю. Д. Биологические свойства гонадотропина сыворотки крови жеребых кобыл и его применение в каракулеводстве. - Автореф. дис. ... докт. биол. наук., М.: Дубровицы, 1971. - 43 с.

34. Клинский, Ю. Д. Гонадотропин-рилизинг-гормон и регуляция половой функции у животных / Ю.Д. Клинский, С.Д. Бутоко, А.Н. Алексеенко // Сельское хозяйство за рубежом. 1978. - №1. - С.43 - 45.

35. Клинский, Ю.Д., Чомаев, A.M. Соотношение прогестерона и эстра-диола при различных физиологических состояниях коров в норме и патологии / Ю.Д. Клинский, A.M. Чомаев // Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных. 2007. - №7. - С. 224-227.

36. Ключникова, Н. Ф. и др. Связь размеров яичников с продуктивностью у первотелок / Н. Ф. Ключникова и др. //Зоотехния. - 2008. - №. 8. - С. 29-30.

37. Коляков, Я.Е. Ветеринарная иммунология / Коляков Я.Е. // - М.: Агро-промиздат, 1986. - С. 238-239.

38. Коноплев, В.В. Диагностика беременности и бесплодия у коров / В.В. Коноплев // - Челябинск: Южно-Уральское кн. изд., 1968. - 74 с.

39. Корчак, Г.К. Ранне розтзнавания Тшьносл i неплщност корiв / Г.К. Корчак // - Киев: Держсшьгоспвидав УРСР, 1959. - 90 с.

40. Костомахин, Н. М. Организация искусственного осеменения и определение стельности коров и телок / Н. М. Костомахин //Главный зоотехник. - 2009. - №. 6. - С. 9-13.

41. Крупко, А.Я. Гормональные методы диагностики беременности / А.Я. Крупко. - Л.: Медиз, 1956. - С. 17-39.

42. Кузьмич, Р.Г. Клиническое акушерство и гинекология животных / Р. Г. Кузьмич // Витебск: УО ВГАВМ. - 2002.

43. Кузьмич, Р.Г., Рыбаков, Ю.А. Применение эхографии в ветеринарном акушерстве / Р.Г. Кузьмич, Ю.А. Рыбаков // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства / Берорус. гос. с.-х. акад. — Горки.- 2003. — С. 146-150.

44. Курнявко, Н.Ю. Ультразвуковая диагностика стельности КРС / Н.Ю. Курнявко // Актуальные проблемы современного аграрного производства. ,2008. -С. 93-95.

45. Леонов, К.В. Возможность коррекции репродуктивной функции у коров при различных состояниях естественной резистентности / К.В. Леонов // Ав-тореф. дис. ... докт. вет. наук. - Москва: МГАВМиБ, 2005, - 42 с.

46. Лимарева, Т.Д. Влияние условий сублимационного высушивания про-

биотиков на специфическую активность / Т.Д. Лимарева, В.Н. Девякович, М.И. Демешева, Л.Н. Мезенцева, Е.В. Рузавина // Сибирский медицинский журнал. -2009. - № 2. - С. 68-71.

47. Лободин, К.А. Плацента активное начало - препарат для коррекции воспроизводительной функции коров / К.А. Лободин // Ветеринария. - 2006. -№7. - С.38-41.

48. Логвинов, Д.Д. Беременность и роды у коров / Д.Д. Логвинов // - М.: Урожай, 1975. - 240 с.

49. Мамаев, А. В. Оценка физиологического состояния коров по биоэлектрическому потенциалу / А.В. Мамаев // Ветеринария. - 2004. - №. 7. - С. 41-42.

50. Матвеев, Л.В., Иноземцева, Е.И. / Ультразвуковая диагностика воспроизводительной функции кобыл / Л.В. Матвеев, Е.И. Иноземцева // Ветеринар. 2006. - №4. - С. 40-43.

51. Мышкин, Н.Ф. Диагностика беременности и бесплодия сельскохозяйственных животных / Н.Ф. Мышкин. // - М. - Л., 1929. - 55 с.

52. Мышкин, Н.Ф. О необходимости пересмотра клинического исследования животных / Н.Ф. Мышкин // Ветеринария. - 1943. - №7. - С. 27-30.

53. Мышкин, Н.Ф. Определение небеременного состояния у коров / Н.Ф. Мышкин // - М.: Новая деревня, 1925. - 26 с.

