Трансляционная активация генома некоторых фитовирусов в составе вириона или вирусного транспортного рибонуклеопротеида тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук в форме науч. докл. Карпова, Ольга Вячеславовна

• Карпова, Ольга Вячеславовна
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 2002

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Карпова, Ольга Вячеславовна

I. Транспортные белки тобамовирусов образуют с РНК рибонуклеопротеидный комплекс и подавляют трансляцию РНК в составе комплекса.

Вирус табачной мозаики (ВТМ) - представитель тобамовирусов, палочковидных вирусов растений (длина 300 нм; диаметр 18нм). Геномная "плюс" РНК состоит из 6395 нуклеотидов и содержит, по крайней мере, четыре открытые рамки трансляции (ОРТ). Геном ВТМ кэпирован, а З'-проксимальная нетранслируемая последовательность включает около 200 нуклеотидов и формирует тРНК-подобную структуру. Белки 126К и 183К (являются компонентами вирусной репликазы) транслируются непосредственно с геномной РНК. Два других белка -транспортный белок (ТБ) - 32К и белок оболочки (БО) - 17.5К транслируются с субгеномных РНК (Meshi et al., 1982; Lehto et a/., 1990).

Более десяти лет назад были получены первые результаты, свидетельствующие о том, что в зараженных ВТМ растениях присутствуют информосомо-подобные рибонуклеопротеидные (РНП) комплексы (Dorokhov et al., 1983, 1984). После обнаружения РНК-связывающих свойств у ТБ ВТМ U1 (Citovsky et al., 1990) предположили, что подобные протяженные, неструктурированные РНП комплексы могут быть образованы кооперативно связанными с вирусной РНК молекулами ТБ.

Citovsky et al. (1990, 1992) считают, что обнаруженные РНП комплексы представляют собой транспортные формы, и РНК в их составе должна выводиться из цикла репликации и переключаться на выполнение транспортной функции. Мы предположили, что это может быть достигнуто, если ТБ окажется способным препятствовать трансляции РНК, благодаря своей РНК-связывающей активности.

Влияние транспортных белков на трансляцию РНК в бесклеточных белоксинтезирующих системах (ББС) из лизата ретикулоцитов кролика (ЛРК) или экстракта зародышей пшеницы (ЭЗП), исследовали, добавляя экспресс/,рованные в бактериях ТБ в трансляционную систему либо в свободном состоянии, либо в форме предварительно сформированных РНП комплексов. Поскольку связывание транспортных белков с РНК является неспецифическим, т.е. не зависит от последовательности нуклеотидов (Citovsky et al., 1990, 1992), ставили параллельные опыты с различными матрицами (РНК ВТМ U1, тобамовируса крестоцветных - крВТМ и вируса мозаики костра - ВМК). Также изучали зависимость степени ингибйрования трансляции от соотношения между ТБ и РНК.

В работе были получены и использованы препараты рекомбинантных ТБ ВТМ U1 и крВТМ, содержащие N-концевой (Гис)6- аффинный домен, Поскольку результаты экспериментов с использованием РНК и ТБ различных тобамовирусов были вполне сходны, далее мы пользуемся едиными терминами «ТБ ВТМ» и «РНК ВТМ».

92.5К 69К

46К ЗОК

14.3К

92.6К 69К

46К ЗОК

14.3К

Рис. 1 Транспортный белок (ТБ) ВТМ подавляет трансляцию вирусных РНК в ЭЗП.

A). ТБ добавляли либо непосредственно в систему (дорожки 1-5), либо после преинкубации с РНК (дорожки 6-10).

1.- препарат РНК ВТМ без добавления ТБ; 2.- РНК ВТМ с ТБ ВТМ в соотношении 1:100; 3.- препарат РНК ВМК без добавления ТБ; 4.- РНК ВМК с ТБ ВТМ в соотношении 1:100; 5. -ТБ ВТМ без добавления РНК. Дорожки 6-9: РНК ВТМ преинкубировали с ТБ ВТМ в молярных соотношениях 1:100 (6); 1:75 (7); 1:50 (8); 1:25 (9). 10- РНК ВТМ после ее экстракции фенолом из РНП комплекса с ТБ ВТМ (соотношение 1:100).

B) РНК и ТБ были проинкубированы перед добавлением в ЭЗП

1-препарат РНК ВТМ без добавления ТБ; 2.- РНК ВТМ преинкубировали с ТБ ВТМ (1:100); 3.- РНК ВТМ преинкубировали с ТБ1 ХВК (1:100); 4.- РНК ВТМ преинкубировали с р50 (1:100); 5.- проба без добавления РНК.

Радиоавтограф (8-20% ПААГ)- Справа указаны молекулярные массы маркерных белков в килодал ътонах. Концентрация РНК в пробе 75 миУмп

Транспортные белки тобамовирусов проявили себя как эффективные ингибиторы трансляции в двух типах экспериментов: (1) ТБ и РНК добавляли непосредственно в ББС без предварительной инкубации или (2) перед добавлением в ББС РНК и ТБ преинкубировали с целью образования РНП комплекса. Эффективность подавления трансляции ТБ зависела от молярного соотношения ТБ:РНК и была максимальной при соотношений 100:1 и заметной при 75:1 (Рис. 1 А дор.6, 7 и В дор.2). При молярном соотношении ТБ: РНК 25:1 и 50:1 трансляция не ингибировалась, по-видимому, вследствие присутствия, свободных (несвязанных белком) молекул РНК в ББС (Рис. 1 А дор.8, 9).

Способность РНК эффективно транслироваться в ББС полностью восстанавливается после ее экстракции фенолом из инкубационной смеси с ТБ. (Рис.1 А, дор. 10). Следовательно, наблюдаемое ингибирование синтеза белка обусловлено образованием комплексов ТБ-РНК, и не связано с деградацией матрицы при взаимодействии с ТБ.

Иные результаты были получены с транспортным белком, кодируемым тройным блоком генов (ТБГ) , 25К ТБ1 X вируса картофеля (ХВК) (Morozov et а/., 1987,1989). В отличие отТБ ВТМ, ТБ1 ХВК не ингибировал трансляцию (Рис 1В, дор. 3), что может быть объяснено низким сродством ТБ1 ХВК к РНК.

В работе использовали штамм-продуцент рекомбинантного (Гис)б-ТБ1, любезно предоставленный проф., д.б.н. С.Ю.Морозовым. Показано, что ТБ1 ХВК обладает активностью НТФазы и РНК-хеликазы (Kalinina eta!., 1996; 2002).

Для подтверждения того, что образование ТБ-РНК комплексов является необходимым условием подавления трансляции, [32Р]-меченный РНК-транскрипт и РНК ВТМ преинкубировали с ТБ ВТМ в различных молярных соотношениях. Полученные РНП комплексы анализировали, фильтруя пробы через двойные нитроцеллюлозные (НЦ) мембраны. В основе метода лежит тот факт, что белок и связанная с ним в форме РНП РНК задерживаются на верхней, незаряженной мембране, в то время как свободная от белка РНК проходит через верхнюю мембрану и сорбируется на нижней, положительно заряженной мембране (Wong & Lohman, 1993). 32Р-меченный РНК-транскрипт использовали как маркер и при расчете молярных соотношений «РНК:белок» весовым количеством транскрипта пренебрегали как незначительно малым по сравнению с количеством немеченой РНК. Этот подход позволяет определять долю молекул РНК, связавшихся с белком, как отношение радиоактивности верхней мембраны к суммарной радиоактивности пробы.

Из таблицы 1 видно, что ТБ ВТМ в молярном соотношении 100:1 полностью связывает РНК ВТМ, которая вся удерживается верхней мембраной. Однако при соотношении 25:1 практически вся РНК остается свободной и оказывается на нижней позитивно заряженной мембране.

Результаты эксперимента показали, что ингибирующая активность связана со способностью ТБ ВТМ образовывать нетранслируемые комплексы с вирусной РНК.

Таблица

Анализ РНП-комплексов, образованных ТБ ВТМ и РНК, на двойных различно заряженных нитроцеллюпозных мембранах,

Процент радиоактивности, оставшейся на

Проба Молярное Нитроцеллюлозной Положительно соотношение мембране (РНК в заряженной мембране белок:РНК составе РНП) (свободная РНК)

ТБ ВТМ - РНК 100:1 99.0±0.6 1.

ВТМ 75:1 69.0±0.5 31.

50:1 60.5±3.4 39.

25:1 0.6±0.4 99.

РНК >1 100.

ТБ1 ХВК - РНК 100:1 0.8±0.2 99.

В таблице представлены. средние значения результатов, по крайне мере, шести независимых экспериментов. За 100% принимали суммарную радиоактивность РНК, остающуюся на обеих мембранах, за вычетом неспецифической сорбции РНК на верхней мембране, не превышавшей 1% от активности, оставшейся на нижней мембране.

В случае ТБ1 ХВК и ТБ ВТМ в молярном соотношении ТБ:РНК 25:1 РНП-комплексы не образовывались, и подавление трансляции также не наблюдалось (Таблица 1).

На следующем этапе мы исследовали инфекционность комплексов ТБ - РНК ВТМ в интактных растениях и протопластах. В протопласты из мезофилла ячменя Hordeum vulgare методом электропорации вводили РНК ВТМ, которая предварительно была проинкубирована с ТБ ВТМ или ТБ1 ХВК. Эквивалентное количество свободной РНК ВТМ использовали для заражения в качестве контроля. Из данных Таблицы 2 следует, что РНК ВТМ, предварительно проинкубированная с ТБ1 ХВК, была инфекционна в протопластах. С другой стороны net наблюдалось накопление ВТМ в протопластах, инокулированных РНК ВТМ, предварительно проинкубированной с ТБ ВТМ в соотношении 1;100:тПри соотношении ;РНК:ТБ ВТМ 1:25, т.е. когда транспортного белка было явно недостаточно для образования РНП-комплексов (Таблица 1), в протопластах накапливался вирус (Таблица 2).

Таблица

РНП комплексы, образованные ТБ и РНК ВТМ, не способны инфицировать изолированные протопласты ячменя.

Инокулюм Молярное соотношение ТБ-РНК Количество вируса, протопластах (нг на 5x106) аккумулированного в

Эксп.1 Эксп.2 Эксп.З Эксп.4 Эксп.5 Эксп.

РНК ВТМ

ТБ ВТМ - РНК ВТМ 100:1 0 0 0 ND

75:1 ND 0 ND 0 ND ND

25:1 1000 ND 320 ND ND ND

ТБ1 ХВК - РНК ВТМ 100:1 990 1100 ND ND ND ND

Р50-РНК ВТМ 100:1 ND ND ND ND

Фосфорилиро-ванный ТБ(ФТБ) ВТМ -РНК ВТМ 300:1 N0 600 ND 420 350 ND

Буфер без РНК отрицательный контроль)

Протопласты электропорировали или инокулировали в присутствии ПЭГ РНК ВТМ или РНК ВТМ, преинкубированной с белками. Каждая проба содержала 8 мкг РНК на 50-100 мкл инокулюма. Концентрацию ВТМ определяли методом «сэндвич» - ELISA. ND - эксперимент не ставили

Следовательно, вирусная РНК в составе нетранслируемого in vitro РНП-комплекса, собранного при молекулярном соотношении ТБ:РНК 100:1, теряет способность реплицироваться в протопластах.

Это позволило предполагать, что устойчивость протопластов к заражению ТБ-РНК комплексами связана с отсутствием плазмодесм (ПД), необходимых для превращения РНП в транслируемую (и инфекционную) форму.

В соответствии с этим предположением, мы обнаружили, что в интактных индикаторных растениях (C.amaranticolor и N. glutinosa) инфекционность ТБ-РНК

БйБ * ^ ,ЛА комплексов была эквивалентна инфекционности свободной РНК при различных соотношениях ТБ:РНК в инкубационной смеси (Таблица 3).

Результаты анализа на НЦ-фильтрах (Таблица 1) показали, что в инокулюме, содержащем ТБ и РНК в молярном соотношении 100:1, отсутствует свободная РНК, т.е. вся РНК существует в форме ТБ-РНК-комплекса. Это означает, что ТБ-РНК комплекс per se способен заражать растения. Принимая во внимание, что эти комплексы нетранслируемы (Рис.1) и неинфекционны в протопластах (Таблица 2), можно предположить, что РНК ВТМ, которая попадает в растение в виде ТБ-РНК комплексов, не может реплицироваться в первично зараженных клетках. Однако, in planta ТБ-РНК комплексы способны перемещаться через ПД и индуцировать инфекцию в соседних клетках. Таблица

РНП комплексы, образованные РНК с ТБ ВТМ, инфицируют интактные растения.

Инфекционность: среднее число некрозов на половину листа С. amaranticolor '3'1 и N. glutinosa(6)

Эксп.1 Гэ) Эксп.И (61 Эксп.И Iй

РНК РНП Комплекс РНК РНП комплекс РНК РНП Комплекс

ТБ ВТМ -РНК 51+11 59+12 96+11 106+21 117+12 42+2.

ТБ1ХВК-РНК 53±9 66+11 - - 156+23 150± рбО-РНК 61+10 0 139+48 2+0.8 179+20 1±0.

3) и (б> Противоположные половинки листьев С. amaranticolor или N. glutinosa соответственно инокулировали комплексом белок-РНК ВТМ и РНК ' ВТМ соответственно; представлено среднее число некрозов из 8-10 зараженных листьев в каждом из трех независимых экспериментов. Молярное соотношение белок: РНК составляло 100:1. Половинки листьев заражались 5-15 мкл инокулюма, содержащего 1 мкг РНК ВТМ. а! РНК ВТМ, использованная в качестве контроля, была выделена из предварительно сформированных соответствующих белок-РНК комплексов.

