Целлюлолитические ферментные препараты на основе грибов Trichoderma, Penicillium и Myceliophtora с увеличенной гидролитической активностью тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Чекушина, Анна Вячеславовна

• Чекушина, Анна Вячеславовна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Чекушина, Анна Вячеславовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ у

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Целлюлозосодержащее сырье

1.1. Запасы и характеристика целлюлозосодержащего сырья

1.2. Клеточная стенка растений

1.3. Предварительная обработка целлюлозосодержащего сырья 16 Глава 2. Ферментативная конверсия целлюлозосодержащего сырья

2.1. Гликозил гидролазы, классификация и механизм действия

2.2. Общие представления о биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

2.3. Целлюлазы

2.4. Гемицеллюлазы

2.5. Механизм действия полисахаридмонооксигеназ

2.6. Факторы, влияющие на ферментативную конверсию целлюлозосодержащего

27

сырья

Глава 3. Различные продуценты ферментов, используемых в процессах

30

биоконверсии целлюлозосодержащего сырья 3.1 Ферментные комплексы, продуцируемые грибами родов Trichoderma,

30

Aspergillus, Myceliophthora

3.2. Ферментные комплексы, продуцируемые грибами рода Pénicillium

Глава 4. Масштабирование процессов биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 5. Материалы и методы экспериментов

5.1. Ферментные препараты

5.2. Субстраты

5.3. Прочие реактивы

5.4. Хроматографические сорбенты

5.5. Определение концентрации белка

5.6. Определение биохимических характеристик ферментов, ферментных

42

препаратов

5.7. Методы определения активности ферментных препаратов

5.8. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков

5.9. Метод определения компонентного состава ферментных препаратов

5.10. Гидролиз целлюлозосодержащего сырья 44 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. Состав и свойства промышленных ферментных препаратов, полученных с

46

помощью различных продуцентов

6.1. Состав и свойства ферментных препаратов, полученных с помощью грибов

46

рода Trichoderma reesei

6.1.1. Состав и свойства ферментных препаратов серии Cellic СТес фирмы

47

Novozymes, созданных для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

6.1.2. Состав и свойства ферментных препаратов серии Accellerase фирмы

59

DuPont&Genencor, созданных для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

6.2. Состав и свойства ферментных препаратов, полученных с помощью грибов

65

рода Myceliophtora thermophila

Глава 7. Сравнение свойств лучших промышленных ферментных препаратов с лабораторным мультиферментным препаратом, полученным с помощью гриба

Pénicillium verruculosum

7.1. Сравнение гидролитической способности ферментных препаратов при

74

различных рН и температуре

7 2 Сравнение активности и компонентного состава ферментных препаратов

76

Pénicillium verruculosum В221-151 и Cellic СТесЗ

Глава 8. Получение и свойства ферментных препаратов Pénicillium verruculosum с

увеличенной гидролитической способностью

8.1. Сравнение свойств полисахаридмонооксигеназ грибов рода Trichoderma reesei, 79 Myceliophtora thermophila и Thelavia terrestris

8.2. Состав и свойства нового ферментного препарата, полученного с помощью

81

гриба рода Pénicillium verruculosum

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ферменты

ЦБГ целлобиогидролаза

ЭГ эндоглюканаза

БГЛ (3-1,4-глюкозидаза

ПМО полисахаридмонооксигеназа

Ксил ксиланаза

БКС (3-1,4-ксилозидаза

КГ ксилоклюканаза

ЦДГ целлобиозодегидрогеназа

Прочие сокращения

КФ класс ферментов

вя гликозил гидролазы

цсм целлюлозосвязывающий модуль

СП степень полимеризации

К! константа ингибирования

Кэ коэффициент экстинкции

МАиЛ-ТОБ матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация -

времяпролетная масс-спектрометрия

МАиЛ-ТОБ-ТОР тандемная масс-спектрометрия

ЦСС целлюлозосодержащее сырье

ВС восстанавливающие сахара

вэжх высокоэффективная жидкостная хроматография

гпх гельпроникающая хроматография

БРЬС жидкостная хроматография быстрого разрешения

ДДС-ЭФ электрофорез в денатурирующих условиях

кж культуральная жидкость

НФ нитрофенол

кмц Ыа-соль карбоксиметилцеллюлозы

мкц микрокристаллическая целлюлоза

ФБ фильтровальная бумага

/7НФГ и-нитрофенил-(3-В-глюкопиранозид

гсНФК я-нитрофенил-Р-Б-ксилопиранозид

ПААГ полиакриламидный гель

ДДС-Ка додецилсульфат натрия

Шэ гистидин

Туг тирозин

И концентрация субстрата

[Е] концентрация фермента

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Целлюлолитические ферментные препараты на основе грибов Trichoderma, Penicillium и Myceliophtora с увеличенной гидролитической активностью»

ВВЕДЕНИЕ

Большие запасы возобновляемой растительной биомассы (около одного триллиона тонн) делают её привлекательным сырьём для получения различных полезных продуктов. Широкое разнообразие биокатализаторов (ферментов) и их характеристик предоставляет большие возможности для эффективной переработки растительного сырья в сахара. Глюкоза, получаемая ферментативным путём из целлюлозы, может быть конвертирована с помощью микроорганизмов в этанол, бутанол, ацетон, органические и аминокислоты, полимеры и многие другие продукты микробного синтеза. Таким образом, растительная биомасса может служить (частичной) альтернативой нефти, которая в настоящее время является основным сырьем при производстве различных продуктов органического синтеза, а также для получения моторного топлива

К ферментам, осуществляющим конверсию целлюлозосодержащего сырья (ЦСС), относятся различные целлюлазы и гемицеллюлазы, которые продуцируются преимущественно микроскопическими грибами, а также бактериями. Мутантные или рекомбинантные штаммы грибов рода Trichoderma (T.reesei, T.viride, T.longibrachiatum) играют ведущую роль среди промышленных грибных продуцентов биокатализаторов на основе целлюлаз и гемицеллюлаз. Это объясняется, во-первых, их высокой секреторной способностью, а, во-вторых, разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью. Поэтому неудивительно, что ферментные препараты целлюлаз и гемицеллюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются во многих странах ведущими производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), DuPont&Genencor (США), Dyadic International, Inc. (США), Iogen (Канада), PrimAlko (Финляндия), Rohm Gmbh (Германия), EnMex (Мексика) и др. При этом поиск новых продуцентов ферментов, предназначенных для гидролиза ЦСС, а также увеличение общей активности и сбалансированности по компонентному составу уже известных ферментных комплексов, по-прежнему являются актуальными задачами современной энзимологии и биотехнологии. В различных научных центрах проводятся интенсивные исследования и разработки по поиску альтернативных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз. Грибы рода Pénicillium, Myceliophtora (ранее Chrysosporium), Acremonium, Chaetomium, Humicola и др. могут стать достойной альтернативой штаммам рода Trichoderma, поскольку по наиболее важным биотехнологическим критериям не уступают, а иногда и превосходят лучшие из известных штаммов Trichoderma.

В нашей лаборатории разработаны различные подходы по получению

ферментных препаратов на основе грибов рода Pénicillium, которые продуцируют

7

комплексы целлюлитических ферментов сбалансированного состава и обладают хорошей гидролитической способностью по отношению к ЦСС.

