Укорочение длины теломерных районов ДНК при иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояниях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Борисов, Вячеслав Игоревич

• Борисов, Вячеслав Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Борисов, Вячеслав Игоревич

1.ВВЕДЕНИ Е.

1.1 Актуальность.

1.2 Цель исследования.

1.3 Задачи исследования.

1.4 Положения, выносимые на защиту.

1.5 Научная новизна результатов работы.

1.6 Практическая и теоретическая значимость работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Теломерная теория старения.

2.1.1 Лимит Хейфлика и «проблема» концевой недорепликации ДНК.

2.1.2 Строение теломер.

2.1.3 Динамика длины теломер в норме.

2.2 Теломераза.

2.3 Патологические состояния, ассоциированные или вызванные укорочением теломерный районов ДНК.

2.3.1 Длина теломер при онкологических заболеваниях.

2.3.2 Лимфопролиферативные заболевания.

2.3.3 Трансплантация костного мозга.

2.4 Иммуностарение.

2.5 Патогенез заболеваний, связанных с патологией иммунной системы и динамика длины теломер в лейкоцитах при этих заболеваниях.

2.5.1 Аутоиммунные заболевания (Ревматоидный артрит).

2.5.1.1 Динамика длины теломер в лейкоцитах при ревматоидном артрите

2.5.2 Атопия.

2.5.2.1 Бронхиальная астма (БА)

2.5.2.2 Атопический дерматит

2.5.3 Иммунодефицит (ВИЧ инфекция).

2.5.3.1 Динамика длины теломер в лимфоцитах при ВИЧ инфекции.50 2.6 Методы измерения длины теломер.

2.6.1 Southern Blotting.

2.6.2 FISH метод (fluorescence in situ hybridization).

2.6.3 Flow-FISH (flow cytometry and fluorescence in situ hybridization)

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:.

3.1 Характеристика обследованных больных.

3.1.1 Ревматоидный артрит.

3.1.2 Атопический дерматит.

3.1.3 Бронхиальная астма.

3.1.4 ВИЧ.

3.2 Flow-FISH.

3.2.1 Метод получения лейкоцитов периферической крови.

3.2.2 Получение мышиных спленоцитов.

3.2.3 Получение мышиных тимоцитов.

3.2.4 Оценка относительной длины теломер (ОДТ).

3.2.5 Оценка абсолютной длины теломер в субпопуляции лимфоцитов

3.2.6 Измерение длины теломер в субпопуляциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов.

3.2 Southern Blotting.

3.2.1 Заливка клеток в блочки и их обработка.

3.2.2 Гидролиз ДНК в блочках и пульс-форез.

3.2.3 Саузерн-блот гибридизация.

3.3 Статистическая обработка данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1 Метод Flow-FISH для измерения относительной длины теломер.

4.2 Модифицирование метода для измерения длины теломер в парах нуклеотидов (п.н.).

4.3 Длина теломер в субпопуляциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов.

4.3.1 Ревматоидный артрит.

4.3.2 ВИЧ инфекция.

4.3.3 Атопический дерматит.

4.3.4 Бронхиальная астма.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

5.1 Метод-Flow-FISH.

5.2 Результаты по длине теломер в группе доноров.

5.3 Ревматоидный артрит.

5.4 Атопический дерматит.

5.5 Бронхиальная астма.

5.6 ВИЧ инфекция.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Укорочение длины теломерных районов ДНК при иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояниях»

1.1 Актуальность

После установления связи ограниченного количества делений клеток в культуре, так называемого предела Хейфлика, из-за критического сокращения теломерных районов ДНК (теломер) в результате проблемы концевой недорепликации ДНК, теломеры стали рассматриваться как "митотические часы" клетки и это привело к взрывообразному изучению данного феномена. Была установлена прямая зависимость между длиной теломерных районов ДНК и максимальным количеством делений клетки. Было показано, что при длине теломер, менее чем 2 тысячи пар нуклеотидов (тыс.п.н.) клетка выходит из клеточного цикла и больше уже не способна делиться, с последующей, как правило, скорой гибелью в результате апоптоза (Allsop R.C., 1992). Во множестве работ была показана обратная связь между длиной теломер и возрастом (Harley С., 1990, Frenck R.W., 1998, Rufer N., 1999). Укорочение теломер происходит во всех соматических клетках организма (Cherif Н., 2003), включая и лейкоциты крови, в то время как в стволовых клетках, а также в клетках некоторых опухолевых линий, длина теломер не изменяется, что происходит за счет активности в недавнем времени открытого фермента теломеразы (Blackburn Е.Н., 1992, Counter С.М., 1992). В настоящий момент длина теломерных районов ДНК в соматических клетках рассматривается как показатель их пролиферативного потенциала или как показатель "состаренности" клетки (Allsopp R.C., 1992, Weng N.-P., 1995, Effros R.B., 1996). Соответственно, при исследовании любых процессов, связанных с клеточной активностью, пролиферацией и апоптозом, длина теломер становится одним из важных функциональных показателей.

Для такой системы как иммунная характерна высокая пролиферативная активность, как за счет постоянного клеточного обновления, так и за счет массивной пролиферации в ответ на различные антигены. Соответственно, сокращенная длина теломер может стать ограничением к адекватному уровню пролиферации в ответ на антиген или для нормального клеточного обновления.

Согласно сказанному выше представляется актуальным измерение такого показателя, как длина теломер при исследовании иммунной системы, как в норме, что позволит узнать качественные изменения в системе с возрастом, так и при патологии, что даст понимание патогенеза заболевания, направление его развития, а также изменений, происходящих с самой иммунной системой. Следует заметить, что из-за разнородности по качественному и функциональному составу, измерение теломер необходимо проводить как на популяционном, так и на субпопуляционном уровне.

