Транспортные свойства нанокластерных полиоксометаллатов, как потенциальных средств адресной доставки биологически активных веществ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Гагарин Илья Дмитриевич

• Гагарин Илья Дмитриевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Гагарин Илья Дмитриевич

1.2.3 Полимерные «нанокапсулы»

1.2.4 Углеродные наноструктуры

1.2.5 Проблемы и перспективы развития

1.3 Соединения молибдена. Нанокластерные полиоксометаллаты (ПОМ)

1.3.1 Классификация полиоксометаллатных кластеров

1.3.2 Механизм образования

1.3.3 Механизм образования «гигантских» ПОМов

1.3.4 Специфические свойства и связанные с ними применения ПОМ

1.3.5 Обобщение данных о ПОМ

1.4 Представления о строении кожи

1.5 Ионофорез (лекарственный электрофорез)

1.6 Модели чрескожного переноса вещества

1.6.1 Пассивный перенос

1.6.2 Учёт воздействия электрического поля в моделях переноса

1.6.3 Обобщение данных о рассмотренных моделях

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Методика синтеза {Мо132}

2.2 Методика синтеза {Мо72Ре30}

2.3 Методы аттестации ПОМ

2.4 Методы исследования кинетики разложения ПОМ в водных растворах

2.5 Методика измерения кислотности растворов

2.6 Методика исследования взаимодействия ПОМ с тиамина хлоридом в водном растворе методом спектрофотометрии

2.7 Методика получения сухих осадков ионных ассоциатов на основе ПОМ {Mo72Fe30} и тиамина хлорида (витамина В\) для исследования методом ИК спектроскопии

2.7.1 Приготовление рабочих растворов {Mo72Fe30} и витамина В\

2.7.2 Приготовление суспензий ассоциатов

2.8 Методика определения содержания витамина Б! в пробах водных растворов

2.9 Методика измерения Z-потенциала ассоциатов тиамин-{Мс>72Гезо}

2.10 Методика эксперимента по изучению ассоциации {Mo72Fe30} с альбумином и

её влиянию на процесс разложения {Mo72Fe30} в водных растворах

2.11 Методика экспериментов по электрофоретическому переносу {Mo72Fe30} и ассоциатов на его основе in vitro

2.11.1 Электрофоретический транспорт нанокластерного ПОМ {Mo72Fe30} и

его ассоциатов с лантаном и ПВП через кожу in vitro

2.11.2 Электрофоретический транспорт нанокластерного ПОМ {Mo72Fe30} и его ассоциатов с биологически активными веществами (витамином Б1? инсулином) через кожу in vitro

2.12 Методика численного моделирования процесса электрофоретического переноса ПОМ

2.12.1 Расчёт профиля концентрации переносимого вещества по глубине мембраны

2.12.2 Расчёт количества вещества, перенесённого через мембрану

2.12.3 Алгоритм поиска эффективного значения коэффициента диффузии

2.12.4 Оценка погрешностей численного решения

2.13 Методика оценки коэффициента разделения октанол-вода для ПОМ {Mo72Fe30}

2.14 Методика поиска значений коэффициента диффузии D и коэффициента разделения Kpart оптимизацией целевой функции

Глава 3. Обсуждение результатов

3.1 Изучение взаимодействия ПОМ {Mo72Fe3o} с биологически активными веществами

3.1.1 Выбор биологически активных веществ для экспериментов с ПОМ

3.1.2 Взаимодействие ПОМ {Mo72Fe30} с тиамина хлоридом (витамином Bi)

в водных растворах

3.1.3 Ассоциаты {Mo72Fe30} с тиамина хлоридом (витамином B1) в твёрдом состоянии

3.1.4 Возможность взаимодействия {Mo72Fe30} с инсулином

3.2 Взаимодействие {Mo72Fe30} с БСА в растворе. Влияние взаимодействия на скорость разложения ПОМ

3.3 Изучение электрофоретического транспорта нанокластерного ПОМ {Mo72Fe30} через кожу in vitro и in silica

3.3.1 Электрофоретический транспорт нанокластерного ПОМ {Mo72Fe30}, его ассоциатов с ионами La3+ и поливинилпирролидоном через кожу in vitro

3.3.2 Перенос нанокластерного ПОМ {Mo72Fe30} в составе ассоциатов с биологически активными веществами

3.3.3 in silica эксперименты по чрескожному переносу

Заключение

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Транспортные свойства нанокластерных полиоксометаллатов, как потенциальных средств адресной доставки биологически активных веществ»

Введение

Актуальность темы исследования. Сложно однозначно определить, кем и когда впервые была придумана идея адресной доставки лекарственных препаратов. Согласно распространённому мнению [1], концепция средства адресной доставки лекарств была сформулирована на рубеже XIX и XX вв. немецким врачом, микробиологом и биохимиком Паулем Эрлихом, предложившим термин «волшебная пуля». Очевидно, что понимание необходимости повышения избирательности воздействия лекарственных средств становится глубже с появлением всё более сильнодействующих препаратов. Открытие в 1928 году Александром Флемингом пенициллина ознаменовало собой начало эры антибиотиков. Это событие вполне заслуженно называют одной из «революций» в фармакологии, так как только с появлением антибиотиков стало возможным по-настоящему активно бороться с инфекционными процессами в организме человека и животных, не полагаясь только лишь на иммунную систему организма. В то же время, довольно скоро стало понятно, что антибиотические препараты оказывают токсическое воздействие не только на болезнетворные микроорганизмы. В той или иной степени от них страдают микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, и даже собственные клетки организма.

В ещё большей степени вышеупомянутая проблема побочных эффектов касается хи-миотерапевтических препаратов из группы цитостатиков. Ряд цитостатических препаратов обладает мутагенным, канцерогенным, общим токсическим действием и т. д. Всё это зачастую приводит к невозможности применения данных препаратов, поскольку доза необходимая для создания терапевтически эффективной концентрации в очаге патологического процесса может нанести организму неприемлемый ущерб.

Перспективным подходом к решению задачи адресной доставки лекарственных препаратов является создание «наноконтейнеров» или «нанокапсул» для переноса действующего вещества к месту назначения. На роль таких наноразмерных переносчиков претендуют: ли-посомы, магнитные наночастицы, полимерные наночастицы и т. д. Частицы такого относительно нового класса соединений, как нанокластерные полиоксометаллаты также рассматриваются в качестве возможного «транспортного средства» для адресной доставки веществ, обладающих биологической активностью.

Частицы полиоксометаллатов обладают в водном растворе отрицательным электрическим зарядом поэтому в качестве «полезной нагрузки» могут рассматриваться, например, катионные биологически активные вещества, а также соединения пептидной природы. Среди них - ряд гормональных препаратов, обеспечение контролируемого высвобождения которых представляет практический медицинский интерес, например инсулин.[2, 3, 4, 5] Кроме того, опубликованы исследования [6], показывающие возможность «перезарядки» анионов гигантских ПОМ, например, посредством ассоциации с катионами лантана, что расширяет возможности взаимодействия, в том числе и с препаратами анионной природы. Актуальной задачей является изучение способности нанокластерного ПОМ {Мо72Ре30} образовывать ас-социаты с различными биологически активными веществами, транспорт которых с помощью наноразмерных носителей может иметь практическое значение.

Одним из способов введения лекарственных препаратов в организм, повышающим, кроме прочего, локальность воздействия является лекарственный электрофорез. Электрофоре-тический метод введения может обладать рядом преимуществ, среди которых: создание в коже или иной ткани «депо» обеспечивающего замедленное поступление препарата в кровь или соседние ткани; низкая инвазивность метода; местный характер воздействия. Актуальным является исследование электрофоретического переноса как отрицательно заряженных частиц на основе ПОМ, так и перезаряженного ионами лантана (данный элемент выбран в качестве модельного) ассоциата, при соответствующей полярности подводимого напряжения. Последнее вызывает интерес ещё и потому, что может являться экспериментальным подтверждением «перезарядки» частицы ПОМ.

Вызывает интерес возможность оценивать количество введённого в организм таким методом вещества, его распределение в ткани. Шагом в этом направлении может стать подбор адекватной математической модели процесса переноса таких частиц.

Стоит отметить, что распространённой методикой, позволяющей направленно изменять свойства неорганических наночастиц, вводимых в организм, повышать их «биосовместимость», увеличивать время циркуляции в крови, является модификация наночастиц молекулами полимеров. В числе перспективных соединений для такого применения рассматривается поливинилпирролидон (ПВП).[7, 8, 9] Известно, что ПОМ {Мо72Ре30} способен образовы-

вать ассоциаты с ПВП [10], влияние такой ассоциации на возможность электрофоретического введения ПОМ также представляет интерес.

Важным преимуществом ПОМ {Мс72Ре30}, как потенциальной основы для систем адресной доставки биологически активных веществ в организме, является разложение до более простых продуктов с течением времени. Необходимо также упомянуть, что в предварительных исследованиях на животных и на культурах клеток не было обнаружено токсического действия данного ПОМ и продуктов его разложения.[11, 12, 13, 14] В то же время, для эффективного выполнения задачи доставки действующего вещества необходимо, чтобы частица-носитель сохраняла целостность на протяжении заданного времени в условиях внутренней среды организма. В связи с этим актуальной задачей является исследование влияния факторов внутренней среды организма на скорость разложения ПОМ {Мс72Ре30}.

