Трехмерный анализ микро- и нанострутуры биоматериалов, клеток и тканей методом сканирующей зондовой нанотомографии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.24, доктор наук Ефимов Антон Евгеньевич

• Ефимов Антон Евгеньевич
• доктор наук
• 2018

Оглавление диссертации доктор наук Ефимов Антон Евгеньевич

1.2 Рентгеновская нанотомография

1.3 Сканирующая электронная микроскопия с фокусированным

ионным пучком

1.4 Оптическая микроскопия сверхвысокого разрешения

1.5 Сканирующая зондовая микроскопия

1.6 Сканирующая зондовая нанотомография с использованием

ультрамикротомии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Изготовление образцов двух-масштабных полиуретановых матриксов

2.2. Получение и биопринтирование тканевых сфероидов

2.3 Сканирующая электронная микроскопия тканевых сфероидов на двух-масштабных полиуретановых матриксах

2.4 Сканирующая зондовая нанотомография двух-масштабных полиуретановых матриксов с адгезированными тканевыми сфероидами

2.5 Изготовление образцов полилактидных нановолокон методом электроспиннинга

2.6 Выделение и культивирование кардиомиоцитов крысы

2.7 Сканирующая электронная микроскопия электроспиннинговых полилактидных нановолокон

2.8 Оптическое картирование культуры кардиомиоцитов

2.9 Флуоресцентное маркирование и лазерная конфокальная микроскопия кардиомиоцитов и сердечных фибробластов

2.10 Фиксация и заливка клеток миокарда крысы, культивированных на нановолокнах

2.11 Трансмиссионная электронная микроскопия клеток миокарда крысы, культивированных на нановолокнах

2.12 Сканирующая зондовая нанотомография клеток миокарда крысы, культивированных на нановолокнах

2.13 Подготовка образцов флуоресцентно-меченых полимерных микросфер для исследований методами сканирующей зондовой нанотомографии, сканирующей электронной микроскопии и оптической микроскопии

2.14 Исследование образцов флуоресцентно-меченых полимерных микросфер с магнитными наночастицами методами сканирующей зондовой нанотомографии и магнитно-силовой микроскопии

2.15 Флуоресцентная конфокальная микроскопия образцов флуоресцентно-меченых полимерных микросфер с магнитными наночастицами

2.16 Сканирующая электронная микроскопия образцов флуоресцентно-меченых полимерных микросфер с магнитными наночастицами

2.17 Подготовка образцов ткани легкого и почки крысы для исследований методами сканирующей зондовой нанотомографии

2.18 Подготовка образцов ткани миокарда человека для исследований методами сканирующей электронной микроскопии, трансмиссионной электронной микроскопии и сканирующей зондовой нанотомографии

2.19 Сканирующая зондовая нанотомография образцов тканей миокарда человека и легкого крысы

2.20 Сканирующая электронная микроскопия образцов ткани миокарда человека

2.21 Трансмиссионная электронная микроскопия образцов ткани миокарда человека

2.22 Вычисление морфологических параметров трехмерных поверхностей

2.23 Проведение статистического анализа полученных результатов

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АППАРАТНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ НАНОТОМОГРАФИИ

3.1 Особенности технических решений экспериментального аппаратного комплекса для сканирующей зондовой нанотомографии со сканирующим зондом

3.2 Особенности технических решений экспериментального аппаратного комплекса для сканирующей зондовой нанотомографии со сканированием образцом

3.3 Тестовые испытания экспериментальных аппаратных комплексов для

сканирующей зондовой нанотомографии

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ТРЕХМЕРНЫХ МИКРО- И НАНОСТРУКТУР ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

4.1 Исследование структуры образцов флуоресцентно-меченых полимерных микросфер с магнитными наночастицами методами сканирующей зондовой нанотомографии

4.2 Исследование структуры образцов кодированных флуоресцентными нанокристаллами полимерных микросфер методами сканирующей зондовой

нанотомографии

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЯ ТРЕХМЕРНЫХ МИКРО- И НАНОСТРУКТУР ПОЛИУРЕТАНОВЫХ ЭЛЕКТРОСПИННИНГОВЫХ МАТРИКСОВ И КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ НА ИХ ОСНОВЕ

5.1 Исследование микро- и наноструктуры микроволокнистого биосовместимого полиуретанового матрикса методом сканирующей зондовой нанотомографии

5.2 Исследование наноструктурных особенностей контактов фибробластов и двух-масштабного биосовместимого полиуретанового матрикса методом

сканирующей зондовой нанотомографии

ГЛАВА 6 ИССЛЕДОВАНИЕ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ КАРДИОМИОЦИТОВ КРЫСЫ И КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ НА ИХ ОСНОВЕ

6.1 Исследование трехмерной структуры кардиомиоцитов крысы,

культивированных на плоских субстратах

6.2 Исследование трехмерной структуры кардиомиоцитов крысы,

культивированных на полилактидных микроволокнистых матриксах

ГЛАВА 7 ИССЛЕДОВАНИЯ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ ТКАНЕЙ ЛЕГКОГО И МИОКАРДА МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ НАНОТОМОГРАФИИ

7.1 Исследования трехмерной структуры ткани легкого крысы

7.2 Исследования трехмерной структуры ткани почки крысы

7.3 Исследования трехмерной структуры ткани миокарда человека

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Трехмерный анализ микро- и нанострутуры биоматериалов, клеток и тканей методом сканирующей зондовой нанотомографии»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Прогресс в разработке технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины для компенсации или замены функций пораженных органов и тканей невозможен без знания механизмов взаимодействия биоинженерных систем с организмом человека на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях.

К одним из основных факторов, определяющих биосовместимые и функциональные свойства биомедицинских клеточных продуктов и систем доставки биологически активных веществ, относятся трехмерные микро- и наноструктурные характеристики исследуемых объектов взаимодействия. Несмотря на это, прямых методов измерений этих физико-химических параметров не существует.

Широко используемые методы исследования, такие как атомно-силовая микроскопия (АСМ), сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), рентгеновская нанотомография или сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (СЭМ/ФИП) и др. способны дать информацию только о структурных свойствах поверхности. В то же время, например, такое свойства матриксов как поддержание адгезии и пролиферации клеток в клеточно-и тканеинженерных конструкциях определяются трехмерной наноморфологией матрикса, пространственным распределением микропор, нанопор и нанодобавок в его объеме, а также наноструктурными особенностями интерфейсов между матриксами и клетками. Кроме того, существующие методы не позволяют исследовать биологические (водосодержащие) образцы без предварительной дегидратации, нарушающей их исходную структуру.

Нами было высказано предположение, что использование сканирующего зондового микроскопа, ультрамикротома, а в ряде случаев, и криокамеры в одном устройстве, позволит изучать объекты синтетического и природного происхождений в трехмерном виде, с минимальными изменениями их реальной микро- и наноструктуры и других физико-химических свойств.

Разработка аппаратного комплекса для исследования трехмерных микро- и наноструктур образцов методом сканирующей зондовой нанотомографии (СЗНТ) и методических подходов для демонстрации на конкретных примерах информативности метода СЗНТ могут стать основой для развития уникальных технологий 3D-визуализации не только при разработке клеточных технологий, но и для фундаментальных биомедицинских исследований.

Степень разработанности темы исследования

Проведенные в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) серии исследований по разработке метода сканирующей зондовой нанотомографии показали принципиальную возможность анализа трехмерной структуры полимерных, нанокомпозитных и наногибридных материалов. Были разработаны методические подходы к изучению микро- и наноструктур для задач материаловедения и нанотехнологий. Однако эффективность применения метода СЗНТ для трехмерного анализа микро- и наноструктуры биоматериалов, клеток и тканей оставалась под вопросом, что и послужило основанием для выполнения настоящей работы.

Цель исследования

Цель работы: разработать технологию анализа трехмерных структур биоматериалов и биологических объектов методом сканирующей зондовой нанотомографии и охарактеризовать микро- и наноструктурные параметры полимерных носителей, матриксов для клеточно-инженерных конструкций, клеток и биотканей.

Задачи исследования

1. Разработать экспериментальный образец аппаратного комплекса сканирующей зондовой нанотомографии (СЗНТ) для микро- и наноструктурного анализа полимерных и биологических объектов.

2. Сформулировать и экспериментально обосновать алгоритм исследования микро- и наноструктурных характеристик полимерных и биологических объектов методом СЗНТ.

