Терапевтический эффект совместной экспрессии генов тимидинкиназы вируса простого герпеса и ГМ-КСФ в опухолях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Алексеенко, Ирина Васильевна

• Алексеенко, Ирина Васильевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Алексеенко, Ирина Васильевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Введение

1.2 Современные подходы к лечению онкологических заболеваний

1.2.1 Молекулярная таргетная терапия рака

1.2.2 Генная терапия рака

1.2.3 Способы повышения эффективности ГНЭПТ систем

1.2.4 Транскрипционный контроль экспрессии терапевтических генов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Культуры клеток и образцы тканей человека

2.1.2 Бактериальные клетки

2.1.3 Реактивы

2.1.4 Ферменты

2.1.5 Антитела

2.1.6 Буферные растворы

2.1.7 Микробиологические среды

2.1.8 Среды для культивирования эукариотических клеток

2.1.9 Наборы реактивов

2.1.10 Маркеры

2.1.11 Оборудование

2.1.12 Олигонуклеотиды

2.2 Методы

2.2.1 Стандартные процедуры

2.2.2 ПЦР

2.2.3 Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.4 Лигирование фрагмента ДНК с вектором

2.2.5 Выделение ДНК из агарозного геля

2.2.6 Введение плазмидной ДНК в клетки E.coli

2.2.7 Анализ содержания плазмидной ДНК в клетках колоний E.coli методом ПЦР

2.2.8 Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.2.9 Получение аналитических/препаративных количеств плазмидной ДНК

2.2.10 Выделение и очистка РНК из клеточных линий человека

2.2.11 ОТ-ПЦР

2.2.12 Введение плазмидной ДНК в эукариотические клетки

2.2.13 Приготовление осадков эукариотических клеток

2.2.14 Получение клеточных экстрактов для проведения иммуноблотинга

2.2.15 Анализ содержания белков в клеточных экстрактах методом иммуноблотинга

2.2.16 Получение GM-CSF- кондиционированной среды

2.2.17 Анализ содержания ГМ-КСФ в кондиционированной среде

2.2.18 Функциональный тест на цитотоксичность HSVtk

2.2.19 MTS-тест

2.2.20 Функциональный тест биологической активности hGM-CSF на клеточной линии TF1

2.2.21 Определение биологической активности mGM-CSF

2.2.22 Оценка терапевтического эффекта плазмидных конструкций ex vivo на мышах49

2.2.23 Доклинические испытания препарата «АнтионкоРАН-М»

2.2.23.1 Оценка терапевтического эффекта препарата «АнтионкоРАН-М» in vivo на мышах

2.2.24 Статистический анализ

2.2.25 Создание плазмидных конструкций, несущих ген люциферазы светлячка под контролем исследуемых промоторов

2.2.26. Создание плазмидных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем промотора CMV

2.2.27 Создание плазмидных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем промоторов PhSurv и PhTSurv269

2.2.28 Сайт-направленный мутагенез и создание двойных промоторов, содержащих мутантный промоторгена сурвивина человека

2.2.29 Анализ транскрипционной активности промоторов

2.2.30 Определение точек инициации транскрипции

2.2.31 Интернет ресурсы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Создание генно-инженерных конструкций, несущих гены HSVtk и GM-CSF под контролем одного промотора

3.2 Анализ экспрессии генов HSVtk и GM-CSF в составе полученных конструкций

3.3 Анализ биологической активности белков HSVtk и GM-CSF, синтезируемых в клетках, трансфицированных полученными конструкциями

3.4 Оценка терапевтического потенциала полученных конструкций ex vivo на животных

3.5 Оценка терапевтического потенциала полученных конструкций in vivo на животных

3.6 Доклиническое изучение специфической (противоопухолевой) активности препарата «АнтионкоРАН-М» в составе системы «АнтионкоРАН-М»/ Ганцикловир

3.7 Доклиническое изучение общетоксических свойств препарата «АнтионкоРАН-М»

3.8 Создание искусственных универсальных опухолеспецифических промоторов

3.9 Сравнительный анализ транскрипционной активности двойных тандемных и одиночных промоторов

3.10 В двойных промоторах PhTS и PhST инициация транскрипции происходит только с проксимального промотора

3.11 Промоторная интерференция между проксимальным и дистальным промоторами тандема

3.12 Сравнительный анализ транскрипционной активности тандемных промоторов с укороченной гипотетической neraeñPhTSurv269 и PhTmSurv

3.13 Инициация транскрипции с укороченных тандемных промоторов происходит как с проксимального, так и с дистального промоторов

3.14 Сравнительный анализ транскрипционной активности тандемных промоторов, содержащих полноразмерный промотор гена hSurv с мутантными Spl сайтами

3.15 Анализ активности промоторов PhSurv и PhTSurv269 в системе с использованием терапевтических генов HSVtk и GM-CSF

3.16 Сравнительный анализ активности np0M0T0p0BPhSurv, PhTSurv269 и CMV ex vivo на

мышах

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АСУ - acyclovir, ацикловир

araT -1-P-D-arabinofuranosylthymine, l-P-D-арабинофуранозилтимин

BIRC5 - Baculoviral IАР Repeat-Containing protein 5, белок, содержащий повторяющиеся

домены бакуловирусного ингибитора апоптоза

BVDU - (E)-5-(2-Bromovinyl)-2'-deoxyuridine, (Е)-5-(2-бромовинил)-2'-дезоксиуридин

CD - Cytosine Deaminase, цитозиндезаминаза

CD86 - Cluster of Differentiation 86, кластер дифференцировки

CDE - cycle dependent elements

CHR - cell cycle homology region

CMV - CytoMegaloVirus, цитомегаловирус

CNTF - Ciliary neurotrophic factor, цилиарный нейротрофический фактор Сге-белок - Causes REcombination, топоизомераза класса I бактериофага PI Сх - connexin, коннексин Еро - erythropoietin, эритропоэтин

GALV - Gibbon Аре Leukemia Virus, вирус лейкимии гиббона

GAPDH - glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

GCV - Ganciclovir, ганцикловир, 9- [(1,3-дигидрокси-2-пропокси)метил]гуанин

GM-CSF - Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, гранулоцитарно-

макрофагальный колониестимулирующий фактор

GR-1 - granulocyte differentiation antigen

F4/80 - белок семейства EGF-фактора роста эпидермиса

HSVtk - Herpes Simplex Virus-1 thymidine kinase, тимидинкиназа вируса простого герпеса первого типа

hTERT - human TElomerase Reverse Transcriptase, обратная транскриптаза теломеразы человека

IFN-a2a - interferon, интерферон альфа 2а IFN-a2b - interferon, интерферон альфа 2Ь IL - interleukin, интерликин

IRES - Internal Ribosome Entry Site, участок внутренней посадки рибосомы LD - lethal dose, летальная доза

LIF - Leukemia inhibitory factor Лейкемия-ингибирующий фактор

LoxP - locus of X-over Bacteriophage PI, сайт узнавания Сге-рекомбиназы бактериофага PI LUC - luciferase, люцифераза светлячка

MDR - Multiple Drug Resistance, множественная лекарственная устойчивость MTT - 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола

MTS - 3- [4,5- диметилтиазол-2-ил]-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий

b-NGF - Nerve growth factor Фактор роста нервов

NF-kB - Nuclear Factor kappa В, ядерный фактор кВ

OSM - Oncostatin M онкостатин M

PBS - phosphate buffered saline, натрий-фосфатный буфер

PolyA - polyadenylation signal, сигнал полиаденилирования

PSA - Prostate Specific Antigen, простата-специфический антиген

Rb - Retinoblastoma tumor suppressor gene, ген-супрессор ретинобоастомы

SCF - Stem cell factor фактор стволовых клеток

Spl - specificity protein 1, фактор транскрипции человека, кодируемый геном SP SV40 - Simian Virus 40, обезьяний вирус

