Усовершенствование программ экстракорпорального оплодотворения с применением современных методик отбора сперматозоидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.01, кандидат наук Дударова Алина Хасановна

• Дударова Алина Хасановна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Дударова Алина Хасановна

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................6

ГЛАВА 1. ЗНАЧИМОСТЬ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДИК ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ В ПРОГРАММАХ ЭКО (Обзор литературы)

1.1 Роль мужского фактора в структуре причин бесплодия...............13

1.2 История внедрения методики ICSI.............................................16

1.2.1 Селекция сперматозоидов для ICSI...........................................18

1.2.2 Метод IMSI. Этапы морфологической оценки мужских гамет и методы микроскопии............................................................................21

1.3. История разработка методики оплодотворения PICSI..............29

1.4. Анализ клинической эффективность методики PICSI..............35

1.5 Фрагментация ДНК сперматозоидов и его значимость как фактора, определяющего тип оплодотворения в программах ЭКО......36

1.6 Преимплантационный генетический скрининг при патозооспермии.........................................................................40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал исследования.....................................................45

2.2 Дизайн исследования..........................................................47

2.3. Методы исследования.........................................................48

2.3.1 Общеклинические методы исследования...........................49

2.3.2 Гормональное исследование.............................................50

2.3.3. Ультразвуковое исследование органов малого таза................51

2.3.4. Спермиологическое исследование эякулята........................52

2.3.5 Специальные методы исследования..................................53

2.3.6. Протокол стимуляции функции яичников........................55

2.3.7. Трансвагинальная пункция яичников..............................56

2.3.8 Метод оплодотворения и культивирования дробящихся эмбрионов in vitro..................................................................................56

2.3.9 Перенос эмбрионов в полость матки................................61

2.3.10 Поддержка лютеиновой фазы и посттрансферного

периода..................................................................................61

2.3.11 Диагностика наступления беременности...........................61

2.3.12 Статистический анализ полученных данных......................61

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.................64

3.1. Клинико-анамнестическая характеристика пар с отклонениями в

спермограмме, включенных в исследование....................................65

3.1.1. Возрастная характеристика супружеских пар с

патозооспермией....................................................................65

3.1.2 Антропометрическая характеристика пациенток, включенных в исследование.......................................................................................68

3.1.3. Социально-экономические характеристики групп, включенных в исследование...........................................................................69

3.1.4. Характеристика менструальной функции женщин............69

3.1.5. Репродуктивный анамнез пациенток..............................71

3.1.6. Характеристика женщин по перенесенным гинекологическим заболеваниям и оперативным вмешательствам.........................75

3.1.7. Гормональный профиль пациенток, включенных

в исследование.................................................................78

3.1.8. Характеристика показателейсупругов пациенток, включенных в исследование.................................................................80

3.2.Параметры стимуляции функции яичников, фолликулогенеза и оогенеза............................................................................................81

3.2.1. Описание раннего эмбриогенеза и анализ исходов циклов ЭКО у пар в сравниваемых группах...............................................................82

3.3. Ассоциация процента фрагментации ДНК сперматозоидов с особенностями раннего эмбриогенеза и исходами программ ВРТ......86

3.3.1. Клинико-анамнестическая, возрастная характеристики супружескихпар, включенных в исследование с высоким процентом фрагментации ДНК сперматозоидов........................................87

3.3.2 Антропометрическая характеристика и характеристика менструальной функции пациенток, включенных в исследование № 2.................................................................................88

3.3.3. Характеристика репродуктивной функции пациенток, включенных в исследование.................................................90

3.3.4. Характеристика анамнестических данных пациенток относительно гинекологических заболеваний и перенесенных операций...........................................................................93

3.3.5. Гормональный профиль пациенток, включенных в исследование № 2..............................................................94

3.3.6. Профиль супругов пациенток, включенных в исследование №

2....................................................................................96

3.4. Стимуляция суперовуляции, фолликулогенез, оогенез у пациенток исследуемых групп......................................................96

3.4.1. Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в исследуемых группах..................................99

3.5. Оценка ролиразличных методов оплодотворения при наличии дефектов ДНК сперматозоидов по результатам PGS..........................101

3.5.1. Клинико-анамнестическая,социально-экономическая и возрастная характеристики включенныхв исследование № 3 супружеских пар...............................................................101

3.5.2. Гормональный профиль пациенток, включенных в исследование № 3..............................................................103

3.5.3. Профиль супругов пациенток, включенных в исследование № 3...................................................................................................105

3.6 Сравнительный анализ данных раннего эмбриогенеза и исходов

циклов ЭКО у пациенток..........................................................105

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................110

ВЫВОДЫ..........................................................................................117

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..................................................119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................123

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Усовершенствование программ экстракорпорального оплодотворения с применением современных методик отбора сперматозоидов»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Проблема бесплодия супружеских пар на сегодняшний день перестала быть только медицинской проблемой и приобрела социальное, демографическое и даже экономическое значение. Непрерывное совершенствование методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) позволило значительно расширить показания к их использованию и в связи с этим проводить лечение различных форм как женского, так и мужского бесплодия. На протяжении длительного времени бесплодие связывалось в большей степени с проблемами в женской репродуктивной системе. Однако согласно данным ряда последних исследований, мужской фактор занимает среди причин бесплодия в браке от 30 до 50% [1,2].

Благодаря внедрению такого метода как интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит (ИКСИ) у мужчин с тяжелым бесплодием появилась возможность рождения родного в генетическом отношении потомства. Однако, поскольку при проведении процедуры ИКСИ минуются некоторые этапы отбора сперматозоидов, осуществляемые in vivo, а некоторые шаги существенно отличаются от физиологического процесса, возникают сомнения в безопасности этого метода [3]. Некоторые исследователи утверждают, что ИКСИ может увеличить риск оплодотворения ооцита сперматозоидом с генетическими или функциональными аномалиями [4,5], поскольку отбор сперматозоидов при ИКСИ основан исключительно на микроскопической оценке их подвижности и морфологии. Зачастую возникновение генетических аномалий эмбрионов, полученных при помощи ИКСИ, как и причины невынашивания беременности после проведения данной процедуры, оказываются обусловленными наличием повреждений в генетическом материале сперматозоида, использованного для оплодотворения [6,7]. Данные сведения ставят под сомнение целесообразность отбора сперматозоидов для ИКСИ лишь по таким параметрам, как их морфология и подвижность. Кроме того, многочисленные исследования описывают повышение

частоты количественных хромосомных аббераций de novo [8], цитогенетически выявляемых структурных хромосомных аббераций [9], хромосомных анеуплоидий [10] и дисомии половых хромосом [11] в эмбрионах, развивающихся после применения ИКСИ.

Имеющиеся данные позволяют предположить, что отбор сперматозоидов для ИКСИ является крайне важным в улучшении качества эмбрионов, их жизнеспособности и, соответственно, результатов лечения бесплодия с помощью ВРТ.

