Транспортные РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы и их высокомолекулярные комплексы в регенерирующей печени крыс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Яремчук, Анна Дмитриевна
- Специальность ВАК РФ03.00.03
- Количество страниц 155
Оглавление диссертации кандидат биологических наук Яремчук, Анна Дмитриевна
Список употребляемых сокращений
Введение.
Глава I. Обзор литературы
1.1. Регуляторная функция тРНК.
1.2. Аминоацил-тРНК-синтетазы эукариотов.
1.3. Особенности биосинтеза белков и нуклеиновых кислот в регенерирующей печени.
Глава 2. Материалы и методы.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Транспортные РНК регенерирующей печени крыс.
3.2. Аминоацил-тРНК-синтетазы регенерирующей печени крыс.
3.3. Высокомолекулярные комплексы /кодосомы/ регенерирующей печени крыс.
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Молекулярная биология», 03.00.03 шифр ВАК
Структурно-функциональные свойства высокомолекулярного комплекса аминоацил-тРНК-синтетаз из печени крыс в условиях острого лучевого поражения1984 год, кандидат биологических наук Слепцова, Инна Леонидовна
Экспрессия генома на ранних стадиях регенерации печени, вызванной частичной гепатэктомией1982 год, доктор биологических наук Платонов, Олег Максимович
Молекулярные основы специфичности аминоацилирования тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазами. Конформационная динамика продуктивного взаимодействия с тРНК2008 год, доктор химических наук Моор, Нина Александровна
D-аминокислоты в процессе трансляции2000 год, кандидат биологических наук Сутурина, Юлия Александровна
Фосфорилирование РНК-связывающих белков ооцитов рыб и амфибий1984 год, кандидат биологических наук Кандрор, Константин Вилленович
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Транспортные РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы и их высокомолекулярные комплексы в регенерирующей печени крыс»
К настоящему времени в целом изучены и охарактеризованы структура, свойства и функции белков и нуклеиновых кислот - биополимеров, участвующих в основных процессах жизнедеятельности клетки. На первый план выдвигается вопрос о регуляции функционирования этих макромолекул в клетке и, с другой стороны, о их роли в регуляции клеточного метаболизма в целом. Известно, что регуляция экспрессии генома является каскадной и осуществляется на разных уровнях. У высших организмов особое значение приобретает посттранскрипционная регуляция, в том числе на уровне трансляции. Накоплен большой экспериментальный материал о том, что одним из компонентов, участвующих в такой регуляции, являются транспортные РНК. Есть веские основания считать, что синтез тРНК не является конститутивным, а взаимосвязан с качественными и количественными изменениями набора мРНК, трансляция которых , происходит в данный период жизнедеятельности клетки. Этот вывод сделан на основе открытия явления "функциональной адаптации" тРНК к синтезу специфических белков в узкоспециализированных тканях /1-4/, таких как эпителий молочной железы, грануляционная ткань, шелковы-делительная железа, хрусталик глаза и др. Возникает вопрос, характерна ли адаптация только для узкоспециализированных тканей или это явление носит универсальный характер и свойственно всем клеткам при изменении в них качественного набора синтезируемых белков. Удобной моделью для выяснения этого вопроса является регенерирующая после частичной гепатэктомии печень, поскольку первые сутки после операции характеризуются существенной стимуляцией белкового синтеза в целом, а максимумы синтеза отдельных белков разобщены во времени. Так, через 6 ч наблюдается усиленный синтез рибосомальных белков, через 15 ч - первый, а через 21-23 ч - второй, более значительный пик синтеза гистонов /5/.
В литературе имеются сведения о свойствах транспортных РНК регенерирующей печени крыс, однако они очень ограниченны и противоречивы, а в указанные сроки регенерации биологическая активность тРНК никем не изучена. Кроме роли тРНК, регуляторная функция которых косвенно и прямо показана в значительном количестве экспериментальных работ, интерес представляет вопрос о функционировании эукариотических АРСаз при существенных изменениях биосинтеза белка. В ряде работ показано, что АРСазные активности в клетках эукариотов отличаются при различных физиологических и патологических состояниях организма, в частности, при гормональных воздействиях, в процессе онтогенеза, дифференцировки и т.д. Однако практически ни в одном случае не показано, связаны ли эти различия с изменением количественного содержания ферментов в клеточном пуле или с изменением их молекулярной активности. Кроме того, известно, что в отличие от прокариот большинство АРСаз в клетках эукариот функционируют в составе высокомолекулярных комплексов так называемых кодосом, составными частями которых также являются тРНК /6/, метилтрансферазы /7/, протеинкиназы /8/ и др. Однако биологический смысл надмолекулярной организации АРСаз и других компонентов белкового синтеза не известен, а вопрос о функционировании высокомолекулярных комплексов при существенных изменениях биосинтеза белка совершенно не изучен. Выбранная нами экспериментальная модель удобна и для решения этого вопроса, поскольку в печени крыс обнаружены и достаточно хорошо охарактеризованы высокомолекулярные комплексы АРСаз, а изменения биосинтеза белка в процессе регенерации дают возможность сравнить их состав и свойства в зависимости от характера белкового синтеза.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение биологической активности и свойств транспортных РБК, АРСаз и их высокомолекулярных комплексов в регенерирующей печени крыс через 6, 15 и 21 ч после частичной гепатэктомии. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
1. Определить акцепторную активность тРНК in vitro, количественное содержание эндогенных аминоащтл-тРНК in vivo и наличие тРНК в высокомолекулярных комплексах.