54. Нежданов, А.Г., Лободин, К.А. Эндокринная функция яичников и щитовидной железы у коров после родов / А.Г. Нежданов, К.А. Лободин // Ветеринария. - 2005. -№3. - С. 36

55. Никитин, В.Я. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных / В.Я. Никитин, М.Г. Миролюбов, В.В. Храмцов и др. // -М.: КолосС, 2004. - 208с.

56. Никитин, В.Я., Мытарев, Д.Н. Диагностика беременности у свиней /

B.Я. Никитин, Д.Н. Мытарев // Актуальные проблемы производства свинины в Российской Федерации / Карачаево-Черкес. гос. технол. акад. 2008. - С. 85-87.

57. Никитин, И.Н. Организация и экономика ветеринарного дела / И.Н. Никитин //- СПб.: Издательство "Лань", 2014 г. - 368 с.

58. Никитин, И.Н., Апалькин, В.А. Научные документы кафедры организации и экономики ветеринарного дела ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» / И.Н. Никитин, В.А. Апаль-кин // - М., 2006. - 8 с.

59. Обыденнов, В.А. Гормоны в жизни животных / В.А. Обыденнов // -

М.: Колос, 1965. - 207 с.

60. Огуй, В.Г. Акушерство, гинекология и биотехника воспроизводства животных: учебное пособие / В.Г. Огуй, Г.Д. Некрасов, И.А. Суманова // Барнаул: Изд-во АГАУ, 2007. 204 с. - 2007.

61. Окань, А.М., Санагурский, Д.И. Модель коливно! динамши трансмембранного потенщалу в ранньому ембрiогенезi в'юна / А.М. Окань, Д.И. Санагурский //Физика живого. - 2008. - Т. 16. - №. 2.

62. Остин, К. Гормональная регуляция размножения у млекопитающих / К. Остин, Р. Шорт // - М.: Мир, 1997. - 208 с.

63. Падучева, А.Л. Гормональные препараты в животноводстве / А.Л. Па-дучева // - М., Россельхозиздат, 1979. - 231 с.

64. Пащенко, Е.А., Шевцов, Ф.И. Диагностика стельности / Е.А. Пащенко, Ф.И. Шевцов // Молоч.и мясн.скотоводство. -2008. N 5. - С. 28-29.

65. Переднев, В.В. Ультразвуковой сканер инструмент роста эффективности воспроизводства стада / В.В. Переднев // Белорус. сел. хоз-во. - 2007. - N 6. -

C. 85.

66. Петросян, Л.А. Иммунологические аспекты привычной потери беременности / Л.А. Петросян // Проблемы репродукции. № 2. -2008.- С. 62-67.

67. Пигарева, Г.П. Соотношение половых стероидов крови коров в динамике беременности / Г.П. Пигарева // Ветеринарная патология. - 2012. - Т. 41. -№. 3.

68. Попков, В.П. Электродиагностика стельности коров / В.П. Попков // Ветеринария. - 1965. - №11. - С. 30-31.

69. Преображенский, О.П. Современные методы диагностики и бесплодия животных / О.П. Преображенский // Ветеринария. - 2003. - № 7. - С. 32-33.

70. Пронина, Н.Ю. Мониторинг в воспроизводстве стада крупного рогатого скота / Н.Ю. Пронина //Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. НЭ Баумана. - 2011. - №. 208. - С. 98-104.

71. Прядко, А.Г. Разработка набора реактивов для иммуноферментного анализа прогестерона в молоке коров с целью ранней диагностики стельности / Т.В. Новик, А.Г. Прядко, Т.В. Новик // Эпизоотология, иммунобиология, фармакология и санитария. — 2007. - N 4. С. 66-72

72. Романова, Н.Г., Воронин, Эндокринная система. Гормоны и адаптация. Учебное пособие для студентов высших учебных заведений / Н.Г. Романова, И.М. Воронин // - Тамбов: Из-во ТГУ им. Г.Р. Державина; ТРО Вольного эконом. общества России, 2003. - 135 с.

73. Руденко, В.В. Автоматизированная система диагностики ранних сроков беременности животных / В.В. Руденко // Региональные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса. - Кур. гос. с.-х. акад. 2007 -ч.З. - С. 217-218.