3. Разработать метод трехмерного анализа распределений наноразмерных магнитных включений в биополимерных системах.

4. Доказать влияние наноструктуры полимерных микросфер с флуоресцентными метками, используемых для медицинской диагностики, на эффективность использования флуоресцентно-кодированных микросфер в системах мультиплексной диагностики.

5. Исследовать возможность использования микроволокнистых полиуретановых матриксов для тканевой инженерии.

6. Изучить и охарактеризовать особенности взаимодействия кардиомиоцитов и полилактидных нановолокон в клеточно-инженерной конструкции миокарда.

7. Обосновать эффективность метода сканирующей зондовой нанотомографии для исследования трехмерной структуры тканей легкого, почки и миокарда.

Научная новизна исследования

1. Разработан экспериментальный аппаратный комплекс сканирующей зондовой нанотомографии для микро- и наноструктурного анализа полимерных и биологических объектов.

2. Предложен алгоритм исследования микро- и наноструктурных характеристик полимерных и биологических объектов методом СЗНТ.

3. Показано, что наноструктурные характеристики микроволокнистых полиуретановых матриксов обеспечивают высокий уровень адгезии и жизнеспособности фибробластов человека в составе тканевых сфероидов.

4. Выявлены существенные различия в характере адгезионного взаимодействия фибробластов и кардиомиоцитов крысы с микроволокнистыми полилактидными матриксами.

5. Установлено, что метод СЗНТ позволяет эффективно и достоверно выявлять наноразмерные особенности трехмерной структуры тканей легкого и почки крысы и миокарда человека.

6. Доказано, что наноструктурные характеристики полимерных микросфер с флуоресцентными метками, используемых для мультифакторной медицинской диагностики, влияют на стабильность флуоресцентного кодирования микросфер, определяющую эффективность и надежность их использования для мультиплексного анализа.

7. Разработан метод контроля распределения квантовых точек в оболочках полимерных флуоресцентно-кодированных микросфер с использованием СЗНТ, обеспечивающий устойчивую функциональность микросфер в системах мультиплексной диагностики.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Разработанные экспериментальные аппаратные комплексы и методики сканирующей зондовой нанотомографии позволяют производить анализ ряда параметров трехмерной морфологии биоматериалов, биоискусственных конструкций и биологических объектов с наноразмерным разрешением.

Анализ характеристик трехмерной наноструктуры и биологической активности полиуретанового матрикса, полученного методом электроспиннинга, позволяет рекомендовать данное изделие для проведения доклинических исследований с целью его использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Разработанные методы исследования распределений квантовых точек и магнитных наночастиц в микросферах с использованием сканирующей зондовой нанотомографии могут применяться для контроля качества и стабильной функциональности флуоресцентно-кодированных микросфер в системах мультиплексной диагностики

Обнаруженные закономерности взаимодействия клеток миокарда крысы с нановолокнами дают возможность заметно повысить эффективность разработок биоинженерных систем для задач регенеративной медицины в области кардиологии.

Результаты исследований наноструктурных особенностей легкого и почки крысы и миокарда человека могут быть использованы для выявления новых критериев для диагностики патологических состояний.

Разработана и внедрена в практику ФГБУ «НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России и ООО «СНОТРА» (участник Фонда Сколково) технология сканирующей зондовой нанотомографии для скрининга биоматериалов, клеточно-инженерных конструкций и тканей различных органов.

Методология и методы исследования

В ходе выполнения работы использован комплекс физико-химических и биологических методов исследования:

1. Метод сканирующей зондовой нанотомографии.

2. Методы оптической и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

3. Методы трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии.

4. Метод магнитно-силовой микроскопии.

5. Методы культивирования клеточных культур.

6. Метод электроспиннинга.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанные экспериментальные аппаратные комплексы для сканирующей зондовой нанотомографии пригодны для эффективного исследования микро- и наноструктуры биоматериалов, клеток и тканей.

2. Разработанный алгоритм исследования биополимерных и биологических объектов методами сканирующей зондовой нанотомографии дает возможность реконструировать наноразмерные трехмерные структуры в объеме исследуемых объектов.

3. Анализ трехмерных наноструктур биосовместимых микроволокнистых матриксов и адгезированных на них клеток при помощи технологии сканирующей зондовой нанотомографии позволяет определять их наноразмерные морфологические параметры, влияющие на эффективность использования микроволокнистых матриксов для тканевой инженерии.

4. Кардиомиоциты крысы при культивировании на полилактидных нановолокнах способны взаимодействовать со всей поверхностью нановолокон и полностью обволакивать их клеточной мембраной.

5. Наноразмерные параметры пространственных распределений квантовых точек в полимерных микросферах с флуоресцентными метками влияют на эффективность и стабильность функционирования флуоресцентно-кодированных микросфер в системах мультиплексной медицинской диагностики.

6. Комплексное использование технологии сканирующей зондовой нанотомографии совместно с методами электронной микроскопии повышает достоверность анализа особенностей трехмерных наноструктур тканей легкого, почки и миокарда и определения наноразмерных морфологических параметров биологических структур в тканях данных органов.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов определяется репрезентативным объемом проведенных экспериментальных исследований, использованием современных методов исследования и методов статистической обработки. Работа выполнена в рамках государственных заданий Минздрава России на осуществление научных исследований и разработок по темам «Системный микро- и наноструктурный анализ полимерных материалов для заместительной и регенеративной медицины (2012-2014 гг.), «Разработка технологии трехмерного нано- и микроструктурного анализа искусственных и нативных биологических объектов» (2015-2017 гг.).

Апробация работы состоялась 21 декабря 2017 года на заседании объединенной научной конференции клинических, экспериментальных отделений и лабораторий ФГБУ «НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России и кафедры Трансплантологии и искусственных органов ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России.

Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на межинститутских семинарах ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России (2015 г., 2016 г., 2017 г.); Международной конференции Multinational Congress on Microscopy 2009, г. Грац, Австрия, 30 августа - 4 сентября 2009 г., 22-м Международном симпозиуме по лазерной физике LPHYS'13 (семинар «Биофотоника»), 15-19 июля 2013 г., г. Прага, Чехия; Международной конференции «Неустойчивость и управление в возбудимых сетях. Биофизика сердца и общие аспекты самоорганизации возбудимых сред» (ICENET-2014), 28-30 мая 2014 г., МФТИ, г. Долгопрудный; 4-й Международной конференции по фотонике и информационной оптике (ФИО-2015), Москва, 28-30 января 2015 г. (в рамках Научной сессии НИЯУ МИФИ - 2015); V Международной Конференции «ФизтехБио» МФТИ, г. Долгопрудный, 29-30 апреля 2015 г.; Международной конференции Techconnect World Innovation Conference NANOTECH-2015, г. Вашингтон, США, 14-17 июня 2015 г.;

Симпозиуме Международного факультета искусственных органов "Искусственные органы 2016", 4-7 сентября 2016г., г. Долгопрудный; III Российском национальном конгрессе с международным участием "Трансплантация и донорство органов", 2-4 октября 2017 г, г. Москва.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в научную практику лаборатории бионанотехнологий и отдела биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России, а также и ООО «СНОТРА» (участник Фонда Сколково), используются для выполнения научных тем госзадания Минздрава России.

Личный вклад автора

Автором лично сформулированы концепция, цели и задачи работы, разработаны технические решения аппаратного комплекса СЗНТ и алгоритм исследований биологических структур, выполнены экспериментальные исследования по определению трехмерных наноструктур биополимерных и биологических объектов различной природы, проведена систематизация и обобщение полученных результатов.

Работы, опубликованные по теме диссертации

Результаты работы отражены в 35-х публикациях. По материалам диссертации опубликовано 27 научных статьей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных результатов докторских диссертаций, из них 17 в зарубежных журналах, 3 патента на изобретения.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, пяти глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, двенадцати выводов, практических рекомендаций, перспектив дальнейшей разработки темы, указателя используемой литературы, включающего 177 наименований, из них 13 отечественных и 164 зарубежных источника. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу и 104 рисунка.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ТРЕХМЕРНОГО АНАЛИЗА МИКРО- И НАНОСТРУКТУРЫ БИОМАТЕРИАЛОВ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Современные микроскопические исследования в областях структурной биологии, биомедицинских исследований, тканевой инженерии требуют наномасштабной характеризации трехмерной структуры и морфологии образцов. В настоящее время для этих целей используется ряд методов микроскопии высокого разрешения, таких как трансмиссионная электронная томография; сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (СЭМ/ФИП), рентгеновская томография, методы оптической микроскопии сверхвысокого разрешения и сканирующая зондовая нанотомография. Данные методы нанотомографии чрезвычайно востребованы в настоящее время в биологических исследованиях и очень активно развиваются. Далее рассмотрим основные методы нанотомографии более подробно.