Выбор высокоэффективных целлюлолитических ферментных препаратов, представляющих собой многокомпонентные ферментные комплексы, зависит от ряда факторов и, в значительной степени, от сбалансированности состава ферментного комплекса и уровня активности его индивидуальных компонентов. Очевидно, что для осуществления максимально эффективного гидролиза ЦСС первостепенное значение приобретает решение задачи об оптимальном качественном и количественном составе ферментного комплекса. Основными ферментами комплекса являются эндоглюканазы и целлобиогидролазы, осуществляющие деструкцию нерастворимой целлюлозы, а также ксиланазы, гидролизующие ксилан (гемицеллюлозу). Однако в последнее время была наглядно продемонстрировано существенное влияние на общую кооперативную эффективность процессов биоконверсии ЦСС «вспомогательных» ферментов (т.н. boosting эффект), осуществляющих гидролиз растворимых олигосхаридов (например, (3-глюкозидаз и Р-ксилозидаз), а также ферментов негидролитической природы (полисахаридмонооксигеназ). Поэтому в области ферментативной конверсии ЦСС активно ведутся фундаментальные исследования и прикладные разработки не только по поиску и получению новых высокоактивных микроорганизмов-продуцентов, но также по поиску новых ферментов, как с высокой гидролитической способностью, так и обладающих «вспомогательной» функцией в процессах гидролиза. Результатом таких исследований могут быть ферментные препараты, способные осуществлять высокоэффективную конверсию различных видов ЦСС.

Таким образом, знание качественного и количественного состава, а также о содержании и свойствах компонентов ферментных комплексов, обладающих высокой гидролитической активностью в процессах биоконверсии ЦСС, является важной и актуальной задачей, направленной на решение проблемы создания высокоэффективных ферментных препаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Целлюлозосодержащее сырье

1.1. Запасы и характеристика целлюлозосодержащего сырья

Истощение запасов невозобновляемых энергоресурсов, а также обострение экологических проблем определили высокий интерес к использованию ЦСС в качестве потенциального источника углеводов, продуктов микробного синтеза и жидкого моторного топлива [1].

Целлюлоза это один из самых распространенных растительных полимеров. Ежегодный прирост растительных органических соединений в процессе биосинтеза составляет около 2*1011 т, где около трети этого количества приходится на целлюлозу [2].

К ЦСС относятся различные отходы переработки сельскохозяйственных культур, а также вторичные продукты лесопиления и деревообработки. Все это можно использовать в качестве сырья для получения Сахаров [3]. Условиями применения в качестве субстратов различных видов ЦСС являются стоимость, размеры запасов ЦСС, возможности концентрирования их в районе расположения гидролизного производства, технологические свойства.

Среди отходов промышленности, прежде всего, следует отметить древесные материалы. К ним относятся различные отходы лесной промышленности: ветки, вершины, пни, кора (25% от общего количества древесины), лесопильные твердые (горбыль, рейка, обрезки и т.д., всего до 20%) и мягкие отходы - опилки (до 12%). Интересным представляется использование в качестве сырья промышленных отходов, содержащих делигнифицированную, или обработанную иным способом целлюлозу, например, отходы вискозных заводов [4]. В отличие от древесной и хлопковой, эта целлюлоза в значительной степени аморфизована. Также можно использовать отходы целлюлозно-бумажного производства, муниципальные отходы и макулатуру [5].

К отходам сельскохозяйственных культур, прежде всего, относится злаковая солома, которая содержит около 30% целлюлозы. Пшеничная солома является крупнотоннажным отходом, она накапливается до 4-5 млрд. т в год, при этом практически не используется, а гниет или сжигается [2]. Свекловичный жом, который является продуктом свеклосахарного производства, часто используется в качестве ЦСС для ферментативного гидролиза [6]. Кукуруза и сахарный тростник являются крупнотоннажным сырьем для ферментативного гидролиза в Бразилии и США. В качестве

ЦСС также можно использовать стебли хлопчатника (0,8 т на 1 т хлопка), хлопковую шелуху, семена хлопчатника, рисовую шелуху (25% от массы зерна), отходы от обработки льна (до 70% от массы поступающей на обработку). Также следует упомянуть торф (степень разложения 15-20%), химический состав которого во многом повторяет химический состав растений, образующих его, и водоросли [7, 8, 9, 10, 11].

Таким образом, ЦСС является наиболее распространенным возобновляемым органическим сырьем на Земле и поэтому может стать источником для получения жидких и газообразных видов топлива, а также многих других полезных продуктов.

ЦСС, в зависимости от происхождения, значительно отличаются по составу. Так, бытовые и промышленные отходы отличаются высоким содержанием целлюлозы и низким содержанием других компонентов. В травах, коре и зеленых частях многолетних растений обнаруживается большое количество гемицеллюлоз и лигнина, солома также лигнифицирована. Древесина хвойных пород богата целлюлозой, в меньшей степени гемицеллюлозой. Древесина лиственных деревьев отличается от древесины хвойных меньшим содержанием лигнина и отсутствием смол, что определяет её реакционную способность (см. табл.1).

В табл.2 представлен химический состав ЦСС различного происхождения [8, 12, 13,14].

Таблица 1. Содержание основных компонентов ЦСС в различных породах

древесины, %.

вещество содержание, %

в хвойных в лиственных

целлюлоза 41-58 39-47

лигнин 28-34 17-27

гемицеллюлоза 15-23 20-38

порода химический состав, %

целлюлоза лигнин гемицеллюлозы

сосна 52 28 20

ель 58 29 13

лиственница сибирская 46 29,5 24,5

пихта 48 30 22

кедр 50 30 20

дуб 39 24 37

бук 42 21 37

береза 47 21 32

клен 41,5 23 35,5

осина 52 20 28

кукуруза початки 45 15 35

кукуруза стебли 39-47 3-5 26-31

лузга подсолнечника 27 27 22

лузга рисовая 29 19 18

солома пшеницы 30 15 50

солома риса 28-36 12-16 23-28

солома овса 31-37 16-19 27-38

хлопок, очески 60 20 20

хлопок, линт 80-95 0 5-20

травы 25-40 10-30 25-50

стебли тростника 40 25 20

стебли бамбука 26-43 21-31 15-26

стебли багассы 32-44 19-24 27-32

бумага 85-99 0-15 0

газетная бумага 40-55 18-30 25-40

целлюлозная пульпа 60-80 2-10 20-30

1.2. Клеточная стенка растений

Клеточная стенка является основным элементом растительного организма: ее содержание в травянистых растениях составляет до 70% сухой массы, а в древесных растениях достигает 90%. Наиболее важными компонентами в составе растительной клеточной стенки являются полисахариды, которые в зависимости от своего состава и строения могут быть разделены на две большие группы, а именно целлюлоза и гемицеллюлоза. Кроме того в состав клеточной стенки входит лигнин (см. рис. 1). Полисахариды могут составлять до 90% сухой массы клеточной стенки [15].

Рисунок 1. Строение клеточной стенки растений.

Целлюлоза относится к гомополисахаридам и состоит из звеньев О-глюкозы, которые связаны между собой с помощью Р-1,4 гликозидных связей (см. рис. 1). Степень полимеризации (СП) целлюлозы может быть выше, чем 10000. Степень кристалличности целлюлозы в микрофибриллах достигает 80%, что делает растительную целлюлозу резистентной к гидролизу. Высокая механическая прочность клеточной стенки обусловлена наличием в ней микрофибрилл целлюлозы [16, 17].