74. Руденко, В.В. Разработка моделей и алгоритмов автоматизированной диагностики ранних сроков беременности животных / В.В. Руденко // Авто-реф. дис. ... канд. вет. наук. - Курск, 2000. - 18 с.

75. Руденко, В.В. Роль информационных технологий в автоматизации производства / А.М. Кривоносов, А.Ю. Помогаева, В.В. Руденко // Инструменты и механизмы современного инновационного развития Сборник статей Междуна-

прогестерону и возможности ее использования для изучения гинекологических заболеваний / Д.И. Санагурский, А.И. Сергиенко, А.О. Костюк и др. // Первая республиканская научная конференция 1618 октября 1990 г.: Тезисы докладов. -Львов, 1990. - 33 с.

77. Сафонов, В.А. О метаболическом профиле высокопродуктивных коров при беременности и бесплодии / В. А. Сафонов // Сельскохозяйственная биология. — 2008. №4. — С. 64-67.

78. Сафронова, В. А. Определение прогестерона методом латерального проточного иммуноанализа / Сафронова, В. А. //Оргкомитет. - 2012. - С. 154.

79. Севастьянова, О.В., Теплова, С.Н. Показатели популяционного состава лимфоцитов перефирической крови при неосложненной беременности по материалам проточной цитофлюорометрии / О.В. Севастьянова, С.Н. Теплова // Журн. Микробиология. № 4. - 2001. с. 97-100.

80. Семиволос, А. М. Клиническая и ультразвуковая оценка методов биотехнологического контроля состояния репродуктивных органов у коров при различных сроках беременности / А. М. Семиволос // Вестник Саратовского ГАУ.-2001. - С. 158

81. Сергиенко, А.И. Гормоны и воспроизводительная функция сельскохозяйственных животных / А.И. Сергиенко // - М.: ВНИИТЭИагропром, 1991. - 36 с.

82. Серых, М.М. Основы молекулярной эндокринологии / М.М. Серых, В.В. Зайцев, Н.А. Кленова, А.М. Петров, В.Г. Подковкин, М.Ю.Языков. // - Самара, 2004. - 144 с.

83. Сидер, А.Х. Клинико-морфологические показатели репродуктивных органов при ранней экспресс диагностики беременности методом УЗИ у коров, кобыл и овец / А.Х. Сидер: Автореф. дис. ... канд. вет. наук. - М., 2000. - 20с.

84. Сковородин, Е.Н., Игуменова, Н.А. Методы ранней диагностики стельности. / Е.Н. Сковородин, Н.А. Игуменова // Известия Оренбургского Государственного Аграрного университета. - 2011. - 2(30-1). - С. 89-91.

85. Соколов, Н.И. Определение беременности сельскохозяйственных животных / Н.И. Соколов. - Л.: Колос, 1971. - 46 с.

86. Солопаева, И.М. Роль хорионического гонадотропина в структурно-функциональном обеспечении онтогенеза млекопитающих в норме и патологии 2003 http://www.medicum.nnov.ru (12 мая 2007).

87. Солопаева, И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине //Н. Новгород: Изд-во Нижегородского госуниверситета им. НИ Лобачевского. - 2000. - С. 15-21.

88. Солсбери, Г.У., Ван-Демарк, Н.Л. Теория и практика искусственного осеменения коров в США / Г.У. Солсбери, Н.Л.Ван-Демарк / Пер. с англ. Березне-вой О.А. - М.: Колос, 1966. - С. 14-16.

89. Сорокин, В.И., Доронин, В.Н. Концентрация прогестерона у помесных телок при беременности / В.И. Сорокин, В.Н. Доронин // Современные методы совершенствования мясного скота: Сб. научных трудов.- Воронежского СХИ, 1984. - С. 64-69.

90. Спрингович, Н.О. Ранняя диагностика стельности по содержанию прогестерона в молоке и крови / Н.О. Спрингович // Молочное и мясное скотоводство. - 1979. - №12. - С. 40.

91. Степанюк, Л. В. Влияние криоконсервирования и лиофилизации на процессы внутриклеточного размножения бактериофага Т4 в бактериях Escherichia coli / Л.В. Степанюк, И.П. Высеканцев, Л.Г. Чернышенко //Проблемы криобиологии и криомедицины. - 2008. - С. 45-51

92. Студенцов, А. П. Акушерство, гинекология и биотехника размножения

животных / А.П. Студенцов // М:«Колос». - 2000.

