Участие фитохромов A и B в регуляции устьичных движений у Pisum sativum L. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Кочетова, Галина Владимировна

• Кочетова, Галина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кочетова, Галина Владимировна

Введение.

Цель и задачи исследования.

Глава I. Обзор литературы.

1. Фитохромная система растений.'.

1.1. История открытия.

1.2. Строение и свойства фитохромов.

1.2.1. Апопротеин.

1.2.2. Хромофор.

1.2.3. Фотоконверсия.

1.2.4. Темновая реверсия.

1.2.5. Деструкция.

1.3. Функции в растении.

1.3.1. Многообразие фитохромов.

1.3.2. Типы физиологических ответов.

1.3.3. Роль фитохромов в развитии растений.

1.3.4. Пути передачи сигнала.

1.3.5. Взаимодействие с другими фоторецепторами.

1.3.6. Взаимодействие с фитогормоналш.

1.3.7. Взаимодействие с биологическими часами.

1.4. Фоторецепторы Pisum sativum L.

2. Устьичный аппарат растений.

2.1. Строение устьичного аппарата.

2.1.1. Строение эпидермалъной ткани.

2.1.2. Строение замыкающих клеток устьиц.

2.2. Эволюция устьичного аппарата.

2.3. Развитие устьичного аппарата.

2.3.1. Регуляция развития устьичного аппарата.

2.4. Транспирация.

2.5. Механизм устьичных движений.

2.5.1. Механизм открывания устьиц.

2.5.2. Механизм закрывания устьиц.

2.5.3. Общие процессы при открывании и закрывании устьиц.

2.5.4. Регуляция устьичных движений.

2.5.5. Пути передачи сигнала в замыкающих клетках.

2.6. Фоторегуляция устьичных движений.

Глава II. Объекты и методы исследования.

1. Объекты исследования и условия выращивания.

1.1. Объекты исследования.

1.2. Условия выращивания.

2. Измерение переменной флуоресценции хлорофилла.

3. Световая и флуоресцентная микроскопия.

4. Исследование изменений апертуры устьиц в ответ на освещение.

4.1. Установка.

4.2. Условия освещения.

4.3 Процедура измерений.

4.4 Расчёты.

4.5. Построение спектра действия устьичных движений.

5. Измерение низкотемпературной флуоресценции фитохромов.

5.1. Установка.

5.2. Приготовление образцов.

5.3. Процедура измерений флуоресценции и фотохимических превращений фитохромов.

5.4. Расчёт спектральных и фотохимических параметров фитохромов.

6. Представление результатов и обработка данных.

Глава III. Результаты и обсуждение.

1. Характеристика мутантов.

1.1. Зависимость морфогенеза фитохромных мутантов от условий выращивания

1.2. Аномалии строения эпидермы листа у мутанта по фитохрому В.

1.3. Собственная флуоресценция эпидермы листа.юз

1.4. Доказательства отсутствия функционального фотосинтети-ческого аппарата в замыкающих клетках устьиц бесхлорофшьного мутанта XL

1.5. Содержание и фотохимические характеристики фитохромов в этиолированных эпикотилях.

2. Исследование изменения апертуры устьиц в ответ на освещение КС и ДКС

2.1. Участие фитохромов А и В в регуляции устьичных движений в ответ на

КС и следующий за ним ДКС.

2.2. Участие фитохрома А в открывании устьиц в ответ на ДКС после темновой адаптации.

3. Спектр действия устьичных движений.

3.1. Подбор условий измерения спектра действия устьичных движений.

3.2. Спектр действия устьичных движений в ответ на КС.

3.3. Спектр действия устьичных движений в ответ на обращающий ДКС.

4. Ритмы устьичных движений на естественном фотопериоде.

5. Исследование содержания крахмала в замыкающих клетках устьиц бесхлорофильного мутанта XL-18.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие фитохромов A и B в регуляции устьичных движений у Pisum sativum L.»

В связи с принципиальной важностью работы устьичного аппарата для обеспечения циркуляции воды по растению, оптимизации газообмена и поддержания высокого уровня фотосинтеза, замыкающие клетки устьиц представляют собой сложно регулируемую высокодифференцированную полуавтономную структуру. Движения замыкающих клеток устьиц контролируются множеством внешних факторов, несущих информацию об окружающей растение среде: интенсивности, длительности и спектральном составе света, водном потенциале воздуха и почвы, температуре, концентрации углекислого газа. Внутренние сигналы, информирующие о состоянии и потребностях растительного организма, также воспринимаются замыкающими клетками: это гормональные и другие сигнальные соединения, изменения концентрации Сахаров, углекислого газа и минеральных солей в апопласте, гидравлические сигналы, свидетельствующие об оводнённости окружающих тканей. Кроме того, работа устьичного аппарата контролируется молекулярными биологическими часами.