2. Изучить аминоацшг-тРНК-синтетазные активности в суммарных препаратах АРСаз и в составе высокомолекулярных комплексов.
3. Получить высокоочшценные препараты глутамил-тРНК-синтета-зы из нормальной и регенерирующей печени 1фыс и изучить свойства ферментов в свободном и ассоциированном состояниях.
4. Определить белковый, фосфолипидный состав высокомолекулярных комплексов и наличие в них метилтрансферазной, протеинки-назной, протеазной и рибонуклеазной активностей.
В результате проведенной работы установлено, что колебания в биосинтезе белка в ранние сроки регенерации печени (6 и 15 ч после операции ) не связаны с изменениями биологической активности и свойств тРБК и АРСаз. Лишь через 21 ч после частичной гепатэктомии в период максимального синтеза гистонов наблюдается слабо выраженная адаптация клеточного состава тРНК и АРСаз к их биосинтезу. Впервые показано, что изменение аминоацил-тРНК-синте-тазной активности в эукариотических клетках, в частности возрастание глутамил-тРНК-синтетазной активности в регенерирующей печени 1фыс, не связано с изменением молекулярной активности фермента, а, по-видимому, определяется увеличением его количественного содержания. Через 21 ч после частичной гепатэктомии существенно возрастает уровень метилирования тРНК и метилтрансферазная активность как в растворимой фракции гомогената печени, так и в составе высокомолекулярных комплексов. Последние выделены и охарактеризованы из регенерирующей печени крыс впервые. Показано, что из изученных компонентов кодосом наиболее существенные изменения наблюдаются для метилтрансферазной и протеинкиназной активностей.
Не все обнаруженные нами изменения носят выраженный характер, однако эффективность процесса трансляции зависит от многих факторов, поэтому даже малые изменения, если они действуют одновременно и в одном направлении, могут привести к амшшфицирован-ному результату. В этом плане заслуживают внимания и дальнейшего изучения результаты по исследованию метилтрансферазной и протеинкиназной активностей кодосом. Изменение количественного содержания и набора этих ферментов, входящих в их состав, может иметь прямое отношение к регуляции биосинтеза белка.
Похожие диссертационные работы по специальности «Молекулярная биология», 03.00.03 шифр ВАК
Метаболизм ядерных белков и ДНК печени, тимуса и костного мозга у крыс и мышей при изменении пролиферативной активности1983 год, доктор биологических наук Савина, Марина Ивановна
Возрастные особенности хроматина тканей с различной митотической активностью1985 год, кандидат биологических наук Мозжухина, Татьяна Георгиевна
Аутофаговая активность лизосом печени крыс на ранних этапах репаративной регенерации органа1984 год, кандидат биологических наук Малыгин, Александр Евгеньевич
Влияние комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I на копирование ДНК эукариот2010 год, кандидат биологических наук Базалук, Виталина Витальевна
Анализ биологических наноструктур в системах метаболизма белков и липидов: Строение, дисперсный состав и механизмы равновесных взаимодействий макромолекул2005 год, доктор биологических наук Тузиков, Федор Васильевич
Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Яремчук, Анна Дмитриевна
Заключение.
В настоящей работе впервые проведено детальное изучение транспортных РНК, аминоацил-тРНК-синтетаз и их высокомолекулярных мультиферментных комплексов в пререпликативный период регенерации печени крыс, вызванной частичной гепатэктомией.