В женском организме природой предусмотрен главный механизм селекции функционально компетентных сперматозоидов во время оплодотворения in vivo, который обеспечивается окружающими ооцит клетками кумулюса и блестящей оболочки, основным компонентом которых является гиалуроновая кислота. Сквозь данные барьеры может проникнуть лишь сперматозоид, содержащий целостную ДНК, в то время как при фрагментированном геноме шансы оплодотворить яйцеклетку минимальны.

Методика отбора сперматозоидов по связыванию с гиалуроновой кислотой (ПИКСИ) представляется перспективной и представляет большой интерес. Понимание физиологических основ связывания сперматозоидов с гиалуроновой кислотой было расширено посредством изучения биохимических маркеров развития и функций сперматозоидов человека. В связанных с гиалуроновой кислотой сперматозоидах по сравнению с аналогичными параметрами несвязанных сперматозоидов усилены значимые маркеры корректного развития [12]. Наиболее важным представляется наблюдаемое в связанных с гиалуроновой кислотой сперматозоидах снижение частоты хромосомных анеуплоидий по сравнению со сперматозоидами без связывания [13]. Совокупное воздействие фрагментации ДНК и нарушения ядерного и цитоплазматического созревания сперматозоидов оказывают негативное влияние на развитие эмбриона.

Имеющиеся в литературе данные относительно эффективности ПИКСИ противоречивы. В ряде крупных исследований отмечена положительная

динамика по частоте наступления беременности и улучшению качества полученных в результате лечения эмбрионов [14,15].

В 2013 году в многоцентровом двойном слепом рандомизированном контролируемом исследовании также было продемонстрировано статистически значимое улучшение клинических результатов при использовании ПИКСИ, а именно - повышение частоты имплантации и наступления беременности наряду со снижением потерь беременности до 12 недель. Использование феномена связывания сперматозоидов с гиалуронатом способствует селекции зрелого, функционально компетентного сперматозоида с целостной ДНК, снижая, таким образом, потенциальные риски возникновения побочных эффектов, оказываемых вкладом отцовского генома в развитие эмбриона [16].

Вместе с тем, в ряде публикаций приводятся сведения об отсутствии различий в частоте оплодотворения и наступления беременности после использования гиалуронат-связанных сперматозоидов для ИКСИ, что может быть обусловлено малой выборкой пациентов, участвовавших в данных исследованиях [17,18,19].

В одной из публикаций указывается на отсутствии различий в проценте оплодотворения ооцитов как связавшимися, так и несвязавшимися с ГК сперматозоидами [20]. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным и перспективным определение значимости физиологической селекции сперматозоидов в исходах программы ЭКО и отработка показаний к ее использованию.

Цель исследования:

Оптимизация и индивидуализация программ вспомогательных репродуктивных технологий при использовании современных методик отбора сперматозоидов с учетом оценки процента фрагментации ДНК сперматозоидов, параметров спермограммы супруга, а также результатов преимплантационного генетического скрининга.

Задачи исследования:

1. Провести анализ данных анамнеза, параметров клинического и

гормонального статуса пациенток, показателей фертильности их супругов для определения метода оплодотворения в циклах ЭКО;

2. Проанализировать показатели раннего эмбриогенеза, частоту наступления и исходы беременностей у супружеских пар с патозооспермией в зависимости от применения различных методик отбора сперматозоидов в программе ЭКО;

3. Определить связь между показателями спермограммы и целостностью ДНК сперматозоидов, а также эмбриологическими параметрами (процент оплодотворения ооцитов; процент бластуляции), частотой наступления и исходами беременностей при различных методиках отбора сперматозоидов;

4. Оценить корреляцию между целостностью ДНК сперматозоидов в эякуляте и результатами предимплантационного генетического скрининга на эмбрионах, полученных в программах ЭКО с различными методиками отбора сперматозоидов;

5. Определить показания к использованию ПИКСИ на основании полученных клинических и эмбриологических данных и разработать алгоритм дифференцированного подхода к лечению супружеских пар с мужским фактором бесплодия при использовании методов ВРТ.

Научная новизна

В результате проведенного исследования была оценена корреляция параметров развернутой спермограммы и фрагментации ДНК сперматозоидов, оценена связь нарушений в целостности ДНК сперматозоидов и типа оплодотворения ооцитов с результатами предимплантационного генетического скрининга, определена значимость ПИКСИ в исходах программ ВРТ и установлена связь между целостностью ДНК сперматозоидов в эякуляте и клиническими исходами в программах ВРТ в зависимости от типа отбора сперматозоидов. Патогенетически обосновано применение методики ПИКСИ у супружеских пар с отклонениями в показателях спермограммы и дефектами в структуре спермальной ДНК.

Практическая значимость работы.

Отбор сперматозоидов для ИКСИ является крайне важным в улучшении качества эмбрионов, их жизнеспособности и, соответственно, результатов лечения бесплодия с помощью ВРТ. В данном исследовании была показана положительная роль физиологической селекции сперматозоидов на показатели раннего эмбриогенеза в программах ВРТ, частоту имплантации, наступления клинической беременности и ранних репродуктивных потерь при использовании методов ВРТ. Определены показания к использованию ПИКСИ в программах ВРТ и разработан персонализированный алгоритм ведения супружеских пар с фрагментацией ДНК сперматозоидов более 15 %.

Представленные в работе практические рекомендации дадут возможность клиницистам изменить подход в лечении супружеских пар с мужским фактором бесплодия и впоследствии будут способствовать улучшению результативности методов ВРТ, снижению количества репродуктивных потерь, а также рождению здоровых детей с меньшими рисками развития внутриутробных пороков развития, связанных с хромосомной патологией.

Положения, выносимые на защиту

1. У супружеских пар с различными видами патозооспермии и наличием фрагментации ДНК сперматозоидов более 15 % применение методики «физиологический» селекции мужских гамет перед ИКСИ повышает частоту имплантации, наступления клинической беременности, процент живорождения в программах ЭКО, а также снижает процент репродуктивных потерь.

2. Выявление фрагментации ДНК сперматозоидов более 26,8 % является значимым неблагоприятным фактором наступления беременности в программе ЭКО при использовании стандартного метода оплодотворения и позволяет рекомендовать использование метода оплодотворения PICSI для данной категории супружеских пар.

3. Частота хромосомной патологии эмбрионов, полученных в цикле ВРТ в группе супружеских пар с фрагментацией ДНК сперматозоидов > 15%, коррелирует с методикой отбора мужских половых гамет для оплодотворения ооцитов. В группе, где проводилась процедура ИКСИ со стандартным визуальным отбором сперматозоидов, анеуплоидии встречались в 1,5 раза чаще, чем в группе с отбором сперматозоидов по способности к связыванию с гиалуроновой кислотой перед интрацитоплазматической инъекцией в ооцит.