Другими словами, наши результаты предполагают, что нетранслируемые in vitro ТБ-РНК комплексы, которые не могут реплицироваться в протопластах, преобразуются в транслируемые и реплицируемые формы в процессе прохождения через ПД.

С целью проверки этого предположения в следующих экспериментах использовали белок р50, способный эффективно связывать различные РНК, но неспособный обеспечивать вирусный транспорт. Мы ожидали, что р50 будет подавлять трансляцию и инфекционность РНК ВТМ как в протопластах, так и в интактных растениях.

Очищенный препарат р50 был любезно предоставлен проф. Л.П. Овчинниковым. Белок р50 - крупный коровый белок рибонуклеопротеидных частиц, находящихся в цитоплазме соматических клеток млекопитающих (Evdokimov et ai, 1995), эффективно связывается с различными РНК и ингибирует их трансляцию (Minich & Ovchinnikov, 1992). Естественно, р50 не участвует в вирусном транспорте от клетки к клетке.

В соответствии с нашим предположением, было обнаружено, что р50 ингибирует трансляцию РНК ВТМ in vitro (Рис.1 В дор. 4), а комплексы РНК ВТМ-р50 неинфекционны в протопластах (Таблица 2) и, что особенно важно, в интактных растениях (Таблица 3).

Возможно, РНП-комплексы, образующиеся в клетках инфицированных ВТМ in vivo, имеют более сложное строение по сравнению с ТБ-РНК-комплексами, сформированными in vitro, и включают в себя клеточные белки и/или белок оболочки. Однако очевидно, что независимо от состава, транспортная форма вируса, проникшая в соседнюю, здоровую клетку, должна быть доступна для рибосом.

II. Фосфорилирование ТБ в составе транспортного рибонуклеопротеида приводит к его трансляционной активации.

Обратимое фосфорилирование белков протеинкиназами и фосфатазами -фундаментальный процесс, играющий определяющую роль и контролирующий многие биологические процессы. Примерно треть всех клеточных белков подвергается фосфорилированию на различных стадиях развития эукариотической клетки (Zolnierowich & Bollen, 2000). Системы фосфорилирования-дефосфорилирования белков являются своеобразным «центральным процессором» растительной клетки (Hardie, 1999). Продемонстрирована роль фосфорилирования-дефосфорилирования и в патогенезе вирусов растений (Yang & Klessig, 1997).

Идея о возможном участии посттрансляционных модификаций ТБ в регуляции транспортной фазы вйрусной инфекции появилась, когда было обнаружено, что ТБ ВТМ может фосфорилироваться в зараженных клетках. Было показано, что ТБ тобамовирусов фосфорилируется in vivo (Watanabe et ai., 1992; Haley et a/., 1995;

Waigmann et al., 2000; Kawakami et al., 1999; Matsushita et al., 2000), а также in vitro протеинкиназами фракции клеточных стенок N. tabacum (Citovsky et al., 1993).Транспортные белки ряда других вирусов также могут фосфорилироваться в процессе инфекции (Citovsky et al., 1993; Sokolova et al., 1997; Seron et al., 1996; Kawakami et al., 1999, Ivanov et al., 2001).

Вероятно, транспортная форма вирусного генома временно исключена из процессов репликации/трансляции, но становится доступна для рибосом после проникновения в соседнюю (здоровую) клетку. Известно, что при первичном заражении клеток вирионная РНК ВТМ «родительских частиц» освобождается от белка оболочки в процессе «котрансляционного раздевания» (Wilson, 1984; Mundry et al., 1991).

Можно было ожидать, что введение дополнительных отрицательных зарядов при фосфорилировании ТБ вызовет дестабилизацию ТБ-РНК комплексов, переводя их в транслируемую форму.

В настоящей работе для фосфорилирования ТБ ВТМ использовали ПК фракции клеточных стенок, выделенных из листьев N. tabacum (ПК-КС) и коммерческий препарат протеинкиназы С (ПКС); в специальных опытах было продемонстрировано, что эти протеинкиназы обладают сходной специфичностью при фосфорилировании ТБ ВТМ. Было обнаружено, что в результате фосфорилирования ТБ ВТМ утрачивает способность подавлять трансляцию РНК ВТМ in vitro даже в молярном соотношении 1;300, добавленный в систему одновременно с РНК или после предварительной инкубации (Рис. 2 дор. 5 и 6). Интересно, что неспособность фосфорилированного ТБ (ФТБ) ВТМ подавлять трансляцию проявлялась не только при использовании свободного ФТБ для образования ТБ-РНК комплексов, но и при фосфорилировании ТБ в составе предварительно сформированного РНП (Рис. 2 дор. 7). Результаты трансляции in vitro не могли дать однозначного ответа на вопрос: утрачивает ли ТБ ВТМ в результате фосфорилирования РНК-связывающую активность, или же способность ФТБ ВТМ связываться с РНК сохраняется, однако образуемые фосфорилированным ТБ РНП-комплексы являются менее стабильными и, как следствие, транслируемыми.

Анализ РНП на нитроцеллюлозных мембранах показал. что фосфорилированный ТБ при молярном соотношении 100:1 связывает около 75% РНК; практически полное связывание (98.5% РНК) наблюдалось при соотношении РНК ВТМ:ФТБ ВТМ 1:150 - 1:200. Таким образом, фосфорилирование лишь незначительно ослабляет РНК-связывающие свойства ТБ ВТМ. При молярном соотношении РНК:белок 1:300 ФТБ ВТМ полностью связывает РНК, но не влияет на эффективность трансляции РНК (рис.2, дор. 5).

Рис. 2. Влияние фосфорилирования транспортного белка ВТМ на 126 К способность ТБ ВТМ подавлять трансляцию РНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе из лизата ретикулоцитов кролика (ЛРК). ТБ и РНК добавляли либо непосредственно в систему (дорожки 1 -3, 5, 8) либо после преинкубации (дорожки 4,6, 7)

1. - проба без РНК; 2. - РНК ВТМ; 3. - РНК ВТМ + немодифицированный ТБ в молярном соотношении 1:100; 4. - комплекс РНК ВТМ-ТБ, 1:100; 5. - РНК ВТМ + фосфорилированный ТБ в молярном соотношении 1:300; 6. - комплекс РНК ВТМ-ФТБ, 1:300; 7. - комплекс РНК ВТМ-ТБ, 1:100, фосфорилированный перед добавлением в ЛРК; 8. - РНК ВТМ + ПКС без добавления ТБ (контроль). Радиоавтограмма (8-20% ПААГ") продуктов трансляции РНК ВТМ U1. Концентрация РНК в ЛРК составляла 75 мкг/мл.

Стрелкой указано положение вирусспецифического продукта - РНК-полимеразы (126К).

Рис. 3. Фосфорилирование ТБ ВТМ изменяет структуру комплекса РНК ВТМ-ТБ ВТМ.

Маркеры мол. массы: 1. - Транскрипт 800 нукл.; 2. - препарат тРНК.

Пробы, проинкубированные с РНКазой А: 3. - РНК ВТМ; 4. - РНК ВТМ + ТБ в молярном соотношении 1:100; 5. - РНК ВТМ + фосфорилированный ТБ в молярном соотношении 1:300.

Пробы инкубировали с РНКазой А при комнатной температуре в течение 15 мин. из расчета 1 мкг РНКазы на 2 мкг РНК; реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения образцов, содержавшего 10 М мочевину и прогревали 3 мин при 65°С перед нанесением на 4% ПААГ. Гель окрашивали метиленовым синим. ' -Щ

В отдельной серии опытов мы не обнаружили различий в стабильности РНП-комплексов, образуемых ТБ ВТМ и ФТБ ВТМ, при инкубации в буферах с различными концентрациями NaCI. В то же время существенные различия в структуре РНП-комплексов, образованных РНК ВТМ с ТБ или ФТБ ВТМ, были обнаружены в опытах по сравнению чувствительности данных РНП к обработке рибонуклеазой. На Рис. 3 представлены результаты анализа в денатурирующем 4% ПААГ продуктов гидролиза РНК (свободной и в форме РНП) рибонуклеазой А. В результате гидролиза РНП-комплексов, образованных РНК и ТБ ВТМ, были обнаружены фрагменты РНК, длиной примерно 500 нуклеотидов, полностью защищенные от РНКазы (Рис. 3 дор. 4). Среди продуктов гидролиза свободной РНК и РНП комплексов, образованных ФТБ ВТМ подобные фрагменты отсутствуют (Рис. 3 дор. 3, 5).

Кооперативный характер связывания ТБ с фрагментами РНК был подтвержден при исследовании структуры комплексов РНК-ТБ ВТМ с помощью атомно-силовой микроскопии (ACM) (Kiselyova et а/., 2001).

По-видимому, фосфорилирование белка нарушает или ослабляет связи между соседними молекулами, что и приводит к «разрыхлению» РНП комплекса.

В отдельной серии экспериментов мы попытались определить тип протеинкиназ, ассоциированных с фракцией КС растений табака, способных фосфорилировать ТБ ВТМ. С этой целью использовали ингибиторы различных серин/треониновых протеинкиназ: сурамин и кверцетин (оба в концентрациях, при которых они ингибируют казеин киназу II (KKII) (Matsushita et а!., 2000); генистеин как ингибитор тирозиновых протеинкиназ; стауроспорин как ингибитор ПК, относящихся к группе протеинкиназы С (ПКС) (Reed et а/., 1998) и Н-89 - ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ и протеинкиназы А. Было показано, что ПК-КС, способные фосфорилировать ТБ ВТМ in vitro, относятся к типу казеинкиназы II, как и протеинкиназы клеточных экстрактов (Matsushita et at., 2000). Мы не обнаружили каких-либо различий в действии ингибиторов на протеинкиназную активность КС, выделенных из разных растений-хозяев ВТМ: N.tabacum, N.glutinosa, N.benthamiana.

Следующим этапом работы стало исследование инфекционности фосфорилированных РНП-комплексов в изолированных протопластах ячменя. Мы предположили, что конверсия РНП - комплексов в транслируемую форму при фосфорилировании ТБ может сопровождаться также изменением их инфекционности в протопластах. Из Таблицы 2 следует, что, в отличие от нефосфорилированного ТБ ВТМ, ФТБ образует с РНК ВТМ при соотношении

РНК:ФТБ 1:300 комплексы, способные инфицировать как протопласты (Таблица 2), так и интактные растения N.glutinosa. Приведенные выше данные позволяют предположительно рассматривать фосфорилирование ТБ как возможный механизм конверсии вирусных рибонуклеопротеидов в транслируемую форму.

Итак, было обнаружено, что ТБ ВТМ является активным репрессором трансляции. Комплекс РНК ВТМ-ТБ ВТМ не может транслироваться in vitro и инфицировать изолированные протопласты, однако заражает клетки интактных растений. Превращение ТБ-РНК ВТМ комплекса в транслируемую форму могло бы происходить на одном из этапов межклеточного транспорта в результате модификации транспортного РНП. Нами была высказана гипотеза, что переход РНП-комплекса в транслируемое состояние может быть связан с фосфорилированием транспортного белка.

Было показано, что фосфорилирование ТБ приводит к структурной модификации РНП-комплекса, в результате чего РНК становится доступной для рибосом и рибонуклеаз. Подобный эффект «разрыхления» вирусного капсида в результате фосфорилирования описан для полиовируса (Ratka et ai, 1989). Согласно нашим данным фосфорилирование не оказывает существенного влияния на РНК - связывающие свойства транспортного белка ВТМ. Возможно, фосфорилирование сопровождается конформационными изменениями в молекулах ТБ, приводящими к нарушению белок-белковых взаимодействий в составе РНП. Таким образом, фосфорилирование ТБ может играть определенную роль в ходе вирусной инфекции, однако, молекулярный механизм и функциональная роль фосфорилирования до настоящего времени не ясны.

Существует и другая точка зрения на роль фосфорилирования транспортного белка ВТМ. Согласно Citovsky et ai. (1993) и Waigmann et al. (2000), ТБ ВТМ может быть инактивирован фосфорилированием С-концевых остатков серина и треонина протеинкиназами, ассоциированными с клеточными стенками. Интересно, что этот процесс зависит от растения-хозяина, так в N. benthamiana фосфорилирование ТБ не влияет на функционирование белка. Фосфорилирование ТБ приводит к его инактивации и к секвестру внутри клеточных стенок, т.е. играет негативно-выводящую роль в ходе распространения инфекции. Следует отметить, однако, что те же авторы не исключают, что фосфорилирование предоставляет вирусу определенные потенциальные преимущества (Waigmann & Citovsky,2001). Как известно, ВТМ способен инфицировать широкий круг растений, что возможно и обусловлено фосфорилированием ТБ, которое может позитивно влиять на транспортные функции ТБ в некоторых хозяевах.

Фосфорилирование по нескольким сайтам - простое приспособление, позволяющее белку участвовать в различных биологических процессах. При этом фосфорилирование более чем одного остатка может происходить с помощью двух и более протеинкиназ (Cohen, 2000). Возможно, фосфорилирование белка по нескольким сайтам повышает его потенциальные функциональные и регуляторные возможности. Следует отметить, что сайты фосфорилирования ТБ тобамовирусов остаются предметом дискуссий. Так, сообщалось, что фосфорилированию подвергаются остатки Ser-37 и Ser-238 (Kawakami ef al., 1999) или внутренние области (в районе аминокислот 61-114 и 212-231) белка (Haley et al., 1995). С другой стороны клеточные протеинкиназы фосфорилируют С-концевую область ТБ : Ser-258, Thr-261 и Ser-265 ( Citovsky et. al. 1993); Thr-256, Ser-257, Ser-261 и Ser-263 (Matsushita et al., 2000).