СН2ОН ОН СН2ОН он

НО—А—П^Л^О^/^г--.^

эн СН2ОН

ж но

Го^4"'

он

Рисунок 2. Строение целлюлозы.

■О

снгон он сн2он

Как и все гидрофильные линейные полимеры, целлюлоза обладает склонностью к образованию первичных фибрилл, в которых группы из 40-60 параллельно расположенных цепей макромолекул связаны между собой множественными водородными связями, причем восстанавливающие концы всех полимерных молекул фибрилл расположены с одной и той же стороны.

В первичных фибриллах однородные высокоупорядоченные кристаллические зоны (кристаллиты) чередуются с неоднородными и менее упорядоченными аморфными зонами. В кристаллитах существует трехмерный дальний порядок в расположении цепей целлюлозы. В аморфных участках дальний порядок отсутствует, а сохраняется лишь общая продольная направленность цепей. В аморфных участках относительно легко могут проходить реакции целлюлозы с другими веществами. Длина макромолекул целлюлозы значительно больше длины кристаллических участков, поэтому каждая макромолекула проходит последовательно ряд кристаллических и аморфных участков [18]. Первичные фибриллы целлюлозы соединяются между собой с помощью водородных связей в микрофибриллы, которые и являются основными звеньями строения волокон целлюлозы. Микрофибриллы состоят из нескольких первичных фибрилл, поперечное сечение их составляет примерно 100x200 А, длина - около 600 А. Между первичными фибриллами в микрофибрилле находится лигнин и гемицеллюлозы.

Химические свойства целлюлозы определяются наличием гликозидных связей между элементарными звеньями и гидроксильных групп. Гликозидная связь в целлюлозе неустойчива в условиях кислотного гидролиза. Функциональная роль целлюлозы -создание механического каркаса - непосредственно связана с особенностями химического строения макромолекулы и характером надмолекулярной структуры.

Гемицеллюлоза является гетерополисахаридом и составляет около 20% клеточной стенки растений. В зависимости от источника (и способов выделения), молекулы гемицеллюлоз могут иметь как линейную, так и разветвленную структуру. Макромолекулы гемицеллюлозы могут быть построены из ксилозы, арабинозы (пентозы) или из фруктозы, галактозы, маннозы (гексозы). Гемицеллюлозы разветвлены и их СП и молекулярная масса значительно меньше, чем у целлюлозы (СП составляет от 50 до 200) [19].

Трехмерная структура гемицеллюлозы образована за счет присоединения к гемицеллюлозе ксиланов, глюкуроноксиланов, глюкоманнанов, галактоманнанов, арабинанов, арабиноксиланов и т.д. Гемицеллюлозы можно разделить на три группы: ксиланы, маннаны и арабаногалактаны.

Ксиланы, полисахариды с преобладанием ксилозных остатков: собственно ксиланы, глюкуроноксиланы и глюкуроноарабаноксиланы. Эти полисахариды присутствуют во всех лигнифицированных растительных тканях и в особенно больших количествах — в соломе злаков (25—35%). Один из наиболее хорошо изученных ксиланов из овсяной соломы имеет основную цепь из ксилопиранозных остатков, соединенных 0-1,4-связями. К этой цепи в качестве ответвлений присоединены при помощи 1,3-связей остатки арабофуранозы и при помощи а-1,2-связей — остатки глюкуроновой кислоты и ее 4-метилпроизводного (см. рис. 3).

Ар.ф.

1 I

3

— Ксил.п. ¡3-1—4 Ксил.п. 0-1----4Ксил.п. 6-1----4 Ксил.п. р-1----4Ксил.п. —

г 2 2

I !

% 1 I

а а

Гл.к. 4Ме.Гл,к.

Рисунок 3. Строение ксиланов.

Глюкоманнаны и галактоглюкоманнаны, преобладающими структурными компонентами, которых являются маннозные остатки, содержатся в наибольших количествах в древесине хвойных пород, дающей при гидролизе 8-12% маннозы. Остатки глюкозы и маннозы в этих полисахаридах связаны, по-видимому, главным образом Р-1,4-связями.

Арабаногалактаны и глюкуроноарабаногалактаны, в которых преобладают остатки галактозы, содержатся в древесине некоторых растений в значительных количествах (до 18%).

В древесине хвойных пород преобладают полисахариды, состоящие из гексоз (гексозаны, чаще глюко- и галактоглюкоманнаны), в лиственных - из пентоз (пентозаны, преимущественно ксилан). Гемицеллюлозы лиственной древесины близки по составу гемицеллюлозам других растительных материалов.

Большинство гемицеллюлоз отличается от целлюлозы лучшей растворимостью в растворах щелочей и способностью легко гидролизоваться кипящими разбавленными минеральными кислотами. В растениях гемицеллюлозы служат опорным конструкционным материалом и, возможно, резервным питательным веществом. Содержание гемицеллюлоз в древесине и других растительных материалах - соломе, шелухе семян, кукурузных кочерыжках и т.п. составляет 13-43%. Извлекают гемицеллюлозы обычно щелочными растворами непосредственно из растительных

материалов или экстракцией диметилсульфоксидом из холоцеллюлозы (углеводного комплекса, остающегося после выделения из древесины лигнина). В последнем случае получается продукт, близкий по составу природному [20, 21].

Такая структура и свойства гемицеллюлоз обуславливают основную функциональную роль гемицеллюлозы: осуществление взаимосвязи между основными компонентами клеточной стенки за счет формирования переходного слоя между ними. В первичной клеточной стенке они объединяют пектины и целлюлозу, во вторичной -целлюлозу и лигнин. Присоединение лигнина осуществляется для большинства растений посредством образования диферуловых (дикумаровых) мостиков между ксиланом и лигнином. У некоторых растений (например, бука) присоединение также возможно за счет образования сложноэфирной связи между глюкуроновой кислотой ксилана и ароматическим спиртом лигнина. Присоединение пектина к гемицеллюлозе осуществляется через арабинаны и арабиногалактаны [20].

Лигнин, еще один компонент клеточной стенки растений, является сложной ароматической макромолекулой, образованной в результате реакции радикальной полимеризации фенил - X спирты (где X - 4-оксикоричный (и-кумаровый), З-метокси-4-оксикоричный (конифериловый) и 3,5-диметокси-4-оксикоричный (синаповый) спирты, см. рис. 4) [19].

Лигнин в отличие от углеводов не является индивидуальным веществом, а представляет собой смесь ароматических полимеров родственного строения. Он входит в состав одревесневших клеток всех наземных растений и, по мнению большинства исследователей, химически связан с углеводами. Молекулярная масса лигнина изменяется от нескольких сотен до миллиона. Лигнин можно представить как нерегулярный полимер с разветвленными макромолекулами, построенными в основном из замещенных фенилпропановых звеньев [22].

Лигнин можно разделить на следующие группы: лигнин мягких и твердых пород древесины и лигнин травы. В состав лигнина, который содержится в мягких породах

л-кум ар ов ьш спирт

НО СН--СУ-СНг —ОН конифериловый спирт ОСНа

i

синаповый спирт

ОСНз

Рисунок 4. Спирты, входящие в состав лигнина.