В регуляции устьичных движений участвует большинство известных фоторецепторов. Освещение фотосинтетически активной радиацией вызывает открывание устьиц, запуская фотосинтез как в замыкающих клетках, так и в прилежащих клетках мезофилла. Активация процесса фотосинтетической ассимиляции в мезофилле приводит к снижению концентрации углекислого газа в межклетниках листа, и устьица открываются в ответ на этот сигнал (Vavasseur, Raghavendra, 2005). В результате активации процесса фотосинтеза в самих замыкающих клетках в них образуются растворимые сахара и запасается энергия, необходимая для устьичных движений (Scarth, 1932; Schwartz, Zeiger, 1984). Импортируемые из мезофилла углеводы также могут принимать участие в повышении осмотического давления в замыкающих клетках, приводящего к открыванию устьиц в ответ на освещение (Ritte et al., 1999; Stadler et al., 2003). Кроме того, в регуляции работы устьичного аппарата показано участие дополнительных рецепторов синего света: фототропинов (Kinoshita et al., 2001) и криптохромов (Мао et al., 2005), обсуждается возможная роль зеаксантина (Talbott et al., 2003) и родопсин-подобных рецепторов (Paolicchi et al., 2005). Устьичные ответы на свет УФ-Б диапазона обеспечиваются специфическим рецептором УФ-Б, молекулярная природа которого пока неизвестна (Nogues et al., 1999; Eisinger et al., 2000).

При фототропин-зависимом открывании устьиц на синем свету происходит временное повышение концентрации Са2+ в цитозоле, задействуется ряд других посредников передачи сигнала, что приводит к активации Н+-АТФаз плазмалеммы. В результате гиперполяризации плазмалеммы открываются вносящие К+|п-каналы, в замыкающие клетки входят ионы калия и вслед за ними по С17Н+-антипортерам поступают ионы хлорида. Одновременно происходит деградация крахмала в хлоропластах замыкающих клеток с образованием малата или сахарозы. Накопление ионов калия, хлорида, малата и/или сахарозы приводят к осмотическому набуханию, изменению формы замыкающих клеток и открыванию устьица (Kinoshita et al., 2003; Shimazaki et al., 2007).

Вопрос об участии в регуляции устьичных движений дополнительных рецепторов красного света (КС) — фитохромов — до сих пор оставался достаточно спорным, несмотря на полученные рядом авторов косвенные свидетельства (Habermann, 1973; Roth-Bejerano, Itai, 1981; Eckert, Kaldenhoff, 2000; Talbott et al., 2003; Baroli et al., 2008). Ранее в нашей лаборатории при исследовании ответов на КС у бесхлорофильного мутанта гороха XL-18 было показано наличие К/ДК-обратимых транспирационных ответов низкоэнергетического (LFR) типа — что является прямым классическим доказательством участия фитохромов в исследуемом процессе (Sokolskaya et al., 2003). Обратимые ответы низкоэнергетического типа, как правило, обеспечиваются фитохромом В, однако в результате наших дальнейших исследований выяснилось, что фитохромный ответ замыкающих клеток имеет сложную природу и состоит, очевидно, более чем из одного компонента. Представленная работа посвящена исследованию участия комплексной фитохромной системы и роли её компонентов в регуляции устьичных движений.

Цель работы — исследование участия компонентов фитохромной системы в регуляции устьичных движений Pisum sativum L.: разделение ответов, вызываемых фитохромами А и В, а также выяснение их роли в быстром ответе замыкающих клеток на свет и в формировании ритма устьичных движений.

Для её достижения были поставлены следующие задачи:

1. определить, какие типы фитохром-зависимых реакций (сверхнизкоэнергетический (VLFR), низкоэнергетический (LFR), высокоэнергетический (HIR)) имеются в замыкающих клетках устьиц;

2. разделить вклады фитохромов А и В в регуляции устьичных движений, основываясь на выявленных типах фитохром-зависимых реакций и используя мутантов по фитохромам А и В;

3. построить и проанализировать спектры действия устьичных движений на КС и ДКС с использованием бесхлорофильного мутанта гороха XL-18;

4. выявить роли обоих фитохромов в формировании ритма устьичных движений;

5. выявить возможные пути реализации фитохромного сигнала в замыкающих клетках устьиц.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Кочетова, Галина Владимировна

выводы

1. Показано, что в регуляции устьичных движений у гороха принимают участие оба имеющихся у него компонента фитохромной системы: фитохромы А и В. Фитохром В вызывает открывание устьиц на красном свету и закрывание на дальнем красном (К/ДК-обратимый LFR тип ответа); фитохром А вызывает открывание устьиц в ответ как на красный, так и на дальний красный свет (ответ HIR типа).