Весьма возможно, что ТБ ВТМ (и родственных тобамовирусов) могут фосфорилироваться по ряду сайтов различными ПК. Можно предположить, что фосфорилирование различных сайтов ТБ ВТМ несет различную «смысловую нагрузку», причем набор фосфорилируемых сайтов может различаться на разных стадиях транспортировки вирусных макромолекул или даже на разных этапах вирусной инфекции.

III. Селективное связывание транспортного белка ТБ1 с одним из концов вириона активирует трансляцию РНК ХВК в составе вирусных частиц.

X вирус картофеля (ХВК) относится к группе потексвирусов (Purcifull & Edvardson, 1981) и представляет собой гибкую полярную спиральную структуру (длина 515 нм; диаметр 13.5 нм). Геномная «плюс» РНК ХВК (6435 нуклеотидов) кэпирована, полиаденилирована и содержит пять ОРТ (Skriabin et а!., 1988). Наибольшая 5'-концевая ОРТ 1 кодирует репликазу (165 К), которая транслируется непосредственно с геномной РНК. Ген белка оболочки (БО) находится на З'-конце РНК (ОРТ5). Перед ним расположены три частично перекрывающиеся ОРТ (2, 3 и 4), так называемый «тройной блок генов» (ТБГ). ТБГ кодирует транспортные белки ТБ1, 2 и 3; все три транспортных белка необходимы для развития инфекции (Morozov ef al., 1989,1991).

Предложены две модели транспорта потексвирусов из клетки в клетку через плазмодесмы:

- геном ХВК перемещается в составе вириона (Chapman ef а/., 1992; Oparka ef а/., 1996; Santa Cruz ef a/., 1998)

- геном вируса мозаики белого клевера транспортируется в виде рибонуклеопротеида, содержащего РНК, белок оболочки и ТБ1 (Lough ef а/., 1998; 2000).

Не исключено также, что разные представители рода Potexvirus используют различные РНП для транслокации генома через ПД. В обеих моделях транспорта участвуют РНК и белок оболочки, при взаимодействии которых РНК может выключаться из процессов трансляции и репликации либо в виде вирионов, либо в виде вирусного РНП. В любом случае необходимо, чтобы транспортируемые вирусные РНК были временно исключены из процессов репликации и трансляции. Если допустить, что роль транспортной формы ХВК выполняют вирионы, можно было ожидать, что РНК ХВК в составе вирусных частиц не транслируется. В то же время очевидно, что транспортная форма ХВК должна быть доступна для рибосом при развитии инфекции. Мы предположили, что ТБ1, являясь, наряду с БО, компонентом транспортной формы ХВК, может также служить регулятором трансляции РНК в составе транспортного рибонуклеопротеида.

Влияние ТБ1 на трансляцию вирионной РНК ХВК исследовали в ББС из ЭЗП. Из Рис.4 следует, что в отличие от ВТМ и ряда других вирусов, РНК ХВК в составе вирусных частиц является нетранслируемой in vitro (дор. 2). Этот результат позволяет предположить, что механизм котрансляционного «раздевания» вирионной

4. 165К Рис. 4. Влияние транспортного белка ТБ1 X-вируса картофеля на трансляцию РНК ХВК в составе вирусных частиц in vitro.

1. - РНК ХВК; 2. - ХВК; 3. - 5. - ХВК + ТБ1 в молярных соотношениях: 3. - 1:100; 4. - 1:50; 5. -1:25; 6. - проба без РНК. Радиоавтограмма (8-20% ПААГ) продуктов трансляции РНК ХВК. Концентрация РНК в ЭЗП составляла 40 мкг/мл. Стрелкой указано положение вирусспецифического продукта - РНК-полимеразы (165К).

РНК, описанный на примере ВТМ (Wilson & Shaw, 1987; Shaw, 1999), не функционирует в качестве механизма, открывающего возможность трансляции РНК родительских вирионов ХВК. С другой стороны, было обнаружено, что 60-минутная инкубация нетранслируемых in vitro частиц ХВК с транспортным белком ТБ1 в ББС переводит РНК в составе вирионов в транслируемую форму (Рис. 4 дор. 3-5). Вирионы ХВК, преинкубированные с ТБ1 в молярном соотношении 1:100, не отличались по эффективности трансляции от аналогичного количества свободной РНК ХВК (Рис. 4 дор. 1 и 3). Последовательное уменьшение молярного соотношения ХВК-ТБ1 от 1:100 до 1:50 и 1:25 приводило к заметному уменьшению эффективности трансляции (Рис. 4, дор. 3-5).

Эффективность трансляции РНК в составе вириона после инкубации с ТБ1 в молярном соотношении 1:100 близка к эффективности трансляции свободной РНК (Рис, 4). Можно сделать вывод, что большая часть, или даже все вирусные частицы препарата, вовлечены в процесс перестройки, индуцируемый ТБ1. С другой стороны, опыты по связыванию 14С- меченного ТБ1 с ХВК в буфере 0.01 М трис-HCI рН 7.4 с последующим ультрацентрифугированием и анализом осадков продемонстрировали, что не более 60% молекул ТБ1 в инкубационной смеси способны формировать ТБ1-ХВК комплексы. Следовательно, реальное молярное соотношение ТБ1:ХВК ниже, чем рассчитанное и использованное в нашей работе. Более того, реальное молярное соотношение ТБ1 :ХВК трудно рассчитать точно в связи со способностью ТБ1 молекул формировать /л vitro олигомеры, состоящие из двух и более копий белка (Н.О. Калинина, персональное сообщение).

Взаимодействие транспортного белка ТБ1 с вирионами ХВК является обратимым.

Представленные на Рис. 4 результаты были получены при 60-минутной трансляции в ББС. Из Рис. 5 следует, что при увеличении времени трансляции от S0 до 120 минут эффективность трансляции РНК в составе преинкубированной смеси ХВК-ТБ1 и свободной РНК ХВК выравнивалась уже при соотношении ХВК:ТБ1 1:25 (Рис. 5 дор. 3 и 4). Более того, даже при соотношении Х8К:ТБ1 1:1 после 120 минуг трансляции выявляйтся продукты трансляции вирионной РНК ХВК (Рис. 5 дор. 6). Таким образом, продление времени трансляции привело к увеличению доли транслируемых инкапсидированных РНК ХВК при весьма низких молярных соотношениях ХВК:ТБ1, Следовательно, взаимодействие ТБ1 с вирионами ХВК является обратимым, и при достаточно продолжительном времени трансляции, даже относительно небольшие количества ТБ1 способны активировать значительную часть присутствующих в реакционной смеси инкапсидированных РНК-матриц. Как уже отмечалось раньше реальное соотношение ТБ:ХВК значительно ниже. Можно

Рис. S. Взаимодействие транспортного белка ТБ1 с вирионами ХВК является обратимым.

1.-6. - Трансляция в течение 120 мин.: 1. - проба без РНК; 2. - ХВК; 3. - РНК ХВК; ХВК + ТБ1 в молярных соотношениях: 4. -1:25; 5. - 1:10; 6. -1:1; 7.-10. - Трансляция в течение 60 мин.: 7. - РНК ХВК; ХВК + ТБ1 в молярных соотношениях: 8. - 1:25; 9. -1:10; 10.-1:1;

Радиоавтограмма (8-20% ПААГ) продуктов трансляции РНК ХВК. Концентрация РНК в ЭЗП составляла 40 мкг/мл. Стрелкой указано положение кодируемой ХВК РНК-репликазы (165К). сделать вывод, что процесс перестройки вирусной частицы не требует стехиометрического взаимодействия между ТБ1 и частицами ХВК, и взаимодействие ТБ1 и ХВК является обратимым.

На данном этапе исследования возник вопрос: обратимы ли те изменения, которые ТБ1 ХВК вносит в структуру ХВК и которые заставляют РНК в составе вириона трансляционно активироваться. С целью его решения, препараты ХВК и комплексы ХВК-ТБ1, сформированные при молярном соотношении 1:100, центрифугировали при ЮООООд 2.5 часа через 30% сахарозную подушку в присутствии 0.5% ДСН (додецилсульфат натрия) и без него (контрольные образцы). Осадки суспендировали и равные аликвоты материала анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, иммуноблотом и добавляли в ББС. Прежде всего мы убедились, что присутствие 0.5% ДСН не привело к диссоциации вирусных частиц и не помешало осаждению вируса в комплексе с ТБ1 (Рис. 6 В). Иммуноблот с лоликпональными антителами к ТБ1 ХВК (Рис. 6 С) продемонстрировал, что в случае осаждения комплекса ТБ-ХВК без 0.5% ДСН в осадке присутствует ТБ1 ХВК. Наличие же в пробе ДСН приводит к диссоциации комплекса, и в осадке не удавалось обнаружить ТБ1. Далее образцы были добавлены в ББС. Как видно из Рис. 6 А (дор. 2, 4) РНК в составе ХВК, осажденного в присутствии или без ДСН, не транслировалась в ЭЗП. РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК успешно направляла синтез белков (Рис. 6 А дор. 3), но в случае комплекса, осажденного в присутствии ДСН, трансляция прекращалась, по-видимому, вследствие диссоциации ТБ1 и ХВК.

В то же время, при повторном добавлении к нетранслируемому образцу дополнительно ТБ1 ХВК в соотношении 100:1, РНК в составе вириона начинала

165 К

А) Радиоавтограф (8-20% ДСН-ПААГ) продуктов трансляции в ЭЗП.

1,- РНК ХВК (контроль); 2,- ХВК; 3.- ХВК-ТБ1; 4. - ХВК (0.5% ДСН); 5. - ХВК - ТБ1 (0.5% ДСН); 6. - ХВК (0.5% ДСН) + ТБ1; 7,- ХВК -ТБ1 (0.5% ДСН) + ТБ1; 8,- проба без РНК Пробы 2, 3, 4, 5 центрифугировали 100,000 g 2.5 ч; 4 и 5 - в присутствии 0.5% ДСН. Соотношение ТБ1:ХВК100:1. Осажденный материал после растворения транслировали в ЭЗП. Пробы 6 и 7: к пробам 4 и 5 соответственно перед началом трансляции добавили ТБ1 в соотношении ХВК : ТБ1 1:100.

В). Анализ осажденного материала электрофорезом в ДСН-ПААГ (8-20%)

R 1. ХВК; 2. ХВК (0.5% ДСН); 3. ХВК - ТБ1; 4. ХВК - ТБ1 (0.5% ДСН) Вирусные препараты ХВК (пробы 1, 2) и ХВК, инкубированный с ТБ1 (1:100) (пробы 3, 4) центрифугировали 100,000 g 2.5 ч; 2 и 4 - в присутствии 0.5% ДСН. Осажденный материал после растворения анализировали в ДСН-ПААГ. Гель окрашен Кумасси G-25D, Каждая проба содержала 1 мкг ХВК.

С). Иммуноблот с поликлональными антителами к ТБ1. р 1.- ХВК; 2,- ХВК (0.5% ДСН); 3. - ХВК - ТБ1; 4. - ХВК - ТБ1 (0.5% ДСН); 5. - ТБ1 (контроль)

Вирусные препараты ХВК (пробы 1, 2) и ХВК, инкубированный с ТБ1 (1:100) (пробы 3, А) центрифугировали 100,000 g 2.5 ч; 2 и 4 - в присутствии 0.5% ДСН. Осажденный материал после растворения анализировали в ДСН-ПААГ. Иммуноблот с поликлональными антителами к ТБ1. Каждая проба содержала 1 мкг ХВК.

Рис. 6. Изменения в структуре вириона, которые вносит ТБ1 при образовании комплекса, являются обратимыми. транслироваться вновь (Рис. 6 А дор.7). Таким образом, можно утверждать, что предполагаемое изменение структуры, которое вносит ТБ1 при образовании комплекса с вирионом, является обратимым.

Транспортный белок ТБ1 избирательно связывается с одним из концов частицы ХВК.

Мы показали, что ТБ1 образует устойчивый комплекс с вирусными частицами в бесклеточной трансляционной системе и в буфере. Оставалось неясным, с какими именно участками вириона взаимодействуют молекулы ТБ1.

Конверсия (превращение) нетранслируемой РНК в составе вириона в транслируемую форму происходит при относительно низком молярном соотношении ТБ:ХВК. В этих условиях только небольшая часть белковых субъединиц вириона может непосредственно связываться с молекулами ТБ1 при образовании ТБ1-ХВК комплекса. Можно было бы представить, что для взаимодействия с ТБ1 нужен не тот домен(ы) белка оболочки вируса, который экспонирован на поверхности частицы вдоль всей ее длины, а домен(ы), локализованные на торцах спиральной вирусной частицы.

Рис. 7. Транспортный белок ТБ1 избирательно связывается с одним из концов частицы ХВК.

Результаты иммуноэлектронной микроскопии; размер метки: А - 100 нм; Б - Е - 50 нм; Ж - 25 нм. Диаметр частиц коллоидного золота: А - Д - 10 нм; Е, Ж - 5 нм.