древесины, входит преимущественно конифериловый спирт. В состав лигнина твердых пород древесины входят и конифериловый и синаповый спирты. Лигнин, входящий в состав травы, отличается наличием я-кумарового спирта. Лигнин и гемицеллюлозы, которые входят в состав микрофибриллы целлюлозы, обеспечивают ее защиту от химической и/или биологической деградации [23].

В состав многих растительных тканей также входят пектины. Пектины - группа полисахаридов, общим признаком которых является наличие неразветвленных блоков полигалактуроновой кислоты или ее метилового эфира. Молекулы пектина имеют основную цепь, состоящую из остатков 1,4-а-галактуроновой кислоты с вставками 1,2-связанных остатков Ь-рамнопиранозы. Пектины выполняют важную функциональную роль: регулируют водный обмен, являясь промежуточным звеном в поглощении и транспорте ионов [24].

Помимо этих основных компонентов, стенки растительных клеток содержат ряд других материалов: воск, жиры, смолы, таннины, терпены, крахмал и различные составляющие цитоплазмы.

1.3. Предварительная обработка целлюлозосодержащего сырья

При ферментативном гидролизе реакционная способность природного ЦСС невелика, поэтому для увеличения реакционной способности необходимо провести предварительную обработку. Следует отметить, что определенные виды сырья (например, отходы целлюлозно-бумажной промышленности, макулатура и др.) не требуют предобработки, поскольку в процессе их получения был удален лигнин и произошло уменьшение степени кристалличности. Смысл предобработки заключается в удалении гемицеллюлозы и/или лигнина, в увеличение объема и площади внутренней поверхности целлюлозы, а также в снижение степени полимеризации и кристалличности целлюлозы (см. рис. 5). При этом в результате предобработки не должны образовываться вещества, ингибирующие действие ферментов, осуществляющих гидролиз, и микроорганизмов, отвечающих за последующую конверсию Сахаров. Кроме того, предобработка должна быть рентабельной [25, 26, 27].

Способы предобработки можно разделить на механические, физические, химические и биологические [28, 29, 30].

К механическим способам относят различные виды измельчения, например с помощью различных видов лабораторных мельниц [28, 31].

Лигмнн

Целлюлоза

< (/-' Предобработка '. щ '

ГОПЩ1Х1ЮЛОМ

\

/V //

Рисунок 5. Схема процесса предобработки ЦСС.

К физическим методам относят воздействие у-лучами, ультразвуком, микроволновым излучением и паровой взрыв. Например, воздействие ультразвука позволяет разрыхлить целлюлозу и увеличить площадь поверхности целлюлозы [31, 32].

К биологическим способам предобработки относят разрушение лигнина с помощью различных микроорганизмов, которые используют лигнин в качестве единственного источника углерода. Следует отметить, что биологические способы делигнификации практически не применяются из-за их продолжительности [33].

Химические способы предобработки разнообразны и многочисленны. Они направлены на удаление гемицеллюлоз и лигнина или на растворение целлюлозы с последующем осаждением или получением водорастворимых продуктов. Примеры химических методов предобработки: делигнификация разбавленными растворами щелочи или аммиака при кипячении или автоклавировании, сульфатная или сульфитная варка, экстракция лигнина водным раствором этанола или бутанола [1, 34, 35]. Наиболее часто применимый метод - паровой взрыв. В этом случае ЦСС подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением (несколько секунд; 240-300°С; 3,5-7,5 МПа) в присутствии или без БОг. Далее давление сбрасывают, что вызывает дефибрилляцию ЦСС. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается и выходит из структуры целлюлозы, кроме того, происходит частичная дезинтеграция целлюлозы и частичный гидролиз гемицеллюлоз [36, 37]. Существуют различные модификации этого метода, которые могут образовывать меньшее количество ингибирующих веществ, а также позволяют уменьшить энергозатратность. Например, паровой взрыв можно проводить при более низкой температуре, но при этом увеличивается время процесса [38, 39, 40].

Глава 2. Ферментативная конверсия целлюлозосодержащего сырья

2.1. Гликозил гидролазы, классификация и механизм действия

Гликозил гидролазы - это ферменты, которые относятся к классу гидролаз, катализирующих гидролиз гликозидной связи (класс ферментов (КФ) 3.2). Гликозил гидролазы делятся на 3 подкласса: О-, ТЧ- и 8-гликозил гидролазы [41]. Важную роль в биоконверсии полисахаридов играют именно О-гликозил гидролазы [42].

О-гликозил гидролазы (карбогидразы, КФ 3.2.1) катализируют гидролиз полисахаридов по гликозидной связи [42, 43]. Гены О-гликозил гидролаз кодируются почти всеми живыми организмами, за исключением части архей и некоторых паразитических одноклеточных эукариотов. Гены гликозил гидролаз составляют примерно 1% от всех известных генов [41, 44]. Для многих гликозил гидролаз характерна доменная (модульная) структура, т.е. у них есть каталитический и целлюлозосвязывающий модули, которые соединены пептидным линкером [45, 46]. По данным гидрофобного кластерного анализа каталитические модули гликозил гидролаз разделили на 6 семейств: «А - Б». Другая классификация гликозил гидролаз была предложена Хенриссатом. Он классифицировал гликозил гидролазы по гомологии первичных аминокислотных последовательностей и структурным особенностям с учетом модульной организации молекулы белка [47]. Субстратами для гликозил гидролаз являются различные поли- и олигосахариды, которые отличаются по свойствам и структурам, это также объясняет наличие большого числа разнообразных гликозил гидролаз [44, 48, 49]. Гликозил гидролазы обычно специфичны к конкретному типу субстрата, но могут различаться по типу действия (например, эндо- и экзодеполимеразы), а также часто имеют невысокую активность по отношению к субстратам схожего строения [50].

На сегодняшний день описаны 132 семьи гликозил гидролаз, в пределах одной семьи ферменты проявляют сходство аминокислотных последовательностей и имеют близкую трехмерную структуру, а также функционируют по одинаковому механизму с точки зрения стереохимии катализа, т.е. катализируют расщепление гликозидной связи либо с сохранением, либо с обращением аномерной конфигурации субстрата [49]. Схематично механизм расщепления гликозидной связи представлен на рис. 6.

._______ _ нон

в

I I

I

) Г

н Н

Б

н -- V-—Л^ОН

В^ В'----1

I I

р А '

5.5%

/О н ^н

> ^

3

вн--

10 А

Рисунок 6. Механизм расщепления гликозидной связи карбогидразами. а - механизм с обращением аномерной конфигурации субстрата (одностадийный), б - механизм с сохранением аномерной конфигурации субстрата (двухстадийный).

Существование двух различных механизмов гидролиза гликозидной связи обусловлено разницей в структуре активных центров ферментов того или иного типа действия.

Для ферментов сохраняющего типа действия характерны реакции трансгликозилирования, т.е. реакции переноса гликозидного остатка, в результате которых может происходить удлинение цепи олигосахарида. В этом случае фермент-субстратный комплекс подвергается не гидролизу, а реакции замещения нуклеофильного каталитического остатка другим нуклеофилом, например, спиртами или фенолами. Акцепторами глюкозного остатка в этих реакциях могут быть как сахара, так и другие соединения (спирты, фенолы и т.д.) [51, 52].