Степень разработанности темы исследования. С момента открытия первого соединения [15], относимого к классу нанокластерных полиоксометаллатов, в 1998 году и открытия объекта данной работы - ПОМ {Мо72^е30} в 1999 году [16], эта группа веществ привлекла внимание множества исследователей по всему миру. В фокусе исследований оказались каталитические, магнитные, электрические и некоторые другие свойства. В несколько меньшей степени изучены на данный момент биологические свойства этих веществ. Работы, посвя-щённые исследованию свойств {Мо72Ре30} в контексте адресной доставки лекарственных препаратов немногочисленны. В работах указывается на перспективность исследований в данном направлении.

Целью работы является исследование физико-химических свойств {Мс72Ре30}, существенных для его использования в качестве переносчика биологически активных веществ в организме.

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить поведение нанокластерного ПОМ {Мс72Ре30} в растворах, приближающихся по свойствам к внутренним средам организма, определить параметры кинетики разложения ПОМ в таких растворах.

2. Изучить взаимодействие нанокластерного ПОМ {Мс72Ре30} с биологически активными веществами различной природы.

3. Изготовить электрофоретическую диффузионную ячейку для чрескожного переноса ex vivo. Изучить электрофоретический перенос через кожную мембрану ПОМ {Mo72Fe3o} как в неизменном виде, так и модифицированного биологически активными веществами (тиамина хлорид, инсулин), биосовместимым полимером (ПВП), катионами лантана La3+.

4. Используя модельное описание процесса чрескожного электрофоретического переноса ПОМ {Mo72Fe30} и ассоциатов на его основе через биологическую мембрану, оценить значения параметров данного процесса.

Научная новизна работы. Впервые получены ассоциаты ПОМ {Mo72Fe30} с биологически активными веществами (тиамина хлорид, инсулин). Ассоциат ПОМ с тиамина хлоридом исследован комплексом физико-химических методов (ИК-, КР-спектроскопия, лазерное светорассеяние).

Впервые проведено исследование кинетики разложения полиоксометаллата кеплерат-ного типа {Mo72Fe30} в среде, моделирующей внутренние среды организма (сыворотка крови). Показано существенное замедление разложения {Mo72Fe30} в сыворотке, по сравнению с буферным раствором со слабощелочным pH.

Выдвинуто предположение о том, что обнаруженная стабилизация ПОМ в растворе сыворотки крови связана со взаимодействием ПОМ с белками, содержащимися в сыворотке, в первую очередь - с альбумином.

В ходе дальнейших экспериментов явление стабилизации ПОМ {Mo72Fe30} в слабощелочном буферном растворе обнаружено также в присутствии бычьего сывороточного альбумина. Данный факт согласуется с выдвинутым ранее предположением.

Впервые показана возможность электрофоретического переноса тиамина в составе ас-социата с {Mo72Fe30} через кожную мембрану.

Модель электрофоретического транспорта через однородную мембрану с учётом коэффициента разделения донорный раствор/кожа впервые применена к процессу переноса ПОМ {Mo72Fe30} и его ассоциатов с другими веществами через кожную мембрану.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены экспериментальные данные по ассоциации ПОМ {Mo72Fe30}

[Mo™Feg10252(CH3C00)12 [Мо207(Н20)}2 [Н2Мо208(Н2О)} (Н20)91] ■ « ШН20

с такими биологически активными соединениями, как: тиамина хлорид (витамин B1), инсулин, что позволяет судить о возможности использования ПОМ {Mo72Fe30} в качестве «носителя» для этих, либо иных сходных по свойствам и строению веществ в системах адресной доставки или модифицированного высвобождения лекарств.

Получены экспериментальные данные по переносу ПОМ {Mo72Fe30} и его ассоциатов с биологически активными веществами через кожу под действием электрического поля in vitro. Это позволяет судить о возможности введения в организм ПОМ {Mo72Fe30} и его ассоциатов методом электрофореза.

Проведено исследование кинетики разложения ПОМ {Mo72Fe30} в средах, моделирующих биологические среды организма. Получены данные, указывающие на стабилизирующее действие белков сыворотки крови по отношению к ПОМ {Mo72Fe30} в водных растворах с нейтральной и слабощелочной реакцией. Это говорит о потенциальной возможности достаточно длительного существования ПОМ {Mo72Fe30}, выполняющего роль «носителя» для лекарственного препарата, во внутренней среде организма.

Основываясь на экспериментальных данных по переносу ПОМ {Mo72Fe30} и его ассо-циатов через кожу, провели расчёты коэффициентов диффузии, а также дали оценки коэффициентов разделения в приближённом представлении кожи, как однородной однослойной мембраны. Наличие модельных представлений о процессе переноса может быть необходимо для оценки количества переносимого через кожу и депонируемого в ней препарата.

Методы исследования. Процесс образования ассоциатов между ПОМ {Mo72Fe30} и биологически активными веществами в водных растворах изучался методом оптической спектроскопии. Дополнительная информация была также получена методом рН-метрии. Измерение размеров частиц осуществлялось методами статического и динамического лазерного светорассеяния. Измерение Z-потенциала осуществлялось методом электрофоретического светорассеяния (метод основанный на динамическом лазерном светорассеянии).

Образовавшиеся ассоциаты с тиамина хлоридом были исследованы в твёрдом состоянии с помощью ИК- и КР-спектроскопии.

Для изучения электрофоретического транспорта {Mo72Fe30} и ассоциатов на его основе через кожную мембрану in vitro использовалась оригинальная электрофоретическая установка подробно описанная в разделе 2.11.2.

Количество ПОМ {Mo72Fe30}, перенесённого через мембрану в процессе электрофореза, рассчитывалось по содержанию Mo и Fe в приёмных растворах, определённому методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой. Также методом элементного анализа жидких проб были получены оценки содержания ПОМ {Mo72Fe30} в кожных мембранах после экспериментов по электрофоретическому переносу. Методика оценки содержания витамина Б1 в приёмных растворах состояла из окисления тиамина до тиохро-ма, с последующим определением концентрации последнего посредством люминесцентной спектроскопии. Концентрации инсулина в приёмных растворах в соответствующих экспериментах определяли методом иммуноферментного анализа с помощью специализированного автоматического анализатора.

Для изучения переноса анионов {Mo72Fe30}, «перезаряженных» путём ассоциации к ним катионов La3+, к электродам прикладывалась разность потенциалов соответствующего знака («+» в донорном отсеке, «—» в приёмном).

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Кинетические параметры процесса деструкции полиоксометаллата {Mo72Fe30} в растворах, приближающихся по свойствам к внутренним средам организма;

2. Способность полиоксометаллата {Mo72Fe30} связываться с бычьим сывороточным альбумином (БСА), соотношение компонентов в ассоциате;

3. Стабилизирующее действие альбумина на {Mo72Fe30};

4. Способность к самопроизвольному образованию комплексов {Mo72Fe30} с биологически активными веществами (инсулин, тиамина хлорид) в водном растворе. Строение ассоциатов {Mo72Fe30} с тиамином в твёрдом состоянии;

5. Электрофоретический перенос {Mo72Fe30}, а также его ассоциатов с La3+, ПВП, биологически активными веществами через модельную мембрану.

6. Расчёт коэффициентов диффузии и профилей концентрации, с использованием модели одномерной однородной мембраны, на основе экспериментальных данных по электро-форетическому переносу {Mo72Fe30} и его ассоциатов через модельную мембрану.

Апробация результатов работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных мероприятиях:

1. XXV Российская молодёжная научная конференция «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». 22-24 апреля 2015 года, Екатеринбург.

2. 7th International Congress Nanotechnology in Biology & Medicine 6-8 April 2016, Krems an der Donau, Austria.

3. Experimental and computational biomedicine: Russian Conference with International Participation in memory of Professor Vladimir S. Markhasin. April 10-20, 2016, Ekaterinburg.

4. Vlll-th International symposium «Design and synthesis of supramolecular architectures» II-nd Youth school on supramolecular and coordination chemistry. April 25-29, 2016, Kazan.

5. 2018 Ural Symposium on Biomedical Engineering, Radioelectronics and Information Technology (USBEREIT). 7-8 May 2018, Yekaterinburg.

6. V Школа-конференция молодых учёных «Неорганические соединения и функциональные материалы» ICFM-2019. 30 сентября - 04 октября 2019 года, Новосибирск.

7. XXX Российская молодежная научная конференция с международным участием «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». 6-9 октября 2020 года, Екатеринбург.

8. XXXI Российская молодежная научная конференция с международным участием «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». 20-23 апреля 2021 года, Екатеринбург.

9. XXIII International Conference on Chemical Thermodynamics in Russia (RCCT - 2022). August 22-27, 2022, Kazan, Russia.

10. VI Международная научно-практическая конференция «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (MOSM 2022). 7-11 ноября 2022 года, Екатеринбург.