4. Наличие у супружеской пары фрагментации ДНК сперматозоидов более 15% должно являться показанием для проведения программы ЭКО/PICSI и преимплантационного генетического скрининга.

Личный вклад автора Соискатель лично принимал участие в выборе научного исследования, в постановке цели, формировании задач настоящего исследования, участвовал в сборе материала, интерпретации результатов параметров спермограммы и показателей целостности ДНК сперматозоидов, в анализе, обобщении и обработке полученных данных с помощью статистических расчетов. Автор лично занимался лечением пациенток на различных этапах цикла ЭКО с ПЭ, анализировал и научно интерпретировал полученные результаты настоящего исследования.

Соответствие диссертации паспорту полученной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты настоящего исследования соответствуют пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация материалов диссертации Основные положения и результаты настоящей работы были доложены на XXVI международной конференции РАРЧ "Репродуктивные технологии сегодня и завтра" (Москва,2016),на XVII Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2016), на XXVII международной конференции РАРЧ "Репродуктивные технологии сегодня и завтра" (Москва, 2016).

Работа рассмотрена на межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия имени Б.В. Леонова (05.05.17) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НМИЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (15.05.17).

Внедрение результатов настоящего исследования в практическую работу

Результаты исследования внедрены и используются в клинической работе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия имени Б.В.Леонова ФГБУ «НМИЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, 4 из которых входят в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, описания и обсуждения собственных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и перечня литературы. В работе представлены 22 таблицы и 21 рисунок. Библиографический указатель состоит из 121 литературного источника, из которых 6 русскоязычных и 115 иностранных работ.

Глава 1. ЗНАЧИМОСТЬ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДИК ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ В ПРОГРАММАХ ЭКО (обзор литературы)

1.1 Роль мужского фактора в структуре причин бесплодия.

Бесплодие в настоящее время является актуальной проблемой медицины и распространность его достигает около 15% [21].

На протяжении длительного времени бесплодие связывалось больше с проблемами в женской репродуктивной системе. Однако согласно данным ряда последних исследований мужской фактор занимает среди причин бесплодия в браке от 30 до 50% [1,2,22].

Качественные характеристики сперматозоида отражаются на адекватности таких последовательно происходящих механизмов как:

- хемотаксис (взаимное притяжение половых клеток, регулируемое андрогамонами со стороны сперматозоида),

- реотаксис (движение сперматозоидов против тока жидкости в маточной трубе),

- капацитация (активация сперматозоидов под воздействием факторов женского организма),

- акросомальная реакция (выделение трипсина и гиалуронидазы из акросом сперматозоида, расщепление ими лучистого венца и блестящей оболочки яйцеклетки),

- проникновение и слияние пронуклеусов, образование зиготы. Следовательно, успех оплодотворения и последующего развития эмбриона

зависит от параметров развития, ядерной и цитоплазматической компетентности мужской половой клетки.

Имеется широкий спектр состояний, способствующих развитию нарушений мужской репродукции. Это могут быть как эндогенные, так и различные экзогенные факторы. Так, к причинам нарушения мужской фертильности можно отнести: варикоцеле, инфекционно-воспалительные заболевания половых органов, различные иммунологические нарушения,

врожденные пороки развития, цирроз печени, хроническая почечная недостаточность, заболевания респираторных органов, сахарный диабет, эпидемический паротит, операции по поводу паховой грыжи, противоопухолевая лучевая терапия, гормоно- и химиотерапия, прием гипотензивных и психотропных средств, приема нтибиотиков. Также к мужскому бесплодию могут приводить сексуально-эякуляторные нарушения, обструктивная азооспермия, некрозооспермия, гипогонадизм, гиперпролактинемия [24].

Известно, что среди мужчин с репродуктивными нарушениями хромосомная патология составляет от 5 до 15%, при этом патология гоносом составляют порядка 70%, аутосомные аномалии отмечаются в 31% наблюдений. При отсутствии бесплодия хромосомные нарушения редки и составляют около 0,37% [25,26,27]. На сегодняшний день известны около 2000 генов, контролирующих процессы пролиферации и мейотическое деление сперматогониев [28,29,30,31,32].

Актуальным остается и изучение воздействия табакокурения и употребления этанола на фертильность. Meri Z.B. с рядом авторов было описано крайне негативное воздействие дыма на сперматогенез, а именно конденсацию хроматина и апоптоз в сперматозоидах [33].

Соответственно, отказ от курения, что особенно актуально в настоящее время, является одним из крайне важных условий эффективного лечения бесплодия.

Однако, даже при современных методах диагностики причины мужского бесплодия все же часто остаются неизвестными. 1.2 История внедрения ИКСИ.

Непрерывное совершенствование методов ВРТ позволило достигнуть значительного прогресса в лечении как женского, так и мужского бесплодия.

Предложенный в 1992 году в Бельгии профессором Ван Штертейгемом (VanSteirteghem) метод ИКСИ (интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит - ICSI) дал возможность преодолеть тяжелые формы бесплодия. После получения первых обнадеживающих результатов попытки

инъецировать сперматозоид в цитоплазму ооцита были повторены. Однако по результативности циклов стало ясно, что должно последовать техническое усовершенствование методики. В частности, была снижена концентрация гиалурондазы, используемой для удаления окружающих клеток кумулюса и лучистого венца, так как было обнаружено, что оолемма после проникновения сперматозоида сквозь блестящую оболочку не рвется сразу. Стали отбираться подвижные сперматозоиды с их последующей иммобилизацией. Наконец, если после прохождения зоны пеллюцида оолема не рвалась, ее аспирировали в инъекционную пипетку до момента разрыва. Эти модификации в последующем продемонстрировали увеличение частоты успешных инъекций. Однако, вскоре возникли вопросы относительно потенциальных отдаленных эффектов данной техники. При проведении процедуры ИКСИ минуются некоторые этапы отбора сперматозоидов, осуществляемые in vivo, а отдельные шаги существенно отличаются от физиологического процесса, что порождает сомнения в безопасности этого метода. Некоторые исследователи утверждают, что ИКСИ может увеличить риск оплодотворения ооцита сперматозоидом с генетическими или функциональными аномалиями, поскольку отбор сперматозоидов при ИКСИ основан исключительно на микроскопической оценке их подвижности и морфологии [5,9,34]. Зачастую генетические аномалии эмбрионов, полученных при помощи ИКСИ, как и невынашивание беременности после проведения данной процедуры, оказываются обусловленными наличием повреждений в генетическом материале сперматозоида, использованного для оплодотворения [6,7,9]. Кроме того, многочисленные исследования описывают повышение частоты количественных хромосомных аберраций de novo, цитогенетически выявляемых структурных хромосомных аберраций, хромосомных анеуплоидий и дисомии половых хромосом в эмбрионах, развивающихся после применения ИКСИ [35].

1.2.1 Селекция сперматозоидов для ИКСИ.