2.2. Общие представления о биоконверсии целлюлозосодержащего сырья

Как отмечено выше, ЦСС имеет сложный состав, который может сильно различаться в зависимости от источника ЦСС. Целлюлоза из различных источников характеризуется разной степенью кристалличности, кроме того, необходимо учитывать

наличие гемицеллозы, которая различается в зависимости от типа ЦСС. Компоненты растительной клеточной стенки имеют различную природу, но при этом тесно связаны друг с другом [53]. Поэтому для эффективного гидролиза каждого типа сырья необходимо оптимизировать состав ферментного комплекса.

Ферментативный гидролиз целлюлозы и сопутствующих ей веществ осуществляется комплексом различных ферментов, которые можно условно разделить на целлюлазы, гемицеллюлазы и вспомогательные ферменты [54]. Целлюлазы осуществляют гидролиз целлюлозы до глюкозы - целевого продукта процесса гидролиза ЦСС [55, 56]. Гемицеллюлазы осуществляют гидролиз гемицеллюлозы, вспомогательные ферменты способствуют повышению доступности целлюлозы для целлюлаз [57].

Целлюлазы относятся к классу р-1,4-глюканаз, т.е. карбогидраз, гидролизующих Р~ 1,4-связи в О-гликозильных соединениях. По типу действия на субстраты целлюлазы делят на эндо-1,4-Р-глюканазы (ЭГ) (КФ 3.2.1.4), экзо-1,4-Р-глюканазы (ЦБГ) (КФ 3.2.1.91) и Р-глюкозидазы (БГЛ; экзо-1,4-Р-глюкозидазы - КФ 3.2.1.74 и целлобиазы - КФ 3.2.1.21). Классическая схема биоконверсии целлюлозы включает совместное действие всех вышеперечисленных классов ферментов:

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чекушина, Анна Вячеславовна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bungay H.R. Energy: the biomass options. Bungay H.R. New-York, 1981, 347 pp

2. Тиунова H.А. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов. Под ред. Клетовича В.Л. М., 1981, с. 40-73

3. Sánchez С. Lignocellulosic residues: Biodégradation and bioconversion by fungi. Biotechnology Advances, 2009, 27, p. 185-194

4. Gullón В., Yáñez R., Alonso J.L., Parajó J.C. Production of oligosaccharides and sugars from rye straw: A kinetic approach. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 6676-6684

5. Максимов В.Ф., Вольф И.В., Яковлева О.И. Борьба с загрязнениями окружающей среды в целлюлозно-бумажной промышленности. М., 1976, с. 30

6. Бушина Е.В. Новые высокоэффективные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Pénicillium. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2012, 136 с.

7. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова Л.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М., 1980, с. 83-90

8. Евилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982, с. 4-40

9. Шарков В.И., Куйбина И.И., Соловьева Ю.П. Количественный и химический анализ растительного сырья. М., 1976, 72 с.

10. Bihond P., Sindhu R., Singhania R.R., Surender V., Devi L., Nagalakshmi S., Kurein N., Sukumaran R.K., Pandey A. Bioethanol production from rice straw: An overview. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 4767^1774

11. Goldemberg J. The Brazilian biofuels industry. Biotechnology for Biofuels 2008, 1:6, p.

1-7

12. Михайличенко А.Л., Сметанин И.С. Древесиноведение и лесное товароведение. Лесная промышленность, М., 1990, 224 с.

13. Yang X., Zhang S., Zuo Z., Men X., Tian S. Ethanol production from the enzymatic hydrolysis of non-detoxified steam-exploded corn stalk. Bioresource Technology, 2011, 102, p. 7840-7844

14. Xu J., Wang Z., Cheng J.J. Bermuda grass as feedstock for biofuel production: A review. Bioresource Technology, 2011, 102, p. 7613-7620

15. Pandey A., Soccol C.R., Nigam P., Soccol V.T. Biotechnological potential of agroindustrial residues: sugarcane bagasse. Bioresource Technology, 2000, 74, p. 69-80

16. Ding S.Y., Himmel M.E. The maize primary cell wall microfibril: a new model derived from direct visualization. Agriculture Food Chemistry, 2006, 54, p. 597-606

17. Matthews J.F., Skopec C.E., Mason P.E., Zuccato P., Torget R.W., Sugiyama J. Computer simulation studies of microcrystalline cellulose lb. Carbohydrate Research, 2006, 341, p. 138-152

18. Bansal P., Hall M., Realff M.J., Lee J.H., Bommarius A.S. Multivariate statistical analysis of X-ray data from cellulose: A new method to determine degree of crystallinity and predict hydrolysis rates. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 4461—4471

19. Kuhad R.C., Singh A., Eriksson K.E. Microorganisms and enzymes involved in the degradation of plant fiber cell walls. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1997, 57, p. 45-125

20. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. Portland Press Research Monograph. London, 1993, 4, 120 p.

21. Stone B.A, Clarke A.E. Chemistry and biology of l,3-(3-glucans. La Trobe University Press. Bundoora, Australia, 1992, 426 p.

22. Закис Г.Ф., Крейцберг 3.H., Можейко JI.H., Сергеева В.Н. Лигнин. Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии. Рига, 1972, с. 136-242

23. Buckeridge M.S., Goldman G.H. Routes to cellulosic ethanol. New-York, 2011, p. 45-72

24. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Review of Biochemistry, 1984, 53, 625 p.

25. Wyman C.E., Dale B.E., Elander R.T., Holtzapple M., Ladisch M.R., Lee Y.Y. Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies. Bioresource Technology, 2005, 96, p. 1959-1966

26. Mosier N., Wyman C., Dale В., Elander R., Lee Y.Y., Holtzapple M. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 2005, 96, p. 673-686

27. Hansenl M.A.T., Hidayatl B.J., Mogensen K.K., Jeppesen M.D., J0rgensen В., Johansen K.S., Thygesenl L.G. Enzyme affinity to cell types in wheat straw (Triticum aestivum L.) before and after hydrothermal pretreatment. Biotechnology for Biofuels, 2013, 6, 54, p. 1-15

28. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов B.M. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М., 1995, 224 с.

29. Heiss-Blanquet S., Zheng D., Ferreira N.L., Lapierre С., Baumberger S. Effect of pretreatment and enzymatic hydrolysis of wheat straw on cell wall composition, hydrophobicity and cellulase adsorption. Bioresource Technology, 2011, 102, p. 5938-5946

30. Yang M., Li W., Liu В., Li Q., Xing J. High-concentration sugars production from corn stover based on combined pretreatments and fed-batch process. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 4884-4888

31. Синицын А.П., Ковалев Г.В., Меса-Манреса C.P., Козловский Д.Ф., Калязин Е.П., Клесов А.А. Сравнительное изучение влияния различных видов предобработки на

скорость ферментативного гидролиза природных целлюлозосодержащих материалов. Химия древесины, 1984, 5, с. 60-71

32. Chang М., Chou Т., Tsao G.T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose. Advances in Biochemical Engineering/Bioenergy, 1981, p. 15-42

33. Boominathan K., Reddy C.A. cAMP-mediated differential regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1992, 89, p. 5586-5590

34. Калунянц K.A., Шаненко Е.Ф., Зайцева JI.B. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов. Итоги науки и техники, Сер. Химия и технология пищевых продуктов. М., 1988, 1, 187 с.