1.1 Трансмиссионная электронная томография

Методы трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) и электронной томографии широко используются для исследований наноструктуры биологических материалов и объектов [Midgley P.A., Dunin-Borkowski R.E., 2009; Medalia O., Weber I. et al., 2002; Milne J.L., Subramaniam S., 2009; Möebus G., Inkson B.J., 2007; van Bavel S.S., Loos J., 2010]. Принцип ТЭМ заключается в просвечивании тонкого образца (обычно толщиной не более 100 нм) высокоэнергетическим электронным пучком, и регистрации проходящих электронов специализированными датчиками. Энергия электронов, используемых для ТЭМ исследований, может составлять до 300 кэВ. Контраст на ТЭМ изображениях формируется за счет взаимодействия электронов пучка с атомами образца. При этом взаимодействие электронов с более тяжелыми атомами вызывает более заметное отклонение их траектории, поэтому для дополнительного контрастирования биологических объектов при ТЭМ

измерениях обычно используют химические соединения тяжелых металлов (свинец, осмий, уран). Основным преимуществом ТЭМ является высокое разрешение, достигающее 1 нм. Однако, необходимо учитывать, что на ТЭМ-изображении мы видим двумерную проекцию всех структур, распределенных в толщине исследуемого образца.

Для исследования трехмерных структур при помощи ТЭМ используется электронная томография. Принцип ее работы основан на получении серий ТЭМ-изображений образца с поворотом плоскости образца под разными углами к электронному пучку, и дальнейшем восстановлении трехмерной структуры при помощи математической обработки полученных данных [Medalia O., Weber I. et al., 2002; Milne J.L., Subramaniam S., 2009; Bouchet-Marquis C., Hoenger A., 2011]. Криогенная электронная томография позволяет оценивать трехмерные структуры белковых молекул за счет интегрирования ряда ТЭМ-изображений молекул одного вида, полученных стохастически под разными углами [Carroni M., Saibil. H.R., 2016]. Метод электронной томографии позволяет анализировать трехмерные структуры клеток и тканей с разрешением в несколько нанометров.

Рисунок 1.1.1. Трехмерная реконструкция элементов саркоплазматического ретикулума (СР) кардиомиоцита кролика методами ЭТ; а - ТЭМ изображение, стрелкой показана мембранная структура СР; б - сегментация элементов СР (выделено голубым) и Т-трубочки (выделено зеленым); в - трехмерная реконструированная модель фрагмента СР и Т-трубочки. Размерный отрезок 200 нм [Rog-Zielinska E.A., Johnston M.C., O 'Toole E.T. et al., 2016].

На рисунке 1.1.1 показан пример трехмерной реконструкции фрагмента саркоплазматического ретикулума и Т-трубочки кардиомиоцита кролика [Rog-Zielinska E.A., Johnston M.C., O'Toole E.T. et al., 2016]. Одним из недостатков этого метода является то, что толщина исследуемого слоя составляет не более 500 нм, что ограничивает возможности исследования, тканей и клеточно-инженерных конструкций. [Perkins G., Renken C., Martone M.E. et al., 1997; Hayashi T., Martone M.E., Yu Z. et al., 2009; Gan L., Jensen G.J., 2012; Rog-Zielinska E.A., Johnston M.C., O'Toole E.T. et al., 2016; Diebolder, C.A., Koster A.J., Koning R.I., 2012]. Также необходимо учитывать повреждения, наносимые биологическим структурам электронным пучком, что особенно важно для более толстых срезов клеток и тканей, где приходится использовать электронные пучки с большими энергиями [Baker L.A., Rubinstein, J.L., 2010].

В 2017 г. за достижения в области криоэлектронной томографии биологических молекул, что свидетельствует о чрезвычайной актуальности и востребованности исследований по разработке новых современных методов нанотомографии.

1.2 Рентгеновская нанотомография

Для изучения полимеров, биоматериалов, клеточно-инженерных конструкций, тканей и других биологических объектов на микроуровне широко применяется метод рентгеновской томографии неразрушающий метод визуализации трехмерной внутренней микроструктуры объектов с использованием рентгеновского излучения [Withers P.J., 2007; Ho S.T., Hutmacher D.W., 2006; Barbetta A., Bedini R., Pecci R. et al., 2012]. Для подобных биологических объектов экспериментально достигнуто разрешение порядка 50 нм. Однако, для высокоразрешающей рентгеновской нанотомографии необходимо использовать образцы размерами не более 50 мкм, что усложняет исследования тканей и клеточно-инженерных конструкций [Muller W.G.,

Heymann J.B., Nagashima K., 2012; Langer M., Peyrin F., 2016; Moore M.J., Jabbari E., Ritman E.L. et al., 2004].

Показательным примером возможностей рентгеновской нанотомографии для исследования клеточно-инженерных конструкций является изучение трехмерной структуры фибробластов человека, культивированных на электроспиннинговых полилактид-ко-гликолидных матриксах, выполненное с использованием метода фазового контраста Цернике [Bradley R.S., Robinson I.K., Yusuf M., 2017]. На рисунке 1.2.1 приведены примеры трехмерной реконструкции клеток, культивированных в течение 6 дней на данных матриксах с диаметром волокна около 4 мкм, визуализирующие особенности морфологии клеток на волокнах. Однако подобная трехмерная реконструкция требует сложных процедур обработки отдельных изображений (сегментирования и деконволюции), которые приводят к снижению эффективного разрешения до уровня 320 нм.

Рисунок 1.2.1. Трехмерные реконструкции клеток, культивированных в течение 6 дней на электроспиннинговых полилактид-ко-гликолидных матриксах с диаметром волокна около 4 мкм. Ядро клетки показано красным. Размерный отрезок 3 мкм [Bradley R.S., Robinson I.K., Yusuf M., 2017].

1.3 Сканирующая электронная микроскопия с фокусированным

ионным пучком

Одним из наиболее перспективных современных подходов к изучению трехмерной наноструктуры биологических объектов является объединение техники сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и травления поверхности фокусированным ионным пучком (ФИП) [Narayan K., Subramaniam S., 2015; Kizilyaprak C., Daraspe J., Humbel B.M., 2014]. Принцип работы ФИП-СЭМ состоит в использовании непосредственно внутри колонны СЭМ дополнительного фокусированного ионного пучка in situ для удаления тонких слоев с поверхности образца путем распыления атомов образца при воздействии ускоренных ионов о его поверхность. Обычно для травления используются ионы галлия, ускоренные до энергий порядка 30 кВ. Одним из преимуществ этого метода является очень тонкая обработка поверхности образца, т. е. толщина удаленного верхнего слоя составлять не более 5 нм. ФИП можно использовать для контролируемого травления, так как положение ионного пучка, размер и время воздействия хорошо регулируются, к тому же время как ФИП можно использовать практически для любого вида материалов, пригодного для ионного травления. Восстановление трехмерной структуры осуществляется с помощью последовательных СЭМ-изображений поверхности, которые получаются после стравливания слоев материала с поверхности образца ионным пучком.

Метод СЭМ/ФИП позволяет выполнять наномасштабную реконструкцию структуры различных материалов [Holzer L., Indutnyi F., Gasser P.H. et al., 2004; Zankel A., Wagner J., Poelt P., 2014], но воздействие электронных и ионных пучков, а также вакуумные условия могут оказывать структурные изменения, в биологических образцах, что является недостатком при подобных исследованиях [Al-Abboodi A., Fu J., Doran P.M. et al., 2013; Bailey R.J., Geurts R., Stokes D.J. et al., 2013; Linkov P., Artemyev M., Efimov A.E. et al., 2013]. К тому же электронно-микроскопический контраст на поверхности после распыления может быть ограничен по ряду причин.

Тем не менее, в настоящее время данный метод широко используется для исследования трехмерных структур как клеток и тканей [Glancy B., Hartnell L.M., Malide D. et al., 2015; Sulkin M.S., Yang F., Holzem K.M. et al., 2014], так и клеточно-инженерных конструкций [Stachewicz U., Qiao T., Rawlinson S.C.F., 2015].