In vitro селекция сперматозоидов для ИКСИ является крайне важным моментом. Однако, их визуальная оценка лишь по таким критериям, как

морфология и подвижность, может допустить отбор единичного сперматозоида, несущего различного рода патологии. Существенно снизить количество аномальных сперматозоидов, в том числе с дефектами ДНК, при подготовке спермы к оплодотворению in vitro, позволяют разнообразные методики обработки спермы, широко применяющиеся в рутинной практике отделений и лабораторий, применяющих методы ВРТ. Большинство этих методик дает возможность выделить сперматозоиды, которые обладают жизнеспособностью, подвижностью и нормальной морфологией.

Однако, несмотря на это, угроза использования сперматозоида с нарушениями в структуре ДНК для ИКСИ все же сохраняется.

По данным литературы, у 75—80% спонтанных абортусов числовые аномалии хромосом возникают de novo в половых клетках родителей. Исследования ряда авторов показали, что происходит значительное снижение мейотической рекомбинации в половых клетках мужчин с субфертильными показателями спермы. У пациентов с обструктивной формой азооспермии обнаружено большое количество нарушений синаптонемного комплекса, что может приводить к анеуплоидии половых клеток и передаче хромосомных аномалий потомству. Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) в настоящее время позволяет выявлять повышенный процент нерасхождения хромосом в половых клетках мужчин с бесплодием и в серьезных случаях нарушения мейоза рекомендовать метод преимплантационной генетической диагностики (ПГД) эмбрионов в программах ВРТ, а также пренатальный скрининг при наступлении беременности. Необходимо отметить, что форма головки сперматозоида (аморфная, макроголовка и пр.) не связана с присутствием или отсутствием хромосомных аномалий в мужской половой клетке [14].

Числовые хромосомные аберрации могут присутствовать в головках сперматозоидов любого размера и любой морфологии, однако наибольший риск анеуплоидии выявлен у аморфных головок, а также у незрелых половых клеток и сперматозоидов, полученных при аспирации из придатка (PESA) или биопсии

ткани яичка(TESE). В норме основная масса клеток, несущих хромосомопатии, подвергается физиологической дегенерации, которая объясняется взаимодействием клеток Сертоли и макрофагальной системой в эпидидимисе.

Нарушения упаковки хроматина

Для выполнения своих функций сперматозоид должен содержать очень плотно упакованный хроматин, который защищен от эндогенных и экзогенных агентов (нуклеазы, свободные радикалы, мутагены). У человека в сперматозоидах экспрессируется два протамина: протамин 1 (Р1) и протамин 2 (Р2). Эти белки замещают гистоны в процессе созревания мужских половых клеток на поздних стадиях спермиогенеза (в округлых сперматидах структура хроматина аналогична таковой в соматических клетках). В зрелых сперматозоидах 85% гистонов замещены протаминами. У человека Р1 и Р2 экспрессируются в одинаковом количестве, отношение Р1/Р2 близко к 1. При оплодотворении сперматозоидами с нарушенным отношением Р1/Р2 отмечено снижение частоты наступления клинических беременностей. Аномалии упаковки хроматина влияют на процесс деконденсации. Если хроматин сперматозоида не деконденсируется, происходит нарушение доступа ооцитарных факторов, необходимых для формирования мужского пронуклеуса, таким образом, не происходит оплодотворение ооцита.

Постакросомальная пластинка

Зрелые ооциты человека находятся в состоянии заблокированного клеточного цикла на стадии метафазы второго мейотического деления (МП). После проникновения сперматозоида в ооцит происходит подавление фактора-промоутера метафазы (metaphase-promoting factor — MPF) и резкое изменение уровня Са2+, клеточный цикл возобновляется, происходит выброс кортикальных гранул, блокируется проникновение других сперматозоидов в ооцит и, таким образом, исключается вероятность полиплоидии.

При естественном оплодотворении сперматозоид после акросомальной реакции связывается постакросомальной пластинкой с оолеммой и выбрасывает факторы, активирующие ооцит. Постакросомальная пластинка — наиболее

важная структура для оплодотворения ооцита. Потеря данной структуры из апикальной области головки сперматозоида мешает нормальной активации ооцита и ведет к нарушению оплодотворения при ИКСИ.

Проксимальная центриоль

У большинства млекопитающих, включая человека, центриоль наследуется по мужскому типу от сперматозоида, оплодотворившего ооцит. Во время сперматогенеза центросома редуцируется, снижается количество перицентриолярного материала в сперматидах. Для того чтобы избежать аномального оплодотворения, материнская центросома полностью деградирует, при этом белки, которые необходимы для сборки функционирующей центросомы в период раннего эмбриогенеза (например, у-тубулин), накапливаются в ооците. В процессе оплодотворения ооцит обеспечивает зиготу белками, необходимыми для формирования микротрубочек, а мужская центриоль направляет мужской и женский пронуклеусы к центру и друг к другу.

После оплодотворения синхронно с деконденсацией хроматина из центриоли сперматозоида формируется «звезда» и возникает центр организации микротрубочек, необходимый для сближения и сингамии мужского и женского пронуклеусов. Мужская центросома затем удваивается, формируя веретено деления, обеспечивая тем самым дальнейшее развитие эмбриона. Оказывается, взаимодействие центросомы и ядра крайне важно, так как центриоль остается в тесном контакте с деконденсирующимся мужским ядром.

Нарушенная мужская центриоль в сперматозоиде при оплодотворении может приводить к нарушению сингамии, блоку дробления, а также вызывать анеуплоидию и мозаицизм эмбриона за счет неправильного расхождения хромосом при первых делениях. В случае нарушений структур, находящихся в шейке сперматозоида, ооциты могут оплодотвориться и достигнуть стадии двух пронуклеусов, но нарушение процесса сингамии приводит к блоку последующего дробления эмбриона.

Таким образом, блок эмбрионального развития может быть связан с функционально аномальной центриолью, отсутствием взаимодействия между

ядром и проксимальной центриолью во время оплодотворения, что подчеркивает роль генетической полноценности мужской половой клетки на всех этапах развития эмбриона [14].

1.2.2 Метод ИМСИ. Этапы морфологической оценки мужских половых клеток и методы микроскопии.

В 1999 году израильские ученые во главе с доктором Бенжамином Бартовым предложили новую методику отбора мужских половых клеток для оплодотворения ооцитов с использованием сканирующей электронной микроскопии - ИМСИ (mtracytoplasmic тогр^^юаПу погта1 sperm кдесйоп -интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида без морфологических аномалий).

Увеличение при ИМСИ составляет до 6 000 раз (600 оптическое и 10 -цифровое), в то время как при ИКСИ — только до 400.

Рисунок 1. Вид сперматозоидов при отборе в процедурах ICSI и IMSI (увеличение х400 и х6300).