2. Зависимые от фотолабильного фитохрома А устьичные ответы усиливаются при увеличении длительности темновой адаптации, во время которой происходит ресинтез и накопление данного фоторецептора.

3. Получены спектры действия устьичных движений: открывания на КС — с характерным для фитохромных ответов максимумом 660-670 нм; и закрывания на ДКС — с характерным максимумом около 730 нм. При получении спектра действия закрывания, вероятно, не удалось полностью избавиться от вклада фитохрома А и вызываемого им параллельного открывания устьиц.

4. Обнаружено, что при формировании ритма устьичных движений на естественном фотопериоде главным фоторецептором является фитохром А, фитохром В также необходим, но его роль более второстепенна.

5. Показано, что одним из механизмов реализации фитохромного сигнала при открывании устьиц на красном свету является гидролиз крахмала в пластидах замыкающих клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование регуляции работы устьичного аппарата одним из важнейших сигналов окружающей среды - светом - насчитывает более 150 лет. Обнаруженный эффект открывания устьиц в ответ на белый свет интерпретировался сначала как результат процесса фотосинтеза. Первые спектры действия открывания устьиц с максимумами в синей и красной областях подтверждали эти предположения. Но затем более детальные исследования выявили участие в регуляции устьичных движений дополнительных рецепторов синего света - фототропинов и криптохромов. Наиболее спорный вопрос о роли рецепторов красного света - фитохромов - в данном процессе получает в последнее время всё больше подтверждений. Однако при этом, как правило, исследуется лишь наличие классического, К/ДК обратимого ответа низкоэнергетического (LFR) типа, вызываемого в большинстве случаев фитохромом В. В данной работе впервые представлены данные, свидетельствующие об участии в регуляции устьичных движений наряду с фотостабильным фитохромом В также и фотолабильного фитохрома А. Об участии фитохрома А в этом процессе свидетельствует обнаруженный нами ответ на дальний красный свет (высокоэнергетический, FR-HIR), свойственный только фитохрому А, а также наличие ответа на красный свет у мутанта по фитохрому В.

Использование мутантов Pisum sativum L., дефицитных по хлорофиллу, фитохромам А и В, а также отсутствие у гороха минорных фитохромов, как правило имеющихся у других видов растений, позволило разделить вклады этих трёх составляющих в комплексном устьичном ответе на свет красного и дальнего красного диапазонов. Из-за отсутствия мутантов, дефицитных одновременно по хлорофиллу и одному из фитохромов, фотосинтетическая составляющая у зелёных растений исключалась благодаря использованию длинноволнового или низкоинтенсивного света, неэффективного для фотосинтеза, но действующего для фитохромных ответов. Фотосинтетическая составляющая вызывает открывание устьиц в ответ на любой свет, поглощаемый хлорофиллом, обеспечивая замыкающие клетки необходимой для этого энергией и осмотиками. Суммирование данных о роли фитохромной системы позволяет сказать, что фитохром А обеспечивает открывание устьиц на КС и на ДКС, а фитохром В — К/ДК обратимые ответы: открывание на КС и закрывание на ДКС. При этом зависимые от фотолабильного фитохрома А устьичные ответы усиливаются при увеличении длительности темновой адаптации, во время которой происходит накопление белка данного фоторецептора.

Таким образом, в красной области спектра устьичные ответы, обусловленные обоими фитохромами, сонаправлены. Полученный спектр действия устьичных движений на КС у бесхлорофильного мутанта гороха XL-18 имеет характерный для фитохромных ответов низкоэнергетического типа максимум 660-670 нм. Ответы на ДКС, обусловленные фитохромами А и В, направлены противоположно, причём соотношение вкладов двух фоторецепторов зависит от длины волны и интенсивности действующего света, а также от длительности темновой адаптации, что даёт сложные дозовые зависимости устьичных ответов, наблюдаемые при действии ДКС.

Преобразование фитохромного сигнала в осмотический механизм устьичных движений нуждается в подробном изучении. Из приведённых данных следует, что одним из механизмов реализации фитохромного сигнала является процесс гидролиза крахмала в пластидах замыкающих клеток. Образующиеся при этом растворимые сахара и/или малат могут использоваться в качестве осмотиков и/или субстратов для активизирующегося дыхания при открывании устьиц. Этот механизм не требует наличия фотосинтетического аппарата в замыкающих клетках, так как наблюдается как у растений гороха дикого типа, так и у бесхлорофильного мутанта XL-18.