На рисунке 1.3.1 приведен пример трехмерной реконструкции остеобласто-подобных клеток MC3T3-E1, культивированных на ориентированном электроспиннинговом полилактид-ко-гликолидном матриксе [Stachewicz U., Qiao T., Rawlinson S.C.F., 2015]. Полученные данные позволяют проанализировать структуру и интерфейсов между клетками и матриксом, в частности, взаимодействие филоподий создаваемых клетками с электроспиннинговыми нановолокнами (рисунок 1.3.1 б).

Метод ФИП/СЭМ может быть эффективно использован для исследования трехмерной организации внутриклеточных компартментов на наноуровне, например, систем Т-трубочек [Sulkin M.S., Yang F., Holzem K.M. et al., 2014] и митохондрий [Glancy B., Hartnell L.M., Malide D. et al., 2015] в миоцитах.

На рисунке 1.3.2 показан пример трехмерной реконструкции фрагмента кардиомиоцита человека с выделенными системами Т-трубочек и жировых капель. Полученные трехмерные данные позволяют проанализировать особенности морфологии и количественные размерные параметры внутриклеточных систем. Анализ подобных трехмерных данных позволяет лучше понять функциональные взаимосвязи клеточных органелл и систем.

Рисунок 1.3.1. Трехмерные реконструкции остеобласто-подобных клеток MC3T3-E1 (выделены зеленым), культивированных на ориентированной сети полилактид-ко-гликолидных нановолокон (выделены красным). а - трехмерная реконструкция в объеме of 20 х 5 х 10 мкм; (б) трехмерная реконструкция области А, указанной на (а); (в) - трехмерная реконструкция области В, указанной на (а). [Stachewicz U., Qiao T., Rawlinson S.C.F., 2015].

4

Рисунок 1.3.2. Трехмерные реконструкции ультраструктуры кардиомиоцита человека: а - система Т-трубочек (выделена синим); б -жировые капли (выделены желтым. Объем реконструкции: 14.7 х 14.8 х 2.2 мкм [Sulkin M.S., Yang F., Holzem K.M. et al., 2014].

1.4 Оптическая микроскопия сверхвысокого разрешения

Методы оптической микроскопии, в том числе флуоресцентной, традиционно являются широко используемым инструментом для изучения структуры и динамики процессов в клетках и тканях. Основным преимуществом флуоресцентной микроскопии является возможность флуоресцентного

окрашивания определенных биологических молекул за счет применения специализированных красителей, в том числе коньюгированных с антителами, специфичными к заданным биомолекулам. Также активно развиваются методы исследований, основанные на детекции флуоресцентных белков, которые не требуют дополнительного окрашивания [Chudakov D.M., Matz M.V., Lukyanov S. et al., 2010; Kremers G.-J., Gilbert S.G., Cranfill P.J. et al., 2011].

Разрешение традиционной оптической микроскопии ограничено дифракционным пределом Аббе, составляющим порядка 200 нм и более для обычно используемых объективов и спектральных диапазонов. Это обстоятельство существенно ограничивало возможности применения флуоресцентной микроскопии для анализа наноструктуры биологических объектов. Однако в последнее десятилетие был предложен ряд методов, позволяющих преодолеть этот предел и изучать распределение флуоресцентных молекул с разрешением в несколько десятков нм, в том числе и для трехмерных структур [Yamanaka M., Smith N.I., Fujita K., 2014; Huang B., Bates M., Zhuang X., 2009].

Одним из подходов для достижения этой цели является физическое уменьшение размера функции рассеяния точки, используемой в качестве источника возбуждения, например, за счет подавления спонтанного испускания (STED) [Hell S.W., Wichmann J., 1994; Westphal V., Rizzoli S.O., Lauterbach M.A., 2008]. В данном методе используется второй лазерный пучок для подавления флуоресценции по краям фокусного пятна микроскопа, что улучшает разрешение флуоресцентной микроскопии в центральной части пучка.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Ефимов Антон Евгеньевич, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арутюнов П.А., Толстихина А.Л. Сканирующая зондовая микроскопия

(туннельная и силовая) в задачах метрологии наноэлектроники // Микроэлектроника, 1997; 26 (6): 426 - 439.

2. Василец В.Н., Казбанов И.В., Ефимов А.Е., Севастьянов В.И. Разработка

новых методов формирования имплантационных материалов с использованием технологий электроспиннинга и биопринтирования. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2009; 11 (2): 47-53.

3. ГОСТ Р ИСО 27911-2015. Определение и калибровка латерального

разрешения ближнепольного оптического микроскопа. - М: Стандартинформ, 2015.

4. Насырова А.А., Шевченко А.О. Функциональные показатели

магистральных артерий и риск отторжения трансплантированного сердца. Трансплантология: итоги и перспективы. Том VII. 2015 год. Под ред. С.В. Готье. М.-Тверь: Триада, 2016: 431-450.

5. Самосват Д.М., Чикалова-Лузина О.П., Степашкина А.С., Зегря Г.Г.

Безызлучательный резонансный перенос энергии между двумя полупроводниковыми квантовыми точками. // Письма в ЖТФ. 2013; 39 (1): 39-46.

6. Севастьянов В.И. Клеточно-инженерные конструкции в тканевой

инженерии и регенеративной медицине. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2015; 17 (2): 127-130.

7. Сумм Б. Д., Иванова Н. И. Объекты и методы коллоидной химии в

нанохимии // Успехи химии, 2000; 69: 995-1008.

8. Сургученко В., Пономарева А., Ефимов А., Немец Е., Агапов И.,

Севастьянов В. Особенности адгезии и пролиферации фибробластов мыши линии МН/3Т3 на пленках из бактериального сополимера поли(3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерата) с различной шероховатостью

поверхности. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2012; 14(1): 72-77.

9. Толстихина А. Л. Атомно-силовая микроскопия кристаллов и пленок со

сложной морфологией поверхности: диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук: 01.04.18. М. - 2013. - 333 с.

10. Троян В.И., Пушкин М.А., Борман В.Д., Тронин В.Н. Физические основы методов исследования наноструктур и поверхности твердого тела // Под ред. В.Д. Бормана: Учебное пособие, 2008, М.: МИФИ.

11. Шевченко О.П., Стаханова Е.А. Мультимаркерный (мультиплексный) анализ - инструмент персонифицированной медицины. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2015; 17 (2): 90-92.

12. Шевченко О.П., Аксенова А.В., Улыбышева А.А., Можейко Н.П., Никитина Е.А., Орлов В.И., Стаханова Е.А., Шевченко А.О. Сравнительный анализ диагностической значимости панелей биомаркеров у реципиентов сердца в отдаленные сроки после трансплантации. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2017; 19 (2): 27-33.

13. Шевченко О.П., Стаханова Е.А., Гичкун О.Е., Курабекова Р.М., Муминов И.И., Шевченко А.О. Мультиплексный анализ биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у реципиентов сердца. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2015; 17 (1): 12-17.

14. Achatz I. Ultrastructure of the striated muscle and moire patterns. // Acta Biochim Biophys. Acad Sci Hung. 1968; 3: 183-193.

15. Al-Abboodi A., Fu J., Doran P.M., Chan P.P. Three-dimensional nanocharacterization of porous hydrogel with ion and electron beams. // Biotechnology and bioengineering. 2013; 110: 318-326.

16. Alekseev A., Chen D., Tkalya E.E., Ghislandi M.G., Syurik Y., Ageev O., Loos J., de With G. Local Organization of Graphene Network Inside Graphene/Polymer Composites. // Adv. Funct. Mater. 2012; 22(6): 1311-8.

17. Alekseev A., Efimov A., Lu K., Loos J. Three-dimensional electrical property reconstruction of conductive nanocomposites with nanometer resolution. // Advanced Materials. 2009; 21 (48): 4915-4919.

18. Alekseev A., Loos J., Koetse M.M. Nanoscale electrical characterization of semiconducting polymer blends by conductive atomic force microscopy (C-AFM). // Ultramicroscopy. 2006; 106(3): 191-199.

19. Alekseev A., Efimov A., Loos J., Matsko N., Syurik J. Three-dimensional imaging of polymer materials by Scanning Probe Tomography. // Eur. Polym. J. 2014; 52: 154-165.

20. Al-Khayat H.A., Morris E.P., Kensler R.W., Squire J.M., 3D Structure of Relaxed Fish Muscle Myosin Filaments by Single Particle Analysis. // J Struct Biol. 2006; 155: 202-217.