Вопрос корректной оценки морфологии сперматозоидов и количества нормальных, способных к оплодотворению клеток в эякуляте является спорным, мнения специалистов существенно разнятся. В среднем морфологически нормальные сперматозоиды составляют 40-60 % от общей массы. При этом, согласно стандартам и нормам ВОЗ 2010 года, количество сперматозоидов с

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дударова Алина Хасановна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bashamboo A, Ferraz-de-Souza B, Lourenfo D, Lin L, Sebire NJ, Montjean D, Bignon-Topalovic J, Mandelbaum J, Siffroi JP, Christin-Maitre S, Radhakrishna U, Rouba H, Ravel C, Seeler J, Achermann JC, McElreavey K. Human male infertility associated with mutations in NR5A1 encoding steroidogenic factor 1.Am J Hum Genet. 2010 Oct 8;87(4):505-12.

2. Kathleen Hwang, John W. Weedin, and Dolores J. Lamb.The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility // TherAdv Urol. 2010 Aug; 2(4): 157-169.

3. Oehninger S. Poor responders in in vitro fertilization (IVF) therapy: the challenge continues // Facts Views Vis Obgyn. 2011; 3(2): 101-108.

4. Heytens E, Parrington J, Coward K, Young C, Lambrecht S, Yoon SY, Fissore RA, Hamer R, Deane CM, Ruas M, Grasa P, Soleimani R, Cuvelier CA, Gerris J, Dhont M, Deforce D, Leybaert L, De Sutter P. Reduced amounts and abnormal forms of phospholipase C zeta (PLCzeta) in spermatozoa from infertile men. // Hum Reprod. 2009 Oct;24(10):2417-28.

5. Paulo Navarro-Costa, JoaoGonfalves, Carlos E. Plancha. The AZFc region of the Y chromosome: at the crossroads between genetic diversity and male infertility. // Hum Reprod Update. 2010 Sep-Oct; 16(5): 525-542.

6. Zini A, Boman JM, Belzile E, CiampiA.Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI: systematic review and meta-analysis // Hum Reprod. 2008 Dec;23(12):2663-8.

7. Lucas H1, Lammers J, Pfeffer J, Aknin I, Carre-Pigeon F, Jafou N, Paulus JM, Sifer C.Conventional IVF versus ICSI in sibling oocytes: a French experience analysis for BLEFCO. // Gynecol. Obstet. Fertil. 2010 Sep;38(9):515-20.

8. Simpson JL, Lamb DJ.Genetic effects of intracytoplasmic sperm injection. // SeminReprod Med. 2001 Sep;19(3):239-49. Review.

9. Bonduelle M, Van Assche E, Joris H, Keymolen K, Devroey P, Van Steirteghem A, Liebaers I. Prenatal testing in ICSI pregnancies: incidence of chromosomal anomalies in 1586 karyotypes and relation to sperm parameters. // HumReprod. 2002 Oct;17(10):2600-14.

10. Tournaye H, Verheyen G, Albano C, Camus M, Van Landuyt L, Devroey P, Van Steirteghem A.Intracytoplasmic sperm injection versus in vitro fertilization: a randomized controlled trial and a meta-analysis of the literature. // FertilSteril. 2002 Nov;78(5):1030-7.

11. Sills ES, Tucker MJ, Palermo GD. Assisted reproductive technologies and monozygous twins: implications for future study and clinical practice. // Twin Res. 2000 Dec;3(4):217-23.

12. Huszar G, Jakab A, Sakkas D, Ozenci CC, Cayli S, Delpiano E, OzkavukcuS.Fertility testing and ICSI sperm selection by hyaluronic acid binding: clinical and genetic aspects. // Reprod Biomed Online. 2007 May;14(5):650-63.

13. Jakab A1, Sakkas D, Delpiano E, Cayli S, Kovanci E, Ward D, Revelli A, HuszarG.Intracytoplasmic sperm injection: a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploidies. // Fertil. Steril. 2005 Dec;84(6):1665-73.

14. Parmegiani L., Cognigni G. E., Filicori M. Risks in injecting hyaluronic acid non-bound spermatozoa. // Reprod Biomed Online 2010;20(3):437-8.

15. Worrilow KC, Eid S, Woodhouse D, Perloe M, Smith S, Witmyer J, Ivani K, Khoury C, Ball GD, Elliot T, Lieberman J. Use of hyaluronan in the selection of sperm for intracytoplasmic sperm injection (ICSI): significant improvement in clinical outcomes--multicenter, double-blinded and randomized controlled trial. // Hum Reprod. 2013 Feb;28(2):306-14.

16. Parmegiani L, Cognigni GE, Filicori M. Sperm selection: effect on sperm DNA quality. // AdvExp Med Biol. 2014; 791:151-72.

17. Benkhalifa M1, Montjean D, Cohen-Bacrie P, Ménézo Y Imprinting: RNA expression for homocysteine recycling in the human oocyte. // Fertil. Steril. 2010 Mar15;93(5):1585-90.

18. Arias ME, Risopatrón J, Sánchez R, Felmer. Intracytoplasmic sperm injection affects embryo developmental potential and gene expression in cattle. // Reprod Biol. 2015 Mar;15(1): 34-41.

19. Parmegiani L, Cognigni GE, Bernardi S, Troilo E, Ciampaglia W, Filicori M "Physiologic ICSI": hyaluronic acid (HA) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality. // Fertil. Steril. 2010 Feb;93(2):598-604.

20. Parmegiani L, Cognigni GE, Filicori M. Risks in injecting hyaluronic acid non-bound spermatozoa. // Reprod Biomed Online. 2010 Mar; 20(3):437-8.

21. Majumdar G, Majumdar A. A prospective randomized study to evaluate the effect of hyaluronic acid sperm selection on the intracytoplasmic sperm injection outcome of patients with unexplained infertility having normal semen parameters. // J Assist Reprod Genet. 2013 Nov;30(11):1471-5.

22. Sharma R. et al.(Lifestyle factors and reproductivehealth: takingcontrolofyourfertility // Reprod Biol Endocrinol. - 2013. - Vol. 16, №11. -P. 66.

23. Dohle G.R., Diemer T., Givercman A., A.Jungwirth , Z. Kopa, C. Krausz. // European association of Urology, 2010.

24. Miyamoto T.et al. Male infertilityanditscauses in human. // Adv.Urol.-2012. - Vol. 2012 - Mode of access: http: www.hindawi.com/j ournals/au/2012/384520.

25. Nieschlag E., Behre H.M. Male reproductivehealthanddysfunction. // Andrology. - 2ndEd.SpringerVerlag, Berlin, Chapter 5,p.83-7.

26. S.E. Hofherret al.Clinical diagnostic testing for the cytogenetic and molecular causes of male infertility: the Mayo Clinic experience. // Assist. J. Reprod.Genet. -2011. - Vol. 28, № 11. -P. 1091-1098.