TAR - TransActivation response Region, район трансактивации промотора ВИЧ

Tat - Transcription tans-AacTivator, трансактиватор транскрипции генов ВИЧ

UPRT - Uracil PhosphoRibosylTransferase, урацилфосфорибозилтрансфераза

VP22 - Virus Protein 22 kDa, вирусный белок вируса простого герпеса с массой 22 кДа

АПК - антиген-представляющие клетки

а.о. - аминокислотный остаток

5FC - 5-fluorocytosine, 5-фторцитозин

5FC - 5-fluorouracil, 5-фторурацил

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ГНЭПТ - ген-направленная энзиматическая пролекарственная терапия

ГТ - генная терапия

кДНК - Комплементарная ДНК

ДКИ - доклинические испытания

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПД - дигидропиримидиндегидрогеназы

ДФУ - дигидрофторурацил

ед. - единиц

и/т - интратуморально (внутриопухолево)

кДа - килоДальтон

КИ - клинические испытания

мин. - минут

мРНК - матричная РНК

МТТ - молекулярная таргетная терапия

НК - натуральные киллеры

об/мин - оборотов в минуту

п.н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭИ - полиэтиленимин

РНК - рибонуклеиновая кислота

с - секунда

СПИД - Синдром приобретённого иммунного дефицита

ТД - терапевтическая доза

ТМ - торможение метастазирования

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ТНПК - терапия направленная на пролиферирующие клетки

ТРО - торможение роста опухоли

ТЕМЕД - тетраэтиленметилендиамин

УПЖ - увеличение продолжительности жизни

ФНО-а - факторанекроза опухоли альфа

ч - час

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭТД - эквивалентная терапевтическая доза

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Терапевтический эффект совместной экспрессии генов тимидинкиназы вируса простого герпеса и ГМ-КСФ в опухолях»

1.1 Введение

Рак представляет собой одну из наиболее серьезных проблем медицины: он занимает второе место по смертности в мире и, по прогнозам, имеет перспективу перейти на первое. Онкологическая заболеваемость имеет тенденцию к росту. По прогнозам ВОЗ заболеваемость и смертность, обусловленные онкологическими заболеваниями, в мире вырастут в 2 раза за период с 1999 года по 2020 год: с 10 до 20 млн. новых случаев и с 6 до 12 млн. регистрируемых смертей.

Несмотря на громадные усилия, затрачиваемые во всём мире на поиск новых подходов к лечению рака, и некоторые несомненные успехи, проблема терапии рака в целом остаётся нерешенной. В настоящее время рак обычно рассматривается как заболевание, минимально поддающийся контролю средствами современной медицины, особенно при сравнении с другими распространенными болезнями.

Существующие на сегодняшний день лекарственные методы лечения онкологических заболеваний можно разделить на две широких категории: иммунная и неиммунная терапия. Иммунная терапия подразумевает введение в организм больного иммуностимуляторов, вызывающих развитие специфического противоопухолевого иммунного ответа. Одним из наиболее активно развивающихся направлений неиммунной терапии является генная терапия рака, в основе которой лежит доставка в опухоль генов, вызывающих ингибирование роста или гибель клеток опухоли.

Одной из важных стратегий генной терапии рака является генная хирургия, которая направлена на уничтожение опухолевых клеток путем использования их свойств, которые характерны для всех раковых клеток, например, повышенная скорость митотических делений. Подход заключается в доставке в раковые клетки генов-убийц, кодирующих фермент, как правило, вирусного или бактериального происхождения, который в клетках, где он экспрессируется, модифицирует свой субстрат, превращая его из нетоксичного пролекарства в токсичный для клетки метаболит.

Генная хирургия является двустадийной. На первом этапе в опухолевые клетки вводится ген-убийца с требуемой системой экспрессии, на втором вводят пролекарство, которое под действием фермента, образующегося в результате экспрессии гена-убийцы, превращается в токсин внутри раковых клеток, что резко уменьшает токсичность терапии. Токсин может высвобождаться из клетки, экспрессирующей ген-убийцу, и проникать в соседние клетки, вызывая их гибель, что многократно усиливает терапевтический эффект. Данное явление получило название «эффекта свидетеля» (bystander effect). «Эффект

свидетеля» заключается в том, что опухолевые клетки, не получившие ген-убийцу, но соседствующие с таковыми, оказываются подверженными цитотоксическому эффекту со стороны высвобождающегося токсина. Наиболее перспективными в настоящее время являются две системы ген-убийца/пролекарство, обладающие «эффектом свидетеля» и достигшие поздних стадий клинических испытаний: тимидинкиназа вируса простого герпеса (Н8У1:к)/ганцикловир(ОСУ) и цитозиндезаминаза/5-фторцитозин.

Эффективность системы ШУ^к/вСУ для лечения широкого спектра опухолей была показана в экспериментах на животных. Однако в клинических испытаниях на пациентах пока получают худшие результаты, чем на животных. В значительной степени это связано с недостаточно высокой специфичностью экспрессии терапевтических генов в раковых клетках и с недостаточно высоким уровнем «эффекта свидетеля» при проведении испытаний на пациентах. «Эффект свидетеля» может быть дополнительно усилен за счет работы иммунной системы, поскольку гибель раковых клеток и высвобождение из них опухолевых антигенов активируют способность иммунной системы уничтожать раковые клетки, которые не экспрессируют ген-убийцу.

Таким образом, эффективность действия системы ген-убийца/пролекарство можно повысить, стимулируя противоопухолевый иммунный ответ, например, с помощью цитокинов. В ряде работ показано, что регрессия опухоли значительно возрастает при совместном использовании гена-убийцы и отдельно вводимого в виде белка цитокина, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-СБЕ).

Предполагается, что совместная экспрессия гена-убийцы и СМ-СБР в клетках опухоли будет приводить к уничтожению раковых клеток и высвобождению из них опухолевых антигенов, которые будут эффективно представляться ОМ-СБР-активированными антиген-представляющими клетками Т-клеткам иммунной системы, обеспечивая активацию специфического противоопухолевого иммунитета, в результате чего возрастет гибель опухолевых клеток и снизится вероятность возникновения метастазов.

Одним из важных элементов успеха генной терапии рака является система контроля экспрессии терапевтических генов. В генных противораковых препаратах, предназначенных для внутривенного введения, экспрессия терапевтического гена должна контролироваться опухолеспецифичным промотором. В идеальном случае опухолеспецифичный промотор должен обеспечивать максимально тканеспецифичную и достаточно сильную экспрессию трансгена, чтобы с одной стороны обеспечить безопасность, а с другой - эффективность системы. Обычно используемые для этих целей природные опухолеспецифичные промоторы значительно слабее, чем конститутивные

промоторы, такие как промоторы цитомегаловируса (CMV) или вируса SV40. Они активны в ограниченном числе типов раковых клеток, и их активность сильно варьирует в разных опухолях, затрудняя подбор доз пролекарства и снижая терапевтический эффект. Например, сравнительно сильные опухолеспецифичные промоторы с достаточно широким спектром активности, такие как промотор гена BIRC5 (hSurv), кодирующего ингибитор апоптоза сурвивин и промотор гена обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT) проявляют ее не во всех раковых клетках. При этом наблюдается значительная вариабельность относительной активности данных промоторов в различных опухолевых клеточных линиях. Так активность промотора гена сурвивина человека варьирует в пределах от 0,3 до 16% от активности промотора CMV, а эффективность работы промотора hTERT может различаться до 20 раз в зависимости от типа раковых клеток.