С целью уточнения деталей взаимодействия ТБ1 с вирионами ХВК был использован метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ). Преинкубированные комплексы "ХВК-ТБ1-ATTbi" (АТТб1 - кроличьи антитела к ТБ1) были очищены от не связавшихся белков ультрацентрифугированием через «подушку» из 30% раствора сахарозы. Затем молекулы ТБ1, связанные с вирусными частицами, визуализировали с помощью конъюгата протеина G с частицами коллоидного золота. Результаты ИЭМ, представленные на Рис. 7, свидетельствуют о том, что транспортный белок ТБ1 избирательно связывается с одним из концов вириона ХВК. На микрофотографиях часто наблюдались вирионы, связанные с двумя или более частицами коллоидного золота (Рис. 7, изображения Д - Ж); по-видимому, с одной вирусной частицей одновременно могут взаимодействовать несколько молекул ТБ1.

Эти данные вместе с результатами по трансляционной активации РНК в составе вириона ТБ1 позволяют с большой долей вероятности предположить, что связывание ТБ1 с одним из концов вирусной частицы может приводить к информационным изменениям в терминальных субъединицах белка оболочки (БО), что в свою очередь ведет к дестабилизации того конца вирусной частицы, где, возможно, находится 5'- конец РНК ХВК, вследствие чего он становится доступным для рибосом.

Неясно, однако, взаимодействуют ли ТБ1 непосредственно с вирионной РНК или же белковым компонентом вируса.

По-видимому, частицы без РНК, полученные in vitro путем реполимеризации БО ХВК, были бы удобным объектом для такого рода исследований, однако все попытки реполимеризовать белок ХВК в крупные регулярные агрегаты до сих пор терпели неудачу (Reichmann, 1960; Kaftanova et al., 1975). Мы попытались решить эту проблему путем деградации РНК ХВК РНКазами в составе частицы ХВК in site. Инкапсидированная РНК вирусов растений обычно защищена от воздействия РНКаз. Вследствие этого, РНК, изолированная из препарата ВТМ, обработанного РНКазами А и Т1, взятая нами в качестве контроля, оставалась полностью интактной. В отличие от РНК ВТМ, РНК ХВК в составе вириона оказалась чувствительной к обработке РНКазой : полноразмерную РНК не удалось выделить из частиц ХВК, обработанных: смесью А и Т1 РНКаз. Электрофорез в 12% ПААГ показал, что основная часть РНК присутствует в составе ХВК, обработанного РНКазами (ХВКАегрРНК) в виде фрагментов, размер которых не превышал 5-6 нуклеотидов (именно такое количество нуклеотидов предположительно связано с одной субъединицей БО ХВК (Tollin & Wilson, 1988). С помощью электронного микроскопа было показано, что деградация РНК не приводит к разборке вирусной белковой спирали, так как нам не удалось выявить морфологические различия между нативными частицами ХВК и хВКяегр рнк.

Методом иммуноэлектронной микроскопии мы исследовали способность ХВКдегрРНК связываться с ТБ1 ХВК. Обнаружено, что, ТБ1 способен избирательно связываться с одним из концов ХВКдегрРНК, как и с нативными вирионами (Рис. 8).

Рис. 8). Следовательно, ТБ1 связывается с оболочкой ХВК независимо от наличия интакткой вирусной РНК, которая не нужна для образования комплекса, а субъединицы белковой спирали после обработки РНКазой ориентированы так же, как в нативной частице ХВК.

Итак, мы установили, что молекулы ТБ1 действительно способны образовывать комплекс с одним их концов вирусной частицей ХВК. Однако, как

Рис. 8. Характеристика частиц ХВК, обработанных РНКазой (ХВКдагрРНК) и их комплексов с ТБ1 А, В - электронная микроскопия; С, D -иммуноэлектронная микроскопия, диаметр частиц коллоидного золота - Юнм. А - нативный ХВК; В хвкдегр.рнк;С комплекс ТБ1-ХВК; D -комплекс ТБ1-ХВКдег,>'рнк Размер метки ЮОнм отмечено выше, в условиях ББС это связывание является обратимым. Остается неясным, на какой стадии происходит диссоциация комплекса ТБ1-ХВК: (1) осуществляется ли освобождение ТБ1 без участия компонентов бёлоксинтезирующей системы (возможно, за счет НТФазной и РНК-хеликазной активности ТБ1); (2) происходит ли перестройка вирусной частицы и высвобождение молекул ТБ1 при участии некоего компонента (компонентов) ББС еще до начала трансляции; (3) происходит ли освобождение ТБ1 из комплекса с вирионом одновременно с началом трансляции РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК.

Преинкубация ХВК с ТБ1 в присутствии АТФ не влияет на эффективность последующей трансляции.

Известно, что ТБ1 ХВК обладает активностью АТФ/ГТФазы и РНК-хеликазы (Kalinina et а/,,1996;2002). Нельзя было исключить, что механизм перестройки частицы ХВК, индуцируемый ТБ1, связан с этими активностями транспортного белка.

Оказалось, что преинкубация ХВК с ТБ1 в присутствии АТФ или ГТФ перед добавлением в ББС не влияла на эффективность трансляции РНК ХВК в составе комплекса ХВК-ТБ1. Добавление негидролизуемого аналога АТФ 5'-аденилил-р-у-имидодифосфата (АИДФ) также не повлияло на эффективность трансляции РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК при преинкубации в ББС без метионина. Таким образом, активность РНК-хеликазы и АТФазы ТБ1, скорее всего, не участвует в обратимом взаимодействии ТБ1 с ХВК. Следует отметить, однако, что вопрос об участии АТФазной активности ТБ1 в трансляционной активации частиц ХВК требует дополнительных исследований.

Суммируя представленные данные, можно утверждать, что:

1) При добавлении ТБ1 в ББС вместе с ХВК происходит активация трансляции РНК в составе вириона. Взаимодействие ТБ1 ХВК с вирионами in vitro сопровождается конверсией вирионной РНК ХВК в транслируемую форму.

2) Методом иммуноэлектронной микроскопии показано, что молекулы ТБ1 ХВК взаимодействуют селективно с субъединицами БО, расположенными на одном из концов нитевидной частицы ХВК (предположительно соответствующим 5'-концу РНК). Образование этого комплекса не требует наличия интактной РНК ХВК: избирательное связывание ТБ1 с одним из концов белковой спирали ХВК происходит с участием частиц, содержащих деградированную РНК (ХВКяегр РНК).

3) Мы предполагаем, что связывание ТБ1 с субъединицами БО, расположенными на одном из концов вириона индуцирует конформационные изменения в этих субъединицах БО (ремоделирует вирусную частицу). Результаты наших опытов свидетельствуют о том, что взаимодействие ТБ1 с ХВК является обратимым и АТФ-независимым.

Механизм трансляционной активации РНК ХВК, индуцируемый ТБ1, мог бы функционировать in vivo только на поздних стадиях инфекции, но не в начале вирусного цикла, когда ТБ1 еще не образовался. Естественно возникает вопрос -каким образом РНК в составе родительских вирусных частиц становится транслируемой.

IV. Фосфорилирование вирусных частиц ХВК переводит вирионную РНК ХВК в транслируемую in vitro форму.

В первично инфицированной клетке должен существовать иной, отличный от ТБ1-зависимого, механизм трансляционной активации "родительских" частиц ХВК. Мы предположили, что в основе такого механизма может лежать фосфорилирование БО ХВК. Как было показано выше, фосфорилирование комплекса ТБ ВТМ РНК ВТМ переводит нетранслируемый in vitro комплекс в транслируемую форму,

В серии предварительных экспериментов мы проверили принципиальную возможность фосфорилирования Б О ХВК in situ растворимой фракцией и

БОХВК

С-ТБ ВТМ БОХВК

Рис. 9. Фосфорилирование БО ХВК in situ протеинкиназами растворимой (S10) фракции листьев N.glutinosa в присутствии [у-32Р] АТФ.

ХВК инкубировали с SIO-фракцией в присутствии (А дор.2 и В дор.З) или без (В дор.2) MnCi

A. 1. - S10- фракция без добавления ХВК; 2, - ХВК инкубировали с SIO-фракцией; 3. - ХВК инкубировали с фракцией КС.

B. 1. - S10- фракция без добавления ХВК; 2.-3. - ХВК инкубировали с SIO-фракцией в отсутствие МпС12 (2) и в присутствии МпСЬ (3); 4. - 14С - меченный 32К ТБ ВТМ (маркер). Радиоавтограф йР-меченных белков (8-20% ПААГ). фракцией клеточных стенок (КС), выделенных из листьев N. glutinosa и N. tabacum. и коммерческими препаратами серин/треониновых протеинкиназ (протеинкиназы С - ПКС и казеин киназы I и II - KKI и KKII). Было обнаружено, что: (1) БО ХВК не способен фосфорилироваться in situ ПК фракции клеточных стенок из листьев N. glutinosa (Рис. 9 А дор.З); (2) ПК-активность клеточной растворимой фракции (S10) из листьев N. glutinosa фосфорилирует БО ХВК in situ. (Рис.9 А, дор. 2 и В, дор. 3); (3) ПКС способна фосфорилировать БО ХВК in situ (Рис. 10 В).

Известно, что белок оболочки в составе вирионов ХВК in situ подвергается поэтапному протеолизу (Koenig et ai„ 1970, 1978). В результате выделенные препараты ХВК содержат как полноразмерный БО - Ps форму, так и различные процессированные формы с меньшей молекулярной массой, среди которых преобладают так называемые Pi и Pf формы. (Koenig et а/., 1978). Относительное содержание полноразмерной и процессированных форм БО ХВК варьирует в различных очищенных препаратах вируса. Важно отметить, что все формы БО ХВК, упомянутые выше, могут фосфорилироваться in situ (Рис. 10 А, В). Наконец, (4) оказалось, что эффективность фосфорилирования ХВК KKI была довольно низкой (Рис. 10 С, дор. 2), a KKII сама по себе не фосфорилировала БО ХВК (Рис. 10 С, дор. 1). Однако эффективность фосфорилирования БО ХВК заметно увеличивалась, когда использовали KKI и KKII одновременно (Рис. 10 С, дор. 3). Можно предположить, что повышение эффективности фосфорилирования БО

ХВК смесью KKI+KKIi происходит благодаря способности KKI фосфорилировать БО ХВК и открывать сайты (сайт) фосфорилирования для KKII (Hardie, 1999).

Рис.10. Фосфорилирование БО ХВК в составе вириона. Гель окрашивали Кумасси R-250 (А) и авторадиографировали (В и С).

А. и В. 1, 2 - Два независимо выделенных препарата ХВК инкубировали в присутствии ПКС и [у-32Р] АТФ; 3 - инкубационная смесь без ХВК. С. Фосфорилирование ХВК КК! и KKII в присутствии [у-32Р1 АТФ. 1 - ХВК инкубировали с KKI; 2 - ХВК с ККИ; 3 - ХВК инкубировали с KKI и ККИ вместе; 4 -инкубационная смесь без ХВК.

В отдельной серии экспериментов мы изучали влияние различных ингибиторов протеинкиназ на фосфорилирование БО ХВК S10- фракцией из листьев N. giutinosa. Был использован тот же набор ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ, что и при определении типа ПК, фосфорилирующих ТБ ВТМ КС из листьев N. giutinosa. Ни один из использованных ингибиторов не смог подавить фосфорилирование БО ХВК полностью. Создается впечатление, что более одной серин/треониновой ПК активности, связанной с фракцией S10, могут участвовать в фосфорилировании БО ХВК (две из них, по нашим данным, могут относиться к типу KKII и ПКС). Нельзя исключить вероятность того, что in vivo БО ХВК фосфорилируется по многим сайтам различными протеинкиназами, включая ПКС-подобные и КК-лодобные протеинкиназы.

Важным этапом нашей работы стала проверка предположения о трансляционной активации вирионной РНК ХВК в результате фосфорилирования вирусных частиц. Было обнаружено, что, хотя РНК в составе вириона ХВК полностью нетранслируема in vitro, она может превращаться в транслируемую форму при фосфорилировании ХВК ПКС, или клеточной растворимой S10-фракцией выделенной из листьев здорового растения N. giutinosa (Рис. 11, дор. 3, 4) или смесью KKI и KKII. Эффективность трансляции ХВК после фосфорилирования SIO-фракцией была ощутимо ниже, чем в случае вируса, фосфорилированного ПКС. Скорее всего, концентрация протеинкиназ в очищенном препарате ПКС значительно выше, чем в экстракте листьев. В любом

Рис. 11. Фосфорилирование вирусных частиц ХВК Д5. переводит вирионную РНК ХВК в транслируемую in vitro форму.

1. - ХВК; 2. - РНК ХВК; 3. - ХВК, фосфорилированный ИКС; 4. - ХВК, инкубированный с SIO-растворимой фракцией листьев N.glutinosa; 5. - ХВК, инкубированный с КС-фракцией листьев N.glutinosa; 6. - S10 фракция без добавления ХВК (контроль); 7. - проба без РНК. Радиоавтограмма (8-20% ПААГ) продуктов трансляции РНК ХВК. Концентрация РНК в ЭЗП составляла 40 мкг/мл случае, очевидно, что SIO-экстракг содержит протеинкиназы(зу), которые способны переводить вирионы ХВК в транслируемую форму, фосфорилируя вирусный Б©. Инкубация ХВК с фракцией КС, выделенной из листьев N. glutinosa или N. tabacum, не приводила к трансляционной активации инкапсидированной РНК ХВК (Рис. 11, дор. 5). Это согласуется с тем, что ПК, ассоциированные с КС не способны фосфорилировать БО ХВК in situ (Рис. 9 А, дор. 3).