Получено огромное количество информации по динамике длины теломер в лейкоцитах крови, как в норме, так и при различных заболеваниях инфекционной и онкологической природы (Counter С.М., 1995, Effros R.B., 1996, Maruyama Y., 1997, Palmer L.D., 1997), но существует мало данных при заболеваниях, связанных с патологией самой иммунной системы. Из-за высокой частоты встречаемости заболеваний атопического и аутоиммунного генеза, а также синдрома приобретенного иммунодефицита представляется актуальным и несущим большой научный интерес получение новых и полноценных данных по динамике длины теломер в лейкоцитах периферической крови при данных заболеваниях, связанных с патологией иммунной системы.

Существует несколько методов измерения длины теломер, но все они достаточно длительны и громоздки, имеют свои преимущества и недостатки, разделить которые можно на две основные категории: либо необходимо разрушение клеток для выделения ДНК, либо метод не позволяет оценивать большую выборку одной популяции клеток. При исследовании иммунной системы необходим принципиально новый метод, который бы обладал следующими особенностями: во-первых, не было необходимости разрушения клеток для выделения ДНК, так как необходимо измерение длины теломер in situ, во-вторых, дифференцировка по поверхностным антигенам, и в-третьих, большое количество исследуемых клеток за минимальное время. Таким условиям удовлетворяет метод Flow-FISH - гибридизация in situ в клетках с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. При исследовании клеток периферической крови с помощью проточной цитометрии, по двух параметрам: размеру клетки и ее плотности, можно разделить все ядерные клетки на три популяции: лимфоциты, моноциты и гранулоциты без использования флуоресцентных меток. В настоящий момент при использовании метода Flow-FISH такое разделение популяций было невозможным, получали только популяцию лимфоцитов и популяцию моноцитов и гранулоцитов совместно. Возможно, благодаря этому недостатку flow-FISH, а также невозможности оценки большого количества клеток с помощью других методов, исследование длины теломер в моноцитах не было проведено ни в группе здоровых доноров, ни при какой либо патологии. Исходя из этого, представляется актуальным модернизация метода для получения возможности исследования длины теломер в моноцитах.

Таким образом, исследование динамики длины теломер лейкоцитов периферической крови, как в норме, так и при заболеваниях, связанных с патологией иммунной системы с помощью модернизированного метода Flow-FISH может помочь более полно понять процессы, происходящие в самой иммунной системе, и объяснить некоторые звенья патогенеза заболеваний.

1.2 Цель исследования - исследовать взаимосвязь изменения длины теломерных районов ДНК в иммунокомпетентных клетках с этиологией и патогенезом заболеваний, связанных с аутоиммунными, аллергическими и иммунодефицитными состояниями.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Борисов, Вячеслав Игоревич

7. ВЫВОДЫ

1. Разработанная модификация метода Flow-FISH дает возможность одновременно исследовать суммарное число теломерных повторов ДНК всех популяций лейкоцитов периферической крови: лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, а также субпопуляций лимфоцитов, дифференцированных по поверхностным антигенам.

2. С возрастом у здоровых доноров происходит постепенное сокращение теломер во всех популяциях иммунокомпетентных клеток, включая CD4+- и С08+-лимфоциты. Соотношение длины теломер между моноцитами и гранулоцитами остается постоянным в любом возрасте, тогда как длина теломер в лимфоцитах в молодом возрасте больше, чем в моноцитах и гранулоцитах, а в пожилом возрасте - меньше.

3. У больных ревматоидным артритом укорочение теломер происходит во всех исследованных популяциях лейкоцитов периферической крови: гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах, включая CD4+- и СБ8+-клетки. Развитие анемии хронических заболеваний при ревматоидном артрите ассоциируется с более сильным сокращением теломер в CD4+- и С08+-субпопуляциях лимфоцитов.

4. У больных ВИЧ инфекцией сокращение теломер происходит в CD4+- и СБ8+-лимфоцитах. При бронхиальной астме укорочение теломер в разных субпопуляциях лимфоцитов зависит от типа астмы: при атопической форме сокращение обнаруживается в С04+-клетках, при инфекционно-зависимой - в CD4+- и СБ8+-клетках, при смешанной форме длина теломер в этих клетках остается в пределах возрастной нормы. При атопическом дерматите укорочение теломер происходит в обеих субпопуляциях лимфоцитов, в большей степени в CD4+-KneTKax.

5. Сокращение теломер в иммунокомпетентных клетках характерно для заболеваний, развивающихся на основе аутоиммунных, иммунодефицитных и аллергических состояний, происходит по разным причинам и отражает патогенетические варианты этих заболеваний, проявляясь во всех или отдельных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования длины теломерных участков ДНК иммунокомпетентных клеток человека методом Flow-FISH ограничивались субпопуляциями лимфоцитов и гранулоцитов, на наш взгляд, в основном в связи с трудностями идентификации моноцитов. Суть нашей модификации метода заключается в удалении из гибридизационной смеси клеток внутреннего контроля Эти клетки применялись в базовом методе с целью проведения гибридизации PNA-зонда с теломерными повторами ДНК исследуемых и контрольных клеток в идентичных условиях (в одной пробирке) с целью повышения точности исследования (Борисов В.И., 2006). Присутствие клеток внутреннего контроля, по нашему мнению, затрудняло идентификацию не только моноцитов, но и других клеток в исследуемой лейковзвеси, в связи с чем и сама точность исследования могла снижаться. Удаление клеток внутреннего контроля из проб позволило уверенно идентифицировать моноциты по параметрам светорассеивания после процедуры гибридизации. Более того, исследование одних и тех же образцов базовым и модифицированным методом выявило, что точность исследования (таблица 9) при использовании модифицированного метода также выше.