27. V. Bertini, P. Simi, A. ValettoBertini. Cytogenetic study of 435 subfertile men: incidence and clinical features .J. Reprod. Med. - 2006. - Vol. 51, № 1. - P. 15-20.

28. D. Li et al. Chromosomal abnormalities in men with pregestational and gestational infertility in northeast China . J. Assist. Reprod. Genet. - 2012. -Vol. 29, № 8. - P. 829-836.

29. T.B. Hargreave.Geneticbasisofmalefertility.Br. Med.Bull. -2000. - Vol. 56, № 3. - P. 650-671.

30. Баранов В.С., Т.В. Кузнецова - Спб.: Цитогенетика эмбрионального развития человека Н-Л, 2007. - 116 c.

31. Сокур С.А. Оптимизация исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий у супружеских пар с повышенным уровнем анеуплоидии в сперматозоидах : дис. ... канд. мед. наук. - Москва, 2015.

32. Беляева Н.А., Глинкина Ж.И., Калинина Е.А. Современныеаспектыпроблемымужскогобесплодия, ассоциированного с мутацией AZF локусахромосомы Y // Акушерство и гинекология, 2012, № 82. - С. 21-27.

33. Meriet Z.B.et al. Does cigarette smoking affect seminal fluid parameters. A comparativestudy. // Oman Med.J-2013. Vol.28(1)/- P/12-15.

34. Heytens E, Partington J, Coward K, Young C, Lambrecht S, Yoon SY, Fissore RA, Hamer R, Deane CM, Ruas M, Grasa P, Soleimani R, Cuvelier CA, Gerris J, Dhont M, Deforce D, Leybaert L, De Sutter P.Reduced amounts and abnormal forms of phospholipase C zeta (PLCzeta) in spermatozoa from infertile men. // Hum Reprod. 2009 Oct; 24(10):2417-28.

35. Henkel R.R., Schill W.B. Spermpreparation for ART. // Reprod Biol Endoccrinol 2003;1:108.

36. Wilding M. et al. Intracytoplasmic injection of morphologically selected spermatozoa (IMSI) improves outcome after assisted reproduction by deselecting physiologically poor quality spermatozoa. - 2012

37. Setti A.S. et al. Intracytoplasmic morphologicallyselectedspermmjectionisbeneficial in cases of advanced maternalage: a prospective randomized study. - 2013 Sep 12.

38. Boitrelle F, B Guthauser, L Alter, M Bailly, M Bergere, R Wainer, F Vialard, M Albert, J Selva. High-magnification selection of spermatozoa prior to oocyte injection: confirmed and potential indications. ReprodBiomedOnline 2014;28:6-13

39. El Khattabi L, Dupont C, Sermondade N, Hugues JN, Poncelet C, Porcher R, Cedrin-Durnerin I, Levy R, SiferC.FertilSteril. 2013

40. Knez K, Tomazevic T, Zorn B, Vrtacnik-Bokal E, Virant-Klunl.Reprod Biomed Online. 2012

41. Sermondade N, Hafhouf E, Dupont C, Bechoua S, Palacios C, Eustache F, Poncelet C, Benzacken B, Levy R, SiferC.HumReprod. 2011.

42. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F, Kogosovsky A, Yagoda A, et al. Pregnancy rates are higher with intracytoplasmic morphologically selected sperm injection than with conventional intracytoplasmic injection. FertilSteril. 2003;

43. Hazout A, Dumont-Hassan M, Junca AM, Cohen Bacrie P, Tesarik J. High-magnification ICSI overcomes paternal effect resistant to conventional ICSI.

Reprod Biomed Online. 2006;

44. Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F. Selection of spermatozoa with normal nuclei to improve the pregnancy rate with intracytoplasmic sperm injection. N Engl J Med. 2007.

45. Berkovitz A, Eltes F, Ellenbogen A, Peer S, Feldberg D, et al. Does the presence of nuclear vacuoles in human sperm selected for ICSI affect pregnancy outcome. HumReprod. 2006)

46. Chelli MH, Albert M, Ray PF, Guthauser B, Izard V, et al. Can intracytoplasmic morphologically selected sperm injection be used to select normal-sized sperm heads in infertile patients with macrocephalic sperm head syndrome.FertilSteril. 2010).

47. Oliveira JB, Cavagna M, Petersen CG, Mauri AL, Massaro FC, et al. Pregnancy outcomes in women with repeated implantation failures after intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) ReprodBiolEndocrinol 2011.

48. Balaban B, Yakin K, Alatas C, Oktem O, Isiklar A, et al. Clinical outcome of intracytoplasmic injection of spermatozoa morphologically selected under high magnification: a prospective randomized study. ReprodBiomedOnline 2011).

49. Chelli MH, Albert M, Ray PF, Guthauser B, Izard V, et al. Can intracytoplasmic morphologically selected sperm injection be used to select normal-sized sperm heads in infertile patients with macrocephalic sperm head syndrome.FertilSteril. 2010.

50. Cayli S., Jakab A.,Ovari L. et al.Biochemical markers of sperm function:male fertility and sperm selection for ICSI.Reprod Biomed Online 2003;7(4):462-8.

51. Huszar G., Ozenci C. C., Cayli S. et al.Hyaluronic acid binding by human spermindicates cellular maturity, viability, andunreacted acrosomal status. FertilSteril2003;79 Suppl 3:1616-24.

52. Huszar G., Stone K., Dix D., Vigue L.Putative creatine kinase M-isoform in humansperm is identified as the 70-kilodalton heat shock protein HspA2. BiolReprod/ 2000;63(3):925-32.

53. Cayli S., Jakab A., Ovari L. et al.Biochemical markers of sperm function:male fertility and sperm selection for ICSI. Reprod Biomed Online 2003;7(4):462-8.

54. Huszar G., Celik-Ozenci C., Cayli S. et al. Semen characteristics after overnight shipping: preservation of spermconcentrations, HspA2 ratios, CK activity, cytoplasmic retention, chromatin maturity, DNA integrity, and sperm shape. J Androl/ 2004;25(4):593-604.

55. Jakab A., Sakkas D., Delpiano E. et al. Intracytoplasmic sperm injection: a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploidies. FertilSteril 2005;84(6):1665-73.

56. Nixon B., Mitchell L. A., Anderson A. L.et al. Proteomic and functional analysisof human sperm detergent resistantmembranes. J Cell Physiol2011;226(10):2651-65.

57. Nixon B., Aitken R. J. The biologicalsignificance of detergent-resistantmembranes in spermatozoa. J Reprodlmmunol 2009;83(1-2):8-13.

58. Gadella B. M. The assembly of a zonapellucidabinding protein complex in sperm.ReprodDomestAnim 2008;43 Suppl 5:12-9.

59. Tanphaichitr N., Carmona E., BouKhalil M. et al. New insights into spermzonapellucida interaction: involvementof sperm lipid rafts. Front Biosci2007;12:1748-66.