Антигенные свойства нативного ХВК и ХВК-Р были исследованы в опытах по иммунопреципитации с использованием поликлональных кроличьих антител к ХВК. Как видно из рисунка Рис.12, эффективность преципитации ХВК-Р с

Рис. 12. Влияние фосфорилирования на антигенные свойства ХВК. Препараты вируса инкубировали с поликлональными антителами к ХВК (ИГ-G-XBK), после чего иммунопреципитат осаждали протеин А - сефарозой и анализировали в 8-20% ПААП 1. - ХВК (контроль); 2. - ХВК + ИГ-G-XBK; 3. - фосфорилированный ХВК+ ИГ-G-XBK; 4. - препарат ХВК + гетерологичные поликлональные антитела к вирусу мозаики костра (контроль). Гель окрашен Кумасси G-250. антителами к нативному ХВК была крайне низкой. По-видимому, фосфорилирование заметно влияет на антигенные свойства вирусных частиц ХВК, что свидетельствует о значительных конформационных изменениях в субъединицах фосфорилированного БО. Неясно, как фосфорилирование БО ХВК влияет на его сродство к вирионной РНК; мы предполагаем, что изменения выражаются в снижении сродства БО к РНК и к ее 5'-концевой нетранслируемой области, что, в свою очередь, приводит к связыванию 5'- концевого района с рибосомами и, как следствие, к запуску процесса котрансляционной разборки ХВК.

Вирионы ХВК с протеолитически отщепленным N-концом БО могут быть трансляционно активированы ТБ1 ХВК, но не фосфорилированием.

Ранее сообщалось, что N-концевая часть белка оболочки ХВК экспонирована на поверхности вирусных частиц (Baratova et at., 1992) и участвует в образовании высоко иммуногенной антигенной детерминанты (Koenig & Torrance, 1986; Sober et al., 1988), тогда как С-конец БО скрыт внутри вирусной частицы. N - концевая область БО ХВК обогащена аминокислотными остатками серина и треонина, являющимися потенциальными сайтами фосфорилирования.

Несколькими группами авторов показано, что в ходе очистки препаратов ХВК в растительных экстрактах происходит частичная деградация БО ХВК in situ: при этом нативная форма БО ХВК (Ps) в результате протеолитического отщепления N-концевой области переходит в процессированные формы Pi и Pf (Koenig et at., 1978).

Также продемонстрировано, что трипсин отщепляет от БО ХВК в составе вирусной частицы специфический пептид, содержащий 19 (Tremaine & Aggrawal, 1972) или 24 (Tung & Knight, 1972) аминокислотных остатка, в результате чего образуется Ptd (trypsin degradation) форма БО (БО-Ptd), близкая по электрофоретической подвижности к БО-Pf. Длина триптического пептида зависит от изолята ХВК. Анализ нуклеотиднсй последовательности белка оболочки русского штамма ХВК (Morozov et а/., 1983) выявил в 20-м положении с N-конца наличие остатка лизина, являющегося сайтом расщепления для трипсина. Это позволило предположить, что переход Ps-формы БО ХВК в Ptd-форму сопровождается удалением 20 N-концевых аминокислот, включая 8 остатков треонина и 4 остатка серина. Это подтвердили результата™ наших экспериментов, проведенных совместно с сотрудниками лаборатории д.б.н. Л.А. Баратовой, по обработке препаратов русского штамма ХВК трипсином с последующим анализом аминокислотного состава образующихся пептидов.

Можно было ожидать, что протеолитическое расщепление полноразмерного БО клеточными протеиназами(зой) или трипсином приводит к дестабилизации частиц ХВК. Однако, инкубация в ББС очищенных препаратов ХВК, которые преимущественно содержали Pf, Ps или Ptd формы БО ХВК, показала, что во всех случаях (XBK-Ps, XBK-Pf и ХВК- Ptd) вирионная РНК не была доступна для рибосом. Таким образом, протеолиз БО клеточными протеазами или трипсином не является механизмом конверсии родительских вирионов ХВК в транслируемую форму (Рис. 13 А дор.4; В дор.5). Более того, в отличие от нативного препарата ХВК, инкубация XBK-Ptd с растворимой фракцией S10 из листьев N. glutinosa, с ПКС (Рис. 13 А дор.2,5; В дор.6-9) или с КК I и II не приводит

4-165 К ■ * . *

Я*»?-? ■■■■■■■

Рис.13. Обработанные трипсином частицы ХВК (XBK-Ptd) могут быть трансляционно активированы Т51 ХВК, но не фосфорилированием БО ХВК.

A. 1. - ХВК; 2. - ХВК, фосфорилированный ПКС; 3. - ХВК + ТБ1 в молярном соотношении 1:100; 4, - XBK-Ptd; 5. - XBK-Ptd, фосфорилированный ПКС; 6. - ХВК-Ptd + ТБ1 в молярном соотношении 1:100; 7. - РНК ХВК; 8. - проба без РНК.

B. 1. - проба без РНК; 2. - ХВК; 3. - РНК, выделенная из ХВК; 4. - РНК выделенная из XBK-Ptd; 5. - XBK-Ptd; 6, 7. - ХВК, фосфорилированный ПКС и S10 фракцией, соответственно; 8, 9. - XBK-Ptd, фосфорилированный ПКС и S10 фракцией, соответственно.

Анализ ^S - меченных продуктов трансляции в ПААГ(8-20%). Концентрация РНК в ЭЗП 40мкг/мл. к трансляционной активации РНК ХВК в составе вириона. Важно отметить, что препараты XBK-Ptd, остающиеся ретранслируемыми после обработки ПК могут быть переведены в транслируемую форму после инкубации с ТБ1 ХВК (Рис. 13 А дор. 6).

Далее, мы обнаружили, что удаление трипсином N-концевого полипептида приводит к ощутимому падению степени фосфорилирования БО-Ptd по сравнению БО-Ps. Сравнение эффективности фосфорилирования БО ХВК, лишенного N-концевого полипептида, проводили в двух типах экспериментов (Таблица 4): (1) исходный препарат вируса фосфорилировали фракцией S10 из листьев N. giutinosa или ПКС в присутствии [у-32Р]АТФ. Далее 32Р-меченный ХВК (ХВК-Р*) обрабатывали трипсином, в результате чего получали XBK-P-Ptd*(l) или (2) исходный препарат ХВК обрабатывали трипсином и получали XBK-Ptd и затем фосфорилировали фракцией S10 или ПКС в присутствии [у-32Р]АТФ и получали препарат обозначенный в Таблице 4 как XBK-Ptd-P*(ll). Исходя из данных, представленных в Таблице 4 можно предположить, что N-концевой полипептид БО ХВК содержит основные сайты (сайт) фосфорилирования для серин/треонинспецифических ПК, т.к. конверсия 32Р-меченного ХВК* в XBK-P-Ptd*(l) приводит к удалению около 80% радиоактивности. Таблица 4.

Фосфорилирование in situ БО ХВК и БО ХВК, обработанного трипсином.

Различные фосфорилированные формы БОХВК Относительная радиоактивность (в %) после фосфорилирования: S10-фракцией ПКС

ХВК-Р*

XBK-P-Ptd*(l) 22 16,

XBK-Ptd-P*(ll) 21,4

Контроль (эндогенная радиоактивность) 1,4 3,

ХВК-Р* - исходный препарат ХВК фосфорилировапи S10 - фракцией из листьев N. glutinosa или ПКС в присутствии [у-32Р] АТФ.

XBK-P-Ptd*(l) Радиоактивно-меченный ХВК-Р* обрабатывали трипсином. XBK-Ptd-P*(ll) - исходный препарат ХВК обрабатывали трипсином, после чего ХВК-Ptd фосфорилировапи S10 фракцией в присутствии ty-32P] АТФ. Меченые препараты I, II и ХВК-Р* анализировали в ПААГ, окрашивали Кумасси и радиоавтографировали. Эквивалентные по площади полоски геля, соответствующие БО-Ps (ХВК), БО-Ptd (XBK-Ptd) и без БО (эндогенная радиоат-ивность) сканировали и количественно оценивали с помощью фосфоимеджера.

Радиоактивность препарата ХВК-Р* за вычетом 32Р - метки, неспецифически включившейся в эндогенной пробе, приравнивали к 100%.

Вирионная РНК в составе частиц XBK-Ptd после инкубации с ПК трансляционно не активируется (Рис 13 А, В), из чего можно сделать вывод, что фосфорилирование именно N-конца БО, а не сайтов, находящихся вне этого района играют ключевую роль в перестройке вирионов ХВК.

Неожиданные результаты были получены при трансляции вируса, фосфорилированного перед обработкой трипсином.

В соответствии с результатами, представленными выше, из Рис 14 (дор. 2, 3) видно, что фосфорилирование БО in situ превращает ХВК в транслируемую форму. Интересно, что обработка фосфорилированного препарата ХВК трипсином (аналогично ХВК- P-Ptd(l) в таблице 4) не снижала эффективность трансляции вирусной РНК инкапсидированной в БО-Ptd (Рис 14 дор. 6). Таким образом, эффект трансляционной активации, вызванный фосфорилированием БО ХВК, сохраняется даже при удалении N-концевого полипептида, содержащего основные сайты фосфорилирования, Другими словами, конформационные изменения, внесенные фосфорилированием БО в структуру вирусной частицы, необратимы и сохраняются после удаления подавляющей части

Рис.14. Изменения структуры вирусной частицы, внесенные фосфорилированием, остаются необратимыми.

1.-РНК ХВК; 2.-ХВК; 3,- ХВК-Р (фосфорилированный ХВК); 4.- ХВК, обработанный трипсином (XBK-Ptd); 5.- XBK-Ptd фосфорилированный (XBK-Ptd-P); 6.- ХВК-Р, обработанный трипсином (XBK-P-Ptd); 7.- ST-XBK; 8.- ST-XBK, обработанный трипсином; 9.- проба без РНК. Радиоавтограмма (8-20% ПААГ) продуктов трансляции РНК ХВК. Концентрация РНК в ЭЗП составляла 40 мкг/мл. фосфорилированных групп. Эти результаты свидетельствуют о принципиальной разнице механизмов трансляционной активации при фосфорилировании и в результате связывания Т51 с ХВК. Как упоминалось выше, при взаимодействии ТБ1 с ХВК ремоделирование частицы носило обратимый характер (Рис 6.).

С целью проверки гипотезы о роли фосфорилирования в трансляционной активации "родительских" вирионов ХВК в первично-инфицированных клетках был создан мутант ХВК с заменами потенциально фосфорилируемых остатков серина и треонйна в N - концевой области БО на нейтральные нефосфорилируемые аминокислоты - аланин и глицин.

Мутант был сконструирован на основе клона WT3 (полногеномной копии ХВК под контролем 35S промотора в плазмиде pUC), у которого между тройным блоком генов и геном БО находится ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Клон WT3 был любезно предоставлен проф., д.б.н. С.Ю. Морозовым и д.б.н. А.Г. Соловьевым.

На основе ПЦР-фрагмента была получена мутантнзя полногеномная копия ХВК (ST-XBK), с измененной последовательностью гена БО ХВК, результатом чего явилось изменение аминокислотной последовательности N - концевой области БОХВК:

MSAPASTTQPIGSTTSTTTKTAG - дикий тип (WT3) MAAPAGGAQРIGAGGAAGAKAAG - мутант ST-XBK ST-XBK далее использовали для заражения растений N. benthamiana. Конструкция оказалась инфекционной и вызывала на растениях системную инфекцию с симптомами, подобными вызываемым ХВК WT3. Вирус был выделен и очищен. Далее мы проверили инфекционность потомства ST ХВК на растениях N.benthamlana и D.stramonium. Вопреки нашим ожиданиям, вирусные частицы ST-XBK оказались инфекционными на растениях обоих видов, подобно вирусу дикого типа. По-видимому, родительские вирионы ST ХВК: а) либо переходят в mm ■Ыт ГТ Ш >■' Ц *« '

ЦЩ* V- * транслируемое состояние способом, отличным от фосфорилирования N-концевой области БО, б) либо вообще не нуждаются в трансляционной активации как таковой. Приведенные ниже результаты подтвердили справедливость второго предположения.

Оказалось, что в отличие от препаратов нативного ХВК и XBK-WT3, РНК в составе вирионов ST-XBK может транслироваться в ББС (Рис 14 дор. 7). По-видимому, внесенные нами аминокислотные замены привели к изменениям в структуре белковой спирали вируса, и 5'-концевая нетранслируемая область РНК ХВК стала доступной для рибосом, подобно тому, как это происходит в случае фосфорилирования ХВК. Транслируемость РНК в составе ST- ХВК сохранялась и после удаления трипсином N-концевого пептида БО, аналогично ХВК, фосфорилированному перед обработкой трипсином (Рис 14 дор. 6, 8). Эти, несколько неожиданные для нас результаты, косвенным образом еще раз подтвердили роль N-концевого пептида БО в трансляционной активации РНК в составе вириона.

Инфекционность препаратов XBK-Ptd.

Сравнительный анализ РНК, выделенной из нативного препарата ХВК и XBK-Ptd в 1% агарозном геле показал, что эти РНК не различаются ни по размерам, ни по гомогенности препаратов. Как упоминалось выше, РНК в составе вирионов, обработанных трипсином XBK-Ptd могла быть трансляционно активирована при инкубации с ТБ1. Было показано, что удельная инфекционность (количество некрозов на 1 мкг РНК на листьях С. amaranticolor') препаратов РНК, изолированных из нативного препаратов ХВК и XBK-Ptd идентична. На основании этих результатов был сделан вывод, что РНК в составе вириона XBK-Ptd интакгна. Если механизм трансляционной активации вирионов ХВК посредством фосфорилирования N-концевых остатков серина/треонина БО ХВК функционирует in vivo на ранних стадиях инфекции, то можно было ожидать, что инфекционность частиц XBK-Ptd окажется значительно ниже по сравнению с интактным ХВК. Ранее было показано, что инфекционность XBK-Pf препаратов была приблизительно в 3 раза ниже, чем XBK-Ps (Goldstein et ai., 1990). Как видно из Таблицы б, инфекционность ХВК, обработанного трипсином (XBK-Ptd), по сравнению с нативным препаратом ХВК была неизменно в 2-2.5 раза ниже нативного ХВК.