Для увеличения эффективности опухолеспецифичных промоторов описано два подхода: 1) использование систем регулируемой экспрессии трансгенов, 2) использование гибридных промоторов. Гибридные промоторы могут включать в себя комбинации известных промоторов друг с другом или с отдельными гетерологичными регуляторными элементами с целью увеличить силу и специфичность экспрессии в раковых клетках. Как правило, исследователи при создании гибридных промоторов идут по пути максимального увеличения эффективности и специфичности экспрессии в определенном типе раковых клеток. Использование строго специфичных к опухоли определенного типа промоторов и других регуляторных элементов имеет в качестве преимущества максимальное снижение побочных эффектов за счет снижения экспрессии трансгенов в нормальных тканях. Однако, недостатком таких подходов является их неуниверсальный характер и связанная с этим вероятность инактивации промотора в метастазах, поскольку нет строгой гарантии, что узкоспецифичный промотор, хорошо работающий в первичной опухоли, сохранит эту способность во всех ее метастазах.

Целью данной работы являлось создание эффективной противоопухолевой генно-терапевтической системы, содержащей гены HSVtk и GM-CSF. Работа проводилась в двух направлениях: 1) создание конструкций, несущих терапевтические гены HSVtk и GM-CSF под контролем одного промотора с последующим исследованием их цитотоксического эффекта в экспериментах in vitro, ex vivo и in vivo, 2) конструирование и тестирование двойных опухолеспецифичных промоторов для экспрессии терапевтических генов в широком спектре опухолей.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Создать экспрессионные конструкции, содержащие гены HSVtk и GM-CSF мыши или человека под контролем одного промотора.

2. Провести оценку экспрессии и биологической активности HSVtk и GM-CSF в составе полученных конструкций в экспериментах in vitro.

3. Оценить противоопухолевый эффект полученных конструкций в экспериментах ex vivo и in vivo на животных.

4. Сконструировать двойные тандемные промоторы на основе модифицированных промоторов генов обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT) и сурвивина человека (hSurv) и мыши (mSurv).

5. Провести анализ активности и специфичности созданных двойных тандемных промоторов на панели клеточных линий человека и оценить эффективность наиболее активного промотора в терапевтической системе ex vivo на мышах.

1.2 Современные подходы к лечению онкологических заболеваний

Как было указано выше существующие на сегодняшний день лекарственные методы лечения онкологических заболеваний можно разделить на две широкие категории: иммунная терапия и неиммунная терапия. Методы неиммунной терапии могут быть в свою очередь разделены [1] на две группы: терапия, нацеленная на пролиферирующие клетки (ТНПК), и молекулярная таргетная терапия (МТТ), в которой действие лекарства направлено на определенную молекулярную мишень (таргет), которая предположительно является существенной для развития рака. Следует заметить, что каждое лекарство имеет свою мишень, поэтому термин таргетная терапия является неопределенным [2-4].

1.2.1 Молекулярная таргетная терапия рака

К МТТ относятся противоопухолевые препараты, нацеленные на a priory идентифицированное молекулярное звено (как правило, белок), которое предположительно играет важную роль в росте и прогрессии опухоли.

МТТ можно разделить на 2 категории:

1. МТТГ - молекулярная таргетная терапия, направленная на звено непосредственное повреждение которого служит одной из причин рака. Некоторые авторы определяют такую терапию как генетически таргетную [2].

2. МТТП - молекулярная таргетная терапия нацеленная на звено, не являющееся непосредственной причиной рака, но расположенное в той же сигнальной цепочке, что и причинное звено [5].

Поскольку оба подхода МТТ направлены на определенные звенья в клеточных сигнальных системах, существовало предположение, что они будут менее токсичны и более эффективны для организма, чем ТНПК.

За последние десять лет на фармакологическом рынке появилось множество МТТ агентов для противоопухолевой терапии. При использовании этой стратегии были достигнуты некоторые успехи. Например, препарат Гливек компании Novartis Pharma (Имантиниб), низкомолекулярный ингибитор Bcr-Abl-тирозинкиназы, экпрессируемой «филадельфийской хромосомой», образующейся вследствие реципрокной транслокации 9-й и 22-й хромосомпротеинкиназы. Данный препарат продемонстрировал высокий противоопухолевый потенциал при лечении хронической миелоидной лейкемии и гастроинтестинальных стромальных опухолей. Однако, сегодня есть много оснований полагать, что успех Гливека - скорее исключение, чем правило [3, 6]. Также в настоящее время широко применяется таргетный препарат Герцептин (Трастузумаб) [3]. Герцептин представляет собой моноклональное антитело, избирательно взаимодействующее с внеклеточным доменом рецепторов эпидермального фактора роста человека 2 типа (HER2) на поверхности злокачественных клеток и тормозящее их пролиферацию. Герцептин применяют в основном для лечения рака молочной железы (РМЖ), он может обладать эффективностью только в отношении опухолей, имеющих HER +++ статус. Статус HER +++ имеют не более 20 % больных РМЖ, при этом применение Герцептина приводит к увеличению продолжительности жизни больных примерно на 5 месяцев [7]. Подавляющее большинство агентов МТТ являются малоэффективными, поскольку при их применении происходит быстрое возникновение устойчивости раковых клеток к воздействию [1, 7, 8, 9 ].

Одной из причин неэффективности МТТ является гетерогенность раковых опухолей, в которых каждая раковая клетка отличается от всех других клеток этой же опухоли, а опухоль одного пациента отличается от опухоли того же типа у другого пациента [10]. Поэтому среди множества клеток в опухоли всегда существуют клетки, устойчивые к воздействию, и способные дать рост нового, устойчивого к данному воздействию, клона опухоли.

К тому же опухоль как система обладает высоким уровнем адаптации к внешним воздействиям. Например, в ответ на введение цисплатина в опухоли возникают клетки, содержащие большое количество белков металлотионеинов, в результате чего формируется устойчивость к препаратам на основе платины [11], а в ответ на воздействие 5-фторурацилом клетки опухоли начинают синтезировать мутантную форму тимидилатсинтазы, не чувствительную к его воздействию [12].

Дополнительным препятствием в лечении опухоли является ее способность активно взаимодействовать с окружением, модифицируя его и метастазируя в другие органы организма [13].

МТТП предполагает ингибирование не конкретного звена, а сигнального пути. Хотя выделено шесть основных характерных изменений в физиологии клетки при ее превращении в раковую [14], данный подход также не способен долгое время контролировать рост опухоли. Показано, что в конкретном типе рака может быть вовлечено до 12 различных путей передачи информации. К тому же большинство биологических процессов имеет альтернативные пути передачи сигнала, развитые в процессе эволюционных приспособлений. В результате, если удается ингибировать один из них, то другой может активироваться и компенсировать отсутствие сигнала от первого [7, 9 ]. Также существует проблема идентификации подходящих молекулярных мишеней

[9].

Все вышеописанное свидетельствует о невозможности развития эффективной молекулярной таргетной терапии, которой сейчас уделяется очень большое внимание как потенциальному подходу к лечению рака [3, 7, 9, 15].

В противоположность препаратам МТТ, агенты ТНПК идентифицируют по способности оказывать цитотоксический эффект на линии раковых клеток без предварительного знания мишени [3]. В большинстве случаев препараты ТНПК действуют на быстро делящиеся клетки. При этом ингибирование нацелено не на отдельное молекулярное звено, а на системы, вовлеченные в репликацию ДНК. ТНПК агенты делятся на несколько групп:

(i) Алкилирующие агенты, которые вносят повреждения непосредственно в ДНК и ингибируют ее репликацию;

(ii) Ингибиторы топоизомераз препятствующие расплетанию ДНК;

(iii) Алкалоиды растительного происхождения, препятствующие образованию микротрубочек, необходимых для митотического деления клеток;

(iv) Антиметаболиты, которые блокируют образование и использование предшественников нуклеиновых кислот, важных для репликации ДНК [15-17].

Кроме раковых клеток, агенты ТНПК при введении в организм пациента поражают все относительно быстроделящиеся клетки: клетки желудочно-кишечного эпителия, клетки костного мозга и др, и поэтому являются высокотоксичными [3, 18 ].