Степень достоверности научных результатов. Достоверность результатов обеспечена использованием современных физико-химических методов анализа, корреляцией ряда экспериментальных данных и результатов моделирования с информацией, имеющейся в литературных источниках.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями Работа выполнена в отделе химического материаловедения научно-исследовательского института физики и прикладной математики института естественных наук и математики Уральского федерального университета. Исследования, относящиеся к данной работе, проводились в рамках выполнения госзадания Минобрнауки РФ (проекты № 4.6653.2017/БЧ, № АААА-А20-120061990010-7), при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта № 15-03-03603), в рамках Программы повышения конкурентоспособности УрФУ (02.А03.21.0006, 14.594.21.0011).

Личный вклад автора заключается в поиске информации и подготовке обзора литературы по теме исследования, в планировании, подготовке и проведении экспериментов, а также анализе, интерпретации и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций, совместно с научным руководителем и коллегами.

Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 8 статьях в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus и рекомендованных ВАК для опубликования материалов кандидатской диссертации по специальности 1.4.4. Физическая химия (Химические науки), 1 патенте и тезисах 8 докладов на конференциях различного уровня.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (глава 2), результатов и обсуждения (глава 3), заключения, списка литературы. Число страниц машинописного текста в диссертации - 178, число рисунков - 54, число таблиц - 13. Число наименований в списке литературы - 285.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 История развития средств и методов адресной доставки биологически активных веществ

Можно предположить, что человечество осознавало проблему побочных эффектов лекарственных препаратов, и более широко - медицинского вмешательства, с древних времён. Это понимание отражено в широко известных примерах устного фольклора на разных языках. Если в случае местных лекарственных форм некоторая «направленность» действия обеспечивается самим способом применения, то в случае препаратов, которые в значимых количествах попадают в кровеносное русло вопрос обеспечения направленного действия стоит, пожалуй, более остро.

Идея адресной доставки лекарственных препаратов является логичным продолжением длительного пути развития подходов к созданию более эффективных и безопасных лекарственных средств. На этом сложном пути от чисто эмпирического «слепого» подбора действующих субстанций, оказывающих то или иное действие на весь организм, к современным идеям персонифицированной и адресной медицины, исследователи прошли ряд этапов последовательного приближения. Наиболее ранним способом «сужения» области воздействия лекарственного препарата являются, по всей видимости, лекарственные формы для местного применения. К ним помимо мазей, гелей и других традиционных форм, относятся также и относительно современные системы контролируемого высвобождения препаратов. Это лекарственные пластыри, специальные офтальмологические, гинекологические и другие системы на основе полимерных гелей, силикона и т. д. В случае использования таких лекарственных форм, разумеется, может быть обеспечена некоторая адресность воздействия в масштабе отдельных участков тела. Становится возможным существенно снизить концентрацию препаратов в органах и тканях удалённых от места воздействия. Актуально это, однако, в весьма ограниченных случаях, таких как воздействие на отдельные участки кожи, слизистые (глаза, ЛОР-органы, дыхательные пути, ЖКТ и т. д.). В тех же случаях, когда лекарственный препарат должен достигать внутренних органов, глубоколежащих тканей, такие лекарственные формы перестают быть эффективными, так как действующее вещество разносится током крови по всему организму, что сводит на нет адресность воздействия. Кроме того, даже

при применении на коже, слизистых и т. д. достигается лишь частичная адресность, ведь клетки на которые направлено воздействие соседствуют с теми, которые нежелательно ему подвергать. Так например, при лечении местного инфекционного процесса местными формами антибиотиков, воздействию, тем не менее, подвергаются и здоровые ткани, нормальная симбиотическая микрофлора слизистых оболочек и т. д.

Тем более, использование местных лекарственных форм теряет эффективность в том случае, когда цели воздействия не локализованы отдельными участками организма, либо представляют из себя микроскопические объекты. Подходящими примерами могут служить, например, болезнетворные микроорганизмы находящиеся в различных средах организма, опухолевые клетки и т. д. В связи с этим, на смену идее «местного» воздействия пришла идея адресной доставки лекарственных препаратов, в которой термин адресность понимается уже в контексте отдельных типов клеток, тканей, то есть микроскопических объектов, а не макроскопических областей организма. Ожидаемо, этот новый подход потребовал создания новых типов лекарственных препаратов, способных обеспечить такую адресность. Принципиально, такие средства, которые называют системами адресной доставки лекарств могут включать несколько функциональных блоков. Во-первых, молекулы непосредственно действующего вещества. Во-вторых, молекулы, отвечающие за распознавание «биологической мишени». В-третьих, других вспомогательных компонентов, таких, как структурообразующее ядро-носитель, защитные слои и т. д.

Allan S. Hoffman в обзорной статье The origins and evolution of «controlled» drug delivery systems [17] выделяет три «эры» в развитии систем адресной доставки лекарственных препаратов: «макро-эру», «микро-эру», «нано-эру».

«Макро-эра» развития средств контролируемой адресной доставки Данный период обязан своим названием размеру устройств, использовавшихся для доставки лекарств. Во времена «макро-эры» адресной доставки были созданы системы «контролируемого» высвобождения лекарственного вещества. Среди таких приспособлений: широко известные лекарственные пластыри, офтальмологические системы для контролируемого высвобождения противоглаукомных препаратов, приспособления на основе «силикона» для контролируемого высвобождения контрацептивных препаратов и системы на основе набухающих полимерных гелей. [17]

«Микро-эра» систем доставки с замедленным высвобожением, биоразлагаемых микрочастиц и фазово разделённых депо Биоразалагаемые полимеры для нанесения швов разрабатывались в 1960-х и 1970-х годах, в 1970-х эта технология была позаимствована исследователями в области адресной доставки лекарств и была доведена до клинического применения в 1980-х. Первопроходческая работа Langer и Folkman, которые показали, что белки могут выделяться из неразлагаемых полимерных матриц, вероятно, стимулировала многих людей к тому, что бы задуматься о других путях доставки таких лекарств, таких как «загрузка» и высвобождение подобных лекарств из биоразлагаемых полимеров. [17]

«Нано-эра» направленных или «местоспецифичных» систем доставки лекарств

Можно выделить три основополагающих технологии, относящиеся к данной «эре». Первая -концепция «ПЭГизации», то есть создания конъюгированных с молекулами ПЭГ лекарств. Вторая технология - «активное нацеливание» лекарства конъюгированного с антителами к клеточным рецепторам. [17] Третья технология - использование «эффекта усиленного проникновения и удержания» (enhanced permeability and retention (EPR) effect). Эффект заключается в задерживании наноразмерных носителей в твёрдой опухоли в следствии низкой плотности сосудов в быстро растущей опухоли. [18]

1.2 Обзор основных типов современных средств адресной доставки

Большинство из ныне разрабатываемых средств адресной доставки лекарственных препаратов относятся, согласно приведённой ранее классификации, к лекарствам «наноэры». Наночастицы в данном случае могут служить как непосредственно действующим агентом, так и «наноконтейнером», то есть переносчиком для действующего агента. В обоих случаях, при разработке «нанопрепаратов» решается ряд вопросов:

• устойчивость в организме;

• безопасность для организма;

• доставка к патологическим структурам;

• проникновение в патологические структуры (если требуется) и воздействие;

• выведение из организма (утилизация).

В случае с «наноконтейнерами», то есть в том случае, если наноструктура является переносчиком активного агента, к вышеупомянутым вопросам прибавляются следующие:

• предохранение переносимого агента от деструктивного воздействия среды организма;

• высвобождение активного агента при заданных условиях.

1.2.1 Везикулярные (липосомальные) формы лекарственных препаратов

В последние несколько десятилетий везикулы (липосомы) стали пожалуй самым популярным средством адресной доставки лекарственных препаратов.

Везикулярными или липосомальными называют лекарственные формы, в которых действующее лекарственное вещество находится внутри липосом.

Простейшая униламеллярная липосома представляет из себя близкую к сферической форме полую изнутри структуру образованную бислоем фосфолипидных молекул (Рисунок 1.1). Характерный размер может варьироваться в достаточно широких пределах от десятков нанометров до десятков микрометров.

Рисунок 1.1: Схематическое изображение простой униламеллярной липосомы (иЬУ) в разрезе. 1 - полярные части молекул фосфолипидов, 2 - неполярные части («хвосты») фосфолипидных молекул, 3 - внутренняя полость.