35. Selvan P.V., Ghose Т.К., Ghosk P. Catalytic solvent delignification of agricultural residues: inorganic catalysis. Prosess Biochemistry, 1983, 3, p. 13-15

36. Ropas M., Marchal R., Porquie J., Wandecasteele P. Large-scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass. Part 1: Pretreatment procedures. Biosource Technology, 1992, 42, p. 197-204

37. Ropas M., Marchal R., Porquie J., Wandecasteele P. Large-scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass. Part 2: Conversion into acetone-butanol. Biosource Technology, 1992, 42, p. 205-217

38. Duff S.J.B., Murray W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Biosource Technology, 1996, 55, p. 1-33

39. Holtzapple M.T., Humphrey A.E., Taylor J.D. Energy requirements for the size reduction of poplar and aspen wood. Biotechnology Bioengenering, 1989, 33, p. 207-210

40. Ramos L.P. The chemistry involved in the steam treatment of lignocellulosic materials. Quimica Nova, 2003, 26, p. 863-871

41. Cantarel B.L., Coutinho P.M., Rancurel C., Bernard Т., Lombard V., Henrissat B. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Resource, 2009, 37, p. 233-238

42. Наумов Д.Г. Иерархическая классификация гликозил гидролаз. Биохимия, 2011, 76, 6, с. 764-780

43. Wolfenden R., Lu X., Young G. Spontaneous Hydrolysis of Glycosides. American Chemistry Society, 1998, 120, p. 6814-6815

44. Coutinho P.M., Stam M., Blanc E., Henrissat B. Why are there so many carbohydrate-active enzyme-related genes in plants? Trends Plant Scince, 2003, 8, p. 563-565

45. Рабинович М.Л., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов. Биохимия, 2002, 67, 8, с. 1026-1050

46. Karlsson М. Stenlid J. Evolution of Family 18 Glycoside Hydrolases: Diversity, Doma in Structures and Phylogenetic Relationships. Molecular Microbiology and Biotechnology, 2009, 16, p. 208-223

47. Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochemistry, 1993, 293, p. 781-788

48. Laine R.A. Invited Commentary: A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 * 1012 structures for a reducing hexasaccharide: the Isomer Barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems, Glycobiology, 1994, 4, p. 759-767

49. http://www.cazy.org/

50. Claeyssens M., Nerinckx W., Underwood M., Sinnott M.L., Warren R.A., Gilbert H.J. Substrate Specificity in Glycoside Hydrolase Family 10. Biological Chemistry, 2000, 275, p. 23027-23033

51. Davies G., Henrisssat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Current Biology, 1995, 3, :p. 853-859

52. Sinnott M.L. Catalytic mechanisms of enzymatic glycosyl transfer. Chemistry Review, 1990, 90, p. 1171-1202

53. Billardl H., Faraj A., Ferreiral N.L., Menirl S., Heiss-Blanquetl S. Optimization of a synthetic mixture composed of major Trichoderma reesei enzymes for the hydrolysis of steam-exploded wheat straw. Biotechnology for Biofuels, 2012, p. 5-9

54. Baneijee G., Car S., Scott-Craig J.S., Melissa S. Borrusch M.S., Bongers M., Walton J.D. Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 9097-9105

55. Clarke A J. Biodégradation of cellulose. Enzymology and biotechnology, Technomic Publishing Company Inc. Lancaster, 1997, 272 p.

56. Moraïs S., Barak Y., Lamed R., Wilson D.W., Xu O., Himmel M.E., Bayer E.A. Paradigmatic status of an endo- and exoglucanase and its effect on crystalline cellulose degradation. Biotechnology for Biofuels, 2012, 5, p. 78

57. Jorgensen H., Kristensen J.B., Felby C. Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities. Biofuels, Bioproducts and Biorefming, 2007, l,p. 119-134

58. Payne C.M., Bomble Y.J., Taylor C.B., McCabe C., Himmel M.E., Crowley M.F., Beckham G.T. Multiple functions of aromatic-carbohydrate interactions in a processive cellulase examined with molecular simulation. Biological Chemistry, 2011, 286, p. 41028-41035

59. Bhat K.M., Hay A.J., Claeyssens M., Wood T.M. Study of the mode of action and site-specificity of the endo-l,4-P-D-glucanases of the fungus Pénicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello-oligosaccharides. Biochemistry, 1990, 266, p. 371378

60. Deepak K., Ganti S. Murthy Stochastic molecular model of enzymatic hydrolysis of cellulose for ethanol production. Biotechnology for Biofuels, 2013, p. 63-69

61. Horn S.J., Vaaje-Kolstad G., Westereng В., Eijsink V.G.H. Novel enzymes for the degradation of cellulose. Biotechnology for Biofuels, 2012, p. 45-50

62. Mathew G.H., Sukumaran R.K., Singhania R.R., Pandey A. Progress in research on fungal cellulases for lignocellulose degradation. Scientific & Industrial Research, 2008, 67, p. 898-907

63. Рабинович M.JI., Черноглазов B.M., Клесов A.A. Классификация целлюлаз, их распространенность, множественные формы и механизмы действия. Биоконверсия целлюлозы: микробиология и биохимия, Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология. М., 11, 1988, с. 148-149

64. Karlsson J., Siika-aho М., Tenkanen М., Tjerneld F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. Biotechnology, 2002, 99, p. 63-68

65. Марков A.B. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, М., МГУ, 2003, 201 с.

66. Knowles J.K.C., Lehtovaara P., Murray M., Sinnott M.L. Stereochemical course of the action of the cellobioside hydrolases I and II of Trichoderma reesei. Chemical Society, Chemical Communications, 1988, 21, p. 1401-1402

67. Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends Biotechnology, 1997, 15, p. 160-167

68. Vrsanska M., Biely P. The cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414: action on cellooligosaccharides. Carbohydrate Research, 1992, 227, p. 19-27

69. Konstantinidis A.K., Marsden I., Sinnott M.L. Hydrolyses of a- and (3-cellobiosyl fluorides by cellobiohydrolases of Trichoderma reesei. Biochemistry, 1993, 291, p. 883-888

70. Tuohy M.G., Walsh D.J., Murray P.G., Claeyssens M., Cuffe M.M., Savage A.V., Coughlan M.P. Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1596, p. 366-380

71. Wood T.M., McCrae S.I. Purification and properties of a cellobiohydrolase from Penicillium pinophilum. Carbohydrate Research, 1986, 148, p. 331-344

72. Короткова О.Г., Семенова М.В., Морозова В.В., Зоров И.Н., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства грибных Р-глюкозидаз, Биохимия, 2009, 74, 5, с. 699-709

73. Марков А.В. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, М., МГУ, 2003, 201 с.

74. Короткова О.Г. Получение целлюлазных комплексов с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинатных штаммов Penicillium

verrbculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, М., МГУ, 2011, 156с

75. Bohlin С., Olsen S.H., Morant M.D., Patkar S., BorchK., Westh P. A comparative study of activity and apperent inhibition of fungal P-glucosidases. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 107, 6, p. 943-952

76. Chen H., Hayn M., Esterbauer H. Purification and characterization of two extracellular P-glucosidases from Trichoderma reesei. Biochimica et Biophysica Acta, 1992, 1121, p. 54-60

77. Gong C.S., Ladisch M.R., Tsao G.T. Cellobiase from Trichoderma viride: purification, properties, kinetics and mechanism. Biotechnology and Bioengineering, 1977, 19, p. 959-980

78. Galbe M., Zacchi G. A review of the production of ethanol from softwood. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 59, p. 618-628

79. Гусаков A.B. Кинетическое описание ферментативного гидролиза целлюлозы (сырье, ферменты, процесс, реакторы). Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, М., МГУ, 1984, 192 с.