21. Bailey R.J., Geurts R., Stokes D.J., de Jong F., Barber A.H. Evaluating focused ion beam induced damage in soft materials. // Micron. 2013; 50: 51-56.

22. Baji A., Mai Y.W., Wong S.C., Abtahi M., Chen P. Electrospinning of polymer nanofibers: effects on oriented morphology, structures and tensile properties. // Composites science and technology. 2010; 70 (5): 703-718.

23. Baker L.A., Rubinstein J.L. Radiation damage in electron cryomicroscopy. // Methods Enzymol. 2010; 481: 371-388.

24. Balashov V., Efimov A., Agapova O., Pogorelov A., Agapov I.. Agladze K. High resolution 3D microscopy study of cardiomyocytes on polymer scaffold nanofibers reveals formation of unusual sheathed structure. // Acta Biomaterialia. 2018; 68: 214-222.

25. Balk, S.P., Ko Y.J., Bubley G.J. Biology of prostate-specific antigen. // J Clin Oncol. 2003; 21: 383-91.

26. Barbetta A., Bedini R., Pecci R., Dentini M. Role of X-ray microtomography in tissue engineering. // Annali dell'Istituto superiore di sanita. 2012; 48: 10-18.

27. Barroso M.M. Quantum Dots in Cell Biology // J Histochem Cytochem. 2011; 59 (3): 237-251.

28. Beachley V., Kasyanov V., Nagy-Mehesz A., Norris R., Ozolanta I., Kalejs M., Stradins P., Baptista L., da Silva K., Grainjero J., Wen X., Mironov V. The fusion of tissue spheroids attached to pre-stretched electrospun polyurethane scaffolds // J. Tissue Eng. 2014; 5: 8-15

29. Betzig E., Patterson G.H., Sougrat R., Lindwasser O.W., Olenych S., Bonifacino J.S., Davidson M.W., Lippincott-Schwartz J., Hess H.F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. // Science. 2006; 313: 1642-1645.

30. Bilan R., Nabiev I., Sukhanova A. Quantum Dot-Based Nanotools for Bioimaging, Diagnostics, and Drug Delivery. // ChemBioChem. 2016; 17: 2103-2114.

31. Bilan R.S., Krivenkov V.A., Berestovoy M.A., Efimov A.E., Agapov I.I., Samokhvalov P.S., Nabiev I., Sukhanova, A. Engineering of Optically Encoded Microbeads with FRET-Free Spatially Separated Quantum-Dot Layers for Multiplexed Assays. // ChemPhysChem. 2017; 18 (8): 970-979.

32. Binnig G., Quate C.F., Gerber C. Atomic force microscope. // Phys. Rev. Lett. 1986; 56 (9): 930-933.

33. Bird S.D., Doevendans P.A., van Rooijen M.A., Brutel de la Riviere A., Hassink R.J., Passier R., Mummery C.L. The human adult cardiomyocyte phenotype. // Cardiovasc Res. 2003; 58: 423-434.

34. Bordas J., Svensson A., Rothery M., Lowy J., Diakun G. P., Boesecke P. Extensibility and symmetry of actin filaments in contracting muscles. // Biophys. J. 1999; 77: 3197-3207.

35. Bouchet-Marquis C., Hoenger A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. // Micron. 2011; 42: 152-162.

36. Bozzola J.J., Russell L.D. Electron microscopy: principles and techniques for biologists, first ed., Jones & Bartlett Pub., Sudbury, MA, 1999.

37. Bradley, R.S.; Robinson, I.K.; Yusuf, M. 3D X-Ray Nanotomography of Cells Grown on Electrospun Scaffolds. // Macromol. Biosci. 2017; 17: 1600236.

38. Braghirolli D.I., Steffens D., Pranke P. Electrospinning for regenerative medicine: a review of the main topics. // Drug. Discov. Today. 2014; 19 (6): 743-753.

39. Brazhnik K., Sokolova Z., Baryshnikova M., Bilan R., Efimov A., Nabiev I., Sukhanova A. Quantum dot-based lab-on-a-bead system for multiplexed detection of free and total prostate-specific antigens in clinical human serum samples. // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2015; 11: 1065-1075.

40. Brazhnik K., Grinevich R., Efimov A.E., Nabiev I., Sukhanova A. Development and potential applications of microarrays based on fluorescent nanocrystal-encoded beads for multiplexed cancer diagnostics. Biophotonics: Photonic Solutions for Better Health Care IV, Proc. of SPIE, 2014; 9129: 91292C-1—91292C-9.

41. Breen E.J., Polaskova V., Khan A. Bead-based multiplex immuno-assays for cytokines, chemokines, growth factors and other analytes: Median fluorescence intensities versus their derived absolute concentration values for statistical analysis. // Cytokine. 2015; 71 (2): 188-198.

42. Bruchez M. Jr., Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A.P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. // Science 1998; 281: 2013-2016.

43. Bustamante C., Keller D. Scanning Force Microscopy in Biology // Physics Today. 1995; 48 (12): 32 - 38.

44. Caplan J., Niethammer M., Taylor R. M. II, Czymmek K. J. The power of correlative microscopy: multi-modal, multi-scale, multi-dimensional. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2011; 21: 686-693.

45. Carlisle C.R., Coulais C., Guthold M., The mechanical stress-strain properties of single electrospun collagen type I nanofibers. // Acta Biomater. 2010; 6: 2997-3003.

46. Carregal-Romero S., Caballero-Díaz E., Beqa L., Abdelmonem A.M., Ochs M., Hühn D., Suau B.S., Valcarcel M., Parak W.J. Multiplexed sensing and

imaging with colloidal nano- and microparticles. // Annu. Rev. Anal. Chem. 2013; 6: 53-81.

47. Carroni M., Saibil H.R. Cryo electron microscopy to determine the structure of macromolecular complexes // Methods. 2016; 95: 78-85.

48. Chan W.C., Nie S. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. // Science. 1998; 281: 2016-2018.

49. Chua K.N., Lim W.S., Zhang P., Lu H., Wen J., Ramakrishna S., Leong K.W., Mao H.Q. Stable immobilization of rat hepatocyte spheroids on galactosylated nanofiber scaffold. // Biomaterials. 2005; 26: 2537-2547.

50. Chudakov D.M., Matz M.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. // Physiol Rev. 2010; 90 (3): 1103-1163.

51. Dabiri B.E., Lee H., Parker K.K. A potential role for integrin signaling in mechanoelectrical feedback. // Progress in biophysics and molecular biology. 2012; 110 (2): 196-203.

52. Dahl K.N., Kahn S.M., Wilson K.L., Discher D.E. The nuclear envelope lamina network has elasticity and a compressibility limit suggestive of a molecular shock absorber. // J Cell Sci. 2004; 117 (20): 4779-4786.

53. Dahl R., Larsen S., Dohlmann T.L., Qvortrup K., Helge J.W., Dela F., Prats C., Three-dimensional reconstruction of the human skeletal muscle mitochondrial network as a tool to assess mitochondrial content and structural organization. // Acta Physiol. 2015; 213: 145-155.

54. Daniel T.L., Trimble A.C., Chase P.B. Compliant realignment of binding sites in muscle: transient behavior and mechanical tuning. // Biophys J. 1998; 74 (4): 1611-1621.

55. Dhandayuthapani B., Yoshida Y., Maekawa T., Kumar D.S. Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review. // Int. J. Polymer Sci. 2011; 2011: 290602.

56. Diebolder C.A., Koster A.J., Koning, R.I. Pushing the resolution limits in cryo electron tomography of biological structures. // Journal of Microscopy. 2012; 248: 1-5.

57. Dietz C., Roper S., Scherdel S., Bernstein A., Rehse N., Magerle R. Automatization of nanotomography. // Review of scientific instruments. 2007; 78: 053703.

58. Drake M.J., Fry C.H., Eyden B. Structural characterization of myofibroblasts in the bladder // BJU Int. 2006; 97(1): 29-32.

59. Dvir T., Timko B.P., Kohane D.S., Langer R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. // Nat Nanotechnol. 2011; 6: 13-22.

60. Efimov A.E., Agapova O.I., Parfenov V.A., Pereira F.D.A.S., Bulanova E.A., Mironov V.A., Agapov I. I. Investigating the micro- and nanostructure of microfibrous biocompatible polyurethane scaffold by scanning probe nanotomography. // Nanotechnologies in Russia. 2015; 10 (11-12): 925-929.