Человечество сталкивалось с материалами, которые содержат липосомы, задолго до формального открытия этих образований. Так в коллоидных системах на основе куриных яиц, в которых содержится лецитин, может присутствовать некоторое количество сферических везикул.[19]

Непосредственному открытию липосом предшествовали и, вероятно, поспособствовали многочисленные исследования и открытия. В частности, работы французского исследователя Н.Т. Гобли, который изучая состав ряда биологических образцов, таких как куриные яйца, икра рыб, ткани мозга животных и человека и т. д. пришёл к открытию лецитина.[20] Химическая природа лецитина была выяснена позже А. Штрекером.[21]

Липосомы были открыты в 60-х годах XX века. Британский исследователь Алек Бэн-гхем с коллегами изучали различные составляющие крови. В частности их интересовали особенности поведения дисперсий фосфолипидов. Исследуя результаты электронной микроскопии они обнаружили, что образующиеся многослойные структуры имеют очевидное сходство с мембранами биологических клеток.[19, 22, 23] Поняв важность открытия, Бэн-гхем с коллегами стал изучать проницаемость полученных мембранных структур по отношению к различным ионам. Их исследования продемонстрировали, что мембраны липосом слабопроницаемы для ионов и крупных молекул, но хорошо проницаемы для воды и низкомолекулярных неэлектролитов.[19, 24]

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гагарин Илья Дмитриевич, 2023 год

Источник

Роговой слой

Испарение

•

■тГ. • Диффузия

Растворение 1

Разделение К

БС/зге

Связывание и депонирование

Диффузия Б8С Разделение К8с/згс

К

8С

Живые слои эпидермиса

Рецепторы

Метаболизм Диффузия

К

ер1

Дерма

Рецепторы

Связывание и депонирование

Метаболизм Диффузии Бёег

Системный кровоток

К

ёег

Подкожная клетчатка

Рисунок 1.15: Схема процессов, протекающих в коже при чрескожном введении препаратов

В частном случае, когда в рассматриваемой области отсутствуют источники и стоки вещества, то есть -к = 0

ВС

— + = 0 (1.8)

и соответственно имеем

ВС

— + V- [-ВУС] = 0. (1.9)

Стационарный режим может быть достигнут при постоянных условиях и только по

прошествии определённого времени, которое для диффузии через однородную мембрану со-к2

ставляет ——, где к — толщина мембраны, И — коэффициент диффузии.[159, 160, 161, 162, 163]

При наличии нескольких фаз, что имеет место в случае чрескожного введения вещества необходимо учитывать второй процесс — разделение. Этот процесс характеризуется условием равновесия на границе двух фаз:

КА/в -Св = СА, (1.10)

где КА/в — коэффициент разделения, С а — концентрация вещества на границе в фазе А, С в — концентрация вещества на границе в фазе В.

Метаболизм и удаление из системы (третий процесс) учитываются в слагаемом ж. В случае, если в системе имеют место только процессы, скорость которых линейно зависит от концентрации вещества ж = д — кС, имеем:

ВС

+ V- [—DVC] + кC = (1.11)

где — константа скорости процесса, которая характеризует количество вещества удаляемого из или добавляемого в систему в единицу времени, слагаемое — заключает в себе источники и стоки не зависящие от концентрации вещества.[27] Уравнения такого типа для нескольких веществ претерпевающих взаимные превращения образуют систему уравнений. В случае двух веществ имеем:

§-С°А + А ■ [—] = —к°АС°А + к\С\ ? . (1.12) ° "Л г ~>1 _ иО гуО ,1^1

-С1А + А ■ [—Б1аС1а] = к°АС°А — к\С1А

т

В данном случае, оба сорта частиц переносятся посредством диффузии но с разными коэффициентами диффузии И0А и И А. Константы кА и кА описывают превращения между двумя компонентами.

Данное описание процесса очень схоже с описанием четвёртого процесса — связывания. Если подразумевать под СА и СА концентрации свободного и связанного вещества, соответственно. Обычно считают, что связанные частицы неподвижны, то есть И'А = 0. Это процесс обратимой адсорбции, условие равновесия которого задаётся, как:

Процесс является необратимым в том случае, когда любая из констант зануляется. Необходимо отметить, что вышеприведённая схема является упрощённой. Чтобы получить линейную систему уравнений необходимо принять несколько упрощений. В частности, пренебрегают ролью связывающего агента в процессе связывания. Считают, что связывающий агент присутствует в избытке и его «ёмкость» не ограничена.

Уравнения (1.12) описывают связывание в общем случае. В случае медленного связывания константы к°А и кА малы и связывание может служить лимитирующей стадией процесса переноса. В случае быстрого связывания, константы скорости большие, что позволяет ещё упростить систему. В таком случае уравнения (1.12) заменяются соответственно на уравнение (1.13) и следующее уравнение:

Описание процессов не будет являться полным без определения начальных и граничных условий. Их выбор в существенной мере зависит от конкретной ситуации. Чаще всего предполагают, что мембрана в начальный момент времени не содержит транспортируемого вещества. То есть:

к0 Г0 = к1 Г1

(1.13)

(1.14)

С (0,ж) = 0

(1.15)

для всех точек х внутри мембраны.

Условие идеального стока представляется, как:

С (Ь,Х) — С3гпк — 0

(1.16)

Различные уровни описания кожи

1. Процессы на уровне молекул (макромолекул) (1-10 нм), т.е. уровень липидных бислоёв.

2. Процессы на субклеточном (0,1 мкм) или клеточном (1 — 10 мкм) уровне.

3. Процессы на уровне мембраны (0,1 — 1 мм), т.е. количества вещества прошедшего на определённую глубину в экспериментах с диффузионной ячейкой.

4. Процессы на уровне компартмента/организма. Т.е. количества вещества прошедшего через мембрану в экспериментах с диффузионной ячейкой или в организм в экспериментах in vivo.

1. Молекулярный 2. Клеточный 3. Уровень 4. Уровень компартмента/

уровень уровень мембраны организма

Рисунок 1.16: Уровни детализации моделей чрескожного переноса

Модели, описывающие процесс чрескожного переноса на 3-м и 4-м уровнях, называют макроскопическими. Они обычно описывают источник вещества и кожу, как последовательность однородных слоёв мембраны (например: источник вещества/эпидермис/дерма), через которые происходит диффузия. Параметры, которые используются в таких моделях, являются усреднёнными по соответствующему объёму (слой, ткань, компартмент). Описание процесса переноса на 1-м и 2-м уровнях осуществляется микроскопическими моделями.[159] Таким образом мы можем выделить основные параметры классификации моделей чрес-кожного переноса вещества:

Масштаб детализации Макроскопический Микроскопический

Тип процесса Стационарный (установившийся) Нестационарный (переходный)

Размерность Ш 2Б 3Б

Наличие дополнительных действующих сил Отсутствуют Электрофорез, фонофорез и др.

Таблица 1.1: Основные параметры классификации моделей

Отдельным подклассом макроскопических моделей являются фармакокинетические (компартментные) модели.[165, 166, 167] В таких моделях слои кожи, а также источник и сток вещества представляются своего рода «резервуарами», называемыми также компарт-ментами. Концентрация переносимого вещества внутри одного компартмента считается одинаковой по всему его объёму.

Рассмотрим отдельный пример такой модели. В работе [165] рассматривается простая фармакокинетическая модель чрескожного переноса. В модель входят 4 компартмента (Рисунок 1.17): источник препарата (на поверхности кожи), роговой слой эпидермиса, «живые» слои кожи, кровеносные сосуды. В данном случае каждый компартмент характеризуют два параметра: концентрация вещества в нём и его объём. Каждую стадию процесса переноса характеризует соответствующая константа скорости первого порядка (к1, к2, к3, к4)

Поверхность кожи Роговой слой "Живые" слои кожи к2 Кровеносные сосуды

к1 ►

кз Л

Г

Рисунок 1.17: Компартменты в простой фармакокинетической модели чрескожного переноса

Константа к1 здесь характеризует стадию абсорбции препарата. Предполагается, что её значение определяется диффузией через роговой слой. Таким образом численная оценка для к1 может быть получена из соотношения /к2зс, где есть коэффициент диффузии

препарата в роговом слое толщиной hsc • Экспериментально значение константы к\ может быть оценено в in vitro диффузионных экспериментах на изолированном роговом слое, либо в in vivo экспериментах, например с использованием различных меченных молекул (радиоактивные метки, флуоресцентные метки и т. д.)

Константа скорости к2 характеризует проникновение препарата через слои кожи следующие за роговым, то есть содержащие большее количество воды «живые» слои эпидермиса и верхнюю часть дермы. Её значение, по аналогии с константой к\, также связывают с коэффициентом диффузии отнесённым к квадрату длины диффузионного пути, то есть Dved/hyED, где Dved — коэффициент диффузии в «живом» эпидермисе и дерме, а hvED — толщина рассматриваемого слоя кожи.

Константа скорости к3 необходима для учёта эффекта накопления в эпидермисе, её значения будут существенными для препаратов с высокой липофильностью, то есть имеющих большее сродство к гидрофобному роговому слою, нежели к более глубоким гидрофильным слоям кожи.