В качестве основного итога работы можно рассматривать положение, во-первых, о распространенности феномена укорочения теломер в иммунокомпетентных клетках при иммунопатологических процессах, в основе которых лежит аутоиммунитет, иммунодефицит и аллергия, и, во-вторых, о разных причинах и механизмах такого укорочения, заложенных в патогенезе заболеваний иммунопатологической природы. Так, в условиях лимфопении, развивающейся при ревматоидном артрите и ВИЧ-инфекции, укорочение теломер в иммунокомпетентных клетках связано, главным образом, с гомеостатической пролиферацией, восполняющей истощение пула Т-клеток. При атопической дерматите количество лимфоцитов не снижается, а укорочение теломер Т-клеток, скоре всего, связано с их массивной антигенной стимуляцией и пролиферацией, в пользу чего свидетельствует и активация теломеразы в Т-клетках при атопическом дерматите. Обнаружение укорочения теломер не только в Т-клетках, но и в моноцитах при ревматоидном артрите свидетельствует о репликативном стрессе уже на уровне плюрипотентных стволовых клеток. Это расширяет наше понимание причин развития лимфопении при ревматоидном артрите, не ограничивая его только генетическим дефектом тимопоэза. Более того, более выраженное укорочение теломер в иммунокомпетентных клетках у больных ревматоидым артритом с анемией, по сравнению с больными без анемии, прямо указывает на то, что более тяжелое течение ревматоидного артрита связано с более выраженными признаками старения Т-клеток. Данные об укорочении теломер в разных субклассах Т-клеток при разных формах бронхиальной астмы, и, в особенности, об отсутствии укорочения при смешанной форме, могут рассматриваться в качестве весомого аргумента в пользу значительных различий патогенеза разных форм бронхиальной астмы. Таким образом, другим важным итогом работы является демонстрация того, что патогенез иммунопатологических процессов находит отражение в состоянии иммунокомпетентных клеток на молекулярно-генетическом уровне.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Борисов, Вячеслав Игоревич, 2007 год

1. Адо А.Д. Общая аллергология. // М, Медицина.-1978.

2. Борисов В.И., Кожевников B.C., Сенюков В.В., Сизиков А.Э., Коненкова Л.П., Герцог О.А., Козлов В.А. Укорочение длины теломер моноцитов при ревматоидном артрите // Мед. иммунология.-2006.-Т.1.-Стр. 87-90.

3. Борисов Л.Б., Смирнова A.M. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. // М, Медицина. 1994ю.-Стр.226.

4. Докудовская С.С., Петров А.В., Донцова О.А., Богданов А.А. Теломераза необычный РНК-содержащий фермент // Биохимия.-1997.-Т.62.-№11.- Стр. 1411-1422.

5. Оловников A.M. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. // Докл. АН СССР.- 1971.- Т.201.- №6.-Стр. 1496-1499.

6. Полякова В.О., Кветной И.М., Хавинсон В.Х. Тимус и старение. //Успехи геронтол.—2001.—Т. 8.—С. 50-57.

7. Сапин М.Р., Этинген Л.Е. Иммунная система человека. // Медицина.- 1996. Стр. 304.

8. Сизиков А.Э. Клинико-иммунологическая характеристика больных РА с наличием анемии. // Мед. Иммунология.-2005. Т.7.-№5-6.-Стр.593-600.

9. Федоров С.М., Кубанова А.А., Адо В.А. // Вестн. Дерматол.Венерол.- 1996.-T.4.-CTp.33-35.

10. Aho К., Koskenvou М., Tuominen J., Kaprio J. Occurrence of rheumatoid arthritis in a nationwide series of twins. // J. Rheumatol. 1986. -Vol.13.-P. 899-902.

11. Akiyama M., Hoshi Y., Sakurai S., Yamada H., Yamada O., Mizoguchi H. Changes of telomere length in children after hematopoietic stem cell transplantation. // Bone Marrow Transplant.- 1998.-Vol.21.-P.167-171.

12. Albanell J., Bosl G.J., Reuter V.E., Engelhardt M., Franco S., Moore M.A.S., Dmitrovsky E. Telomerase activity in germ cell cancers and mature teratomas. // J. Natl. Cancer Inst.- 1999. Vol.91. - P.1321-1326.

13. Allsop R.S., Vaziri H., Pattrerson C., Goldstein S., Younglai E.V., Futcher A.B., Greider C.V. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. // PNAS USA. -1992.-Vol.89.-P.10114-10118.

14. Allsopp R.C., Vaziri H., Patterson C., Goldstein S., Younglai E.V., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. // Proc. Nat.l Acad. Sci. USA.-1992.-Vol.89(21).-P.10114-10118.

15. Aylett S.E., Atherton D.F., Preece M.A. The treatment of difficult atopic dermatitis in childhood with oral beclomethasone disprorionate // Acta Derm. Venerol. Suppl. (Stockh.). 1992 - Vol. 176. -P.123-125.

16. Baerlocher G. M., Мак J., Tien T.,. Lansdorp P.M Telomere Length Measurement by Fluorescence In situ Hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls // Cytometry.-2002.-Vol.47.-P.89-99.

17. Bartkowiak M., Kolecki P., Alkiewicz J. Activation of T lymphocytes and severity of atopic bronchial asthma in children. // Pneumonol. Alergol. Pol.- 1995.-Vol.63.-P.490-497.