Таким образом, с одной стороны медицина располагает достаточно эффективными, но высокотоксичными средствами химиотерапии, с другой - малотоксичными, но малоэффективными средствами молекулярной таргетной терапии.

Определенные надежды в настоящее время возлагают на генную терапию (ГТ).

1.2.2 Генная терапия рака

Генная терапия предполагает доставку регулируемого генетического материала в раковые клетки, где в результате производятся продукты, индуцирующие их гибель. Подходы генной терапии могут быть разделены на две категории: таргентная генная терапия и ген-направленная энзиматическая пролекарственная терапия.

1.2.2.1 Таргетная генная терапия рака

Таргетным агентом при таргетной генной терапии выступает продукт трансгена, который является ингибитором какого-либо продукта, концентрация которого в раковой клетке повышена, что является одной из причин ракового процесса, или продукт трансгена, который компенсирует недостаток определенного белка в раковых клетках. В обоих вариантах мишенью воздействия является определенное звено в сигнальных системах клетки, которое меняется при раковом перерождении и способствует ему. Таргетная генная терапия имеет те же недостатки, что и МТТ. Тем не менее, генная терапия расширяет возможности таргетной терапии. Поскольку гены, вводимые в клетку, могут придавать этой клетке новые фенотипические признаки. Обычно в раковые клетки вводят гены-онкосупрессоры, которые были инактивированы в процессе канцерогенеза [19-21] или проапоптические гены, экспрессия которых в раковой клетке индуцирует процесс апоптоза [22, 23]. Наиболее изученным и используемым в генной терапии геном-онкосуппрессором является ген р53. Точковые мутации и делеции гена р53 наблюдаются в 50-60% случаев всех злокачественных заболеваний человека [24, 25]. Так, например первый одобренный для клинического применения генно-терапевтический препарат «Гендицин» представляет собой аденовирус, несущий ген р53 [26, 27]. Показано, что в сочетании с радиотерапией «Гендицин» вызывает полную регрессию опухоли у 64% пациентов с раком головы и шеи и частичную - у 29%, тогда как монорадиотерапия приводит к полной регрессии у 19% и частичной у 60% пациентов [26]. Однако, есть основания ожидать появления вторичного роста опухоли, поскольку было показано, что введение р53 в опухоли в которых он исходно поврежден вызывает появление устойчивых кр53 вариантов [28].

Также существуют генно-терапевтические подходы, направленные не на конкретное звено, а на сигнальные пути клетки. Так, было показано, что с помощью РНК-интерференции можно блокировать одновременно несколько сигнальных путей [29, 30]. И хотя, в рамках доклинических и клинических испытаний таргетных генно-

терапевтических препаратов продемонстрирована их низкая токсичность и относительная эффективность, полученные данные предполагают, что, также как и классическая МТТ и вследствие тех же причин, таргетная генная терапия вряд ли будет эффективной и универсальной [19-21, 31].

Также клинические испытания проходят онколитические вирусы (ОВ), которые обладают способностью селективно размножаться в опухолевых клетках [32, 33]. Этот подход обладает рядом преимуществ, главным из которых является цепная реакция распространения вируса в опухоли и связанное с этим быстрое уничтожение тех опухолевых клеток, которые чувствительны к вирусу. Однако при этом остаются клетки, резистентные к вирусу, которые с высокой вероятностью присутствуют в гетерогенной опухолевой популяции, в результате чего после периода уменьшения размеров опухоли наступает ее вторичный рост. Вновь образуемая опухоль устойчива к обработке вирусом. Кроме того они дороги в производстве и иммуногены, что затрудняет их повторное введение в организм. Поэтому выражаются сомнения в том, что технологии основанные на использовании онколитических вирусов коммерчески жизнеспособны [34].

1.2.2.2 Ген-направленная энзиматическая пролекарственная терапия (ГНЭПТ)

ГНЭПТ или суицидальная генная терапия, или генная хирургия [4, 23, 35, 36, 37 ], представляет собой генную терапию, направленную на уничтожение опухолевых клеток как таковых, путем использования их свойств, которые характерны для всех раковых клеток. В этом отношении ГНЭПТ подобна ТНПК, но ГНЭПТ, в отличие от ТНПК, обладает низкой токсичностью, поскольку токсин, убивающий раковые клетки путем ингибирования систем репликации, образуется внутри них. Данный подход не является молекулярно таргетированным и потому избегает всех недостатков МТТ.

Все клетки опухоли, как бы гетерогенны они ни были, имеют одно общее фундаментальное свойство - они все непрерывно делятся, то есть процесс деления и репликации является универсальной мишенью для противоопухолевого воздействия.

Подход генной хирургии заключается в доставке в раковые клетки-мишени генов, кодирующих фермент, который в клетках, где он экспрессируется, способен превращать свой субстрат, вводимый системно, в высокотоксичный агент (Рис.1). При этом должны выполняться следующие требования [4]:

1. Терапевтическое воздействие должно осуществляться на реплицирующуюся ДНК, наиболее универсальный и главный элемент репликации клеток, или на системы, непосредственно участвующие в репликации.

2. Клетка, где осуществляется воздействие, должна распространять его на окружающие клетки.

раковой

Токсин

клетки

трансляция

фермент

транскрипция

Промотор Ген-убийца

х

Доставка в m раковые клетки

Выход из клетки, попадание в соседние клетки, их смерть (эффект свидетеля)

Нетоксичное пролекарство

Рис.1. Схема работы системы ген-убийца/пролекарство.

Ген-убийца доставляется в клетки в комплексе с носителем. В результате экспрессии гена-убийцы в клетке продуцируется фермент, превращающий нетоксичное пролекарство, вводимое внутривенно, в токсин. Наработка в раковой клетке токсина приводит к ее гибели. Токсин может высвобождаться из клетки, в которой он был образован, и проникать в соседние раковые клетки, вызывая их гибель.

Основное преимущество генной хирургии заключается в том, что даже небольшого количества экспрессирующих трансген клеток достаточно для того, чтобы вызвать гибель большого числа опухолевых клеток. Токсин, образовавшийся в клетках, экспрессирующих трансген, может высвобождаться из них и проникать в соседние клетки, не получившие трансген, вызывая их гибель, что многократно усиливает терапевтический эффект. Данное явление получило название «эффекта свидетеля» (bystander effect). «Эффект свидетеля» заключается в том, что опухолевые клетки не получившие трансген, но соседствующие с таковыми, оказываются подверженными цитотоксическому эффекту со стороны высвобождающегося токсичного агента (Рис.2).

Величина «эффекта свидетеля» зависит от способности неактивированного пролекарства проникать в раковые клетки и способности активированного пролекарства распространяться в соседние, не несущие ген-убийцу опухолевые клетки [38]. Образующийся в раковых клетках токсин может проникать в соседние клетки через щелевые контакты или путём простой диффузии. [39, 40]

Синтез продукта гена-убийцы в раковых клетках Трансфицированные

Рис.2. Развитие «эффект свидетеля» в ГНЭПТ системе.

В раковые клетки вводят ген-убийцу, продукт экспрессии которого превращает нетоксичное пролекарство, поставляемое в клетку, извне в токсин. Токсин способен выходить из клетки, в которой он образовался, и проникать в соседние клетки, не содержащие гена-убийцы, вызывая их гибель. Гибель раковых клеток и высвобождение из них опухолевых антигенов вызывает инфильтрацию опухоли клетками иммунной системы.

Эффект свидетеля может быть дополнительно усилен за счет работы иммунной системы [41], поскольку гибель раковых клеток и высвобождение из них опухолевых антигенов активируют способность иммунной системы уничтожать раковые клетки, которые не экспрессируют ген-убийцу, даже если эти клетки разнесены в пространстве («дальний эффект свидетеля») или во времени ("эффект вакцинации") от клеток, экспрессирующих ген-убийцу [22, 37]. Данные явления могут привести к разрушению метастазов, происходящих из первичной опухоли [42] (Рис.2).