В данной модели концентрации препарата в подкожных капиллярах и системном кровотоке считаются одинаковыми, таким образом константа скорости к4 является фактически константой скорости выведения препарата из организма.[27]

В такой постановке задача описывается системой обыкновенных дифференциальных уравнений первого порядка:

dC\

dt

-k\Ci

^ = £к1С1 - к2С2 + £кзСз

ИГ V ^ , (1.17)

—ТТ = 77к2С2 - (кз + к4)Сз ах У3

^ = Уз с

где Уг и Сг это, соответственно, объём 1-го компартмента и концентрация препарата в нём. Такая система поддаётся аналитическому решению и концентрации в каждом компартменте могут быть выражены, как функции от времени.[165, 166]

Примером более сложного подхода может служить гибридная диффузионно-фармако-кинетическая модель предложенная в работе [168]. Она состоит из двух слоёв кожи, описываемых с диффузионной точки зрения и двух обособленных областей (компартментов)

Схематическое представление данной модели приведено на рисунке 1.18. Концентрация вводимого препарата на поверхности рогового слоя эпидермиса считается постоянной

Кожа

Источник

A

<D

Й и

со «

и

и

« (J

S &

£ « оо

с

Ci, D,

со S Ч О

ю й н

<D

cd

§ Q

§ w

Я ^ S w

^ AI

4-B

i

<-C-

C2, D2

0

h

H

x

Центральные Периферичес сосуды кие сосуды

k12 ^

X Y

Vi V2

k?i

k Выведение —-►

Рисунок 1.18: Схема гибридной диффузионно-фармакокинетической модели чрескожного переноса

Несмотря на реальную многослойность структуры кожи, в данной модели она рассматривается, как состоящая из двух слоёв. Такое упрощение считается допустимым, в частности на основании данных приведённых в работах [156, 157]. Из них можно сделать вывод, что роговой слой эпидермиса и живой эпидермис существенным образом отличаются друг от друга по свойствам, определяющим распределение препаратов. В то же время различия в распределении препаратов между живым эпидермисом и дермой не столь существенны. Таким образом представляется возможным выделять два слоя: первый включает роговой слой эпидермиса (SC от лат. stratum corneum), второй включает в себя живые слои эпидермиса и дерму (обычно означается, как VS (от viable skin) или VED (от viable epidermis + dermis)).[27]

Рассмотрим более детально процессы, учитываемые в данной модели. Вводимый препарат подвергается разделению на внешней границе рогового слоя эпидермиса и проникает в него. В роговом слое он также может частично связываться. Процесс связывания в рамках данного подхода описывается моделью двойной сорбции основанной на изотерме Ленгмюра [169, 170, 171]. Далее препарат претерпевает процесс разделения на границе между роговым слоем и живой кожей. В живой коже имеют место процессы метаболизма. В рассматриваемой модели принята следующая схема превращений: А ^ В ^ С. Ферментативные реакции как правило подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен. Также учитывается простое конкурентное ингибирование.

Метаболиты В и С, вырабатываемые в живой коже диффундируют как в приёмный компартмент (в кровоток), так и назад в роговой слой, данный процесс описывается первым уравнением Фика. В целом, скорость обратной диффузии в роговой слой довольно низкая в силу низкого коэффициента диффузии в роговом слое. Однако, обратная диффузия всё же учитывается, так как именно роговой слой в существенной мере определяет накопление препарата в коже.

Препараты, прошедшие через живую кожу, попадают в компартменты, описывающие организм (кровеносное русло и ткани). В рассматриваемой модели используются два ком-партмента, кинетика выведения препаратов из организма описывается уравнениями первого порядка.

Массовый баланс метаболитов А, В и С в коже описывается системой дифференциальных уравнений:

1 + -^ § = - ^ (1.18)

(1 + даСау) дь дх \ дх ) Ва + Са

{

1 +

Рь

(1 + ЧьСь)2

ЛдСъ = / ь дОЛ

/ дЬ дх \ дх )

+

МаСа Ва + Са

Мь Сь

0+ЮВ*+а

Г1-19)

(1+ * № = Цп д-Сс.)

\ + (1 + дсСст дх\ с дх )

МЬСЬ

+ ^-тг^- (1.20)

(1+а

1 + + СЬ

Здесь р и д — константы скорости связывания из модели двойной сорбции, С — концентрация вещества в коже, Ь — время, х — пространственная координата, П — коэффициент диффузии, М и В — кинетические параметры Михаэлиса-Ментен, К — константа ингиби-рования. Уравнения (1.18), (1.19), (1.20) применимы как к роговому слою (0 < х < К) без метаболизма, так и живой коже (К < х < Н) без связывания (р = д = 0).

При низкой концентрации вещества А уравнения (1.18), (1.19), (1.20) можно свести к следующим:

{1 + (ГТ^ } £ = дх {п£) -ЬС. (1.21)

{1+(Т+^} ддС = I + ЬС.-м (1.22)

{1 + 11^} Ж = + ^ (,23)

Здесь к — константы скорости ферментативных реакций в «живых слоях кожи». В общем случае коэффициент диффузии является функцией пространственной координаты (х), времени ( ) и концентрации (С):

П = 1(х,1,С) (1.24)

Однако, в данной и большинстве других моделей используется предположение о том, что диффузионные характеристики кожи не меняются в течении эксперимента. Таким образом

коэффициент диффузии является функцией только пространственной координаты:

г(0 < ж < h; SC) Вг = { К - - (1.25)

(D2i(h<x <Н; US)

При этом, в силу неоднородности строения, в особенности для рогового слоя, коэффициент диффузии D, разумеется, необходимо рассматривать как эффективное значение.[27]

Константы скорости к\ и к2 ферментативных реакций А ^ В ^ C ^ в общем случае зависят от времени, в особенности, это может проявляться в экспериментах in vitro. Это может быть связано с процессами инактивации ферментов. В рассматриваемой модели [168] предполагается, что константа скорости экспоненциально уменьшается с течением времени.

к = Z exp(-Ajt) г=1, 2 (1.26)

Скорость переноса препарата через кожу можно выразить, как:

(т=(127)

Количество вещества прошедшего через единицу площади кожи выразится, как:

Qi = / ( ^ ) dt= I ( dt.

Jo \dt ) i U dx J х=н

В модели двух компартментов (Рисунок 1.18) концентрация вводимого препарата в плазме крови для центральных сосудов выразится как:

Л(ХУ~ = (Щ ^ + к21¥У2 - к12ХУ' - КеХУъ (1.29)

где Х — концентрация в центральных сосудах, V — концентрация в периферических сосудах, У и У2 — концентрации в центральных и периферических сосудах соответственно, ва — площадь поверхности кожи, через которую осуществляется введение препарата. Для периферического компартмента имеем:

= к^ХУг - к2г¥У2. (1.30)

Стоит также кратко упомянуть о так называемых QSPR (от англ. quantitative structure-property relationship — количественное соотношение структура-свойство) моделях. Данный класс моделей нельзя в полной мере отнести к макроскопическим или микроскопическим моделям. Суть метода QSPR состоит в предсказании кинетики чрескожного переноса некоторого вещества с известной молекулярной структурой, основываясь на статистическом анализе экспериментально определённых параметров кинетики для ряда других веществ. Для этого используются большие наборы экспериментальных данных, такие как набор данных Флинна (англ. Flynn's dataset)[172, 173, 174], включающий в себя данные по чрескожному переносу для 94 веществ, и ряд других наборов данных.[175, 176, 177] В последние годы данный класс моделей получил новый толчок к развитию, благодаря существенному прогрессу в методах машинного обучения, в особенности, широкому внедрению в практику использования искусственных нейронных сетей (ИНС). Чаще всего, данный тип моделей демонстрирует хорошую точность предсказания свойств для веществ, близких по строению к веществам, использованным для «обучения» модели. Как правило, речь идёт об органических веществах.

1.6.2 Учёт воздействия электрического поля в моделях переноса

Как можно видеть, воздействие электрического поля на процесс чрескожного переноса вещества может быть весьма существенным и, в ряде случаев, определяющим.

Как уже было показано ранее, существующие модели чрескожного переноса вещества существенно отличаются друг от друга по детализации, характерным масштабам рассматриваемых явлений и т. д. То же в полной мере касается и моделей электрофоретического переноса. По сути, они являются расширением моделей свободного переноса, в которых помимо градиента концентрации учитывается также наличие электрического поля. Рассмотрим существующие подходы к моделированию чрескожного переноса заряженных частиц при воздействии электрического поля.

Прежде всего отметим, что процессы, имевшие место в случае свободного переноса вещества за счёт разности концентраций (активностей), будут иметь место и в случае ионофо-реза. Рассмотрим ион с зарядом Zi и коэффициентом диффузии Dj, находящийся в растворе с концентрацией Cj. Со стороны постоянного электрического поля с напряжённостью Е на

него воздействует сила ^е Е (е — элементарный заряд). Скорость движения иона в среде под действием этой силы определяется соотношением и = ^ггвЕ, где 7 — есть подвижность иона, выражающаяся через коэффициент диффузии с помощью соотношения Эйнштейна.