18. Beyne-Rauzy O., Prade-Houdellier N., Demur C., Recher C., Ayel J., Laurent G., . Mansat-De Mas V. Tumor necrosis factor-a inhibits hTERT gene expression in human myeloid normal and leukemic cells // Blood. -2005.-Vol.l06.-P.3200-3205.

19. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres. // Nature. .-1991 .-Vol.350.-P.569-572.

20. Blackburn E.H. Telomerases. // Annu. Rev. Biochem.- 1992.-Vol.61.-P. 113-129.

21. Born J., Uthgenannt D., Dodt C., Nunninghoff D., Ringvolt E., Wagner Т., Fehm H.L. Cytokine production and lymphocyte subpopulations in aged humans. An assessment during nocturnal sleep. // Mech. Ageing. Dev.-1995.-Vol.84.-P.l 13-126.

22. Bos J.D., Sillevis Smitt J.H. Atopic dermatitis // YEADV. -1996-vol.7-P.101-114.

23. Bos J.D., Wierenga E.A., Sillevis J.H. Immune dysregulation in atopic eczema // Arch. Dermatol.-1992.-Vol.l28.-P.1509-1512.

24. Brown J.P., Wei W., Sedivy J.M. Bypass of senescence after disruption of p21CIPl/WAFl gene in normal diploid human fibroblasts. // Science.- 1997.-Vol.277.-P.831-834.

25. Brummendorf Т.Н., Maciejewski J.P., Мак J., Young N.S., Lansdorp P.M. Telomere length in leukocyte subpopulations of patients with aplastic anemia // Blood.- 2001.-Vol.97.-P.895-900.

26. Bryl E, Vallejo AN, Weyand CM, Goronzy JJ: Down-regulation of CD28 expression by TNF-alpha. J Immunol 2001, 167:32313238.

27. Cakman I., Rohwer J., Schutz R.M., Kirchner H., Rink L. Dysregulation between TH1 and TH2 T cell subpopulations in the elderly. // Mech. Ageing Dev.-1996.-Vol.87.-P.l97-209.

28. Castle S., Uyemura K., Wong W., Modlin R., Effros R. Evidence of enhanced type 2 immune response and impaired upregulation of a type 1 response in frail elderly nursing home residents. // Mech. Ageing. Dev.-1997.-Vol.94.-P.7-16.

29. Chapman A., Stewart S.J., Nepom G.T., Green W.F., Crowe D., Thomas J.W., Miller G.G. CDllb+CD28-CD4+ human T cells: activation requirements and association with HLA-DR alleles. // J. Immunol.- 1996.-Vol.l57.-P.4771-4780.

30. Cherif H., Tarry J.L., Ozanne S.E., Hales C.N. Ageing and telomeres: a study into organ- and gender-specific telomere shortening. // Nucleic Acids Research.-2003.-Vol.31.-P.1576-1583.

31. Chiu C.P., Dragowska W, Kim N.W., Vaziri H., Yui J, Thomas Т.Е., Harley C.B., Lansdorp P.M. Differential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone marrow. // Srem Cells.-1996.-Vol.l4.-P.239-248.

32. Choe H. The |3 chemokine receptors CCR3 and CCR5 facilitate infection by primary HIV l isolates. // Cell.-1996.-Vol. 85.-P.1135.

33. Cookson W.O.C.M., Sharp P.A., Faux J.A. Linkage between immunoglobulin E responses underlying asthma and rhinitis and chromosome llq. //Lancet.- 1989.-Vol.l.-P. 1292-1295.

34. Counter C.M., Botelho F.M., Wang P., Harley C.B., Bacchetti S. Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human В lymphocytes. // J. Virol. -1994.-Vol.68(5).-P.3410-3414.

35. Counter C.M., Gupta J., Harley C.B., Leber В., Bacchetti S. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematological malignancies. // Blood.-1995.-Vol.85.-P. 2315-2320.

36. Crilly A., Maiden N., Capell H.A., Madhok R. Predictive value of interleukin-1 gene polymorphism for surgery. // Ann. Rheum. Dis.-2000.-Vol.59.-P.695-699.

37. Dahse R., Fiedler W., Ernst G. Telomeres and telomerase: biological and clinical important. // Clin. Chem.- 1997.-Vol.43.-P. 708-714.

38. Deighton G.M., Wentzel J., Cavanagh G., Roberts D.F., Walker D.J. Contribution of genetic factors to rheumatoid arthritis. // Ann.Rheum.Dis.- 1992.-Vol.51 .-P. 182-185.

39. Dunham M.A., Neumann A.A., Fasching C.L., Reddel R.R. Telomere maintenance by recombination in human cells.// Nature Genet.-2000.-Vol.26.-P.447-450.

40. Effros R.B. Insights on immunological aging derived from the T lymphocyte cellular senescence model. // Exp. Gerontol.-1996.-Vol.31.-P.21-27.

41. Effros R.B. Loss of CD28 expression on T lymphocytes: a marker of replicative senescence. // Dev. Сотр. Immunol.- 1997.-Vol.21.-P.471-478.

42. Effros R.B. Replicative senescence of CD8+ T cells in HIV disease. // AIDS. -1996.-Vol.10.- P.17-22.

43. Engelhardt M., Kumar R., Albanell J., Pettengell R., Han W., Moore M.A.S. Telomerase Regulation, Cell Cycle, and Telomere Stability in Primitive Hematopoietic Cells. //Blood.-1997.- Vol 90.-P.182-193.

44. Feldmann M., Brennan F.M., Maini R.M. Role of cytokines in rheumatoid arthritis. // Annu.Rev.Immunol. -1996.-Vol.l4.-P.397-440.