Вышеперечисленными свойствами обладают две генно-терапевтические системы: тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSVtk)/ ганцикловир(ОСУ) и цитозиндезаминаза (СД)/5 -фторцитозин (5FC). Данные системы прошли доклинические испытания и в настоящее время находятся в стадии клинических испытаний. Помимо «эффекта свидетеля» для систем HSVtk/GCV и CD/5FC показано наличие «дистантного эффекта свидетеля» [37]. В частности, продемонстрировано, что в опухолях, подвергшиеся воздействию HSVtk/GCV или CD/5FC происходит увеличения инфильтрации CD8+ и CD4+лимфоцитов [41].

ГНЭПТ система цитозиндезаминаза/ 5-фторцитозин

В широко используемой суицидальной системе CD/5-FC в качестве гена-убийцы выступает цитозиндезаминаза (CD), а в качестве пролекарства 5-фторцитозин (5-FC). Цитозиндезаминаза - фермент, катализирующий реакцию дезаминирования 5-фторцитозина, низкотоксичного агента, используемого для лечения грибковых инфекций человека, в результате которой образуется 5-фторурацил [43]. 5-фторурацил (5FU) - известный химиотерапевтический препарат, обладающий радиосенсибилизирующими свойствами и используемый в протоколах лечения различных опухолей человека. Далее 5FU преобразуется под действием ферментов клетки либо в 5-фтор-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат, необратимый ингибитор тимидилатсинтазы, либо фосфорилируется до 5-фторуридин-5'-трифосфата. В результате ингибирования тимидилатсинтазы нарушается образование тимидина, что приводит к остановке синтеза ДНК [44]. В свою очередь 5-фторуридин-5'-трифосфат способен включаться во вновь синтезируемую РНК вместо уридин-5'-трифосфата, в результате чего происходит ингибирование процессинга рРНК и мРНК в ядре. Кроме того 5-фтор-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат, предшественник 5-фторуридин-5'-трифосфата, может далее метаболизироваться до 5-фтор-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, который может включаеться во вновь синтезируемую ДНК, что приводит к образованию длинных одноцепочечных брешей в ДНК и, как следствие, клеточной смерти. Образовавшийся под действием цитозиндезаминазы 5-фторурацил способен проникать в близлежащие раковые клетки по механизму необлегчённой диффузии. Таким образом, соседние клетки, которые не экспрессируют ген цитозиндезаминазы, тем не менее, оказываются подвержены цитотоксическому воздействию со стороны 5-фторурацила [37, 45 ]. В in vivo экспериментах показано, что всего лишь 2% опухолевых клеток, несущих ген цитозиндезаминазы, достаточно для опухолевой регрессии [45]. Также в in vivo экспериментах продемонстрировано, что экспрессия гена CD в клетках обеспечивает

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алексеенко, Ирина Васильевна, 2013 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Hellerstein М.К., A critique of the molecular target-based drug discovery paradigm based on principles of metabolic control: advantages ofpathway-based discovery. Metab Eng, 2008.10(1). p: 1-9.

2. Druker B.J., Imatinib: paradigm or anomaly? Cell Cycle, 2004. 3(7). p: 833-835.

3. Hait W.N. and T.W. Hambley, Targeted cancer therapeutics. Cancer Res, 2009. 69(4). p: 1263-1267; discussion 1267.

4. Sverdlov E.D., Genetic surgery - a right strategy to attack cancer. Curr Gene Ther, 2011. 11(6). p: 501-531.

5. Sawyers C., Targeted cancer therapy. Nature, 2004. 432(7015). p: 294-297.

6. Murdoch D. and J. Sager, Will targeted therapy hold its promise? An evidence-based review. Curr Opin Oncol, 2008. 20(1). p: 104-111.

7. Bria E. et al., Targeting targeted agents: open issues for clinical trial design. J Exp Clin Cancer Res, 2009. 28. p: 66.

8. Duenas-Gonzalez A. et al., The prince and the pauper. A tale of anticancer targeted agents. Mol Cancer, 2008. 7. p: 82.

9. Hambley T.W. and W.N. Hait, Is anticancer drug development heading in the right direction? Cancer Res, 2009. 69(4). p: 1259-1262.

10. Glazier A., An Inconvenient Truth: Cancer is a hugely diverse, complex, unpredictable, non-linear, stochastic evolutionary process. [Электронный ресурс]: www/curecanproject.org. 2007. URL: http://www.curecancerproject.org/beta/pdf/ An%20Inconvenient%20Truth,%20Cancer%20is%20a%20hugely%20diverse%20compl ex%20stochastic%20evolutionary%20process.pdf.

11. Kartalou M. and J.M. Essigmann, Mechanisms of resistance to cisplatin. Mutat Res, 2001.478(1-2). p: 23-43.

12. Stoehlmacher J., The impact of genomics and proteomics in the clinic: functional genetic polymorphisms and their value in response and toxicity prediction in solid tumours. Ann Oncol, 2006. 17 Suppl 10. p: x263-268.

13. Merlo L.M. et al., Cancer as an evolutionary and ecological process. Nat Rev Cancer, 2006. 6(12). p: 924-935.

14. Hanahan D. and R.A. Weinberg, The hallmarks of cancer. Cell, 2000. 100(1). p: 57-70.

15. Dy G.K. and A.A. Adjei, Systemic cancer therapy: evolution over the last 60 years. Cancer, 2008. 113(7 Suppl). p: 1857-1887.

16. DeVita V.T., Jr. and E. Chu, A history of cancer chemotherapy. Cancer Res, 2008. 68(21). p: 8643-8653.

17. Morrison W.B., Cancer chemotherapy: an annotated history. J Vet Intern Med, 2010. 24(6). p: 1249-1262.

18. Gerber D.E., Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician, 2008. 77(3). p: 311-319.

19. Fang B. and J.A. Roth, Tumor-suppressing gene therapy. Cancer Biol Ther, 2003. 2(4 Suppl 1). p: SI 15-121.

20. Raty J.K., Gene Therapy: The First Approved Gene-Based Medicines, Molecular Mechanisms and Clinical Indications. Current Molecular Pharmacology 2008. 1. p: 13-23.

21. Huang C.L. et al., Clinical significance of the p53 pathway and associated gene therapy in non-small cell lung cancers. Future Oncol, 2007. 3(1). p: 83-93.

22. Lumniczky K. and G. Safrany, Cancer gene therapy: combination with radiation therapy and the role of bystander cell killing in the anti-tumor effect. Pathol Oncol Res, 2006. 12(2). p: 118-124.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32,

33,

34

35,

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

Seth P., Vector-mediated cancer gene therapy: an overview. Cancer Biol Ther, 2005. 4(5). p: 512-517.

Hollstein M. et al.,p53 mutations in human cancers. Science, 1991. 253(5015). p: 49-53. Levine A.J. et al., The p53 tumour suppressor gene. Nature, 1991. 351(6326). p: 453456.

Peng Z., Current status of gendicine in China: recombinant human Ad-p53 agent for

treatment of cancers. Hum Gene Ther, 2005. 16(9). p: 1016-1027.

Wilson J.M., Gendicine: the first commercial gene therapy product. Hum Gene Ther,

2005. 16(9). p: 1014-1015.

Martins C.P. et al., Modeling the therapeutic efficacy of p53 restoration in tumors. Cell,

2006. 127(7). p: 1323-1334.

Wagner E., Advances in cancer gene therapy: tumor-targeted delivery of therapeutic pDNA, siRNA, anddsRNA nucleic acids. J Buon, 2007. 12 Suppl 1. p: S77-82. Wang S.L. et al., Strategies for short hairpin RNA delivery in cancer gene therapy. Expert Opin Biol Ther, 2009. 9(11). p: 1357-1368.