ПР

7* = -Г (1-31)

Электромиграция ионов, то есть их движение под действием электрического поля описывается следующим уравнением:

( = П^еЕ а = П^РЕСг

Уг )тгдг = ^ = —Т ' (132)

Полный поток частиц г-го сорта в движущейся среде при наличии диффузии и миграции равен:

П-х-ЕР

]г = Сгу - пгУСг + (1.33)

где V- скорость потока жидкости, и слагаемое с¿V, таким образом, описывает вклад конвективного переноса. Используем уравнение закона сохранения вещества:

д С

ж = - а1у у (1.34)

Подставив в него выражение для полного потока, получим:

С П Р

+ (г;У)Сг = ПгАСг + йу(СгЕ) (1.35)

или:

д С

+ (г;У)Сг = ПгАСг + 7^у(СгЕ). (1.36)

В общем случае, не только концентрация, но и напряжённость поля, и коэффициент диффузии могут являться функциями от пространственной координаты. Учёт этих зависимостей, однако, приводит к существенному усложнению решения задачи. Поэтому, в реальных расчётах, как правило, прибегают к определённым упрощениям.[123, 178, 179]

Так, обычно пренебрегают зависимостью коэффициента диффузии и напряжённости электрического поля от пространственной координаты. Кроме того, нередко пренебрегают конвективным переносом вещества.[ 149, 150, 180] Таким образом, уравнение (1.35) принимает

f = АДС, - ^VG. (1.37)

Примером модели чрескожного переноса под действием электрического поля может служить работа [181].Кожа в данной модели представлена в виде двухслойной мембраны. Первый слой — роговой (лат. stratum corneum). Второй слой включает живой эпидермис и дерму (лат. vivens epidermis et dermis) — то есть слои, состоящие из живых клеток, в отличии от рогового слоя. В роговом слое учитывается связывание (англ. binding), в живых слоях кожи учитывается метаболизм. Уравнение (1.35) для переноса частиц единственного типа в роговом слое (сокращение — SC) тогда преобразуется следующим образом:

{' + (Т+Ы ^ = Dsc ДС- + ^ VC - („V)C«, (1.38)

Здесь p,q — константы скорости связывания, Csc = Csc(х, t) — концентрация переносимого вещества в роговом слое, Dsc — коэффициент диффузии в роговом слое. Связывание описывается моделью двойной сорбции на основе изотермы Ленгмюра [169]. То же для живых слоёв кожи (сокращение — VED):

dCvED ^ d2CvED dCvED MaCvED ,л

~dT = DvED^2T- - - B+CvED, (L39)

Cved = Cved(х, t) концентрация переносимого вещества в живых слоях кожи, Dved — коэффициент диффузии в живых слоях кожи, Ма, В — параметры метаболизма. Метаболизм описывается кинетикой Михаэлиса-Ментен.

Граничные условия задаются следующим образом:

• Концентрация на внешней границе рогового слоя (х = 0) составляет Csc(0, t) = Co, то есть концентрация источника постоянна во времени.

• На границе роговой слой/живые слои кожи (х = h) имеет место процесс разделения Csc = Ksc/vEDCvED.

• Условие непрерывности на границе задаётся как:

- Dsc + Vsc Csc = - Dved dc^ED + wed Cved . (1.40)

U/Uy U/Uy

Суев = 0. (1.41)

Начальные условия (£ = 0):

С(х, 0) = 0 : (0 < х <Н). (1.42)

1.6.3 Обобщение данных о рассмотренных моделях

С уверенностью можно утверждать, что рассмотренный выше список моделей чрес-кожного переноса не является исчерпывающим, однако и в рамках перечисленных моделей можно видеть существенные различия в уровне детализации процесса, количестве учитываемых явлений, числе входных параметров модели. Вопрос разумного выбора модели должен, вероятно, строиться на балансе между степенью подробности описания, требуемой для решения конкретной задачи и количеством экспериментально определяемых входных параметров, необходимых для применения той или иной модели. Нужно также учитывать значительную естественную вариативность свойств биологических объектов - параметры кожи, как животных, так и человека могут заметно различаться, как между различными индивидуумами, так и у одного индивидуума, в зависимости от физиологического состояния, предшествовавших манипуляций и т. д. Данное обстоятельство ограничивает практическую ценность сложных моделей, так как высокая точность описания процесса может нивелироваться неточностью задания входных данных. Экспериментальное определение многих параметров, входящих в наиболее детализированные микроскопические модели, может быть достаточно трудоёмким. К таким параметрам можно отнести коэффициенты разделения между отдельными слоями кожи и между их компонентами для исследуемого транспортируемого вещества, а также различные коэффициенты диффузии в разных областях кожи. В связи с вышесказанным, использование относительно простых моделей чрескожного электрофореза, таких как модель однородной мембраны, может быть уместным для получения некоторых количественных оценок характеристик данного процесса.

2.1 Методика синтеза {Мо132}

При синтезе нанокластерного полиоксометаллата структуры кеплерата {Мо132} использовали известную методику [15].

Были использованы следующие реактивы:

• гидразина сульфат (N2H • H2S04) квалификации «ч. д. а.»;

• гептамолибдат аммония четырёхводный ((NH4)6Мо7024 • 4H2O) квалификации «ч. д.

а.»;

• ацетат аммония (CH3COONH4) квалификации «ч.»;

• уксусная кислота (CH3C00H) ледяная квалификации «х. ч.».

Навески (NH4)6Мо7024 • 4Щ0 (5,6 г) и CH3C00NH4 (12,5 г) растворяли в 250 мл дистиллированной воды. К полученному прозрачному бесцветному раствору добавляли навеску гидразина сульфата (0,8 г). После этого перемешивали полученную смесь на магнитной мешалке в течение 10 минут. Наблюдали постепенное изменение окраски раствора на голубую (зеленовато-голубую). По окончанию перемешивания к раствору добавили 83 мл 50%-ой уксусной кислоты. Смесь (тёмно-зелёного цвета) хранили в химическом стакане либо конической колбе в тёмном месте при комнатной температуре. Цвет смеси постепенно менялся на тёмно-коричневый. Через 4 дня смесь отфильтровывали через фильтр Шотта (стеклянный фильтр). Образовавшиеся кристаллы полиоксометаллата {Мо132}, отделённые от маточного раствора, промывались последовательно: двукратно этанолом, однократно диэтиловым эфиром. Отделённые кристаллы сушили на воздухе.

2.2 Методика синтеза {Мо72Ге30}

При синтезе нанокластерного полиоксометаллата структуры кеплерата {Mo72Fe3o} использовали известную методику[16].

Были использованы следующие реактивы:

• хлорид железа шестиводный (FeCI3 • 6H20) содержание основного вещества 97—102%

(Panreac Quimica SAU, Испания);

• ацетат натрия трёхводный (CH3C00Nа • 3H20) квалификации «ч. д. а.»;

• кислота соляная (HCl) квалификация «ос.ч.»;

• нанокластерный полиоксометаллат {Мо\32};

• хлорид натрия (NaCl) квалификации «х. ч.».

Навески FeC 13 ■ 6H20 (1,1 г) и CH3C00Na ■ 3H20 (1,1 г) растворили в 75 мл дистиллированной воды. Полученный раствор тёмного красновато-оранжевого цвета прилили к навеске {Моi32} (1,4 г). Полученную смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 24 часов. По прошествии 24 часов к смеси добавили 1М раствор HCl в объёме 1 мл и навеску NaCl 2 г. Наблюдали частичное осветление смеси. Далее, реакционную смесь нагревали при постоянном перемешивании до температуры 90 — 95°С, при этом наблюдали дальнейшее осветление смеси до жёлтой окраски. По достижении необходимой температуры смесь быстро, не давая ей остыть, пропускали через фильтр Шотта (стеклянный фильтр). Маточный раствор прозрачный от золотисто-жёлтого до оливкового цвета переливали в химический стакан или коническую колбу и оставляли при комнатной температуре в тёмном месте. Наблюдали формирование ромбических кристаллов жёлто-оливкового цвета на дне и стенках сосуда. Через 3 дня кристаллы были выделены из раствора и дважды промыты холодной водой на стеклянном фильтре.

2.3 Методы аттестации ПОМ

Аттестацию ПОМ осуществляли с использованием методов ИК (Nicolet 6700, Thermo Scientific) и КР (Alpha 300 AR, WiTec) спектроскопии. Полученные спектры сопоставляли с данными, приведёнными в литературе [16] для образца, структура которого первоначально была разрешена методом монокристальной рентгеновской дифрактографии [16]. Кроме того, в качестве вспомогательного метода использовали элементный анализ на Mo и Fe (iCAP 6500 Duo, Thermo Scientific).

2.4 Методы исследования кинетики разложения ПОМ в водных растворах

Концентрацию ПОМ в водных растворах определяли методом спектрофотометрии. Применимость данного метода для исследования кинетики разложения {Mo72Fe30} в водных растворах обосновывается в работах [182, 183]. Известно, что в определённом диапазоне концентраций зависимость оптической плотности раствора {Mo72Fe30} на длине волны

325 нм, принимаемой за характеристическую, от концентрации подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.[100] Линейный характер такой зависимости был подтверждён и в рамках выполнения настоящей работы (Рисунок 2.1).

Рисунок 2.1: Зависимость оптической плотности водного раствора {Mo72Fe30} от концентрации на характеристической длине волны 325 нм.

В свою очередь, оптическая плотность исследуемых растворов измерялась с помощью спектрофотометров HeXios-a, Shimadzu UV-1800 и Shimadzu UV-1900. Исследуемые растворы помещали в кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 1 см.

2.5 Методика измерения кислотности растворов

рН-метрию исследуемых растворов осуществляли с помощью лабораторного иономе-ра рХ-150 МИ в комплекте с индикаторным стеклянным электродом ЭС-10601 и хлорид-серебряным электродом сравнения ЭСр-10103. Электрод заполнялся раствором KCl 3М.

2.6 Методика исследования взаимодействия ПОМ с тиамина хлоридом в водном растворе методом спектрофотометрии

Методом точной навески готовили исходный раствор |Мо72Ре30} с концентрацией 6,25 х 10-5М. Ввиду того, что растворение {Мо72Ее30} происходит достаточно медленно, приготавливаемый раствор в закрытой мерной колбе оставляли перемешиваться на магнитной ме-

шалке на несколько часов, но не более суток. Исходный раствор тиамина хлорида (DSM Nutritional Products) с концентрацией 2,5 х 10-3М готовили методом точной навески непосредственно перед использованием. Образцы растворов ассоциатов для спектроскопического исследования готовили из исходных растворов {Mo72Fe30} и тиамина хлорида, добавляя необходимое количество воды. Для приготовления всех растворов использовалась дистиллированная вода. Спектры электронного поглощения для исследуемых образцов получали на спектрофотометре HeXios-a не позднее, чем через два часа после приготовления.