45. For detection of telomeres by flow cytometry using fluorescence in situ hybridization and fluorescein-conjugated PNA probe. DACO, Denmark, 2nd edition.- 2002.

46. Franceschi C., Monti D., Sansoni P., Cossarizza A. The immunology of exceptional individuals: the lesson of centenarians. // Immunol. Today.-1995.-Vol. 16.-P. 12-16.

47. Frenck R.W., Blackburn E.H., Shannon K.M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998.-Vol.95.-P.5607-5610.

48. Friedrich U., Schwab M., Griese E.-U., Fritz P., Klotz U. Telomeres in Neonates: New Insights in Fetal Hematopoiesis // PEDIATRIC RESEARCH.- 2001.-Vol.49.-No. 2.

49. Gina M., Coviello-McLaughlin., Karen R.P. Telomere length regulation during postnatal development and ageing in Mus spretus. // Nucleic Acids Research. -1997. Vol. 25. - P.3051-3058.

50. Goronzy J.J., Weyand C.M. Review Ageing, autoimmunity and arthritis T-cell senescence and contraction of T-cell repertoire diversity -catalysts of autoimmunity and chronic inflammation. // Arthritis. Res. Ther.-2003.-Vol.5.-P.225-234.

51. Goronzy J.J., Weyand C.M. Thymic function and peripheral T-cell homeostasis in rheumatoid arthritis // Trends Immunol. 2001. -Vol.22.-P.251-255.

52. Granger M. P., Wright W. E., Shay J. W. Telomerase in cancer and aging. // Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2002.-Vol.41.-P.29-40.

53. Greeley E.H., Kealy R.D., Ballam J.M., Lawler D.F., Segre M. The influence of age on the canine immune system. // Vet. Immunol. Immunopathol. -1996.-Vol.55.-P.10.

54. Gregerson P.K., Silver J., Winchester R.J. The shared epitope hypothesis an approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis. // Arthritis Rheum. - 1987.-Vol.20.-P.1205-1213.

55. Greider C.W. Telomere length regulation. // Annu. Rev. Biochem.- 1996.-Vol.65.-P.337-365.

56. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., La nge T.de. Mammalian Telomeres End in a Large Duplex Loop // Cell.-1999.-Vol.97.-P.503-505.

57. Hanifin Y., Chan S.C. Diagnosis and treatment of atopic dermatitis //Dermatological Therapy. 1996. - Vol.1. - P.9-18.

58. Harley C., Futcher A.B., Greider C.W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. // Nature .-1990.-Vol.346.-P.866-868.

59. Hathcock K.S., Weng N., Merica R., Jenkins M.K., Hodes R. Cutting Edge: Antigen-Dependent Regulation of Telomerase Activity in Murine T Cells. // The Journal of Immunology.- 1998.-Vol.160.-P.5702-5706.

60. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. // Exp Cell Res 1965. - Vol. 37. - P.614-636.

61. Herrera E., Samper E., Martin-Caballero J., Flores J.M., Lee H.-W., Blasco M.A. Disease states associated with telomerase deficiency appear earlier in mice with short telomeres. // The EMBO Journal.-1999.-Vol. 18,-No. 11.- p.2950-2960.

62. Hiyama E., Hiyama K., Tatsumoto N., Shay J. W., Yokoyama T. Telomerase activity in human intestine. // Int. J. Oncol.- 1996.-P.449-453.)

63. Hultdin M., Gronlund E., Norrback K.F., Eriksson- Lindstrom E., Just Т., Roos G. Telomere analysis by fluorescence in situ hybridization and flow cytometry. //Nucleic Acids Res. -1998.-Vol.26.-P.3651-3656.

64. Hwang E.S., Naeger L.K., DiMaio D. Activation of endogenous growth inhibitory pathways in HeLa cervical carcinoma cells by expression of the bovine papilloma virus E2 gene. // Oncogene .-1996.-Vol.12.-P.795-803.

65. Ishikawa F. FISH goes with the flow. // Nat. Biotechnol. -1998.-Vol.16.-P. 723-724.

66. Iwama H., Ohyashiki K., Ohyashiki J. H., Hayashi S., Yahata N., Ando K., Toyama K., Hoshika A., Takasaki M., Mori M., Shay J.W.

67. Telomere length and telomerase activity vary with age in peripheral blood cells obtained from normal individuals. // Hum. Genet. -1998.-P. 102-397.

68. Johnson F.B., Sinclair D.A., Guarente L. Molecular biology of aging. // Cel.- 1999.-Vol.96.-P.291-302.

69. Judy M.Y.W., Collins K. Telomere maintenance and disease. // Lancet.- 2003.-Vol.362.-P.983-988.

70. Karlseder J., Broccoli D., Dai Y., Hardy S., de Lange T. p53-and ATM-Dependent Apoptosis Induced by Telomeres Lacking TRF2. // Science.- 1999.-Vol283.-P.1321-1325.

71. Kay A.B. Allergy and allergic diseases First of Two Parts // Engl. J. Med. -2001. - Vol. 344.- P.30-37.

72. Kim H.R., Kim Y.J., Kim H.J., Kim S.K., Lee J.H. Telomere length changes in colorectal cancers and polyps. // J. Korean. Med. Sci.-2002.-Vol.17.-P. 360-365).

73. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L., Coviello G.M., Wright W.E., Weinrich S.L., Shay J.W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. // Science.- 1994.-Vol.266.-P.2011-2015.

74. Koetz K., Bryl E., Spickschen K. et al. T cell homeostasis in patients with rheumatoid arthritis // Proc. Natl. Acad. Sci.—2000.—Vol. 97.—P. 9203-9208.