Кроме того, было показано, что при заражении листьев N. glutinosa (системного хозяина для ХВК) XBK-Ptd за один и тот же отрезок времени вызывает накопление значительно меньших количеств вируса, чем нативный ХВК (данные не представлены).

Таблица 5.

Инфекционность нативного ХВК и XBK-Ptd на листьях растения-индикатора.

Инфекционность: среднее число некрозов на С. Amaranticolor

Эксп.1 Эксп. Н Эксп. Ill Эксп. IV

ХВК XBK-Ptd ХВК XBK-Ptd ХВК XBK-Ptd ХВК XBK-Ptd

425±10 246±56 76±6 28±4 107±11 46±5 181±45 46±

Противоположные половинки листьев (Эксп. !-1Н) или целые листья (3Kcn.IV) инокулировали ХВК и XBK-Ptd. Представлены результаты просчета некрозов не менее 10 листьев для 4-х независимых экспериментов. Инокулюм содержал 50 мкг/мл ХВК или ХВК- Ptd

Причины меньшего, чем ожидалось, снижения инфекционности обработанного трипсином препарата ХВК на растениях до конца не ясны, поскольку внутриклеточная локализация протеинкиназ, способных фосфорилировать БО ХВК, и факторы, влияющие на их активность в различных растениях и На разных стадиях инфекции, неизвестны.

Следует также отметить, что препараты XBK-Ptd, которые мы использовали для заражения N glutinosa и С. Amaranticolor, содержали примесь нативной Ps-формы БО ХВК, выявляемую иммуноблотом. Поэтому нельзя исключить, что заражение растений препаратом XBK-Ptd происходит за счет присутствия в них минорного количества Ps- формы БО ХВК, т.е. нативных частиц ХВК.

Полученные результаты позволяют предположить, что фосфорилирование БО ХВК цитоплазматическими протеинкиназами может представлять собой способ трансляционной активации «родительских» вирусных частиц в первично инфицированных клетках.

Итак, нами было показано, что нетранслируемая в составе вирусных частиц вирионная РНК ХВК может быть трансляционно активирована в результате фосфорилирования белка оболочки ХВК (1) протеинкиназами растворимой (S1Q) фракции гомогената листьев Nicotiana glutinosa и Nicotiana tabacum, (2) коммерческими препаратами серин-треониновых протеинкиназ, включая протеинкиназу С и смесь казеинкиназ I и II.

Фосфорилирование заметно влияет на антигенные свойства вирусных частиц ХВК, что свидетельствует о значительных конформационных изменениях в субъединицах фосфорилированного белка оболочки. Неясно, как фосфорилирование БО ХВК влияет на его сродство к вирионной РНК. Мы предполагаем, что изменения выражаются в снижении сродства БО к РНК ХВК, и в том числе к 5'-концевой нетранслируемой последовательности РНК, что, в свою очередь, приводит к связыванию с рибосомами и, как следствие, к запуску процесса котрансляционной разборки ХВК.

Мы показали, что переход БО ХВК в составе вирусных частиц из нативной Ps-формы в Ptd-форму не сопровождается переходом вирионной РНК ХВК в транслируемое состояние. Такие препараты ХВК не транслировались после фосфорилирования, хотя содержали в своем составе интактную полноразмерную РНК. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фосфорилирование аминокислот, лежащих вне границ рассматриваемой N-концевой области БО, несущественно с точки зрения конверсии вирионной РНК ХВК в транслируемую форму. Конформационные изменения в структуре вириона ХВК, возникающие после его фосфорилирования, являются необратимыми, так как фосфорилированная частица ХВК, обработанная трипсином и лишенная М-концевого полипептида БО и соответственно сайтов (сайта) фосфорилирования, остается трансляционно активированной. Интересно, что нетранслируемые препараты XBK-Ptd приобретают способность эффективно транслироваться в присутствии ТБ1. Это свидетельствует о незначительной роли N-концевой области субъединиц БО ХВК при взаимодействии вирусных частиц ХВК с ТБ1. По-видимому, для взаимодействия с ТБ1 важны домен(ы) БО ХВК, скрытые по всей длине вирусной частицы ХВК и экспонируемые только на одном из ее концов.

Таким образом, два фактора - фосфорилирование БО м вирусспецифический белок ТБ1 способны активировать трансляцию инкапсидированной РНК ХВК; при этом фосфорилирование и взаимодействие с ТБ1 осуществляются в пределах различных областей молекулы БО ХВК.

На основании приведенных выше данных можно предложить гипотез/, предполагающую существование двух различных механизмов трансляционной активации ХВК на разных стадиях развития инфекции: (1) При попадании XBIC б первично инфицированную клетку происходит фосфорилирование БО в составе «родительских» вирусных частиц, что сопровождается переходом инкапсидированной вирусной РНК в транслируемую форму. Можно допустить, то на последующих стадиях развития инфекции этот механизм по каким-то причинам становится неэффективным. Возможно, что на этом этапе происходит подавление фосфорилирования БО ХВК, например, вследствие активации специфических протеинфосфатаз. Известно, например, что при заражении растений табака ВТМ на ранних стадиях инфекции происходит активация некоторых протеинфосфатаз, что представляет собой часть защитного ответа растения-хозяина (Dunigan & Madlener, 1995). Нами было обнаружено увеличение протеинкиназной активности в S10 фракции листьев Nicotiana glutinosa, зараженных ХВК через несколько часов после инокуляции. В тоже время, через несколько дней после заражения табака ХВК повышалась протеинфосфатазная активность. Предположение о подавлении фосфорилирования вирусных частиц на поздних стадиях инфекции согласуется с тем фактом, что РНК в составе нативных вирионов является нетранслируемой. (2) В ситуации, когда фосфорилирование БО подавлено, вирус вынуяоден использовать альтернативный механизм трансляционной активации вирусных частиц; предназначенных для транспорта через плазмодесмы. Таким механизмом может быть перестройка структуры 5'- конца вирусной частицы в результате взаимодействия вириона с транспортным белком ТБ1. Не исключено также, что оба названных механизма трансляционной активации вирионной РНК ХВК работают одновременно.

Следует отметить, что у различных по своей структуре вирусов - ВТМ и ХВК - фосфорилирование вирусных белков возможно играет существенную роль в жизненном цикле и распространении инфекции. По-видимому, фосфорийирование вирусных белков с использованием клеточного ферментативного аппарата можно считать элементом стратегии инфекции некоторых фитовирусов.

V. Особенности трансляционной разборки ХВК в ходе трансляции вирионной РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК и фосфорилированного ХВК.

В следующей серии экспериментов мы попытались сравнить между собой два способа трансляционной активации ХВК: взаимодействие частицы с ТБ1 и фосфорилирование БО в составе вириона.

Арест трансляции РНК ХВК.

5'-концевая нетранслируемой последовательность РНК ХВК - а{3-лидер, обладает свойствами сильного энхансера на уровне трансляции, сф-лидер содержит 83 нуклеотида (до первого AUG-кодона) и состоит из двух частей, обозначенных как а-последовательйость (41 нуклеотид без гуаниловых остатков) и р-последовательность (42 остатка перед первым AUG) (Smirnyagina et а/., 1991) . Нами был проведен анализ отдельных структурных элементов ар-лидера с точки зрения их ответственности за его активность как трансляционного энхансера,

Выяснилось, что значительная часть последовательности оф-лидера, включая весь р- фрагмент, не вносит позитивного вклада в эффективность трансляции. Анализ а-последовательности, выявил фрагмент, аналогичный участку усиления инициации трансляции (TPS- translation initiation-promoting site), описанному Thanaraj & Pandit (1990), комплементарный З'-концевой области 18S рРНК и предположительно способный взаимодействовать с ней, стимулируя образование комплекса инициации. Роль (3-участка, по-вйдимому, заключается в приближении TPS к AUG - кодону за счет формирования вторичной структуры. Удаление TPS приводит к утрате ар-лидером активности трансляционного энхансера. Полученные результаты были использованы: нами, далее в опытах по аресту трансляции РНК ХВК.

Как видно из Рис.15 (дор. 2 и 3) трансляция изолированной РНК ХВК полностью блокируется олигодезоксирибонуклеотидом 5'dGGTTTGGTTGTGTTG3', полностью комплементарного району а-последовательности оф-лидера РНК ХВК с 22 по 36 нуклеотид и частично - с 2 по 12 нуклеотид с 5'-конца, проинкубированным с РНК перед добавлением в ЭЗП. Ингибируювдий эффект наблюдался также при инкубации фосфорилированного ХВК-Р с олигонукпеотидом (Рис.15, дор. 6 и 7). Скорее всего сф-лидер РНК в составе ХВК-Р доступен и для комплементарного олигонуклеотида и для рибосом после фосфорилирования вирионов ХВК in situ. Аналогичный результат был получен о описанным выше мутантом ST-XBK. (Рис. 15 дор. 8 и 9).

С другой стороны, добавление олигонуклеотида не оказывает ингибирующего эффекта на трансляцию комплекса ТБ1-ХВК (Рис.15, дор. 4 и 5). По-видимому, олигонуклеотид не может связываться с 5'-концом РНК: ТБ1-ХВК, предварительно проинкубированный с олигонукпеотидом, сохраняет способность направлять синтез вирусспецифических белков в ЭЗП. Возможно, 5'- конец РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК становится доступным для рибосом только после взаимодействия ТБ1 с компонентами (компонентом) трансляционной системы, но на этом этапе олигонуклеотид уже не может конкурировать с рибосомами.

Выше отмечалось, что п(зотеинкиназы и ТБ1 используют разные участки молекулы БО для перевода РНК в составе ХВК в транслируемую форму: М-концевой пептид, расположенный на поверхности вириона необходим для ремоделирования ХВК путем фосфорилирования, в то время как молекулы ТБ

1 2345678910 Рис- 1s Арест трансляции РНК

165 К в составе ХВК в присутствии ■*— комплементарного к 5'-концу олигодезоксирибонуклеотида. 1- ХВК; 2,- РНК ХВК; 3,- РНК ХВК + олигонуклеотид; 4,- ТБ1-ХВК (100:1); 5,- ТБ1- ХВК + олигонуклеотид; 6.- ХВК-Р; 7,-ХВК-Р + олигонуклеотид; 8,- ST-ХВК; 9. - ST-XBK + олигонуклеотид; 10.- проба без РНК. Пробы 3, 5, 7 и 9 перед трансляцией инкубировали с олигонуклеотидом 5'dGGTTTGGTTGTGTTG 3' при 4°С, 12- 14 часов, а затем добавляли в ЭЗП. Радиоавтограмма (8-20% ПААГ) продуктов трансляции РНК ХВК. Концентрация РНК в ЭЗП составляла 40 мкг/мл. взаимодействуют с участком БО, скрытым внутри частицы, и доступным для ТБ1 только с одного конца белковой спирали.

Можно допустить, что существуют различные механизмы для перестройки ХВК, необходимые для трансляционной активации инкапсидированной РНК, в случае взаимодействия с ТБ1 и фосфорилирования БО ХВК.

Кинетика синтеза белков, направляемых РНК в составе комплекса ТБ1-ХВКиХВК-Р.

Мы сравнили кинетику синтеза белков, направляемых РНК в составе ТБ1-ХВК, ХВК-Р с эквивалентным количеством изолированной РНК ХВК. Скорость тансляции РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК и свободной РНК была сходной: мы

1 2 3 4 5 6 7 S

10 мин. 15 мин. 20 мин. 25 мин. 30 мим.

Рис.16. Кинетика синтеза белков в ЭЗП, направляемых РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК, ХВК-Р и изолированной РНК ХВК

1, 4, 7, 10, 13 - РНК ХВК; 2, 5, 8, 11, 14 - ХВК-Р; 3, 6, 9, 12, 15 - комплекс ТБ1-ХВК в молекулярном соотношении 100:1. Радиоавтограмма (8-20% ПААГ) продуктов трансляции РНК ХВК. Концентрация РНК в ЭЗП составляла 40 мкг/мл. не смогли обнаружить задержки появления продуктов трансляции, направляемых комплексом ТБ1-ХВК, по сравнению со свободной РНК (Рис.16). С другой стороны, неизменно наблюдалось очевидная задержка трансляции ХВК-Р (Рис. 16 дор. 2, 5, 8, 11 и 14). По-видимому, эти результаты отражают различия в разборке вируса в ходе трансляции РНК ХВК в составе вириона при связывании частиц ХВК с ТБ1 и при фосфорилировании БО. Вероятно, активация трансляции вирионной РНК ХВК ТБ1 не приводит к эффекту котрансляционного раздевания, в отличие от ХВК-Р.

Особенности трансляционной разборки ХВК в ходе трансляции комплекса ТБ1-ХВК и ХВК-Р была предметом наших дальнейших исследований.

Анализ спирально-аранжированной и диссоциированной форм белка оболочки ХВК с помощью обработки трипсином.