61. Efimov A.E., Agapova O.I., Agapov I.I. Scanning Probe Nanotomograph: Features of Engineering Solutions for Low-Temperature Analysis of Biomedical Materials. // Biomed Eng. 2015; 49: 132-135.

62. Efimov A.E., Agapova O.I., Safonova L.A., Bobrova M.M., Parfenov V.A., Koudan E.V., Pereira F.D.A.S., Bulanova E.A., Mironov V.A., Agapov I.I. Nanostructural features of contacts of fibroblasts with dual-scale biocompatible polyurethane scaffold. // Nanotechnologies in Russia. 2016; 11 (11-12): 830834.

63. Efimov A.E., Agapova O.I., Safonova L.A., Bobrova M.M., Volkov A.D., Khamkhash L., Agapov I.I. Cryo scanning probe nanotomography study of the structure of alginate microcarriers. // RSC Adv. 2017; 7: 8808-8815.

64. Efimov A.E., Gnaegi H., Schaller R., Grogger W., Hofer F., Matsko N.B. Analysis of native structure of soft materials by cryo scanning probe tomography. // Soft Matter. 2012; 8: 9756-9760.

65. Efimov A.E., Tonevitsky A.G., Dittrich M., Matsko N.B. Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: a novel device for the

serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. // Journal of Microscopy. 2007; 226(3): 207217.

66. Efimov A.E., Agapov I.I., Agapova O.I., Oleinikov V.A., Mezin A.V., Molinari M., Nabiev I., Mochalov K.E. A novel design of a scanning probe microscope integrated with an ultramicrotome for serial block-face nanotomography. // Rev Sci Instrum. 2017; 88 (2): 023701.

67. Efimov A.E., Moisenovich M.M., Bogush V.G., Agapov I.I. 3D nanostructural analysis of silk fibroin and recombinant spidroin 1 scaffolds by scanning probe nanotomography. // RSC Adv. 2014; 4: 60943-60947.

68. Fan Y.W., Cui F.Z., Hou S.P., Xu Q.Y., Chen L.N., Lee I.S. Culture of neural cells on silicon wafers with nanoscale surface topography. // J. Neurosci. Methods. 2002; 120 (1): 17-23.

69. Fournier-Bidoz S., Jennings T.L., Klostranec J.M., Fung W., Rhee A., Li D., Chan W.C. Facile and rapid one-step mass preparation of quantum-dot barcodes. // Angew. Chem. Int. Ed. 2008; 47: 5577-5581.

70. Gallyamov M.O. Scanning Force Microscopy as Applied to Conformational Studies in Macromolecular Research. // Macromol. Rapid Commun. 2011; 32 (16): 1210-1246.

71. Gan L., Jensen G.J. Electron tomography of cells. // Q. Rev. Biophys. 2012; 45: 27-56.

72. Gao X., Nie S. Quantum Dot-Encoded Mesoporous Beads with High Brightness and Uniformity: Rapid Readout Using Flow Cytometry // Anal. Chem. 2004; 76: 2406-2410.

73. Gaponik N., Radtchenko I.L., Gerstenberger M.R., Fedutik Y.A., Sukhorukov G.B., Rogach A.L. Labeling of Biocompatible Polymer Microcapsules with Near-Infrared Emitting Nanocrystals // Nano Lett. 2003; 3: 369-372.

74. Glancy B., Hartnell L.M., Malide D., Yu Z.-X., Combs C.A., Connelly P.S., Subramaniam S., Balaban R.S. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. // Nature. 2015; 523: 617-620.

75. Gómez-Pozos, H., González-Vidal, J.L., Torres, G.A., de la Luz Olvera M., Castañeda, L. Physical Characterization and Effect of Effective Surface Area on the Sensing Properties of Tin Dioxide Thin Solid Films in a Propane Atmosphere. // Sensors. 2014; 14: 403-415.

76. Gredig T., Silverstein E.A., Byrne M.P. Height-Height Correlation Function to Determine Grain Size in Iron Phthalocyanine Thin Films. // Journal of Physics: Conference Series. 2013; 417: 012069.

77. Greiner A., Wendorff J.H. Electrospinning: A fascinating method for the preparation of ultrathin fibres. // Angew. Chem.-Int. Edit. 2007; 46: 5670-5703.

78. Gu B.K., Kim M.S., Kang C.M., Kim J.I., Park S.J., Kim C.H., Fabrication of Conductive Polymer-Based Nanofiber Scaffolds for Tissue Engineering Applications. // J. Nanosci. Nanotechnol. 2014; 14: 7621-7626.

79. Guelcher S.A. Biodegradable polyurethanes: synthesis and applications in regenerative medicine. // Tissue Eng Part B Rev. 2008; 14 (1): 3-17.

80. Han M., Gao X., Su J.Z., Nie S. Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. // Nat. Biotechnol. 2001; 19: 631635.

81. Hartmann U. Magnetic force microscopy: Some remarks from the micromagnetic point of view. // J. Appl. Phys. 1988; 64 (3): 1561-1564.

82. Hayashi T., Martone M.E., Yu Z., Thor A., Doi M., Holst M.J., Ellisman M.H., Hoshijima M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. // Journal of Cell Science. 2009; 122: 1005-1013.

83. Hayat M.A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, 4th ed. 2000; Cambridge University Press, New Jersey.

84. Hell S.W., Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: Stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. // Optics Letters. 1994; 19 (11): 780-782

85. Hesuani Yu.D., Pereira F.D.A.S., Parfenov V., Koudan E., Mitryashkin A., Replyanski N., Kasyanov V., Knyazeva A., Bulanova E., Mironov V. Design

and Implementation of Novel Multifunctional 3D Bioprinter. // 3D Printing and Additive Manufacturing. 2016; 3 (1): 64-68.

86. Ho S.T., Hutmacher D.W. A comparison of micro CT with other techniques used in the characterization of scaffolds. // Biomaterials. 2006; 27(8): 13621376.

87. Hodge A.J. Studies on the structure of muscle. III. Phase contrast and electron microscopy of dipteran flight muscle. // J Biophys Biochem Cytol. 1955; 1 (4): 361-380.

88. Hodge A.J., Huxley H.E., Spiro D.M. Electron microscope studies on ultrathin sections of muscle. // Journal of Experimental Medicine 1954; 99(2):201-206.

89. Holzem K.M., Vinnakota K.C., Ravikumar V.K., Madden E.J., Ewald G.A., Dikranian K., Beard D.A., Efimov I. R. Mitochondrial Structure and Function Are Not Different Between Nonfailing Donor and End-Stage Failing Human Hearts. // FASEB Journal. 2016; 30: 2698-2707.

90. Holzer L., Indutnyi F., Gasser P.H., Munch B., Wegmann M. Three-dimensional analysis of porous BaTiO3 ceramics using FIB nanotomography. // Journal of microscopy. 2004; 216: 84-95.

91. Houser B. Bio-Rad's Bio-Plex® suspension array system, xMAP technology overview. // Archives of Physiology and Biochemistry. 2012; 118 (4): 192-196.

92. Huang B., Bates M., Zhuang X. Super resolution fluorescence microscopy. // Annu Rev Biochem. 2009; 78: 993-1016.

93. Huang B., Wang W., Bates M., Zhuang X., Three-dimensional Superresolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy // Science. 2008; 319 (5864): 810-813.

94. Hunt A., Ewing R. Percolation Theory for Flow in Porous Media, // Lect. Notes Phys. Springer: Berlin Heidelberg, 2009; 771 p.

95. Huxley H.E. The double array of filaments in cross-striated muscle. // J Biophys Biochem Cytol. 1957; 3 (5): 631-648.

96. Ingavle G.C., Leach J.K. Advancements in electrospinning of polymeric nanofibrous scaffolds for tissue engineering. // Tissue Eng. Part B Rev. 2014; 20 (4): 277-293.

97. Jin L., Wang T., Zhu M.L., Leach M.K., Naim Y.I., Corey J.M., Feng Z.Q., Jiang Q. Electrospun fibers and tissue engineering. // J. Biomed. Nanotechnol. 2012; 8 (1): 1-9.

98. Kai D., Liow S.S., Loh X.J. Biodegradable polymers for electrospinning: towards biomedical applications. // Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 2014; 45: 659-670.