60. Redgrove K. A., Anderson A. L.,McLaughlin E. A. et al. Investigationof the mechanisms by which the molecularchaperone HSPA2 regulates the expressionof sperm surface receptors involved in humansperm-oocyte recognition. Mol Hum Reprod2013;19(3):120-35.

61. Redgrove K. A., Nixon B., Baker M. A.et al. The molecular chaperone HSPA2 playsa key role in regulating the expressionof sperm surface receptors that mediatesperm-egg recognition. PLoS One2012;7(11):e50851.

62. Motiei M., Tavalaee M., Rabiei F. et al.Evaluation of HSPA2 in fertile and infertileindividuals. Andrologia 2013;45(1):66-72.

63. Redgrove K. A., Anderson A. L.,Dun M. D. et al. Involvement of multimericprotein complexes in mediatingthe capacitation-dependent bindingof human spermatozoa to homologous zonaepellucidae. Dev Biol 2011;356(2):460-74.

64. . Dun M. D., Smith N. D., Baker M. A.et al. The chaperonin containing TCP1complex (CCT/TRiC) is involvedin mediating sperm-oocyte interaction. J BiolChem 2011;286(42):36875-87.

65. Kimura M., Kim E., Kang W. et al.Functional roles of mouse sperm hyaluronidases,HYAL5 and SPAM1, in fertilization.BiolReprod 2009;81(5):939-47.

66. Lathrop W. F., Carmichael E. P.,Myles D. G., Primakoff P. cDNA cloningreveals the molecular structure of a spermsurface protein, PH-20, involved in spermeggadhesion and the wide distribution of itsgene among mammals. J Cell Biol1990;111(6 Pt 2):2939-49.

67. Carmona E., Weerachatyanukul W.,Soboloff T. et al. Arylsulfatase A is presenton the pig sperm surface and is involvedin sperm-zona pellucida binding. Dev Biol2002;247(1):182-96.

68. Tantibhedhyangkul J., Weerachatyanukul W.,Carmona E. et al. Role of sperm surfacearylsulfatase A in mouse sperm - zonapellucidabinding. BiolReprod2002;67(1):212-9.

69. Cherr G. N., Yudin A. I., Overstreet J. W.The dual functions of GPI-anchored PH-20:hyaluronidase and intracellular signaling.Matrix Biol 2001;20(8):515-25.

70. Ganguly A., Bansal P., Gupta T. et al."ZP domain" of human zona pellucid glycoprotein-1 binds to human spermatozoaand induces acrosomal exocytosis. ReprodBiolEndocrinol 2010;8:110.

71. Xu H., Liu F., Srakaew N. et al.Sperm arylsulfatase A binds to mZP2 andmZP3 glycoproteins in a nonenzymaticmanner. Reproduction 2012;144(2):209-19.

72. Reitinger S., Laschober G. T., Fehrer C.et al. Mouse testicular hyaluronidase-likeproteins SPAM1 and HYAL5 but notHYALP1 degrade hyaluronan. Biochem J2007;401(1):79-85.

73. Morin G., Sullivan R., Laflamme I. et al.SPAM1 isoforms from two tissue origins aredifferentially localized within ejaculated bullsperm membranes and have different rolesduring fertilization. BiolReprod2010;82(2):271-81.

74. Worrilow K. C., Eid S., Woodhouse D.et al. Use of hyaluronan in the selectionof sperm for intracytoplasmic sperm injection(ICSI): significant

improvement in clinicaloutcomes - multicenter, double-blinded andrandomized controlled trial. Hum Reprod2013;28(2):306-14.

75. Huszar G., Ozenci C. C., Cayli S. et al.Hyaluronic acid binding by human spermindicates cellular maturity, viability, andunreacted acrosomal status. FertilSteril2003;79 Suppl 3:1616-24.

76. Cayli S., Sakkas D., Vigue L. et al.Cellular maturity and apoptosis in humansperm: creatine kinase, caspase-3 and Bcl-XLlevels in mature and diminished maturitysperm. Mol Hum Reprod 2004;10(5):365-72.

77. Parmegiani L., Cognigni G. E.,Bernardi S. et al. "Physiologic ICSI":hyaluronic acid (HA) favors selectionof spermatozoa without DNA fragmentationand with normal nucleus, resultingin improvement of embryo quality. FertilSteril 2010;93(2):598-604.

78. Benchaib M., Braun V., Lornage J. et al.Sperm DNA fragmentation decreasesthe pregnancy rate in an assistedreproductive technique. Hum Reprod2003;18(5): 1023-8.

79. Virro M. R., Larson-Cook K. L.,Evenson D. P. Sperm chromatin structureassay(SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, andongoing pregnancy in in vitro fertilization andintracytoplasmic sperm injection cycles. FertilSteril 2004;81(5): 1289-95.

80. Seli E., Sakkas D. Spermatozoal nucleardeterminants of reproductive outcome:implications for ART. Hum Reprod Update2005;11(4):337-49.

81. Zini A., Borman J. M., Belzile E.,Ciampi A. Sperm DNA damage is associatedwith an increased risk of pregnancy lossafter IVF and ICSI: Systematic reviewand meta-analysis. Hum Reprod2008;23(12):2663-8.

82. Prinosilova P., Kruger T., Sati L. et al.Selectivity of hyaluronic acid binding forspermatozoa with normal Tygerberg strictmorphology. Reprod Biomed Online2009;18(2): 177-83.

83. Tarozzi N., Nadalini M., Bizzaro D. et al.Sperm-hyaluronan-binding assay: clinicalvalue in conventional IVF under Italian law.Reprod Biomed Online 2009;19 Suppl 3:35-43.

84. Razavi S. H., Nasr-Esfahani M. H.,Deemeh M. R. et al. Evaluation of zeta and HA-binding methods for selectionof spermatozoa with normal morphology,

85. . Yagci A., Murk W., Stronk J., Huszar G. Spermatozoa bound to solid statehyaluronic acid show chromatin structurewith high DNA chain integrity: an acridineorange fluorescence study. // J Androl 2010; 31(6):566-72.

86. Worrilow K. C., Eid S., Matthews J. et al.Multi-site clinical trial evaluating PICSI,a method for selection of hyaluronan boundsperm (HBS) for use in ICSI: improvedclinical outcomes. // Hum Reprod 2010; 25 (Suppl 1) :i7.

87. Parmegiani L., Cognigni G. E.,Ciampaglia W. et al. Efficiency of hyaluronicacid(HA) sperm selection. J Assist ReprodGenet 2010;27(1):13-6.

88. Van Den Bergh M., Fahy-Deshe M., Hohl M. K. Pronuclear zygote score followingintracytoplasmic injectionof hyaluronan-bound spermatozoa: a prospective randomized study. // Reprod Biomed Online 2009;19(6):796-801.

89. Sanchez M., Aran B., Blanco J. et al.Preliminary clinical and FISH results on hyaluronic acid sperm selectionto improve ICSI. // Hum Reprod 2005;20(Suppl 1): i200.