75. Langford L., Piatyszek M., Xu R., Schold S., Shay J. Telomerase activity in human brain tumours. // Lancet.-1995.-Vol.346.-P. 1267-1268.

76. Lansdorp P.M., Verwoerd N.P., van de Rijke F.M., Dragowska V., Little M.T., Dirks R.W., Rapp A.K., Tanke H.J. Heterogeneity in telomere length of human chromosome. // Hum. Mol. Genet. -1996.-Vol.5.-P.685-691.

77. Lee J.J., Kook H., Chung I.J., Kim H.J., Park M.R., Kim C.J., Nah J.A., Hwang T.J. Telomere length changes in patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation. // Bone Marrow Transplantation,-1999.-Vol.24.-P.411-415.

78. Lehtonen L., Eskola J., Vainio O., Lehtonen A. Changes in lymphocyte subsets and immune competence in very advanced age. // J. Gerontol.-1990.-Vol.45 .-P. 108-112.

79. Lighart G., Corberand J. X., Fournier C., Galanaud P., Hijmans W., Kennes В., Muller- Hermelink H. K., Steinmann G.G. Admission criteria for immunogerontological studies in man: the SENIEUR protocol. // Mech. Ageing Dev.-1984.-Vol. 28.-P.47-55.

80. Londono-Vallejo J.A., DerSarkissian H., Cazes L., Thomas G. Differences in telomere length between homologous chromosomes in humans. //Nucleic. Acids. Res.- 2001.-Vol. 29.-P.3164-3171.

81. MacGregor A.J., Sneider H., Rigby A.S., Koskenvuo M., Kaprio J., Aho K. Characterising the quantitative genetic contribution to rheumatoid artritis using data from twins. // Arthritis Rheum. -2000.-Vol.43.-P. 30-37.

82. Markovic-Plese S., Cortese I., Wandinger K.P., McFarland H.F., Martin R. CD4+CD28- costimulation-independent T cells in multiple sclerosis. // J. Clin. Invest.- 2001.-Vol. 108.-P.1185-1194.

83. Martens P.B., Goronzy J.J., Schaid D., Weyand C.M. Expansion of unusual CD4+ T cells in severe rheumatoid arthritis. // Arthritis Rheum. 1997. - Vol. 40. - P.l 106-1114.

84. Martens U.M., Zijlmans J.M.J.M., Poon S.S.S., Dragowska W., Yui J., Chavez E.A., Ward R.K., Lansdorp P.M. Short telomeres on human chromosome 17p. //Nat. Genet.- 1998.-Vol.l8.-P.76-80.

85. Maruyama Y., Hanai H., Fujita M., Kaneko E. Telomere length and telomerase activity in carcinogenesis of the stomach. // Jpn. J. Clin. Oncol.- 1997.-Vol.27.-P.216-220.

86. Matsumura Т., Zerrudo Z., Hayflick L. Senescent human diploid cells in culture: survival, DNA synthesis and morphology. // J. Gerontol.-1979.-Vol.34(3).-P.328-334.

87. McClintock B. Cytological observations of deficiencies involving known genes, translocations and an inversion in Zea mays .// Missouri. Agr. Exp. Sta. Res. Bull.-1931.-Vol. 163.-P.1-48.

88. Means R.T., Dessypris E.N., Krants S.B. Inhibition of human erythroid colonyforming units by tumor necrosis factor requires accessory cells. // J.Clin.Invest.-1990.-Vol.86.-P.538-541.

89. Menon M., Jaroslow B.N., Koesterer R. The decline of cell-mediated immunity in aging mice. // J. Gerontol. 1974. - Vol. 29. - P. 499-505.

90. Monteiro J., Batliwalla F., Ostrer H., Gregersen P.K. Shortened telomeres in clonally expanded CD28-CD8+ T cells imply a replicative history that is distinct from their CD28+CD8+ counterparts. // J. Immunol. -1996. -Vol.l556.-P.3587-3590.

91. Muller H.J. The remaking of chromosomes. // Collecting Net.-1938.-Vol.13.-P. 181-198.

92. Murasko D. M., Weiner P., Kaye D. Association of lack of mitogen induced lymphocyte proliferation with increased mortality in the elderly. // Aging: Immunology and Infectious Disease.-1988,-Vol. 1.-P.23.

93. Nagel J.E., Chrest F.J., Adler W.H. Enumeration of T lymphocyte subsets by monoclonal antibodies in young and aged humans. // J. Immunol.-1981 .-Vol. 127.-P2086-2088.

94. Notaro R., Cimmino A., Tabarini D., Rotoli В., Luzzatto L. In vivo telomere dynamics of human hematopoietic stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997.-Vol.94.-P.13782-13785.

95. Notaro R., Cimmino A., Tabarini D., Rotoli В., Luzzatto L. In vivo telomere dynamics of human hematopoietic stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. -1997.-Vol. 94.-P. 13782-137857.

96. O'Leary J. J., Fox R., Bergh N., Rodysill K. J., Hallgren H. M. Expression of the human T cell antigen receptor complex in advanced age. // Mech. Ageing. Dev.-1988.-Vol.45.-P.239-252.

97. Olesen A.B., Andersen G., Jeppesen D.L., Bern C.S., Juul S., Thestrup-Pedersen K. Thymus is Enlarged in Children with Current Atopic Dermatitis. A Cross sectional Study. // Acta Dermato-Venereologica.-2005.-Vol.85.-No.3.-P.240 243.