Xue W. et al., Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature, 2007. 445(7128). p: 656-660.

Hall K. et al., Unity and diversity in the human adenoviruses: exploiting alternative entry pathways for gene therapy. Biochem J, 2010. 431(3). p: 321-336.

Liu T.C. and D. Kirn, Gene therapy progress and prospects cancer: oncolytic viruses. Gene Ther, 2008. 15(12). p: 877-884.

Prestwich R. et al., Oncolytic Viruses: Do They Have a Role in Anti-Cancer Therapy?

Clinical Medicine: Oncology comments, 2008. 2. p: 83-96

Altaner C., Prodrug cancer gene therapy. Cancer Lett, 2008. 270(2). p: 191-201.

Fillat C. et al., Suicide gene therapy mediated by the Herpes Simplex virus thymidine

kinase gene/Ganciclovir system: fifteen years of application. Curr Gene Ther, 2003. 3(1).

p: 13-26.

Portsmouth D. et al., Suicide genes for cancer therapy. Mol Aspects Med, 2007. 28(1). p: 4-41.

Freeman S.M. et al., The "bystander effect": tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified. Cancer Res, 1993. 53(21). p: 5274-5283. Matono S. et al., Bystander effect in suicide gene therapy is directly proportional to the degree of gap junctional intercellular communication in esophageal cancer. Int J Oncol, 2003.23(5). p: 1309-1315.

van Dillen I.J. et al., Influence of the bystander effect on HSV-tk/GCV gene therapy. A review. Curr Gene Ther, 2002. 2(3). p: 307-322.

Gagandeep S. et al., Prodrug-activated gene therapy: involvement of an immunological component in the "bystander effect". Cancer Gene Ther, 1996. 3(2). p: 83-88. Vile R.G. et al., Generation of an anti-tumour immune response in a non-immunogenic tumour: HSVtk killing in vivo stimulates a mononuclear cell infiltrate and a Thl-like profile of intratumoural cytokine expression. Int J Cancer, 1997. 71(2). p: 261-21 A. Koechlin B.A. et al., The metabolism of 5-fluorocytosine-2-14-C and of cytosine-14-C in the rat and the disposition of 5-fluorocytosine-2-l4-C in man. Biochem Pharmacol, 1966. 15(4). p: 435-446.

Mullen C.A. et al., Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-fluorocytosine: a negative selection system. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(1). p: 33-37.

Dachs G.U. et al., Bystander or no bystander for gene directed enzyme prodrug therapy. Molecules, 2009. 14(11). p: 4517-4545.

Kerr D., Clinical development of gene therapy for colorectal cancer. Nat Rev Cancer, 2003.3(8). p: 615-622.

47. Mesnil M. and H. Yamasaki, Bystander effect in herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir cancer gene therapy: role of gap-junctional intercellular communication. Cancer Res, 2000. 60(15). p: 3989-3999.

48. Tomicic M.T. et al., Ganciclovir-induced apoptosis in HSV-1 thymidine kinase expressing cells: critical role of DNA breaks, Bcl-2 decline and caspase-9 activation. Oncogene, 2002. 21(14). p: 2141-2153.

49. Mori K. et al., Bystander killing effect of tymidine kinase gene-transduced adult bone marrow stromal cells with ganciclovir on malignant glioma cells. Neurol Med Chir (Tokyo), 2010. 50(7). p: 545-553.

50. Yamamoto S. et al., A novel combination of suicide gene therapy and histone deacetylase inhibitor for treatment of malignant melanoma. Cancer Gene Ther, 2003. 10(3). p: 179-186.

51. Azatian A. et al., Effectiveness of HSV-tk suicide gene therapy driven by the Grp78 stress-inducible promoter in esophagogastric junction and gastric adenocarcinomas. J Gastrointest Surg, 2009. 13(6). p: 1044-1051.

52. Vile R.G. and I.R. Hart, Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer Res, 1993. 53(17). p: 3860-3864.

53. Westphal M. et al., Adenovirus-mediated gene therapy with sitimagene ceradenovec followed by intravenous ganciclovir for patients with operable high-grade glioma (ASPECT): a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol. 14(9). p: 823-833.

54. Immonen A. et al., AdvHSV-tk gene therapy with intravenous ganciclovir improves survival in human malignant glioma: a randomised, controlled study. Mol Ther, 2004. 10(5). p: 967-972.

55. Rainov N.G., A phase III clinical evaluation of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and ganciclovir gene therapy as an adjuvant to surgical resection and radiation in adults with previously untreated glioblastoma multiforme. Hum Gene Ther, 2000. 11(17). p: 2389-2401.

56. Klatzmann D. et al., A phase I/II study of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase "suicide" gene therapy for recurrent glioblastoma. Study Group on Gene Therapy for Glioblastoma. Hum Gene Ther, 1998. 9(17). p: 2595-2604.

57. Kim K.H. et al., A phase I clinical trial of Ad5.SSTR/TK.RGD, a novel infectivity-enhanced bicistronic adenovirus, in patients with recurrent gynecologic cancer. Clin Cancer Res. 18(12). p: 3440-3451.

58. Sterman D.H. et al., Long-term follow-up of patients with malignant pleural mesothelioma receiving high-dose adenovirus herpes simplex thymidine kinase/ganciclovir suicide gene therapy. Clin Cancer Res, 2005. 11(20). p: 7444-7453.

59. Chevez-Barrios P. et al., Response of retinoblastoma with vitreous tumor seeding to adenovirus-mediated delivery of thymidine kinase followed by ganciclovir. J Clin Oncol, 2005.23(31). p: 7927-7935.

60. Greco O. and G.U. Dachs, Gene directed enzyme/prodrug therapy of cancer: historical appraisal and future prospectives. J Cell Physiol, 2001. 187(1). p: 22-36.

61. Both G.W., Gene-directed enzyme prodrug therapy for cancer: a glimpse into the future? Discov Med, 2009. 8(42). p: 97-103.

62. Kuriyama S. et al., Immune response to suicide gene therapy. Methods Mol Med, 2004. 90. p: 353-369.

63. Aghi M. et al., Prodrug activation enzymes in cancer gene therapy. J Gene Med, 2000. 2(3). p: 148-164.

64. Kajiwara E. et al., Long-circulating liposome-encapsulated ganciclovir enhances the efficacy of HSV-TK suicide gene therapy. J Control Release, 2007. 120(1-2). p: 104-110.

65.

66.

67.

68.

69.

70

71

72,

73

74

75

76

77

78

79

80

Tanaka T. et al., Induction of a bystander effect in HeLa cells by using a bigenic vector carrying viral thymidine kinase and connexin32 genes. Mol Carcinog, 2001. 30(3). p: 176-180.

Robe P.A. et al., Pharmacological modulation of the bystander effect in the herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy system: effects of dibutyryl adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, alpha-glycyrrhetinic acid, and cytosine arabinoside. Biochem Pharmacol, 2000. 60(2). p: 241-249.

Robe P.A. et al., Modulation of the HSV-TK/ganciclovir bystander effect by n-butyrate in glioblastoma: correlation with gap-junction intercellular communication. Int J Oncol, 2004. 25(1). p: 187-192.

Gentry B.G. et al., Hydroxyurea induces bystander cytotoxicity in cocultures of herpes simplex virus thymidine kinase-expressing and nonexpressing HeLa cells incubated with ganciclovir. Cancer Res, 2006. 66(7). p: 3845-3851.

Nicholas T.W. et al., Suicide gene therapy with Herpes simplex virus thymidine kinase and ganciclovir is enhanced with connexins to improve gap junctions and bystander effects. Histol Histopathol, 2003. 18(2). p: 495-507.