Анализ БО ХВК с помощью обработки трипсином четко выявляет различия между белком в свободном (низкомолекулярном) состоянии или находящимся в составе белковой спирали ХВК. БО в составе вирусных частиц (XBK-Ps и XBK-Ptd) относительно устойчив к обработке трипсином: обработка трипсином БО, собранного в спиральную структуру, приводит лишь к отщеплению N-концеаого пептида и превращению БО-Ps в БО-Ptd форму. С другой стороны, обработка трипсином не собранных в белковую спираль (низкомолекулярных) отдельных субъединиц БО ХВК приводит к образованию коротких пептидов, которые не могут быть обнаружены при электрофорезе в ДСН-ПААГ в обычных условиях.

Таким образом, наличие БО в форме БО-Ptd или смеси БО-Ps/ БО-Ptd посте обработки трипсином четко указывает, что в анализируемом образце БО ХВК аранжирован в виде спирали. Мы использовали эти различия для анализа разборки ХВК в ходе трансляции комплекса ТБ1-ХВК и ХВК-Р в ББС.

После обработки трипсином нативного (нетранслируемого) XBfC, проинкубированного 60 мин в ЭЗП, мы наблюдали только переход формы БО-Ps е БО-Ptd (Рис.17 А дор. 1-2). Соответственно, упоминавшиеся выше обработанные РНКазой частицы хвкдегрРНК, не содержащие интактной РНК, также остаются устойчивыми к трипсину после инкубации в ЭЗП (Рис.17 В дор. 1-2). Можно сделать вывод о том, что при инкубации в ЭЗП нетранслируемых частиц (нативного ХВК и частиц обработанных РНКазой ХВКдегрРНК) разборки белковой оболочки не происходит. Эти результаты продемонстрировали, что на ранних этапах трансляции комплекса ТБ1-ХВК происходит быстрая и, возможно, кооперативная разборка оболочки ХВК, В контрольном эксперименте было показано, что после трех минут трансляции свободной РНК, комплекса ТЫ -ХВК, или ХВК-Р в ДСН-ПААГ не выявляются З53-меченные продукты трансляции. l-f*P"*St

БО-Ps БО-Ptd

1.-2. ХВК инкубировали 60 мин; 3. - 4. ХВК + ТБ1 инкубировали 10 мин; 5. - 6. ХВК + ТБ1 инкубировали 60 минут; 7. - 8. ХВК-Р инкубировали 10 мин; 9. -10. ХВК-Р инкубировали 60 минут; 11. -12. Проба без ХВК(ЭЗП)

БО-Ps БО-Ptd

1.-2. ХВК, Обработанный РНКазой (ХВКД8ГрРНК); 3.-4. ХВКдегрРНК + ТБ1; 5.

- 6. ХВК + ТБ1 в отсутствие метионина; 7. - 8. ХВК + ТБ1;

9.-10. ХВК; 11.-12. Проба без ХВК (ЭЗП); пробы инкубировали 60 минут

БО-Ps БО-Ptd

I. - 2.ХВК; 3. - 4.БО ХВК;5. - 6. ХВК-Р; 7. - 8. ХВК + ТБ1; 9. - 10. ХВК-Р;

II. - 12.ХВК + ТБ1; 13. - 14.Проба без ХВК.

Все пробы инкубировали в ЭЗП в течение 10 мин. Пробы 9-12 перед добавлением матрицы инкубировали 2 мин в присутствии 24mM NaF.

БО-Ps БО-Ptd

1.-6. ХВК + ТБ1 + циклогексимид; 1.-2. циклогексимид добавлен одновременно с ХВК. 3. - 4. циклогексимид добавлен через Юмин после начала трансляции; 5. - 6. циклогексимид добавлен в ЭЗП перед добавлением матрицы. Все пробы инкубировали 10 минут.

Рис.17. Разборка ХВК происходит на начальном этапе элонгации трансляции ТБ1-ХВК комплекса. Анализ БО при обработке трипсином. Пробы (1 мкг ХВК или БО ХВК) инкубировали в ЭЗП.

В пробах 1, 3, 5, 7, 9,11, 13 реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ. К пробам 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 добавляли трипсин (6 нг) и дополнительно инкубировали 2 часа при +37° С; реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ. Гель окрашен Кумасси G-250. Конечная концентрация циклогексимида 1 тМ.

Мы предполагаем, что связывание ТБ1 с одним из концов ХВК индуцирует структурный переход (ремоделирование) от стабильного нетранслируемого вириона к метастабильной форме. В результате этого перехода 5'-конец вирусной РНК становится доступен для рибосом при помощи пока еще неизвестного механизма. Далее, разборка метастабильной вирусной частицы с образованием низкомолекулярной (трипсин-чувствительной) формы БО и вирионной РНК индуцируется на ранних этапах трансляции. Ничего подобного не происходит в случае трансляционной активации РНК в составе ХВК-Р. БО в составе ХВК-Р после инкубации в ЭЗП в течение 10 минут остается в виде белковой спирали: при обработке трипсином БО-Ps превращается в БО-Ptd (Рис.17 А дор. 7-8). Скорее всего в этом случае имеет место котрансляционная разборка вириона, описанная ранее для ВТМ (Wilson and Shaw, 1987; Show, 1999).

ТБ-зависимая разборка ХВК требует начальных актов транслокации при трансляции ТБ1-ХВК комплекса.

В следующей серии экспериментов мы предприняли попытку выяснить, какой этап трансляции необходим для индукции разборки вирионов ХВК в составе ТБ1-ХВК комплекса.

Известно, что отсутствие инициаторной тРНК„Мет, связанной с метионином ингибирует инициацию трансляции на стадии формирования тройного комплекса (Levin et а/., 1973; Gupta et al„ 1973; Hunter et al„ 1977). Синтез полипептидной цепи не может быть инициирован в отсутствие метионина, присоединенного к тРНК„Мет.

Мы обнаружили, что разборка ХВК не происходит, и БО остается в виде белковой спирали после инкубации комплекса ТБ1-ХВК в ЭЗП без метионина (Рис.17 В дор. 5-6), также как и нативного (нетранслируемого) ХВК (Рис.17 В дор. 9-10). На основании этих результатов был сделан вывод, что в отсутствие инициации трансляции разборки белковой оболочки комплекса ТБ1-ХВ1С не происходит.

Ранее было показано (Kappen & Goldberg, 1976), что фторид натрия во фракционированной системе не ингибирует образование тройного комплекса и позволяет 40S субъединице связываться с соответствующим сайтом инициации трансляции, но предотвращают формирование стабильного 80S инициаторного комплекса. Разборка ХВК в составе ТБ1-ХВК комплекса в ЭЗП изучалась в присутствии фторида натрия, и было показано, что фторид натрия полностью блокировал трансляционную разборку ТБ1-ХВК комплекса (Рис.17 С дор. 11-12). Следовательно, ингибирование инициации трансляции блокирует процесс разборки ТБ1-ХВК на этапе формирования 48S инициаторного комплекса. Возможно, следующие начальные стадии трансляции ТБ1-ХВК комплекса необходимы для запуска разборки белковой спирали ХВК на субъединицы. Иными словами, возник вопрос: только ли стадия инициации трансляции необходима и достаточна для запуска разборки ХВК до низкомолекулярного БО и РНК, и играет ли какую-нибудь роль в этом процессе этап элонгации. Далее мы использовали циклогексимид а концентрации (1мМ), ингибирующей элонгацию полипептидной цепи на стадии транслокации (Obrig et al., 1971; Lehninger et al,, 1993). Циклогексимид при добавлении в ЭЗП должен был, по существу, "заморозить" 80S инициаторный комплекс на вирусной РНК.

Оказалось, что присутствие* циклогексимида (ЦГ) не предотвращает разборку ТБ1-ХВК комплекса, если ЦГ был добавлен через 10 минут после начала трансляции или одновременно с комплексом ТБ1-ХВК (Рис.17 D дор. 1-4). В отдельных контрольных опытах было показано, что трансляция свободной РНК полностью блокируется ЦГ в этих условиях. Однако, при добавлении ЦГ в ББС перед добавлением матрицы, дальнейшая инкубация в системе не приводила к разборке белковой спирали ТБ1-ХВК комплекса (Рис.17 D дор.5-6). Мы предполагаем, что добавление ЦГ перед внесением матрицы в ББС полностью ингибирует транслокацию в начале элонгации трансляции, в то время, как добавление ЦГ через 10 минут и даже сразу вслед за матрицей допускает прохождение первых актов транслокации при трансляции РНК в составе ТБ1-ХВК комплекса. На основании полученных результатов был сделан вывод, что начальные этапы элонгации трансляции ТБ1-ХВК комплекса необходимы для индукции процесса быстрой разборки вирусной белковой спирали.

Фракционирование ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы комплекса ТБ1-ХВК и ХВК-Р, проинкубированных в ЭЗП.

Параллельно с анализом трансляционных проб с помощью обработки трипсином мы фракционировали их центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы (8-20%). Образцы инкубировали в ЭЗП в течение 2-3 мин после чего в систему добавляли циклогексимид до конечной концентрации 1 мМ, чтобы заблокировать элонгацию трансляции. Затем центрифугировали, раскапывапи на фракции и анализировали фракцию №1 (мениск пробирки) и придонную фракцию № 22 иммуноблотом с поликлональными антителами к БО ХВК. Предполагалось, что при быстрой и, возможно, кооперативной разборке ХВК и высвобождении БО из комплекса ТБ1-ХВК, запускаемом рибосомами после инициации трансляции, мы обнаружим в первой фракции градиента свободный

Рис.18. Иммуноблот фракций ТБ1 - ХВК комплекса и ХВК-Р, после — БО ХВК инкубации в ББС и центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы.

Комплекс ТБ1-ХВК, ХВК-Р, нативный ХВК и свободный БО ХВК инкубировали в ЭЗП в течение 2-3 минут, после чего добавляли цикпогексимид (1мМ) и центрифугировали в градиенте концентраций сахарозы (8-20%), 100 ООО g в течение 2.5 ч„ после чего пробы раскапывали на 22 фракции, фракции № 1-мениск (дор. 1 - 4) и №22 - придонная фракция (дор. 6-9) анализировали иммуноблотом с поликлональными антителами к ХВК; дор.5 - ВТМ (отрицательный контроль).

1, 6 - БО ХВК; 2, 7 - ХВК; 3, 8 - ХВК-Р; 4, 9 - ТБ1-ХВК; 5 - ВТМ.

БО, которого не будет при фракционировании нативного ХВК или ХВК-Р. В этих: условиях вирусные (недиссоциировавшие) частицы окажутся в придонных фракциях градиента. Как видно из Рис.18 в соответствии с этим предположением БО ХВК был обнаружен в верхней фракции градиента при короткой инкубации а ЭЗП комплекса ТБ1-ХВК (дор.4 и 9). С другой стороны, нативный (дор.2 и 7) и фосфорилированный ХВК (дор. 3 и 8) выявлены иммуноблотом только а придонной, но не в верхней фракции градиента. Аналогичный эксперимент был поставлен с добавлением в трансляционную систему фторида натрия, чп> предотвращало формирование 80S инициаторного комплекса. В этом случае БО не был обнаружен в первой фракции градиента в пробе, содержавшей ТБ1-ХВК-комплекс, т.к. ингибирование инициации трансляции фторидом натрия предотвращало разборку белковой спирали в составе комплекса ТБ1-ХВК.

Обобщая представленные данные, можно утверждать, что разборка ХВК не происходит, когда подавлены начальные этапы трансляции РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК. По-видимому, определяющим моментом для диссоциации БО являются первые акты транслокации в ходе элонгации трансляции.

Различия, выявленные в разборке вируса между ТБ1-ХВК и ХВК-Р в коде трансляции в опытах по аресту трансляции, кинетике синтеза белков, направляемых РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК или ХВК-Р и при обработке трипсином БО ХВК, позволяют заключить, что разные механизмы ответственны за трансляционную активацию РНК ХВК в составе вириона в случае связывания частицы с ТБ1 и фосфорилирования БО. При трансляции комплекса ТБ1-ЛЗК имеет место быстрая разборка белковой оболочки, в то время как трансляция ХВК-Р, по-видимому, основана на механизме котрансляционного раздевания вируса.

Дестабилизация белковой спирали ХВК при взаимодействии ТБ1 с частицами ХВК, не содержащими интактной РНК.

Как упоминалось выше, при обработке нативного ХВК РНКазами А и Т1 образуются частицы морфологически сходные с нативными вирионами ХВК, но не содержащие в своем составе интактную РНК (ХВКАегрРН|<). ТБ1 способен избирательно связываться с одним из концов ХВКдетрРНК, также как и с частицами ХВК-и обработка трипсином, нативного ХВК или хвКАефрнк после инкубации в ЭЗП приводила к сходным результатм (Рис. 8 и 17 В ).

Седиментационный анализ также не выявил существенных различий между препаратами нативного ХВК и хвКяефРНК. При аналитическом центрифугировании коэффициент седиментации хВКдефРНК (S2o,») составлял от 157 до 168S, что было близко по своему значению к нативному ХВК (Sao,® около 140S)

Таким образом, результаты электронной микроскопии, седиментационного анализа и результаты обработки трипсином свидетельствовали, что частицы ХВКД£!ГрРНК морфологически сходны с нативным ХВК. Эти выводы были подтверждены результатами исследований частиц ХВК и хвкдегрРНК с помощью атомно-силовой микроскопии, проведенными совместно с д.ф.н, И.В. Яминским и к.ф.н. О.И. Киселевой. Можно предположить, что после деградации РНК in situ структура частиц ХБКдегрРНК поддерживается в основном за счет белок-белковых взаимодействий молекул БО.