80. Polizeli M.L., Rizzatti A.C.S., Monti R., Terenzy H.F., Jorge G.A., Amorim D.S. Xylanases from fungi: properties and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 67, p. 577-591

81. Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. Microbial xylanases and their industrial applications:a review. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 56, p. 326-338

82. Kulkarni N., Shendey A., Rao N. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiology Review, 1999, 23, p. 411-456

83. Gomes M., Isorna P., Rojo M., Estrada P. Kinetic mechanism of P-xylosidase from Trichoderma reesei QM 9414. Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, 16, p. 7-15

84. Saloheimo M., Nakari-Setala Т., Tenkanen M., Penttila M. cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast. European Journal of Biochemistry, 1997, 249, p. 584-591

85. Westereng В., Ishida Т., Vaaje-Kolstad G., Wu M., Eijsink V.G.H. The Putative Endoglucanase PcGH61D from Phanerochaete chrysosporium Is a Metal-Dependent Oxidative Enzyme that Cleaves Cellulose. PLOS ONE, 2011, 6, p. 1-11

86. Koseki Т., Mese Y., Fushinobu S., Masaki K., Fujii Т., Ito K., Shiono Y., Murayama Т., Iefuji H. Biochemical characterization of a glycoside hydrolase family 61 endoglucanase from Aspergillus kawachii. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 77, p. 1279-1285

87. Karlsson J., Saloheimo M., Siika-Aho M., Tenkanen M., Penttila M., Tjerneld F. Homologous expression and characterization of Cel61A (EG IV) of Trichoderma reesei. European Journal of Biochemistry, 2001, 268, p. 6498-6507

88. Zhou J., Wang Y.H., Chu J., Zhuang Y.P., Zhang S.L., Yin P. Identification and purification of the main components of cellulases from a mutant strain of Trichoderma viride T 100-14. Bioresource Technology, 2008, 99 , p. 6826-6833

89. Harris P.V., Welner D., McFarland K.C., Re E., Poulsen J.C.N., Brown K., Salbo R., Ding H., Vlasenko E., Merino S., Xu F., Cherry J., Larsen S., Leggio L.L. Stimulation of Lignocellulosic Biomass Hydrolysis by Proteins of Glycoside Hydrolase Family 61: Structure and Function of a Large, Enigmatic Family. Biochemistry, 2010, 49, p. 3305-3316

90. Cannella D., Hsieh C.C., Felby C., Jorgensen H. Production and effect of aldonic acids during enzymatic hydrolysis of lignocellulose at high dry matter content. Biotechnology for Biofuels, 2012, 5,26, p. 1-10

91. Levasseur A., Drula E., Lombard V., Coutinho P.M., Henrissat B. Expansion of the enzymatic repertoire of the CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes. Biotechnology for Biofuels, 2013, 6, p. 41-48

92. Quinlana R.J., Sweeneya M.D., Leggio L.L., Otten H., Poulsen J.C.N, Johansen K.S., Krogh K.B.R.M., Jorgensen C.I., Tovborg M., Anthonsen A., Tryfona Т., Walter C.P., Dupree P., Xu F., Davies G.J., and Walton P.H. Insights into the oxidative degradation of cellulose by a copper metalloenzyme that exploits biomass components. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 2011, 108, 37, p. 15079-15084

93. Beeson W.T., Phillips C.M, Cate J.H.D., Marietta M.A. Oxidative Cleavage of Cellulose by Fungal Copper-Dependent Polysaccharide Monooxygenases. American Chemical Society, 2012, 134, p. 890-892

94. Roman Kittl R., Daniel Kracher D., Daniel Burgstaller D., Dietmar Haltrich D., Roland Ludwig R. Production of four Neurospora crassa lytic polysaccharide monooxygenases in Pichia pastoris monitored by a fluorimetric assay. Biotechnology for Biofuels, 2012, 5, 79, p. 113

95. Karkehabadil S., Hansson H., Kim S., Piens K., Mitchinson C., Sandgren M. The First Structure of a Glycoside Hydrolase Family 61 Member, Cel61B from Hypocrea jecorina, at 1.6 A Resolution. Molecular Biology, 2008, 383, p. 144-154

96. Bauer S., Vasu P., Persson S., Mort A. J., Somerville C.R. Development and application of a suite of polysaccharidedegrading enzymes for analyzing plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 2006, 103, p. 11417-11422

97. Клесов A.A., Рабинович M.JI., Синицыи А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Часть II. Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источников. Биоорганическая химия, 1980, 6, с. 1225-1241

98. Gusakov A.V., Sinitsyn А.Р., Manenkova J.A., Protas O.V. Enzymatic sacharification of industrial and agricultural lignocellulosic wastes. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1992, 34, p. 625-637

99. Prior B.A., Day D.F. Hydrolysis of ammonia-pretreated sugar cane bagasse with cellulase, beta-glucosidase, and hemicellulase preparations. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2008, 146, p. 151-164

lOO.Sukumaran R.K., Singhania R.R., Mathew G.M., Mathew P.A. Cellulase production using biomass feed stock and its application in lignocellulose saccharification for bio-ethanol production. Renewable Energy, 2009, 34, p. 421-424

101.Arantes V., Saddler J.N. Cellulose accessibility limits the effectiveness of minimum cellulase loading on the efficient hydrolysis of pretreated lignocellulosic substrates. Biotechnology for Biofuels, 2011, 4, 3, p. 1-16

102.Chundawat S.P.S., Bellesia G., Uppugundla N., Sousa L.D., Gao D.H., Cheh A.M., Agarwal U.P., Bianchetti C.M., Phillips G.N., Langan P. Restructuring the crystalline cellulose hydrogen bond network enhances its depolymerization rate. American Chemistry Society, 2011, 133,p.11163-11174

103.Saloheimo M., Paloheimo M., Hakola S., Pere J., Swanson В., Nyyssonen E., Bhatia A., Ward M., Penttila M. Swollenin, a Trichoderma reesei protein with sequence similarity to the plant expansins, exhibits disruption activity on cellulosic materials. European Journal of Biochemistry, 2002, 269, p. 4202-4211

104.Gourlay K., Hu J., Arantes V., Andberg M., Saloheimo M., Penttila M., Saddler J. Swollenin aids in the amorphogenesis step during the enzymatic hydrolysis of pretreated biomass. Bioresource Technology, 2013, 142, p. 498-503

105.Гусаков A.B., Синицын А.П., Клесов A.A. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса. Биохимия, 1982, 47, с. 1322-1331

106.Синицын А.П., Митькевич О.В., Клесов А.А. Инактивация препаратов ферментов целлюлазного комплекса при перемешивании и стабилизация целлюлозой. Прикладная биохимическая микробиология, 1986, 2, с. 759-765

107.Синицын А.П., Митькевич О.В. Различия в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе целлюлолитических ферментов. Биотехнология, 1987, 3, с. 227-233