Полученные результаты свидетельствуют об определенной стабильности содержания и активности, данных компонентов аппарата трансляции в печени на ранних стадиях регенерации. Пререпликативный период характеризуется подготовкой гепатоцитов к митозу и последующему восстановлению массы органа. Для него характерны существенные изменения многих биосинтетических процессов, в том числе так называемое перепрограммирование генома гепатоцитов, усиленный синтез /либо подготовка к нему/ ряда компонентов хроматина и аппарата трансляции. Однако изучение компонентов аппарата трансляции, ответственных за первый этап биосинтеза белка - образование аминоацил-тРНК, показало, что концентрация тРНК и АРСазз, по-видимому, не лимитирует скорость белкового синтеза, т.е. достаточна для обеспечения интенсификации этого процесса. Так, известно, что увеличение скорости биосинтеза белка в регенерирующей печени начинается уже через I ч после операции ¡118/, к 12 ч содержание общего белка достигает, максимума и сохраняется на высоком уровне, до 36 ч. Через. 6 ч после частичной гепатэктомии наблюдается максимум синтеза рибосомных белков, через 15 ч - первый максимум синтеза гистонов. Однако как содержание тРНК /в мг на I мг ДНК/, так и ее акцепторная активность in vivo и in vitro не изменяются в печени крыс через. 6 и 15 ч после частичной гепатэктомии. На уровне контроля остается и аминоацил-тРНК-синтетазная активность. Определенные изменения биологической активности изученных в работе компонентов аппарата трансляции обнаружены лишь, через
21 ч после операции - в период, характеризующийся вторым максимумом синтеза гистонов. Как известно, аминокислотный состав гистонов носит специфический характер и отличается высоким содержанием лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, аланина; низким содержанием фенилаланина, гистидина, метионина и практическим отсутствием триптофана, цистина и цистеина. В связи с этим для изучения биологической активности тРНК и АРСаз нами были выбраны аминокислоты, по-разному представленные в составе гистонов: аланин, глутаминовая кислота, лизин, фенилаланин и триптофан. Изучение уровня аминоаци-лирования по данным аминокислотам тРНК in vitro и in vivo, определение соответствующих АРСазных активностей как в целом клеточном пуле, так и в составе высокомолекулярных комплексов показало наличие определенной адаптации наборов тРНК и АРСаз к синтезу гистонов. В частности, нами показано возрастание TPHKGlu,Lys и. эндогенных глутамил- и лизил-тРНК, отсутствие изменений фенил ал анил-тРНК и снижение триптофанил-тРНК. В отличие от узкоспециализированных тканей, где подобная адаптация носит резко выраженный характер, в печени не устанавливается полная корреляция между составом тРНК и АРСаз; и аминокислотным составом гистонов. Например, практически отсутствуют изменения аланил-тРНК и аланил-тРНК-синте-тазной активности, хотя аланин. содержится в достаточно большом количестве. в гистонах. Однако следует подчеркнуть, что печень не является узкоспециализированным органом. В ней синтезируется большое количество разных по аминокислотному составу и по функциям белков. Поэтому трудно представить себе возможность строгой адаптации к синтезу одного вида белков даже в период их максимального синтеза. В то же время ясно, что синтез тРНК в печени не является конститутивным и регулируется в зависимости от потребностей клетки.
Что касается аминоацил-тРНК-синтетаз, то нами впервые показано на эукариотическом организме, что изменение АРСазной активности органа, скорее всего, связано с изменением количественного содержания фермента, а не его молекулярной активности. При решении этого вопроса наш были получены высокоочшценные препараты глута-мил-тРНК-синтетаз из интактной и регенерирующей через 21 ч после частичной гепатэктомии печени крыс. Для получения ферментов 9С$-ной чистоты по данным аналитического электрофореза в полиакрилами-дном геле /в денатурирующих условиях/ было использовано пять стадий очистки, в том числе хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе и окси-апатите. Следует подчеркнуть, что глу тамил- тРНК- синте таз а является ферментом, прочно ассоциированным в высокомолекулярном мульти-ферментном комплексе, поэтому получение ее в индивидуальном состоянии связано с определенными трудностями и сопровождается большими потерями. Так, выход высокоочшценного фермента по активности составил всего лишь 0,14$. Глутамил-тРНК-синтетаза из печени крыс в высокоочищенном состоянии получена нами впервые. Низкий количественный выход индивидуального фермента не позволил нам провести его детальный физико-химический анализ, однако мы и не ставили такую задачу в данном исследовании. В работе проведено сравнение молекулярной массы и ряда каталитических свойств вдут.амил-тРНК-син-тетазы из интактной и регенерирующей печени. Оказалось, что Кт по всем субстратам, V и молекулярная активность для обоих ферментативных препаратов практически одинаковы. В то же время глутамил-тРНК-синтетазная активность в печени крыс через 21 ч после частичной гепатэктомии возрастает как в суммарном клеточном наборе, так и в составе высокомолекулярных комплексов. Это возрастание, судя по нашим данным, нельзя объяснить изменением молекулярной активности глутамил-тРНК-синтетазы. Вероятно, возрастает ее количественное содержание в гепатоцитах, хотя мы не можем исключить появление активатора /либо исчезновение ингибитора/ данного фермента при усиленном биосинтезе гистонов в этот, период регенерации печени. Вопрос о регуляции активности АРСаз в клетке только начинает изучаться и. требует специального исследования.