2.7 Методика получения сухих осадков ионных ассоциатов на основе ПОМ {Мo72Fе30} и тиамина хлорида (витамина В) для исследования методом ИК спектроскопии

2.7.1 Приготовление рабочих растворов {Мo72Fe30} и витамина В\

Для приготовления рабочего раствора ПОМ {Мo72Fе30} на аналитических весах брали навеску 0,25 г нанокластера. Эту навеску переносили в мерную колбу на 100 мл и добавляли дистиллированной воды до метки. Взбалтывали. Смесь оставляли перемешиваться на магнитной мешалке в течение 12 часов. После этого, в случае необходимости, доводили объём раствора до 100 мл. В итоге получали раствор золотисто-жёлтого цвета с молярной концентрацией нанокластера 1,34 • 10-4М, в некоторых случаях наблюдалась незначительная опалесценция.

Для приготовления рабочего раствора витамина В на аналитических весах брали навеску порошкообразного витамина В (тиамина хлорида) массой 0,575 г. Навеску переносили в мерную колбу на 25 мл и наливали дистиллированную воду до метки. Взбалтывали. Наблюдали полное растворение тиамина хлорида в воде. После этого, в случае необходимости, доводили объём раствора до 25 мл. Получали раствор с молярной концентрацией витамина В 7 • 10-2М.

2.7.2 Приготовление суспензий ассоциатов

В стеклянный стакан переносили аликвоту 65 мл рабочего раствора {Мo72Fе30}, затем 2,5 мл дистиллированной воды, и 2,5 мл рабочего раствора витамина В. Наблюдали помутнение смеси.

Далее наливали 15 мл смеси в пластиковую пробирку и осаждали взвесь, центрифугируя в пробирке в течении 10 минут при скорости вращения ротора 10000 оборотов в минуту. После этого аккуратно сливали надосадочный слой жидкости, добавляли к осадку новую порцию смеси, и повторяли центрифугирование. Такую процедуру проводили до тех пор, пока не была израсходована вся смесь.

В итоге получали влажный светло-жёлтый пастообразный осадок.

После этого полученные осадки сушили при температуре 45°С до постоянства массы в сушильном шкафу. После стабилизации массы, снимали ИК спектры отражения образцов.

2.8 Методика определения содержания витамина Бх в пробах водных растворов

При определении концентрации тиамина в водной среде использовали хорошо известный подход, основанный на количественном окислении тиамина до его люминесцирующего

Рисунок 2.2: Осадок ионного ассоциата {Мо72} + витамин В\

производного - тиохрома [184, 185] (Рисунок 2.3), с дальнейшей экстракцией и флюориметри-ческим определением концентрации последнего. Данный подход применяется, с некоторыми вариациями, в стандартных методиках определения содержания тиамина в пробах различного происхождения.[186, 187, 188]

Рисунок 2.3: Превращение тиамина в тиохром в реакции с гексацианоферратом (III) калия в щелочной среде.[185]

Использованные реактивы:

• гексацианоферрат (III) калия Ks [Fe(CN)6] (красная кровяная соль);

• гидроксид натрия NaOH, квалификация «ч.д.а.»;

• изобутанол С4Н\0О (2-Метилпропанол-1), квалификация «ч.д.а.». Образующийся в водном растворе тиохром экстрагировали изобутанолом.

Для анализа жидких проб водных растворов отбирали 6 мл анализируемой пробы и переносили в пробирку. Добавляли 1 мл 5% раствора Ks [Fe(CN)6] и 4 мл 10% раствора NaOH. Смесь встряхивали для полного смешивания компонентов.

После этого, смесь переливали в делительную воронку, добавляли к ней 6 мл изобути-лового спирта и интенсивно встряхивали в течении одной минуты.

Далее, давали водной и спиртовой фазам разделиться и отделяли фазу изобутилового спирта.

Содержание тиохрома в полученных образцах определяли по их спектрам люминесценции при облучении светом с длиной волны 370 нм. Регистрация спектров осуществлялась с помощью люминесцентного спектрометра Varian Cary Eclipse (Agilent), со взаимно перпендикулярными лучами, с использованием кварцевых кювет с толщиной поглощающего слоя

он

1 см. Контрольными образцами служили водные растворы витамина В! и ассоциата витамина Bi с {Mo72Fe3o}, с которыми были проведены те же манипуляции, что и с анализируемыми образцами. Предварительно строили калибровочный график по чистому препарату. Для этого получали зависимость площади под спектральной кривой в условных единицах интенсивности люминесценции при нескольких известных концентрациях тиамина.

2.9 Методика измерения Z-потенциала ассоциатов тиамин-{Мо7^е30}

Для измерения Z-потенциала ассоциатов тиамин-{Мо7^е30} был приготовлен ряд образцов с различным молярным соотношением взаимодействующих компонентов, концентрация {Mo72Fe30} во всех образцах составляла 1,2 х 10-4моль/л. Образцы готовили из рабочих растворов компонентов, добавляя объём деионизованной воды, необходимый для создания во всех образцах одинаковой концентрации {Mo72Fe30}. Заданные объёмы рабочих растворов и воды вносили с помощью микродозатора. Рабочие растворы {Mo72Fe30} (С = 1,5 х 10-4моль/л) и тиамина хлорида (С = 6 х 10-2моль/л) в деионизованной воде готовили методом точной навески.

Измерения осуществляли на анализаторе дисперсий Brookhaven 90-BI ZetaPlus методом элетрофоретического рассеяния света.

2.10 Методика эксперимента по изучению ассоциации {Mo72Fe30} с альбумином и её влиянию на процесс разложения {Mo72Fe30} в водных растворах

Синтез {Mo72Fe30} проводился по ранее описанной методике (стр. 74). В качестве стабилизирующего агента использовали альбумин бычий сывороточный лиофилизированный (BSA) «для культур клеток, ИФА, иммуногистохимии» (ООО БиолоТ) с чистотой > 95%.

Спектры оптического поглощения исследуемых растворов получали с использованием двухлучевого спектрофотометра UV-1900 (Shimadzu, Япония).

Изучение процесса ассоциации {Mo72Fe30} с альбумином в водной среде проводили методом молярных отношений при постоянной концентрации альбумина.

В качестве сред для моделирования процесса разложения ПОМ в крови были использованы: фосфатный буфер с pH 7,4 (приготовленный с использованием Na2НР04 (ч. д. а.) и NаН2Р04 (ч. д. а.)) и сыворотка крови КРС «для культур клеток» (ООО БиолоТ) разбавленная в 16 раз дистиллированной водой.

2.11 Методика экспериментов по электрофоретическому переносу {Mo72Fe30} и ассоциатов на его основе in vitro

Нанокластерный полиоксометаллат кеплератного типа {Mo72Fe3o} синтезировали в соответствии с вышеописанной методикой (раздел 2.2) и аттестовали методом ИК-спектроскопии. Для проведения эксперимента по электрофоретическому переносу ПОМ {Mo72Fe30} и его ассоциатов через кожную мембрану in vitro использовалась оригинальная диффузионная ячейка (Рисунок 2.4), состоящая из двух пространств (анодного и катодного), разделенных нативной кожной мембраной. В эксперименте использовали биологический материал лабораторных крыс, предоставленный ИИФ УрО РАН.

Рисунок 2.4: Диффузионная установка 1 — донорный отсек; 2 — приёмный отсек; 3 — кожная мембрана; 4 — Pt-электроды; 5 — магнитная мешалка

В верхний (донорный) отсек наливали исследуемый образец, в нижний (приёмный) дистиллированную воду. К электродам, с помощью стабилизированного источника тока Б5-46, прикладывалась разность потенциалов равная 4 В.

По прошествии заданного времени из приёмного отсека с помощью микродозатора отбирали пробу раствора для дальнейшего анализа. Содержание молибдена в пробах приёмного раствора определяли на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно-связанной плазмой iCAP-6500 Duo (Thermo Scientific).[189, 190]

В более ранних исследованиях установлено, что ассоциат {Mo72Fe3o} с лантаном содержит порядка 40 ионов La3+ на один полианион нанокластера [191], а ассоциат с ПВП содержит, оценочно, около 160 мономерных звеньев поливинилпирролидона на один полианион {Mo72Fe30} [10]. Ассоциаты {Mo72Fe30} с ПВП получали путём растворения навески {Mo72Fe30} в растворе ПВП заданной концентрации исходя из соотношения 160 мономерных звеньев ПВП на одну молекулу ПОМ. Концентрация ПОМ в полученном растворе составляла 1 г/л (5,36 х 10-5М). Ассоциат {Mo72Fe30} с ионами La3+ получали в соответствии с методикой описанной в [191]. Соотношение La3+ : {Mo72Fe30} составляло 40 : 1, концентрация {Mo72Fe30} в полученном растворе составляла 1 г/л. На собранной экспериментальной установке была проведена серия экспериментов по определению потока переносимых через мембрану частиц. Для этого 5 мл приготовленного раствора нанокластера {Mo72Fe30} или его ассоциата заливали в верхний отсек. В нижний сосуд наливали 50 мл деионизованной воды. При выборе полярности прикладываемого к электродам напряжения учитывали знак заряда ассоциатов в растворе. При проведении эксперимента по определению диффузионного потока осуществлялся отбор проб из нижнего сосуда. Объём пробы составлял 10 мл каждые 15 минут. Исходная концентрация нанокластера в верхнем сосуде составляла 1 мг/мл. Учитывая относительно низкую скорость диффузии, концентрацию в верхнем растворе можно считать постоянной. Нижний раствор перемешивали магнитной мешалкой. По прошествии заданного времени, из приёмного раствора отбирались пробы жидкости для дальнейшего анализа.