108.Saddler J.N. Screening of highly cellulolitic fungi and the action of their cellulase enzyme systems. Enzyme Microbiological Technology, 1982, 4, p. 414-418

109.Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов A.A. Влияние состава целлюлазного препарата на эффективность ферментативного гидролиза хлопкового линта. Химия древесины, 1982, 2, с. 91-96

110.Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов А.А. Ферментативное получение глюкозы из целлюлозы: влияние ингибирования продуктами и изменение реакционной способности субстрата на скорость ферментативного гидролиза. Прикладная биохимическая микробиология, 1981, 17, с. 315-321

111.Berlin A., Balakshin М., Gilkes N., Kadla J., Maximenko V., Kubo S., Saddler J. Inhibition of cellulase, xylanase and beta-glucosidase activities by softwood lignin preparations. Biotechnology, 2006, 125, p. 198-209

112.Palonen H., Tjerneld F., Zacchi G., Tenkanen M. Adsorption of Trichoderma reesei CBH I and EG II and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin. Biotechnology, 2004, 107, p. 65-72

ПЗ.Клесов А.А., Синицын А.П. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Часть IV. Влияние физико-химических и структурных факторов на эффективность ферментативного гидролиза. Биоорганическая химия, 1981, 7, с. 1801-1812.

114.Lynd L.R. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, 66, p. 506-577

115.Merino S.T., Cherry, J. Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 2007, 108, p. 95-120

116.Sims R.E.H. An overview of second generation biofuel technologies. Bioresource Technology, 2010, 101, p. 1570-1580

117.Wilson D.B. Cellulases and biofuels. Current Opinion in Biotechnology, 2009, 20, p. 295-299

118.Kubicek C.P. Metabolic engineering strategies for the improvement of cellulase production by Hypocrea jecorina. Biotechnology for Biofuels, 2009, 2, 19 p.

119.Zhang Y-H. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnology Advances., 2006, 24', p. 452-481

120.Viikari L. Thermostable enzymes in lignocellulose hydrolysis. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 2007, 108, p. 121-145

121.Eveleigh D., Mandels M. In Carbohydrases from Trichoderma reesei and Other Microorganisms. Structure, Biochemistry, Genetics and Applications. The Royal Society of Chemistry, 1998, 345 p.

122.Le Crom S. Tracking the roots of cellulose hyperproduction by the fungus Trichoderma reesei using massively parallel DNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 2009, 106, p. 16151-16156

123.Foreman P.K. Transcriptional regulation of biomassdegrading enzymes in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Biological Chemistry, 2009, 278, p. 31988-31997

124.0uyang J. A complete protein pattern of cellulase and hemicellulase genes in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Biotechnology, 2006, 1, p. 1-9

125.Martinez D. Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei (syn Hypocrea jecorina). Nature Biotechnology, 2008, 26, p. 553-560

126.Nieves R.A. Technical communication: survey and analysis of commercial cellulase preparations suitable for biomass conversion to ethanol. World J. Microbiol. Biotechnology, 1998, 14, p. 301-304

127.Gusakov A.V. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production. Trends in Biotechnology, 2011, 29, p. 419-425

128.http://www.novozymes.com

129.http://biosciences.dupont.com

130.Марков А.В., Гусаков А.В., Дзедзюля Е.И., Устинов Б.Б., Антонов А.А., Окунев О.Н., Беккеревич А.О., Синицын А.П. Свойства гемицеллюлаз ферментного комплекса Trichoderma longibrachiatum. Прикладная биохимия и микробиология, 2006, 42, 6, с. 654664

131.De Vries R.P., Visser J. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2001, 65, p. 497-522

132.Schulein M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens. Biotechnology, 1997,57, p. 71-81

133.Fujii T. Enzymatic hydrolyzing performance of Acremonium cellulolyticus and Trichoderma reesei against three lignocellulosic materials. Biotechnology for Biofuels, 2009, 2, 24 p.

134.Baez-Vasquez M.A., Sinitsyn A.P. Chrysosporium lucknowense cellulases and xylanases in cellulosic biofuels production. Bioenergy, 2008, p. 139-145

135. www, dyadic. com

136.Hinz S.W.A. Hemicellulase production in Chrysosporium lucknowense CI. Cereal Science, 2009, 50, p. 318-323

137.Godfrey Т., West S. Industrial Enzymology. Stockton Press, New-York, 1996, 609 p.

138.Gusakov A.V., Sinitsyn A.P. Cellulases from Penicillium species for producing fuels from biomass. Biofuels, 2012, 3, 4, p. 463-477

139. www.adisseo.biz

140.Скомаровский А. А. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2006, 170 с.

141.Морозова В. В. Свойства целлюлолитических ферментов Penicillium verruculosum и их применение для осахаривания лигноцеллюлозного сырья. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2009, 159 с.

142.3оров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М.,МГУ, 1998, 156 с.

143.Кастельянос О., Ермолова О.В., Синицын А.П., Попова Н.Н. Схема очистки ферментов целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum, исследование их биохимических свойств и специфичности. Биохимия, 1995, 60, с. 925-943

144.Szakacs G., Reczey К., Hernadi P., Dobozi M. Penicillium verruculosum WA 30 a new source of cellulose. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 1981, 11, p. 120-124

145.Соловьева И.В., Окунев O.H., Вельков B.B., Кошелев А.В., Бубнова Т.В., Кондратьева Е.Г., Скомаровский А.А., Синицын А.П. Получение и свойства мутантов

Pénicillium verruculosum - суперпродуцентов целлюлаз и ксиланаз. Микробиология, 2005, 74, с.1-7

146.Короткова О.Г., Рожкова A.M., Матыс Ю.В. Получение комплексных биокатализаторов на основе ферментных препаратов из рекомбинантного гриба Pénicillium verruculosum и применение их в гидролизе отходов деревообрабатывающей промышленности. Катализ в промышленности, 2011, 5, с. 61-68

147.Осипов Д.О., Рожкова A.M., Матыс В.Ю. Получение биокатализаторов на основе рекомбинантных штаммов-продуцентов гетерологичной ксиланазы в грибе Pénicillium verruculosum. Применение их в гидролизе отходов лесной и деревообрабатывающей отраслей промышленности. Катализ в промышленности, 2010, 5, с. 64-71

148.Правильников А.Г. Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., 2012, 104 с.

149.Lin Y., Tanaka S. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 69, p. 627-642

150.http://www.abercade.ru

151 .www.biofuelstp.eu

152.Российское энергетическое агентство. Развитие рынка биотоплива в мире и в Российской Федерации. 2011, 56 с.

153.Nystrom J.M., Andren R.K., Allen A.L. Enzymatic hydrolysis of cellulosic waste: the status of process technology and economic accessment. American Institute of Chemical Engineers Symposium. Series, 1978, 74, p. 82-88

154.Досон P. Справочник биохимика. M., Мир, 1991, 544 с.

155.Синицын А.П., Черноглазое В.М., Гусаков А.В. Методы исследования и свойства целлюлолитических ферментов. М., 1990, 25, с.30-37

156.Doner L.W., Irwin P.L. Assay of reducing end groups in oligosaccharide homologues with 2,2-bicinchoninate. Analytical Biochemistry, 1992, 202, p. 50-53

157.Березин И.В., Рабинович M.Д., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, 42, с. 1631-1636