Carrio M. et al., Retrovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase and connexin26 genes in pancreatic cells results in variable efficiency on the bystander killing: implications for gene therapy. Int J Cancer, 2001. 94(1). p: 81-88. Udawatte C. and H. Ripps, The spread of apoptosis through gap-junctional channels in BHK cells transfected with Cx32. Apoptosis, 2005. 10(5). p: 1019-1029. Jimenez T. et al., Connexin over-expression differentially suppresses glioma growth and contributes to the bystander effect following HSV-thymidine kinase gene therapy. Cell Commun Adhes, 2006. 13(1-2). p: 79-92.

Qiu Z. et al., Bovine herpesvirus tegument protein VP22 enhances thymidine kinase/ganciclovir suicide gene therapy for neuroblastomas compared to herpes simplex virus VP22. J Virol, 2004. 78(8). p: 4224-4233.

Liu C.S. et al., VP22 enhanced intercellular trafficking of HSV thymidine kinase reduced the level of ganciclovir needed to cause suicide cell death. J Gene Med, 2001. 3(2). p: 145-152.

Roy V. et al., Direct evidence for the absence of intercellular trafficking ofVP22 fused to GFP or to the herpes simplex virus thymidine kinase. Gene Ther, 2005. 12(2). p: 169-176.

Tasciotti E. and M. Giacca, Fusion of the human immunodeficiency virus type 1 tat protein transduction domain to thymidine kinase increases bystander effect and induces enhanced tumor killing in vivo. Hum Gene Ther, 2005. 16(12). p: 1389-1403. Cao L. et al., Intracellular localization and sustained prodrug cell killing activity ofTAT-HSVTK fusion protein in hepatocelullar carcinoma cells. Mol Cells, 2006. 21(1). p: 104-111.

Lemken M.L. et al., Fusion of HSV-1 VP22 to a bifunctional chimeric SuperCD suicide gene compensates for low suicide gene transduction efficiencies. Int J Oncol, 2007. 30(5). p: 1153-1161.

Simpson G.R. et al., Combination of a fusogenic glycoprotein, prodrug activation, and oncolytic herpes simplex virus for enhanced local tumor control. Cancer Res, 2006. 66(9). p: 4835-4842.

Balzarini J. et al., Differential mechanism of cytostatic effect of (E)-5-(2-bromovinyl)-2 '-deoxyuridine, 9-(l,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine, and other antiherpetic drugs on tumor cells transfected by the thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1 or type 2. J Biol Chem, 1993. 268(9). p: 6332-6337.

81.

82.

83.

84.

85.

86.

87.

88.

89.

90.

91.

92,

93

94

95

96

97

98

99

Field A.K. et al., 9-([2-hydroxy-l-(hydroxymethyl)ethoxy]methyl)guanine: a selective inhibitor of herpes group virus replication. Proc Natl Acad Sci USA, 1983. 80(13). p: 4139-4143.

Black M.E. et al., Herpes simplex virus-1 thymidine kinase mutants created by semirandom sequence mutagenesis improve prodrug-mediated tumor cell killing. Cancer Res, 2001. 61(7). p: 3022-3026.

Wiewrodt R. et al., Adenovirus-mediated gene transfer of enhanced Herpes simplex virus thymidine kinase mutants improves prodrug-mediated tumor cell killing. Cancer Gene Ther, 2003.10(5). p: 353-364.

Kokoris M.S. et al., In vitro evaluation of mutant HSV-1 thymidine kinases for suicide gene therapy. Anticancer Res, 2000. 20(2A), p: 959-963.

Ardiani A. et al., Fusion enzymes containing HSV-1 thymidine kinase mutants and guanylate kinase enhance prodrug sensitivity in vitro and in vivo. Cancer Gene Ther. 17(2). p: 86-96.

Kaliberov S.A. et al., Mutation of Escherichia coli cytosine deaminase significantly enhances molecular chemotherapy of human glioma. Gene Ther, 2007. 14(14). p: 1111-1119.

Mahan S.D. et al., Random mutagenesis and selection of Escherichia coli cytosine deaminase for cancer gene therapy. Protein Eng Des Sel, 2004. 17(8). p: 625-633. Mahan S.D. et al., Alanine-scanning mutagenesis reveals a cytosine deaminase mutant with altered substrate preference. Biochemistry, 2004. 43(28). p: 8957-8964. Fuchita M. et al., Bacterial cytosine deaminase mutants created by molecular engineering show improved 5-fluorocytosine-mediated cell killing in vitro and in vivo. Cancer Res, 2009. 69(11). p: 4791-4799.

Chung-Faye G.A. et al., In vivo gene therapy for colon cancer using adenovirus-mediated, transfer of the fusion gene cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Gene Ther, 2001. 8(20). p: 1547-1554.

Erbs P. et al., In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res, 2000. 60(14). p: 3813-3822.

Park S.Y. et al., Combination gene therapy using multidrug resistance (MDR1) gene shRNA and herpes simplex virus-thymidine kinase. Cancer Lett, 2008. 261(2). p: 205-214.

Aghi M. et al., Synergistic anticancer effects of ganciclovir/thymidine kinase and 5-fluorocytosine/cytosine deaminase gene therapies. J Natl Cancer Inst, 1998. 90(5). p: 370-380.

Uckert W. et al., Double suicide gene (cytosine deaminase and herpes simplex virus thymidine kinase) but not single gene transfer allows reliable elimination of tumor cells in vivo. Hum Gene Ther, 1998. 9(6). p: 855-865.

Boucher P.D. et al., A novel mechanism of synergistic cytotoxicity with 5-fluorocytosine and ganciclovir in double suicide gene therapy. Cancer Res, 2006. 66(6). p: 3230-3237. Moore E.C. and R.B. Hurlbert, Regulation of mammalian deoxyribonucleotide biosynthesis by nucleotides as activators and inhibitors. J Biol Chem, 1966. 241(20). p: 4802-4809.

Luo X.R. et al., Targeted killing effects of double CD and TK suicide genes controlled by survivin promoter on gastric cancer cell. Mol Biol Rep. 38(2). p: 1201-1207. Rogulski K.R. et al., Glioma cells transduced with an Escherichia coli CD/HSV-1 TK fusion gene exhibit enhanced metabolic suicide and radiosensitivity. Hum Gene Ther, 1997. 8(1). p: 73-85.

Blackburn R.V. et al., Adenoviral-mediated transfer of a heat-inducible double suicide gene into prostate carcinoma cells. Cancer Res, 1998. 58(7). p: 1358-1362.

100.

101.

102.

103.

104.

105.

106.

107.

108.

109.

110

111

112

113,

114

115

116

117

118

119

120

Atkinson S.C. and M.J. Allen, Parental requests for drug testing on minors. J Med Assoc Ga, 1991.80(5). p: 293-294.

Dranoff G., Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. Nat Rev Cancer, 2004. 4(1). p: 11-22.

Seruga B. et al., Cytokines and their relationship to the symptoms and outcome of cancer. Nat Rev Cancer, 2008. 8(11). p: 887-899.

Metcalf D., Hematopoietic cytokines. Blood, 2008. 111(2). p: 485-491.

Mughal T.I., Current and future use of hematopoietic growth factors in cancer medicine.

Hematol Oncol, 2004. 22(3). p: 121-134.

Slavcev R. et al., Nanomedicine Based Approaches to Cancer Diagonsis and Therapy, Non-Viral Gene Therapy, ed. X. Yuan. 2011.

Cerullo V. et al., Oncolytic adenovirus coding for granulocyte macrophage colony-stimulating factor induces antitumoral immunity in cancer patients. Cancer Res, 2010. 70(11). p: 4297-4309.

Niculescu-Duvaz I. and C. Springer, Introduction to the Background, Principles, and State of the Art in Suicide Gene Therapy. Methods in Molecular Medicine, Suicide gene therapy; methods and reviews., ed. C. Springer. Vol. 90. 2004, Totowa (NJ): Humana Press.