Данная работа является одной из первых попыток определить функциональное значение аминоацил-тРНК-синтетазных комплексов.Одним из подходов к изучению этого вопроса является сравнение свойств АРСаа в очищенном и ассоциированном состоянии. В связи с этим нами были изучены константы Михаэлиса и термостабильность высокоочи-щенных лизил- и глутамил-тРЖ-синтетаз и в составе кодосом. Оказалось, что Кт по всем субстратам для указанных АРСаз в комплексах, практически не отличаются от таковых для очищенных ферментов. Полученные результаты согласуются с данными других авторов для лизил-, метионил- /иб / и изолейцил-тРНК-синтетаз /134 /. Нами не обнаружено также различий в термостабильности глутамил- и лизил-тРНК-синтетаа в составе комплексов и в очищенном состоянии. Эти данные, наряду с литературными, дают, нам основание отдавать предпочтение гипотезе, компартментализации.
Для выяснения возможной роли высокомолекулярных комплексов в интенсификации белкового синтеза был изучен их состав в печени крыс в норме и через 21 ч после частичной гепатэктомии.
В составе комплексов из пяти наученных АРСаз не обнаружена лишь триптофанил-тРЖ-синтетазная активность, что согласуется с литературными данными об отсутствии этого фермента в агрегированном состоянии, либо его слабой ассоциации в комплексе. По схеме, предложенной в работе /но/, триптофанил-тРЖ-синтетаза расположена во внешнем слое структурной организации кодосом и может диссоциировать уже при гомогенизации ткани.
Установлено, что изменения АРСазных активностей в составе кодосом при регенерации печени крыс соответствуют изменениям в суммарном цитоплазматическом пуле. Следует подчеркнуть, что глута-мил-, лизил- и фенилаланил-тРЖ-синтетазы в печени контрольных и частично гепатэктомированных животных находятся полностью в ассоциированном состоянии. Аланил-тРНК-синтетазная активность в комплексах: составляет 70%.
В отличие от. АРСаз в составе кодосом нами обнаружены только tPHKG1u и TPHKLys из всех изученных тРНК. Увеличение содержания этих тРНК в суммарном клеточном наборе при регенерации печени сопровождается увеличением их содержания и в составе комплексов. Можно предположить, что те тРНК, которые наиболее эффективно используются в процессе трансляции, более прочно ассоциированы в высокомолекулярных комплексах. Однако в отличие от АРСаз относительное содержание тРНК в комплексах значительно ниже и составляет около 2%, как установлено на примере tPHKG1u и тРНКЪуБ. п#угим цитоплазматическим компонентом, почти полностью ассоциированным в высокомолекулярные комплексы, являются метилтранс-феразы. Их содержание /либо активность/ существенно возрастает при регенерации печени, что соответствует повышенному уровню метилирования тРНК in vivo через 21 ч после частичной гепатэктомии. Использование в качестве субстрата субметилированной тРНК показало, что характер изменения отдельных метилтрансферазных активностей не одинаков. Эти исследования требуют дальнейшего развития для установления как молекулярных механизмов, лежащих в основе возрастания метилтрансферазной активности, так и для выяснения вопроса, к каким последствиям приводит увеличение уровня метилирования тРНК. Например, отличаются ли такие тРНК по их способности связываться с рибосомами и по точности трансляции определенных кодонов.
Кроме тРНК-метилтрансфераз, важным компонентом кодосом являются протеинкиназы. Нами был изучен уровень эндогенного фосфорилирования белков кодооом и. зависимость этого процесса от циклических. нуклеотидов. Кодосомы, выделенные из печени крыс через 21 ч после частичной гепатэктомии, характеризуются снижением уровня эндогенного фосфорилирования in vitro в 2,3 раза. Однако этот результат нельзя однозначно интерпретировать как снижение протеин-киназной активности кодосом, поскольку при добавлении экзогенного субстрата /протамина/ уровень фосфорилирования возрастает в 3 раза. Можно предположить, что в составе кодосом из регенерирующей печени либо снижено содержание специфических субстратов, либо эти белки уже находятся в фосфорилированном in vivo состоянии. Заслуживает внимания тот факт, что добавление в реакционную смесь циклических нуклеотидов не оказывает заметного влияния на процессы фосфорилирования в кодосомах печени контрольных животных-, в то время как при регенерации печени протеинкиназы проявляют значительную чувствительность к,циклическим нуклеотидам. Эти результаты могут послужить началом новых: исследований, так как известно, что процессы фосфорилирования и дефосфорилирования лежат в основе регуляции активности ряда ферментативных систем и регуляции биосинтеза белка на уровне трансляции, в частности процессов инициации синтеза полипептидной цепи. Возможно, что существенные изменения биосинтеза белка при регенерации печени связаны не столько с изменениями акцепторной активности тРНК и: АРСаз, сколько с изменением скорости отдельных этапов процесса трансляции в результате активации белковых факторов.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.