Хотя, деградация РНК не приводит к разборке белковой спирали, можно было ожидать, что отсутствие интактной молекулы РНК приведет к уменьшению стабильности ХВКдегрРНК по сравнению с нативным ХВК. Препараты хвкдегрРНК были использованы для дальнейших исследований механизма дестабилизации белковой спирали ХВК при взаимодействии с ТБ1. При аналитическом центрифугировании основная часть комплекса ТБ1- хвКдефРНК, в отличие от ХВКдеф'рнк, диссоциирует с образованием белковых субъединиц с коэффициентом седиментации 2.8S, что соответствует мономерам (или димерам) молекул БО (Dementjeva et ai., 1970; Kaftanova et al., 1975). Этот результат свидетельствует, что связывание ТБ1 с одним их концов частицы хВКдегр'рнк индуцирует перестройку, которая приводит к разборке оболочки вируса до белковых субъединиц. Известно, что давление, возникающее при центрифугировании, может служить причиной того, что частицы подвергаются сжатию (Schachman, 1959). Кажется логичным предположить, что связывание молекул ТБ1 с одним из концов, спиральной частицы индуцирует конформационные изменения в БО, линейно распространяющиеся вдоль всей белковой спирали, приводя к нарушению белок-белковых связей и дестабилизации частиц хвКдегрРНК Частицы переходят в метастабильное состояние и могут разбираться на субъединицы благодаря гидростатическому давлению и сжатию частиц при центрифугировании с ускорением более 10 ОООд. Меньшая часть препарата ХВКАегрРНК, не вовлеченная в разборку, быстро седиментирует на дно аналитической ячейки и содержит ХВК-подобные частицы.

В отличие от ТБ1-ХВКдегрРНК, при седиментационном анализе комплекса ТБ1-ХВК разборка вирионов не наблюдалась: на седиментограмме отсутствовали низкомолекулярные формы БО. Стабильность ТБ1-ХВК комплекса при седиментационном анализе, вероятно, объясняется вкладом РНК-белковых взаимодействий в сохранение структуры вириона.

Можно предположить, что связывание молекул транспортного белка ХВК-ТБ1 с одним из концов вириона ХВК или частиц хВКдегрРНК может служить причиной информационных изменений в терминальных белковых субъединицах частиц, приводящих к дестабилизации всей полярно ориентированной, спиральной оболочки вируса.

Выше, в разделе V, мы показали, что трансляция комплекса ТБ1-ХВК сопровождается некоторыми специфическими особенностями: (1) РНК ХВК не становится доступной для рибосом путем котрансляционного раздевания, (2) быстрая и, возможно, кооперативная диссоциация белка ХВК в комплексе ТБ1-ХВН запускается рибосомами в начале элонгации трансляции РНК ХВК, (3) диссоциация белка оболочки происходит даже тогда, когда синтез вирусспецифических белков подавлен циклогексимидом, (4) связывание ТБ1 с одним из концов частицы, обработанной РНКазой (ХВКАегрРНК) и не содержащей интактной РНК, приводит к линейной дестабилизации: белковая спираль оказывается метастабильной в комплексе с ТБ1 и может разбираться на субъединицы благодаря гидростатическому давлению и сжатию частиц при центрифугировании. Предполагается, что трансляционная активация РНК ХВК в составе вириона, запускаемая ТБ1, связанного с одним из концов частицы XBIC, приводит к линейной дестабилизации спирали белковой оболочки частицы XBIC При этом внутренние конформационные изменения передаются от одного конца частицы к другому вдоль уложенных в виде спирали белковых субъединлц; разборка метастабильных ТБ1-ХВК-частиц запускается в начале элонгации трансляции. Индуцированная ТБ1 кооперативная трансляционная разборка частиц ХВК представляет собой неизвестный до сих пор способ регуляции трансляции вирусных РНК.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Карпова, Ольга Вячеславовна

Выводы.

1. Обнаружено, что транспортный белок ВТМ является эффективным репрессором геномных вирусных РНК in vitro. Показано, что комплекс РНК ВТМ-ТБ ВТМ не может инфицировать изолированные протопласты, однако заражает клетки интактных растений. Предполагается, что в составе комплекса с ТБ вирусная РНК исключена из процессов трансляции и репликации и используется в межклеточном транспорте.

2. Установлено, что фосфорилированный ТБ ВТМ не способен подавлять трансляцию in vitro, несмотря на сохранение РНК-связывающей активности Фосфорилирование ТБ приводит к конформационными изменениями в молекулах ТБ, в результате чего РНК в составе РНП становится доступной для рибосом и рибонуклеаз.

3. Показано, что вирионная РНК ХВК недоступна для рибосом в составе вирусных частиц, однако может быть трансляционно активирована двумя разными способами: в результате взаимодействия вируса с транспортный белком 1 (ТБ1) ХВК или в результате фосфорилирования белка оболочки ХВК

4. Методом иммуноэлектронной микроскопии показано, что молекулы ТБ1 ХВК взаимодействуют селективно с субъединицами БО, расположенными на одной из концов частицы ХВК (предположительно соответствующим 5'-концу РНК), Вирусная РНК не участвует в формировании ТБ1-ХВК комплекса. Образование комплекса ТБ1-Х8К, сопровождаемое конверсией вирионной РНК ХВК в транслируемую форму, является обратимым и АТФ-независимым.

5. Показано, что сайты фосфорилирования, играющие ключевую роль в трансляционной активации РНК ХВК расположены в N-kohi^som районе БО. Фосфорилирование заметно влияет на антигенные свойства вирусных частиц ХВК, что свидетельствует о значительных конформационных изменениях в субъединицах фосфорилированного БО. Инфекционность еирионов ХВК заметно снижается при обработке трипсином и утрате N- концевого полипептида; таше препараты ХВК могут быть трансляционно активированы при взаимодействии с ТБ1.

6. Установлено, что трансляция комплекса ТБ1-ХВК сопровождается рядом специфических особенностей: (1) В отличие от ВТМ, трансляция вирионной РНК ХВК не основана на механизме котрансляционного удаления БО, (2) быстрая и, вероятно, кооперативная разборка белка оболочки комплекса ТБ1-ХВК индуцируется рибосомами на начальных стадиях элонгации трансляции РНК ХВК.

7. Получены частицы (при обработке ХВК РНКазами) морфологически неотличимые от нативного ХВК, но не содержащие интактную РНК (ХВКАефРНК). Селективное связывание ТБ1 с одним из концов ХВКдегрРНК приводит к линейной дестабилизации белковой спирали, и метастабильный комплекс ТБ1-хвкдегр.рнк может разбираться на белковые субъединицы при центрифугировании.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Карпова О.В., Козловский С.В., Архипенко М.В., Заякина О.В., Решетникова В.Г., Родионова Н.П., академик Атабеков И.Г. Сравнительная характеристика протеинкиназ, фосфорилирующих in vitro транспортный белок ВТМ, // Доклады РАН, 2002, 386, №6, (в печати).

2. Zayakina O.V., Karpova O.V., Arkhipenko M.V., Kozlovsky S.V., Rodionova N.P., and Atabekov j.G, The role of plant protein kinases in translationa! activation of potato virus X RNA. // Abstracts of 13- Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Hersonissos, Crete, Greece, 2-6 Septemper 2002, P474, p. 703

3. Kozlovsky S.V., Rodionova N.P., Karpova O.V., Archipenko M.V., and Atabekov J.G. Two ways of encapsidated potato virus X RNA translational activation. // Abstracts of Xll~ International Congress of Virology, Paris, France, 27 July - 1

August, 2002, 112-V-907, p. 305.

4. Kiselyova O.I., Galiamov N.S., Nasikan N.S., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Novikov V.K. Scaning probe microscopy of biomacromolecules: nucleic acids, proteins and their complexes. // In Frontiers of Multifunctional Nanosystem (E.V. Buzaneva, P. Scharff, eds), 2002, p.321 -330, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

5. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Novikov V.K., and Arkhipenko M.V. Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. // Virology, 2001,286, p. 466-474.

6. Atabekov J.G., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Rodionova N.P. Role of a plant virus-coded movement protein and coat protein in regulation of viral RNAs translation. If Abstracts of International Conference in Honour of Alexander Spirin "Protein synthesis". Pushchino, Russia, August 27 - September 1, 2001, p. 41.

7. Kozlovsky S.V., Karpova O.V., Arkhipenko M.V., Rodionova N.P., Atabekov J.G. Coordinations of protein kinase and protein phosphatase activities in nicotiana giutinosa leaves infected by potato virus X. II Abstracts of International Symposium "Signaling Systems of Plant Cells", Moscow, Russia, 5-7 June, 2001, p. 28-29.

8. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., and Poljakov V.Yu. The movement protein-triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. //Virology, 2000, 271, p. 259-263.

9. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Archipenko M.V., Poljakov V.Yu., and Atabekov J.G. The movement protein TGBpl of potato virus X converses virion RNA from nontranslatable into a translatable form. // Abstracts of EMBO Workshop "Plant Virus Invasion and Host Defence", Kolymbari, Crete, Greece, 2000, p, 70.

10. Karpova O.V., Rodionova N.P., ivanov K.I., Kozlovsky, S.V.,. Dorokbov Yu.L, and Atabekov, J.G. Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. //Virology, 1999, 261, p.20-24

11. Карпова O.B., Козловский C.B., Архипенко M B., Родионова Н.П., Атабеков И Г. Комплексы РНК ВТМ с транспортным белком гордеивируса инфекционны s растениях, восприимчивых к обоим вирусам // Доклады РАН, 1999, 368, № 3, с. 406-409

12. Ivanov K.I., Karpova O.V., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L,, Atabekov I.G. Influence of phosphorylation on stability of movement protein-RNA complexes If Abstracts of 17a Annual meeting American Society for Virology. Canada, Vancouver, 1998, p. 6-12.

13. Karpova O.V., Ivanov K.I., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L., Atabekov I.G. Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. //Virology, 1997, 230, p. 11-21.

14. Дорохов Ю.Л., Карпова O.B., Калинина H.O., Иванов К.И., Фролова О.Ю., Самуилова О.В., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. Кодируемые тобамовирусами транспортные белки подавляют трансляцию геномных вирусных РНК in vitro. // Доклады РАН, 1996, 349, с. 259-261.

15. Мавродиева В.А., Карпова О.В., Томашевская О.Л., Родионова Н.П., Атабеков ИТ. Роль короткой 5'- нетранслируемой последовательности субгеномной РНК фитовируса как трансляционного энхансера. //Доклады РАН, 1995, 341, с. 828-830.

16. Карпова О.В., Мавродиева В.А., Томашевская О.Л., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. 3'- нетранслируемые тРНК-подобные структуры фитовирусов как трансляционные энхансеры. //Доклады РАН, 1995, 343, с. 828-830.

17. Rodionova N.P, Tomashevskaya O.L., Karpova O.V., Atabekov J.G. Enhancement of translation by the 5'-nontranslate оф-leader of potato virus X RNA. // Abstract of International Conference "Fundamental and applied problems in phytovirology. Ukraine, Yalta, 1994, p. 17.

18. Rodionova N.P, Karpova O.V., Mavrodieva V.A.Tomashevskaya O.L. The role of 5' - and 3'- nontranslated sequences of plant viral RNA in translational enhancement. // Abstract of International Conference "Molecular biology at the end of the XX century", Russia, Moscow, 1994, p. 21,

19. Tomashevskaya O.L., Solovyev A.G., Karpova O.V., Fedorkin O.N., Rodionova N.P., Morozov S.Yu and Atabekov J.G. Effects of sequence elements in the potato virus X RNA 5' non-translated оф-leader on its translation enhancing activity. // J.Gen.Viroi. 1993, V 74, p. 2717-2724.

20. Томашевская О.Л., Карпова O.B., Родионова Н.П, Роль комплементарного взаимодействия 5'-нетранслируемой лидерной последовательности геномной РНК Х-вируса картофеля и З'-концевой области 18S РНК в инициации трансляции.// Тезисы II Российского симпозиума «Новые методы биотехнологии растений», Пущино, Россия,1993, с.92

21. Томашевская О.Л., Соловьев А.Г., Карпова О.В., Федоркин О Н., Морозов С.Ю., Родионова Н.П. и Атабеков И.Г. Роль структурных элементов 5'-нетранслируемой последовательности РНК Х-вируса картофеля (сф-лидера) в определении его активности как трансляционного энхансера.// Доклады РАН,

1992, 324, с. 625-628.

22. Rodionova N.P., Morozov S.Yu., Miroshnicheriko N.A., Solovyev A.G., Fedorkin O.N., Lukasheva L.I., Smirnyagina E.V., Karpova O.V., Tomashevskaya O.L., and Atabekov J.G. Translation enhancing properties of the 5'-leader sequence of potato virus X RNA. // Abstracts of FEBS Advanced Course "The Plant Virus Genome: Structure and Expression", Riga, 1991, p.18.

23. Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Karpova O.V., Rodionova N.P.Solovyev AG., Fedorkin O.N., Zelenina D.A., Lukasheva L.I., Tomashevskaya O.L., and Atabekov J.G. Expression of Potato virus X genome. // Abstracts of International conference "Protein Biosynthajj^, Pushino, 19^^.27.

24. Miroshnichenko N.A., Karpov^u.V., Morozov S^i., Rodionova N.P. and Atabekov J.G. Translation arrest of potato virus X RNA in Krebs-2 cell-free system: RNase H cleavage promoted by complementary oiigodeoxynucleotides. // FEBS Lett.1988, V 234, №1, p. 65-68. •

Подписано в печать 1.10.2002 Заказ № 137. Формат 60х90/1в Усл. печ. л. 3,0 Тираж 120 экз. Отпечатано на ризографе в ОНТИ ГЕОХИ РАН

• •