93. Студенцов, А.П. Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения/ А.П. Студенцов, В.С. Шипилов, В.Я. Никитин, М.Г. Миролюбов, Л.Г. Субботина, О.Н. Преображенский, В.В. Храмцов, В.П. Гончаров // Под ред.

Никитина В.Я., Миролюбова М.Г.: Учеб. для студ. высш. учеб. завед. - М.: Колос, 2005. - 512 с.

94. Студенцов, А.П. Диагностика беременности и бесплодия сельскохозяйственных животных / А.П. Студенцов. - М.: Сельхозгиз, 1949. - 131 с.

95. Тернавщенко, К. О. Методика планирования воспроизводства стада на основе синхронизации половой охоты / К.О. Тернавщенко //Аграрный вестник Урала. - 2011. - С. 15.

96. Филиппо, Н. Основы сублимационной сушки / Н. Филиппо // ВОС Edwards Pharmaceutical Systems: Международная конференция. - Москва. - 2005.

- С. 2-47.

97. Хадер, С. А. Клинико-морфологические показатели репродуктивных органов при ранней экспресс-диагностике беременности методом УЗИ у коров, кобыл и овец. / С.А. Хадер // - Москва. - 2000. - 133 с

98. Халипаев, М.Г. Иммуноферментный анализ (ИФА) в диагностике беременности и бесплодия овец / М.Г. Халипаев // Овцы, козы, шерстяное дело. 2005. - N 3. - С. 28-30.

99. Харламов, Ю.Е. Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных. / Е.Ю. Харламов //Ветеринария.- 2007.-№6- С.35-37.

100.Храмцов, В. В. Ультразвуковая диагностика как современный метод биотехнологии в воспроизводстве крупного рогатого скота / В.В. Храмцов, Г.П. Дюльгер, П.А. Елкин //Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии.

- 2007. - №. 1. - С. 100-105.

101.Чомаев, A.M., Оборин, А.А. Уровень прогестерона и результативность осеменения / A.M. Чомаев, А.А. Оборин // Животноводство России. -2008. -N 6. С. 43-44.

102.Чохатариди, Л. Прогестерон и щелочная фосфатаза в организме коров / JI. Чохатариди // Молоч.и мясн.скотоводство. — 2007. N 4. - С. 32.

103. Шевелев, К.Ю. Сублимационная сушка. Описание технологии / К.Ю. Шевелев // Сублимационная сушка в фармацевтической и пищевой промышлен-

104. Шевелев, Н. Метод ИФА в диагностике бесплодия / Н. Шевелев, Н. Матрешина, В. Краснов //Животноводство России. - 2008. - Т. 1. - С. 47-48.

105. Шевелев, Н. Метод ИФА в диагностике бесплодия. / Н. Шевелев, Н.Матрешина, В.Краснов // Животноводство России. 2008. (1). 47-48.

106. Шипилов, В.С. Физиологические основы профилактики бесплодия коров / В.С. Шипилов // - М.: Колос, 1977. - 338 с.

107. Эрнст, Л. К., Варнавский, А.Н. Репродукция животных / Л.К. Эрнст, А.Н. Варнавский //. М. Колос - 2007. - 156 с.

108. Antol, T. Az inszeminalas idujen velt tejmintak alasconu vagy magas progeszteronarteke es a vemhessles kuzutti kapesolat vizsgalata szarvasmarhaallomanykkan / T. Antol, S. Faluhelyi, I. Shabo // Magyar allatow Lapia, 1988. - V. 43. - №9. - P. 539-541.

109. Badtram, G.A. Factors influencing the accuracy of early pregnancy detection in cattle by real time ultrasound of uterus / G.A. Badtram, J.D. Gaine, C.B. Thomas, W.T.K. Bosu // Theriogtnology, 1991. - V. 35. - P. 1153-1167.

110.Barresi, A. A. In-line control of the lyophilization process. A gentle PAT approach using software sensors / Barresi A. A., Velardi S. A., Pisano R. et al. // International journal of refrigeration. - 2009. - Vol. 32. - P. 1003-1014.

111. Barresi, A. A.. Monitoring of the primary drying of a lyophilization process in vials / Barresi A. A., Pisano R., Fissore D. et al // Chemical Engineering and Processing. - 2009. - Vol. 48. - P. 408-423.