2.11.2 Электрофоретический транспорт нанокластерного ПОМ {Mo72Fe30} и его ассоциатов с биологически активными веществами (витамином Bi, инсулином) через кожу in vitro

Для эксперимента по переносу ассоциата {Mo72Fe30} с тиамина хлоридом (витамин Bi) готовили исходные растворы {Mo72Fe30} в концентрации 5,36 • 10-5М (1г/л) и тиамина хлорида в концентрации 5,36 • 10-4М (0,181г/л). Рабочий раствор ассоциатов получали смешиванием исходных растворов в пропорции 1:1. Таким образом, молярное соотношение

тиамин-ПОМ в эксперименте составляло 10:1. Рабочий раствор тиамина хлорида (контрольный эксперимент) получали смешиванием исходного раствора тиамина хлорида и дистиллированной воды в пропорции 1:1.

Для эксперимента по переносу ассоциата {Mo72Fe30} с инсулином готовили исходные растворы {Mo72Fe30} в концентрации 5,36 • 10-6М (0,1г/л) и инсулина (Росинсулин «Мед-синтез») в концентрации 5,36 • 10-6М (3,11 • 10-2г/л). Рабочий раствор ассоциатов получали смешением исходных растворов в пропорции 1:1. Рабочий раствор инсулина (контрольный эксперимент) получали смешением исходного раствора инсулина и дистиллированной воды в пропорции 1:1.

По прошествии заданного времени электрофоретического эксперимента in vitro, из анодного пространства диффузионной ячейки отбирались пробы жидкости для анализа.

Качественное определение присутствия тиамина в образцах жидкости, отобранных из анодного пространства производили посредством стандартной диазореакции, образцы, в которых присутствовал тиамин давали характерную красную окраску. Количественное определение содержания тиамина в образцах осуществляли методом люминесцентной спектроскопии (раздел 2.8), предварительно окисляя тиамин до тиохрома в щелочной среде с помощью гексацианоферрата (III) калия. Образующийся в водном растворе тиохром экстрагировали изобутанолом (квалификации «ч.д.а»). Содержание тиохрома в полученных образцах определяли по их спектрам люминесценции при облучении светом с длиной волны 370 нм. Регистрация спектров осуществлялась с помощью люминесцентного спектрометра Varian (Agilent) Cary Eclipse, со взаимно перпендикулярными лучами, с использованием кварцевых кювет с толщиной поглощающего слоя 1 см. Контрольными образцами служили водные растворы витамина В! и ассоциата витамина В! с {Mo72Fe30}, с которыми были проведены те же манипуляции, что и с анализируемыми образцами. Предварительно строили калибровочный график по чистому препарату. Для этого получали зависимость площади под спектральной кривой в условных единицах интенсивности люминесценции при нескольких известных концентрациях тиамина.

Анализ образцов на содержание инсулина проводили с помощью специализированного прибора «Axsym» (Abbott).

Спектры оптического поглощения водных растворов {Мо72Ре30} с инсулином получали на спектрофотометре НеХюэ-а с использованием кварцевых кювет с толщиной поглощающего слоя 1 см, в качестве раствора сравнения использовалась дистиллированная вода.

2.12.1 Расчёт профиля концентрации переносимого вещества по глубине мембраны.

Численное моделирование процесса электрофоретического переноса ПОМ {Мо72Ре30} через кожу основывалось на одномерной модели однослойной однородной мембраны. Перенос макроанионов ПОМ, как заряженных частиц, описывали уравнением Нернста-Планка с начальными и граничными условиями. Задача, таким образом состояла в нахождении значений концентрации, как функции от координаты (глубина) и времени (длительность процесса переноса) С(х,Ъ) на заданной дискретной сетке. (Здесь и далее, чтобы избежать путаницы, дифференциальный оператор Лапласа будет обозначен, как V2, а приращение (конечная разность), как А)

С(х,г) = DV2С(х,1) - VС(х,1)

С(х,0) = 0 : х е [0;Ь)

, (2.1)

С(0,1) = Со : ге [0; ¿эксп.]

С(Ь,1) = 0 : Ь е [0; ¿эксп.]

где х — пространственная координата, Ь — время, Ь — толщина мембраны, Ьэксп. — длительность эксперимента.

Для численного решения данной задачи использовали метод конечных разностей. Замену производных на конечные разности осуществляли по следующей схеме.

С(х,г) ^

АС(х, )

V2С(х,Ь) ^ VС(х,г) ^

Аí

/АСМ

V Ах

)

(2.2)

Ах

ас (х,г)

Ах

Ах и А — шаг дискретизации по пространственной и по временной координатам, соответственно. Таким образом имеем:

АС (х, ¿) А*

D

/ас (х, г)

Ах

>

Ах

_DZFE АС (х!) КТ Ах '

(2.3)

А (Сп,к — Сп,к-1) - ^ )2 (Сп+1,& — 9Сп,к + Сп-1,ь) + ^ЯТЕ ^ п,к ^^ — 0 1 • А

(2.4)

А*

ЯТ Ах

(С„,Л - СП_1>Л) — 0 (2.5)

С

(Ах)2 ЯТ Ах

+ С /1+9^+ °ЕгР Аí ^ С DАt

+ Сп,к "I 1 + 9——— +--^--~у - Сп+1,к • (Ах)2

(2.6)

ющим образом:

Рисунок 2.5: Иллюстрация неявной конечно-разностной схемы

/1 0 0

0 ••• 0

0 •••

0

0 0

0 0

... 0

0

01

(Сл Л

С1 ,к

С

2 ,к

\См,к у

С С2,к-1

СИ,к-1

(2.7)

0

где N — количество пространственных слоёв в схеме, I, сиг — левый, центральный и правый коэффициенты.

Разберём подробнее члены матричного уравнения (2.7). Первый член — квадратная матрица размерности N х N, где N — число пространственных слоёв в разностной схеме. Коэффициент с в матрице, заполняющий главную диагональ (кроме первой и последней строк) есть коэффициент при Сп,к в уравнении (2.6). Коэффициенты I и г, заполняющие нижнюю и верхнюю кодиагонали главной диагонали (кроме первой и последней строк) есть коэффициенты при Сп-1^ и Сп+1^ в уравнении (2.6), соответственно. Первая и последняя строки матрицы содержат единицу на главной диагонали и нули во всех остальных ячейках. Это связано с тем, что согласно граничным условиям модели концентрации на верхней и нижней границах мембраны неизменны во времени, то есть С\уи = С0 и С^,к = 0.

Второй член в левой части уравнения (2.7) — вектор-столбец, содержащий пространственный профиль концентраций переносимого вещества на к-ом временном слое.

Член в правой части уравнения (2.7) — вектор-столбец, содержащий пространственный профиль концентраций переносимого вещества на ( к — 1)-ом временном слое.

Последовательно решая матричные уравнения (2.7) для к от 2 до К получим набор из К вектор-столбцов (образующих прямоугольную матрицу размерности N х К следующего вида (2.8)), каждый из которых описывает пространственный профиль концентрации вещества в

(с

о Со

0 С2,2

О См-1,2

0

0

Со

С2,К

СИ-1,К 0

(2.8)

2.12.2 Расчёт количества вещества, перенесённого через мембрану.

В том случае, если зависимость концентрации переносимого через мембрану вещества от глубины в мембране для каждого момента времени известна, оценить количество вещества, перенесённого через мембрану за заданное время, можно, интегрируя поток через мембрану в приёмный раствор.

Используя уравнение Нернста-Планка в следующем виде:

БгЕР

з (х,г) = -бус (х,г) + с (хД

(2.9)

где 3(х,Ь) — плотность потока вещества, Б — коэффициент диффузии, С(х,Ь) — концентрация переносимого вещества, х — пространственная координата, направленная перпендикулярно поверхности кожи, Ь — время, г —заряд переносимой частицы, Е — напряжённость электрического поля, Р —постоянная Фарадея, К — универсальная газовая постоянная, Т — абсолютная температура.[192]

Исходя из определения плотности потока вещества 3(х,Ь), как количества вещества перенесённого через единицу площади поверхности перпендикулярной направлению переноса, за единицу времени, можем выразить Q количество вещества, перенесённого через заданный слой мембраны, как:

Qtэксп. (х) = ^мем. ■ 3(х,г) •(И, (2.10)