С помощью фитохромных мутантов выявлены роли обоих фитохромов гороха в регуляции ритма устьичных движений в течение светового дня. Показано, что при формировании ритма устьичных движений на естественном фотопериоде главную роль играет фитохром А, обеспечивая основные компоненты ритма: утреннее и вечернее открывания и дневное призакрывание. Фитохром В играет более минорную роль - из всех компонентов ритма обеспечивает только вечернее закрывание.

При микроскопических исследованиях эпидермальных срывов обнаружены значительные аномалии в развитии этой ткани у мутанта phyb-5. Увеличенные размеры и искажённые, раздутые формы покровных клеток, а также нарушения нормального развития замыкающих клеток: их формы, размеров и расположения на листе, — по крайней мере отчасти связаны с известной повышенной продукцией этилена у этого мутанта. Подобные нарушения роста клеток характерны для действия этилена, но наблюдались ранее в основном в тканях стебля. Таким образом, нами показана важная роль фитохрома В в контроле развития эпидермальной ткани листа: как основных эпидермальных, так и замыкающих клеток. Фитохром В в данном процессе, вероятнее всего, действует через регуляцию гормонального баланса, однако для выявления точного механизма его участия необходимы дальнейшие исследования. •

Таким образом, в работе доказана двухкомпонентная природа фитохромной регуляции устьичных движений, выявлены и разделены роли обоих имеющихся у гороха фитохромов как в быстром ответе на свет, так и в формировании ритма движений замыкающих клеток в течение светового периода.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кочетова, Галина Владимировна, 2008 год

1. Алёхина Н.Д., Харитонашвили Е.В. Минеральное питание. // Физиология растений. Под ред. И.П. Ермакова. -М.: Издательский центр «Академия», 2005, с.306-415.

2. Ашофф Ю. Биологические часы. Под ред. Шноля С.Э. М.: Мир, 1964, с.27-59.

3. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В., Основы микротехнических исследований в ботанике. Справочное руководство. М.: Изд. каф. высш. растений биол. ф-та Моск. гос. ун-та, 2000. - с. 42.

4. Беляева О.Б., Литвин Ф.Ф. Фотоактивные пигмент-ферментные комплексы предшественника хлорофилла в листьях растений. Успехи биологической химии, 2007, 47: 189-232.

5. Бюннинг Э. Биологические часы. Под ред. Шноля С.Э. М.: Мир, 1964, с. 11-26, 409-421.

6. Веселова С.В., Фархутдинов Р.Г., Веселов Д.С., Кудоярова Г.Р. Роль цитокининов в регуляции устьичной проводимости проростков пшеницы при быстром локальном изменении температуры. Физиология растений, 2006, 53(6): 857-862.

7. Власова Т.А. Водный режим растений. Малый практикум по физиологии растений, под. ред. Мокроносова А.Т.-М.: МГУ, 1994, с. 147-153.

8. Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В. Большой практикум по фотосинтезу. Под ред. И.П. Ермакова. М.: Издательский центр «Академия», 2003, с. 127-147.

9. Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В. Фотосинтез. // Физиология растений. Под ред. И.П. Ермакова. -М.: Издательский центр «Академия», 2005, с. 108-211.

10. Гостимский С. А., Карвовская Е.А., Синещёков В. А., Беляева О.Б. Электронно-микроскопические и спектральные свойства жёлтых летальных мутантов гороха. Генетика, 1982, 18(1): 124-126.

11. Ежова Т.А., Гостимский С.А. Генетический анализ хлорофильных мутантов гороха. Генетика, 1979, 15(4): 691-695.

12. Емельянов Л.Г. Жажда у растений: Адаптивная регуляция водообмена. Мн.: Тэхналопя, 1999.- 199 с.

13. Клаудсли-Томпсон Дж. Биологические часы. Под ред. Шноля С.Э. М.: Мир, 1964, 564-581.

14. Константинова С.В. Регуляция циркадного ритма устьичных движений и транспирации рецепторами красного света. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук, 2008, с.226

15. Кулаева О.Н. Как свет регулирует жизнь растений. Соросовский образовательный журнал, 2001, 7(4): 6-12.

16. Курсанов Л.И., Комарницкий Н.А., Раздорский В.Ф., Уранов А.А. Анатомия и морфология растений под редакцией проф. Л.В.Кудряшова. М.: Просвещение, 1966, Т. 1. с. 111-114.

17. Лотова Л.И. Морфология и анатомия высших растений. М.: Эдиториал УРСС, 2001, с.54-59.20