99. Kelsey M., Kennedy K.M., Bhaw-Luximon A., Jhurry D., Cell-matrix mechanical interaction in electrospun polymeric scaffolds for tissue engineering: Implications for scaffold design and performance // Acta Biomater. 2017; 50: 41-55.

100. Khorshidi S., Solouk A., Mirzadeh H., Mazinani S., Lagaron J.M., Sharifi S., Ramakrishna S. A review of key challenges of electrospun scaffolds for tissue-engineering applications. // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2016; 10 (9): 715-38.

101. Kim B.S., Mooney D.J. Development of biocompatible synthetic extracellular matrices for tissue engineering. // Trends Biotechnol. 1998; 16 (5): 224-230.

102. Kisch B., Electron microscopy of the cardiovascular system: an electron microscopic study with applications to physiology, Thomas, 1960; 180 p.

103. Kizilyaprak C., Daraspe J., Humbel B.M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. // Journal of Microscopy. 2014; 254: 109-114.

104. Koudan E.V., Bulanova E.A., Pereira F.D.A.S., Parfenov V.A., Kasyanov V.A., Hesuani Yu.D., Mironov V.A. Patterning of tissue spheroids biofabricated from human fibroblasts on the surface of electrospun polyurethane matrix using 3D bioprinter. // Int. J. Bioprinting. 2016; 2 (1): 4552.

105. Kremer A., Lippens S., Bartunkova S., Asselbergh B., Blanpain C., Fendrych M., Goossens A., Holt M., Janssens S., Krols M., Larsimont J-C., McGuire C., Nowack M.K., Saelens X., Schertel A., Schepens B., Slezak M., Timmerman

V., Theunis C., Van Brempt R., Visser Y., Guerin C.J. Developing 3D SEM in a broad biological context. // J Microsc. 2015; 259 (2): 80-96.

106. Kremers G.-J., Gilbert S.G., Cranfill P.J., Davidson M.W., Piston D.W. Fluorescent proteins at a glance. // J Cell Sci. 2011; 124: 157-160.

107. Labarrere C.A., Jaeger B.R. Biomarkers of heart transplant rejection: the good, the bad, and the ugly! // Transplantional Research. 2012; 159 (4): 238-251.

108. Langer M., Peyrin F. 3D X-ray ultra-microscopy of bone tissue. // Osteoporosis Int. 2016; 27: 441-455.

109. Li D., Xia Y. Electrospinning of nanofibers: reinventing the wheel? // Advanced materials. 2004; 16 (14): 1151-1170.

110. Liedel C., Hund M., Olszowka V., Boker A. On the alignment of a cylindrical block copolymer: a time-resolved and 3-dimensional SFM study. // Soft Matter. 2012; 8: 995-1002.

111. Lilja, H., Christensson A., Dahlen U., Matikainen M. T., Nilsson O., Pettersson K., Lovgren T. Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1-antichymotrypsin // Clin Chem. 1991; 37: 1618-25.

112. Linkov P., Artemyev M., Efimov A.E., Nabiev I. Comparative advantages and limitations of the basic metrology methods applied to the characterization of nanomaterials. // Nanoscale. 2013; 5: 8781-8798.

113. Lu Y., Huang J., Yu G., Cardenas R., Wei S., Wujcik E.K., Guo Z., Coaxial electrospun fibers: applications in drug delivery and tissue engineering. // Wiley Interdiscip. Rev.-Nanomed. Nanobiotechnol. 2016; 8: 654-677.

114. Luther P. K., Squire J. M. Three-dimensional structure of the vertebrate muscle A-band: II. The myosin filament superlattice. // J. Mol. Biol. 1980; 141: 409439.

115. Ma Z., Kotaki M., Inai R., Ramakrishna S. Potential of nanofiber matrix as tissue-engineering scaffolds. // Tissue Eng. 2005; 11. (1-2): 101-109.

116. Magerle R. Nanotomography. // Phys Rev Lett. 2000; 85: 2749-2752.

117. Magonov S.N., Reneker D.H. Characterization of polymer surfaces with atomic force microscopy. // Annu. Rev. Mater. Sci. 1997; 27(1): 175-222.

118. Markievicz P., Cohen S.R., Efimov A., Ovchinnikov D.V., Bukharaev A.A. SPM Tip visualisation through deconvolution using various characterizers: optimization of the protocol for obtaining true surface topography from experimentally acquired images // Probe Microscopy. 1999; 1 (4): P. 355-364.

119. Matsko N., Mueller M. AFM of Biological Material Embedded in Epoxy Resin. // J Struct Biol. 2004; 146: 334-343.

120. Matsko N.B. Atomic force microscopy applied to study macromolecular content of embedded biological material. // Ultramicroscopy. 2007; 107: 95105.

121. Mattila P.K., Lappalainen P. Filopodia: molecular architecture and cellular functions. // Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 2008; 9: 446-454.

122. Medalia O., Weber I., Frangakis A.S., Nicastro D., Gerisch G., Baumeister W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. // Science. 2002; 298: 1209-1213.

123. Midgley P.A., Dunin-Borkowski R.E. Electron tomography and holography in materials science. // Nat Mater. 2009; 8: 271-280.

124. Mijailovich S.M., Kayser-Herold O., Stojanovic B., Nedic D., Irving T.C., Geeves M. A. Three-dimensional stochastic model of actin-myosin binding in the sarcomere lattice. // J Gen Physiol. 2016; 148 (6): 459-488.

125. Milne J.L., Subramaniam S. Cryo-electron tomography of bacteria: progress, challenges and future prospects. // Nature reviews Microbiology. 2009; 7: 666675.

126. Mirabedini A., Foroughi J., Wallace G.G. Developments in conducting polymer fibres: from established spinning methods toward advanced applications. // RSC Adv. 2016; 6: 44687-44716.

127. Mironov A.V., Grigoryev A.M., Krotova L.I., Skaletsky N.N., Popov V.K., Sevastianov V.I. 3D printing of PLGA scaffolds for tissue engineering. // J Biomed Mater Res A. 2017; 105 (1): 104-109.

128. Mironov V., Visconti R.P., Kasyanov V., Forgacs G., Drake C.J., Markwald R.R. Organ printing: tissue spheroids as building blocks // Biomaterials. 2009; 30: 2164-2174.

129. Mirsaidov U., Timashev S.F., Polyakov Y.S., Misurkin P.I., Musaev I., Polyakov S.V. Analytical method for parameterizing the random profile components of nanosurfaces imaged by atomic force microscopy. // Analyst. 2011. 136 (3): 570-576.

130. Mochalov K.E., Efimov A.E., Bobrovsky A., Agapov I.I., Chistyakov A.A., Oleinikov V.A., Sukhanova A., Nabiev I. Combined Scanning Probe Nanotomography and Optical Microspectroscopy: A Correlative Technique for 3D Characterization of Nanomaterials. // ACS Nano. 2013; 7 (10): 8953-8962.

131. Moebus G., Inkson B.J. Novel Nanoscale Tomography Modes in Materials Science. // Microscopy and Microanalysis. 2003; 9: 176-177.

132. Mogilner A., Keren K. The shape of motile cells. // Current Biology. 2007; 19 (17): R762-R771.

133. Moore M.J., Jabbari E., Ritman E.L., Lu L., Currier B.L., Windebank A.J., Yaszemski M.J. Quantitative analysis of interconnectivity of porous biodegradable scaffolds with micro-computed tomography. // J Biomed Mater Res A. 2004; 71: 258-267.

134. Muller W.G., Heymann J.B., Nagashima K., Guttmann P., Werner S., Rehbein S., Schneider G., McNally J.G. Towards an atlas of mammalian cell ultrastructure by cryo soft X-ray tomography. // Journal of structural biology. 2012; 177: 179-192.

135. Nam J., Huang Y., Agarwal S., Lannutti J. Improved cellular infiltration in electrospun fiber via engineered porosity. // Tissue Eng. 2007; 13 (9): 22492257.

136. Narayan K., Subramaniam S. Focused ion beams in biology. // Nature Methods. 2015; 12: 1021-1031.

137. Neonatal Cardiomyocyte Isolation System: [сайт]. URL: http://www.worthington-biochem.com/NCIS/default.html (дата обращения: 14.12.2017].

138. Noy A., Vezenov D.V., Lieber C.M. Chemical Force Microscopy. // Annu. Rev. Mater. Sci. 1997; 27: 381-421.

139. Orlova Y., Magome N., Liu L., Chen Y., Agladze K. Electrospun nanofibers as a tool for architecture control in engineered cardiac tissue. // Biomaterials. 2011; 32: 5615-5624.