98. Pawelec B.G., Solana R. Immunosenescence. // Immunol. Today.-1997.-Vol.l8. P.514-516.

99. Posnett D.N., Sinha R., Kabak S., Russo C. Clonal Populations of T Cells in Normal Elderly Humans -The T Cell Equivalent to Benign Monoclonal Gammapathy. // J. Exp. Med.- 1994.-Vol.l79.-P.609-618.

100. Poynter M. E., Mu H. H., Chen X. P., Daynes R. A. Activation ofNKl .1(+) T cells in vitro and their possible role in age-associated changes in inducible IL-4 production. // Cell. Immunol.-1997.-Vol. 179.-P.22-29.

101. Radna R.L., Caton Y., Jha K.K., Kaplan P., Li G., Traganos F., Ozer H.L. Growth of immortal simian virus 40 tsA-transformed human fibroblasts is temperature dependent. //Mol. Cell. Biol. 1989.-Vol.9(7).-P.3093-3096.

102. Ramirez R.D., Wright W.E., Shay J.W., Taylor R.S. Telomerase activity concentrates in the mitotically active segments of human hair follicles. // J. Invest. Dermatol. -1997. P. 108-113.

103. Rita B.E. Replicative Senescence in the Immune System: Impact of the Hayflick Limit on T-Cell Function in the Elderly. // Am. J. Hum. Genet.-1998.-Vol.62.-P.000-000.

104. Roberts-Thomson I.C., Whittingham S., Young- Chaiyud U., Mackay I.R. Ageing, immune response and mortality. // Lancet. 1974. -Vol. 2. - P.368-370.

105. Rufer N., Dragowska W., Thornbury G., Roosnek E., Lansdorp P.M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. //Nat. Biotechnol.- 1998.-Vol.l6.-P.743-747.

106. Russo C., Cherniack E.P., Wali A., Weksler M.E. Age-Dependent Appearance of Non-Major Histocompatibility Complex-Restricted Helper T-Cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. US A.-1993.-Vol. 90.-P.l 1718-11722.

107. Saldanha S.N., Andrews L.G., Tollefsbol Т.О. Assessment of telomere length and factors that contribute to its stability. // Eur. J. Biochem. -2003.-Vol.270.-P. 389-403.

108. Savre-Train I., Gollahon L.S., Holt S.E. Clonal heterogeneity in telomerase activity and telomere length in tumor-derived cell lines. // PSEBM. -2000.-Vol.223.-P.379-388.

109. Schirmer M., Goldberger C., Wurzner R., Duftner C., Pfeiffer K.P., Clausen J., Neumayr G., Falkenbach A. Circulating cytotoxic CD8(+) CD28(~) T cells in ankylosing spondylitis. // Arthritis. Res.- 2002.-Vol.4.-P.71-76.

110. Schirmer M., Vallejo A.N., Weyand C.M., Goronzy J.J. Resistance to apoptosis and elevated expression of Bcl-2 in clonally expanded CD4+CD28- T cells from rheumatoid arthritis patients. // J. Immunol. -1998.-Vol. 161.-P. 1018-1025.

111. Schmid I., Dagarang M.D., Hausner M.A., Matud J.L., Just Т., Effros R.B., Jamieson B.D. Simultaneous flow cytometric analysis of two cell surface markers, telomere length, and DNA content. // Cytometry.-2002.-Vol.49.-P.96-105.

112. Schmidt D., Martens P.B., Weyand C.M., Goronzy J.J. The repertoire of CD4+ CD28- T cells in rheumatoid arthritis. // Mol. Med. -1996.-Vol. 2.-P.608-618.

113. Schwab R., Russo C., Weksler M. E. Altered Major Histocompatibility Complex-Restricted Antigen Recognition by T-Cells from Elderly Humans. // Eur. J. Immunol. 1992. - Vol.22. - P.2989-2993.

114. Schwab R., Szabo P., Manavalan J. S., Weksler M. E.,. Posnett D. N, Pannetier C., Kourilsky P., Even J. Expanded CD4(+) and CD8(+) T cell clones in elderly humans. // J. Immunol.-1997.-Vol. 158.-P.4493-4499.

115. Segal R., Dayan M., Globerson A., Habut В., Shearer G.M., Mozes E. Effect of aging on cytokine production in normal and experimental systemic lupus erythematosus afflicted mice. // Mech. Ageing. Dev.-1997.-Vol.96.-P.47-58.

116. Shay J., Gazdar A. J. Telomerase in the early detection of cancer. //Clin. Pathol. -1997.-Vol.50.-P. 106-109.

117. Shay J.W., Wright W.E. Quantitation of the frequency of immortalization of normal human diploid fibroblasts by SV40 large T-antigen.// Exp. Cell Res. -1989.-Vol.184.-P. 109-118.

118. Shay J.W., Wright W.E. Telomeres and telomerase in the regulation of human cellular aging. // Mol.Biol.Aging.- 1999.-Vol.44.-P. 148-158.

119. Shinkai S., Kohno H., Kimura K., Komura Т., Asai H., Inai R., Oka K., Kurokawa Y., Shephard R. J. Physical activity and immune senescence in men. // Med. Sci. Sports. Exerc.-1995.-Vol.27.-P.1516-1526.

120. Silman A.J., MacGregor A.J., Thomson W., Holligan S., Carthy D., Farhan A. Twin concordance rates for rheumatoid arthritis: results from a nationwide study. // Br. J. Rheumatol. 1993.-Vol.32.-P. 903-907.

121. Sindermann J., Kruse A., Frercks H. J., Schutz R. M., Kirchner H. Investigations of the Lymphokine System in Elderly Individuals. // Mech. Ageing. Dev. 1993.-Vol.70.-P.149-159.