112. Barresi, A.A. Monitoring, control and optimisation of freeze-drying process / Barresi A.A., Pisano R., Rasetto V. et al. // Proceedings of the European Drying Conference AFSIA 2007, Biarritz, France, May 24-25, 2007. Cahier de l'AFSIA. - №. 22. - P. 78-79. 17.

113.Bertoni, G. Plasma cortisol variations in dairy cows after some usual or unusual manipulations //Italian Journal of Animal Science. - 2010. - Т. 4. - №. 2s. - С. 200-202.

114.Bielanski, A. Biotechnologia rozrodu zwierz^t udomowionych / Bielanski A. Tiszner M //.- Wroclaw. - 2000.

115.Blitek, A. Embryo-uterine interactions during maternal recognition of pregnancy in pigs / A. Blitek, M. Kaczmarek // Med.weter. 2008. - T.64. -N6. - P. 759-763.

116.Bogdani, E. Implementation and validation of the thermogravimetric method for the determination of equilibrium vapour pressure values and sublimation enthalpies of frozen organic formulations used in drug freeze-drying processes / Bogdani E., Daoussi R., Vessot S. // Chemical engineering research and design. - 2011. - Vol. 89. - P. 2606-2612.

117.Boss, E.A., Freeze drying process: real time model and optimization / Boss E.A., Filho R.M. Vasco de Toledo E.C. // Chemical Engineering and Processing. -2004. - Vol. 43, № 12. - P. 1475-1485.

118.Brulls, M. Heat transfer in vial lyophilization / Brulls M., Rasmuson A. // Int. J. Pharm. - 2002. - Vol. 246. - P. 1-16.

119.Butler J. E. et al. Detection and partial characterization of two bovine pregnancy-specific proteins //Biology of Reproduction. - 1982. - T. 26. - №. 5. - C. 925933.

120. Chaffaux, S. Transrectal real-time ultrasound scanning for diagnosing pregnancy and for monitoring embryonic mortality in dairy cattle / S. Chaffaux, G.N.S. Reddy, F. Valon, M. Thibier // Anim. Repr. Sci, 1986. - V. 10. - P. 193-200.

121. Choi, H.S. Pregnancy diagnosis in sows by estimation of oestrogens in blood, urine or faeces / H.S. Choi, E. Kiesenhofen, H. Gantner // Anim. Reprod. Sci, 1987. - V. 15, - №3. - P. 209-216.

122. Choma, J. Rektalna palpacia a progesteronovy test pri skorey diagnostike gravidity / J. Choma, J. Elecko, A. Jusikova // Zb. ved. Prac. Ustavu Exper. Veter. Med. U Kosiciach, 1988. - №5. - S. 151-157.

123. Chouvenc, P. Optimization of the freeze-drying cycle: a new model for pressure rise analysis / Chouvenc P., Vessot S., Andrieu J. et al. // Drying Technology. - 2004. - Vol. 22. - P. 1577-1601.

124. Cordoba M. C., Sartori R., Fricke P. M. Assessment of a commercially available early conception factor (ECF) test for determining pregnancy status of dairy cattle //Journal of dairy science. - 2001. - T. 84. - №. 8. - C. 1884-1889.

125. Cowie, A.T. Pregnancy diagnosis tests: A review, Commonwealth Agr. Bur. Joint Pub / A.T. Cowie //. - Edinburgh, 1948. - 13 p.

126. Crowe, L.M. Lessons from nature: the role of sugars in anhydrobiosis, Comp.Biochem. Physiol // A Mol. Integr. Physiol. - 2002. - Vol. 131. - P.505-513.

127. Curran, S. Ultrasound appearance of the bovine conceptus from days 10

through 20 / S. Curran, R.A. Pierson, O.J. Ginther // J. Am. Vet. Assoc., 1986. - Vol. 189. - P. 1295-1302.

128. Etches, R. A methods of diagnising pregnancy early using the concentration of progesterone in milk / R. Etches, E. Gowan // Notes on Agr, 1981. - V. 17. - 23 p.

129. Fakes, M.G. Moisture sorption behavior of selected bulking used in lyophi-lized products / Fakes M.G., Dali M.V., Haby T.A. et al. // Journal of Pharmaceutical Science and Technology. - 2000. - Vol. 54, № 2. - P. 144-149.