140. Panorchan P., Schafer B.W., Wirtz D., Tseng Y. Nuclear envelope breakdown requires overcoming the mechanical integrity of the nuclear lamina. // J Biol Chem. 2004; 279 (42): 43462-43467.

141. Perkins G., Renken C., Martone M.E., Young S.J., Ellisman M., Frey T. Electron tomography of neuronal mitochondria: three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts. // J Struct Biol. 1997; 119 (3): 260-272.

142. Pham Q.P., Sharma U., Mikos A.G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. // Tissue Eng. 2006; 12 (5): 11971211.

143. Rehse N., Marr S., Scherdel S., Magerle R. Three-Dimensional Imaging of Semicrystallme Polypropylene with 10 nm Resolution. // Advanced Materials. 2005; 17: 2203-2206.

144. Resch-Genger U., Grabolle M., Cavaliere-Jaricot S., Nitschke R., Nann T. Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels. // Nat. Methods. 2008; 5: 763-775.

145. Rezende R.A., Azevedo F.D.S., Pereira F.D., Kasyanov V., Wen X., de Silva J.V.L., Mironov V. Nanotechnological Strategies for Biofabrication of Human Organs Journal of Nanotechnology. // 2012; 2012: 149264.

146. Rog-Zielinska E.A., Johnston C.M., O'Toole E.T., Morphew M., Hoenger A., Kohl P. Electron tomography of rabbit cardiomyocyte three-dimensional

Ultrastructure. // Progress in Biophysics and Molecular Biology. 2016; 121 (2): 77-84.

147. Rust M.J., Bates M., Zhuang X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). // Nat. Methods. 2006; 3: 793796.

148. Samarel, A.M. Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. // American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 2005; 289 (6): H2291-H2301.

149. Schulze A., Hantschel T., Dathe A., Eyben P., Ke X., Vandervorst W. Electrical tomography using atomic force microscopy and its application towards carbon nanotube-based interconnects. // Nanotechnology. 2012; 23: 305707.

150. Sheets K., Wunsch S., Ng C., Nain A.S. Shape-dependent cell migration and focal adhesion organization on suspended and aligned nanofiber scaffolds. // Acta Biomater. 2013; 9 (7): 7169-7177.

151. Sill T.J., von Recum H.A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. // Biomaterials. 2008; 29: 1989-2006.

152. Squire J.M. Muscle contraction: Sliding filament history, sarcomere dynamics and the two Huxleys. // Global Cardiology Science and Practice. 2016; 2016 (2): 11.

153. Stachewicz U., Qiao T., Rawlinson S.C.F., Almeida F.V., Li W.-Q., Cattell M., Barber A.H. 3D imaging of cell interactions with electrospun PLGA nanofiber membranes for bone regeneration. // Acta Biomaterialia. 2015; 27: 88-100.

154. Sulkin M.S., Yang F., Holzem K.M., Van Leer B., Bugge C., Laughner J.I., Green K., Efimov I.R. Nanoscale three-dimensional imaging of the human myocyte. // J Struct Biol. 2014; 188 (1): 55-60.

155. Susha A.S., Caruso F., Rogach A.L., Sukhorukov G.B., Kornowski A., Mohwald H., Giersig M., Eychmuller A., Weller H. Formation of luminescent spherical core-shell particles by the consecutive adsorption of polyelectrolyte

and CdTe(S) nanocrystals on latex colloids. // Colloids Surf. A. 2000; 163: 3944.

156. Tait B.D., Süsal C., Gebel H.M., Nickerson P.W., Zachary A.A., Claas F.H.J., Reed E.F., Bray R.A., Campbell P., Chapman J.R., Coates P.T., Colvin R.B., Cozzi E., Doxiadis I.I., Fuggle S.V., Gill J., Glotz D., Lachmann N., Mohanakumar T., Suciu-Foca N., Sumitran-Holgersson S., Tanabe K., Taylor C.J., Tyan D.B., Webster A., Zeevi A., Opelz G. Consensus guidelines on the testing and clinical management issues associated with HLA and Non-HLA antibodies in transplantation. // Transplantation. 2013; 95 (1): 19-47.

157. Tanner B. C., Daniel T. L., Regnier M. Filament Compliance Influences Cooperative Activation of Thin Filaments and the Dynamics of Force Production in Skeletal Muscle. // PLoS Comput Biol. 2012; 8 (5): e1002506.

158. Tanner B. C., Daniel T. L., Regnier M. Sarcomere lattice geometry influences cooperative myosin binding in muscle. // PLoS Comput Biol. 2007; 3 (7): e115.

159. Teo W.E., Ramakrishna S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. // Nanotechnology. 2006; 17 (14): 89-106.

160. Teplenin A., Krasheninnikova A., Agladze N., Sidoruk K., Agapova O., Agapov I., Bogush V., Agladze K. Functional analysis of the engineered cardiac tissue grown on recombinant spidroin fiber meshes. // PLoS One. 2015; 10 (3): e0121155.

161. Thiele S., Vierrath S., Klingele M., Zengerle R. Tomographic Analysis of Polymer Electrolyte Fuel Cell Catalyst Layers: Methods, Validity and Challenges. // ECS Trans. 2015; 69(17): 409-418.

162. Van Bavel S.S., Loos J. Volume Organization of Polymer and Hybrid Solar Cells as Revealed by Electron Tomography. // Advanced Functional Materials. 2010; 20: 3217-3234.

163. Villarrubia J.S. Algoritms for scanned probe microscope image simulation, surface reconstruction and tip estimation // J. Res. Natl. Inst. Stand. Technol., 1997; 102 (4): 425 - 454.

164. Walther P., Muller M. Biological ultrastructure as revealed by high resolution cryo-SEM of block faces after cryo-sectioning. // Journal of microscopy. 1999; 196: 279-287.

165. Wang G., Leng Y., Dou H., Wang L., Li W., Wang X., Sun K., Shen L., Yuan X., Li J., Sun K., Han J., Xiao H., Li Y. Highly Efficient Preparation of Multiscaled Quantum Dot Barcodes for Multiplexed Hepatitis B Detection // ACS Nano. 2013; 7: 471-481

166. Webster T.J., Siegel R.W., Bizios R. Osteoblast adhesion on nanophase ceramics. // Biomaterials. 1999; 20: 1221-1227.

167. Westphal V. Rizzoli S.O., Lauterbach M.A., Kamin D., Jahn R., Hell S.W. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. // Science. 2008; 320: 246-249.

168. Wise S.G., Mithieux S.M., Weiss A.S. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. // Adv Protein Chem Struct Biol. 2009; 78: 1-24.

169. Withers P.J. X-ray nanotomography. // Materials Today. 2007; 10 (12): 26-34.

170. Wu M., Huang S. Magnetic nanoparticles in cancer diagnosis, drug delivery and treatment. // Mol Clin Oncol. 2017; 7 (5): 738-746.

171. Xia L., Sakban R.B., Qu Y., Hong X., Zhang W., Nugraha B., Tong W.H., Ananthanarayanan A., Zheng B., Chau I.Y., Jia R., McMillian M., Silva J., Dallas S., Yu H. Tethered spheroids as an in vitro hepatocyte model for drug safety screening. // Biomaterials. 2012; 33: 2165-2176.

172. Xue F., Janzen D.M., Knecht D.A. Contribution of filopodia to cell migration: a mechanical link between protrusion and contraction. // Int. J. Cell Biol. 2010; 2010: 507821.

173. Yamanaka M., Smith N.I., Fujita K. Introduction to super-resolution microscopy. // Microscopy. 2014; 63 (3): 177-192.

174. Yeung F., Li X., Ellett J., Trapman J., Kao C., Chung L.W. Regions of prostate-specific antigen (PSA) promoter confer androgen-independent expression of PSA in prostate cancer cells // J Biol Chem. 2000; 275: 4084640855.

175. Zankel A., Wagner J., Poelt P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. // Micron. 2014; 62: 66-78.

176. Zhang L., Sakai T., Sakuma N., Ono T., Nakayama K. Nanostructural conductivity and surface-potential study of low-field-emission carbon films with conductive scanning probe microscopy. // Appl. Phys. Lett. 1999; 75: 3527-3529.

177. Zlatanova J., Lindsay S.M., Leuba S.H. Single molecule force spectroscopy in biology using the atomic force microscope. // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2000; 74 (1-2): 37-61.