122. Son N.H., Murray S., Yanovski J., Hodes R.J., Wengl N. Lineage-Specific Telomere Shortening and Unaltered Capacity for Telomerase Expression in Human T and В Lymphocytes with Age.// The Journal of Immunolog.- 2006.-Vol.l65.-P.l 191-1196.

123. Southern E.M. Long range periodicities in mouse satellite DNA. // J. Mol. Biol. -1975.-Vol. 94.-P. 51-69.

124. Tang M.L.K., Kemp A.S., Thornburn J., // Lancet.- 1994.-Vol. 344.-P.983-985.

125. Taylor R.S., Ramirez R.D., Ogoshi M., Chaffins M., Piatyszek M.A., Shay J. W. //J. Invest. Dermatol. -1996.-Vol.l06.-P.759-765.

126. Thoman M.L., Weigle W.O. The cellular and subcellular bases of immunosenescence. // Adv. Immunol. 1989. - Vol.46. - P.221-262.

127. Tielen F. J., van Vliet А. С. M., Degeus В., Nagelkerken L., Rozing J. Age-Related Changes in CD4+ T-Cell Subsets Associated with Prolonged Skin Graft Survival in Aging Rats. // Transplant. Proc. 1993. -Vol.25.-P.2872-2874.

128. Tsukahara A., Seki S., Iiai Т., Moroda Т., Watanabe H., Suzuki S., Tada Т., Hiraide H., Hatakeyama K., Abo T. Mouse liver T cells: Their change with aging and in comparison with peripheral T cells. // Hepatology. -1997.-Vol.26.-P.301-309.

129. Uehara M. и С. Kimura Uehara M, Kimura C. Acta Derm Venerol Suppl (Stockh) 1993; 73:62-3. .

130. Ulf G., Goronzy W., Koetz K., Weyand C.M., Jorg J. Perturbation of the T cell repertoire in rheumatoid arthritis // PNAS.- 1998.-Vol.95.-P. 14447-14452.

131. Vallejo A.N., Bryl E., Klarskov K., Naylor S., Weyand C.M., Goronzy J J. Molecular basis for the loss of CD28 expression in senescent T cells. // J. Biol. Chem.- 2002.-Vol.277.-P.46940-46949.

132. Vaziri H., Schachter F., Uchida I., Wei L., Zhu X., Effros R., Cohen D. Harley C.B. //Am. J. Hum. Genet.-1993.-Vol. 52.-P. 661-667.

133. Warner J.A., Miles E.A., Jones A.C. // Clin. Exp. Allergy.-1994.- Vol. 24.-P.423-430.

134. Warrington K.J., Vallejo A.N., Weyand C.M., Goronzy J.J. CD28 lossin senescent CD4+ T cells: reversal by interleukin-12 stimulation. // Blood.- 2003.-Vol.l01.-P.3543-3549.

135. Wayne S.J., Rhyne R.L., Garry P.J., Goodwin J.S. Cell-mediated immunity as a predictor of morbidity and mortality in subjects over 60. // J. Gerontol.-1990.-Vol.45.-P.45-48.

136. Weifen X., Yong L., Xingrong Z., Weizhong C., Xin Z., Zhongbing Z., Hao W. Regulation of telomerase activity by recombinant human tumor necrosis factor in vitro. II Chinese Journal of Digestive Diseases.-2001 .-Vol.2 (4).-P. 198-201.

137. Weng N., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J. Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation. //J. Exp. Med.- 1996.-P.2471-2479.

138. Weng N., Palmer L., Levine B.L., Lane H.C., June C.H., Hodes R.J. Tales of tails: regulation of telomere length and telomerase activity during lymphocyte development, differentiation, activation, and aging. // Immunol. Rev.- 1997.-Vol.l60.-P.43-54.

139. Weng N.-P. Interplay between telomere length and telomerase in human leukocyte differentiation and aging. // J.Leukoc.Biol.-2001.-Vol.70.-P.861-867.

140. Weng N.-P., Granger L., Hodes R. J. Telomere lengthening and telomerase activation during human В cell differentiation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.-Vol.94.-P. 10827-10832.

141. Weng N.-P., Levine B.L., June C.H., Hodes. R.J. Human naive and memory T lymphocytes differ in telomeric length and replicative potential. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995.-Vol.92.-P.l 1091-11094.

142. Wolthers К. C., Otto S. A., Wisman G. B. A., Fleury S., Reiss P., Kate R. W., van der Zee A. G. J., and Miedema F. Normal T-Cell Telomerase Activity and Upregulation in Human Immunodeficiency Virus-1 Infection // Blood.-1999.-Vol 93.-P.1011-1019.

143. Wu K., Higashi N., Hansen E. R., Lund M., Bang K., Thestrup-Pedersen K. Telomerase Activity Is Increased and Telomere Length Shortened in T Cells from Blood of Patients with Atopic Dermatitis and Psoriasis. //J. Immunol. -2000.-Vol.l65.-P.4742-4747.

144. Wynn R.F., Cross M.A., Hatton C. Accelerated telomere shortening in young recipients of allogeneic bone-marrow transplants. // Lancet. -1998.-Vol.351.-P.178-181.

145. Young N.T., Uhrberg M. KIR expression shapes cytotoxic repertoires: a developmental program of survival. // Trends. Immunol.-2002.-Vol.23.-P.71-75.

146. Zimmermann S., Glaser S., Ketteler R., Waller C.F., Klingmuller U., Martensa U.M. Effects of Telomerase Modulation in Human Hematopoietic Progenitor Cells. // Stem Cells .-2004.-Vol.22.-P.741-749.