90. Aitken R.J., Krausz C. Oxidative stress, DNA damage and Y chromosome. // Reproduction 2001; 122(4):497-506.

91. Agarwal A., Said T.M. Role of spermchromatin abnormalities and DNA damagein male infertility. // Hum Reprod. 2003;19(4):331-45.

92. Benchaib M., Braun V., Lornage J. et al.Sperm DNA fragmentation decreases thepregnancy rate in an assisted reproductivetechnique. // Hum Reprod 2003;18(5):1023-8.

93. Carrell D.T., Liu L., Peterson C.M. et al.Sperm DNA fragmentation is increased incouples with unexplained recurrent pregnancyloss. // Arch Androl 2003; 49(1):49-55.

94. Giwercman A., Richthoff J., Hj0llund H.et al. Correlation between sperm motility andsperm chromatin structure assay parameters. // Fertil. Steril 2003;80(6): 1404-12.

95. Henkel R., Kierspel E., Hajimohammad M.et al. DNA fragmentation of spermatozoa andassisted reproduction technology. // Reprod Biomed Online 2003;7(4):477-84.

96. Wang X., Sharma R.K., Sikka S.C. et al.Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNAdamage in patients with male factor infertility. // Fertil. Steril 2003;80(3):531-5.

97. Henkel R., Hajimohammad M., Stalf T.et al. Influence of deoxyribonucleic aciddamage on fertilization and pregnancy. // Fertil Steril 2004; 81(4):965-72.

98. Virro M.R., Larson-Cook K.L., Evenson D.P. Sperm chromatin structure assay(SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and on going pregnancy in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. // Fertil. Steril 2004; 81 (5): 1289-95.

99. Seli E., Sakkas D. Spermatozoal nucleardeterminants of reproductive outcome: implications for ART. // Hum Reprod Update 2005; 11 (4):337-49.

100. Seli E., Gargner D.K., Schoolcraft W.B.et al. Extent of nuclear DNA damagein ejaculated spermatozoa impacts onblastocyst development after in vitro fertilization. // Fertil. Steril 2004; 82 (2):378-83.

100. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. 4-е изд. / Пер. с англ. Р. А. Нерсеяна -М.: МедПресс, 2001. 144 с.

101. Oldereid N.B., Angelis P.D., WigerR.,Clausen O.P. Expression of Bcl-2 familyproteins and spontaneous apoptosis in normalhuman testis. // Mol Hum Reprod 2001; 7(5): 403-8.

102. Boissonneault G. Chromatin remodelingduring spermiogenesis: a possible role for thetransition proteins in DNA strand break repair. // FEBS Lett 2002;514(2-3): 111-4.

103. Govin J., Caron C., Lestrat C. et al.The role of histones in chromatin remodelingduring mammalian spermiogenesis. // Eur J. Biochem 2004; 271 (17). -P. 3459-69.

104. Barnes F., Rabara F., Murphy A. et al.Live births after IVF in men with a DNAfragmentation index of 30% or greateras determined by the sperm chromatinstructure assay (SCSA™).

105. Buyalos R., Hubert G., Schiewe M.C.Poor fertility predictive value of the spermchromatin structure assay (SCSA)is neutralized by sperm injection: case studies. // Fertil Steril 2004;81:(Suppl 3):27-8.

106. Маркова Е.В., Замай А.С. Фрагментация ДНК в сперматозоидах человека. // Проблемы репродукции 2006;(4):42-50.

107. Шильникова Е.М., Мазилина М.А.,Федорова И.Д. Нарушение целостностиДНК сперматозоидов человека: причины,методы исследования, влияние на исход программ ВРТ (обзор литературы). // Медицинская генетика. 2014

108. Bradley C.K. et al. Intervention improves assisted conception intracytoplasmic sperm injection outcomes for patients with high levels of sperm DNA fragmentation: a retrospective analysis. // Andrology. 2016 Sep;4(5):903-10.

109. Preimplantation genetic screening for abnormal number of chromosomes (aneuploidies) in in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection / M. Twisk [et al.] // Cochrane Database Syst. Rev. - 2011.- № 2.

110. Comparison of the aneuploidy frequency in embryos derived from testicular sperm extraction in obstructive and non-obstructive azoospermic men / P. Platteau [et al.] // Hum. Reprod. - 2004.- Vol. 19, № 7. - P. 1570-1574.

111. Chromosomal abnormalities in embryos derived from testicular sperm extraction / S. Silber [et al.] // Fertil. Steril. - 2003. - Vol. 79, № 1. - P. 30-38.

112. The role of preimplantation diagnosis for aneuploidies / L. Gianaroli [et al.] // Reprod. BioMed.Online. - 2002. - Vol. 4, № 3. - P. 31-36.

113. Munne S. Preimplantation genetic diagnosis of numerical and structural chromosomal abnormalities / S. Munne // Reprod. Biomed.Online. - 2002. - Vol. 4, № 3. - P. 183-96.

114. Munne S. Differences in chromosome susceptibility to aneuploidy and survival to first trimester/ S. Munne // Reprod. Biomed. Online. - 2004. - Vol. 8,

№1 - P. 183-196.

115. Современные подходы к использованию методов ВРТ у пациенток с бесплодием / К. Г. Серебренникова [и др.] // Репродуктивные технологии сегодня и завтра : матер. XVIII ежегод. междунар. конф. РАРЧ. -Самара, 2008. - С. 18-19.

116. Современные технологии лечения бесплодия у женщин с оперированными яичниками / К. Г. Серебренникова [и др.] // Международный журнал экспериментального образования. - 2010. - № 9. - С. 115-117.

117. Alviggi, C. Hormonal, functional and genetic biomarkers in controlled ovarian stimulation: tools for matching patients and protocols / C. Alviggi, P. Humaidan, D. Ezcurra // Reprod. Biol. Endocrinol. - 2012. - Vol. 10. - P. 9.

118. Bosch, E. Individualised controlled ovarian stimulation (iCOS): maximising success rates for assisted reproductive technology patients / E. Bosch, D. Ezcurra // Reprod. Biol. Endocrinol. - 2011. - Vol. 9. - P. 82.

119. Conventional IVF as a laboratory strategy to rescue fertility potential in severe poor responder patients: the impact of reproductive aging / P. G. Artini [et al.] // Gynecol. Endocrinol. - 2013. - Vol. 29, № 11. - P. 997-1001.

120. Gearhart, J. In vitro fertilization, the Nobel Prize, and human embryonic stem cells / J. Gearhart, C. Coutifaris // Cell Stem Cell. - 2011. - Vol. 8, № 1. - P. 12-15.

121. Genetic predictors of controlled ovarian hyperstimulation: where do we stand today? / S. Altmae [et al.] // Hum. Reprod. Update. - 2011. - Vol. 17, № 6. -P. 813-828.