Wei L.Z. et al., Localized interleukin-12 delivery for immunotherapy of solid tumours. J Cell Mol Med, 2013. doi: 10.111 l/jcmm.12121.

Cui Y. et al., Immune response, clinical outcome and safety of dendritic cell vaccine in combination with cytokine-induced killer cell therapy in cancer patients. Oncol Lett, 2013.6(2). p: 537-541.

Miguel A. et al., Comparative antitumor effect among GM-CSF, IL-I2 and GM-CSF+IL-12 genetically modified tumor cell vaccines. Cancer Gene Ther, 2013. 20(10). p: 576-581.

Atherton M.J. and B.D. Lichty, Evolution of oncolytic viruses: novel strategies for cancer treatment. Immunotherapy, 2013. 5(11). p: 1191-1206.

Kaufman H.L. and S.D. Bines, OPTIM trial: a Phase III trial of an oncolytic herpes virus encoding GM-CSF for unresectable stage III or IV melanoma. Future Oncol, 2010. 6(6). p: 941-949.

Dranoff G. et al., Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(8). p: 3539-3543. Mach N. et al., Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res, 2000. 60(12). p: 3239-3246.

Qin Z. et al., Interleukin-10 prevents dendritic cell accumulation and vaccination with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene-modified tumor cells. J Immunol, 1997. 159(2). p: 770-776.

Gillessen S. et al., CD ld-restricted T cells regulate dendritic cell function and antitumor immunity in a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent fashion. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(15). p: 8874-8879.

Shi Y. et al., Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: what we do and don't know. Cell Res, 2006. 16(2). p: 126-133. Farrar W.L. et al., Hematopoietic growth-factor signal transduction and regulation of gene expression. Immunol Ser, 1990. 49. p: 379-410.

Cousins D.J. et al., Regulation of interleukin-5 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expression. Am J Respir Crit Care Med, 1994. 150(5 Pt 2). p: S50-53. Nimer S.D. and H. Uchida, Regulation of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin 3 expression. Stem Cells, 1995. 13(4). p: 324-335.

121. Griffin J.D. et al., Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and other cytokines regulate surface expression of the leukocyte adhesion molecule-1 on human neutrophils, monocytes, and their precursors. J Immunol, 1990. 145(2). p: 576-584.

122. Miyajima A., Molecular structure of the IL-3, GM-CSF and IL-5 receptors. Int J Cell Cloning, 1992. 10(3). p: 126-134.

123. Dijkers P.F. et al., Regulation and function of protein kinase B and MAP kinase activation by the IL-5/GM-CSF/IL-3 receptor. Oncogene, 1999. 18(22). p: 3334-3342.

124. Jenkins B.J. et al., Saturation mutagenesis of the beta subunit of the human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor shows clustering of constitutive mutations, activation of ERK MAP kinase and STAT pathways, and differential beta subunit tyrosine phosphorylation. Blood, 1998. 92(6). p: 1989-2002.

125. Krakowski M. et al., Granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) recruits immune cells to the pancreas and delays STZ-induced diabetes. J Pathol, 2002. 196(1). p: 103-112.

126. Drexler H.G. et al., Effects of FLT3 ligand on proliferation and survival of myeloid leukemia cells. Leuk Lymphoma, 1999. 33(1-2). p: 83-91.

127. Shannon M.F. et al., GM-CSF and IL-2 share common control mechanisms in response to costimulatory signals in T cells. J Leukoc Biol, 1995. 57(5). p: 767-773.

128. Oster W. et al., Role of colony-stimulating factors in the biology of acute myelogenous leukemia. Int J Cell Cloning, 1989. 7(1). p: 13-29.

129. Bailer R.T. et al., Comparison of constitutive cytokine release in high and low histologic grade AIDS-related Kaposi's sarcoma cell strains and in sera from HIV+/KS+ and HIV+/KS-patients. J Interferon Cytokine Res, 1995. 15(5). p: 473-483.

130. Lang R.A. et al., Transgenic mice expressing a hemopoietic growth factor gene (GM-CSF) develop accumulations of macrophages, blindness, and a fatal syndrome of tissue damage. Cell, 1987. 51(4). p: 675-686.

131. Stanley E. et al., Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor-deficient mice show no major perturbation of hematopoiesis but develop a characteristic pulmonary pathology. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(12). p: 5592-5596.

132. Wada H. et al., T cell functions in granulocyte/macrophage colony-stimulating factor deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(23). p: 12557-12561.

133. Jones R.K. et al., Combined suicide and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene therapy induces complete tumor regression and generates antitumor immunity. Cancer Gene Ther, 2000. 7(12). p: 1519-1528.

134. Finocchiaro L.M. et al., Suicide gene and cytokines combined nonviral gene therapy for spontaneous canine melanoma. Cancer Gene Ther, 2008. 15(3). p: 165-172.

135. Lechanteur C. et al., Combined suicide and cytokine gene therapy for peritoneal carcinomatosis. Gut, 2000. 47(3). p: 343-348.

136. Majumdar A.S. et al., Efficacy of herpes simplex virus thymidine kinase in combination with cytokine gene therapy in an experimental metastatic breast cancer model. Cancer Gene Ther, 2000. 7(7). p: 1086-1099.

137. Brockstedt D.G. et al., Development of anti-tumor immunity against a non-immunogenic mammary carcinoma through in vivo somatic GM-CSF, IL-2, and HSVtk combination gene therapy. Mol Ther, 2002. 6(5). p: 627-636.

138. Lee K.H. et al., Herpes simplex virus thymidine kinase and granulocyte macrophage colony-stimulating factor combination gene therapy in a murine CT26 cell colon cancer model. Cancer Gene Ther, 2004. 11(8). p: 570-576.

139. Castleden S.A. et al., A family of bicistronic vectors to enhance both local and systemic antitumor effects of HSVtk or cytokine expression in a murine melanoma model. Hum Gene Ther, 1997. 8(17). p: 2087-2102.

140.

141.

142.

143.

144.

145.

146.

147.

148.

149

150

151

152

153

154

155

156

157

Braun B. et al., Expression of G-CSF and GM-CSF in human meningiomas correlates with increased tumor proliferation and vascularization. J Neurooncol, 2004. 68(2). p: 131-140.

Mueller M.M. et al., Tumor progression of skin carcinoma cells in vivo promoted by clonal selection, mutagenesis, and autocrine growth regulation by granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Am J Pathol, 2001. 159(4). p: 1567-1579.

Young M.R. et al., Myeloid differentiation treatment to diminish the presence of immune-suppressive CD34+ cells within human head and neck squamous cell carcinomas. J Immunol, 1997. 159(2). p: 990-996.

Ninck S. et al., Expression profiles of angiogenic growth factors in squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J Cancer, 2003. 106(1). p: 34-44. Mueller M.M. and N.E. Fusenig, Constitutive expression of G-CSF and GM-CSF in human skin carcinoma cells with functional consequence for tumor progression. Int J Cancer, 1999. 83(6). p: 780-789.

Mueller M.M. et al., Autocrine growth regulation by granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte macrophage colony-stimulating factor in human gliomas with tumor progression. Am J Pathol, 1999. 155(5). p: 1557-1567.

Obermueller E. et al., Cooperative autocrine and paracrine functions of granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the progression of skin carcinoma cells. Cancer Res, 2004. 64(21). p: 7801-7812. Gutschalk C.M. et al., Granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor promote malignant growth of cells from head and neck squamous cell carcinomas in vivo. Cancer Res, 2006. 66(16). p: 8026-8036. Pei X.H. et al., Granulocyte, granulocyte-macrophage, and macrophage colony-stimulating factors can stimulate the invasive capacity of human lung cancer cells. Br J Cancer, 1999. 79(1). p: 40-46.

Reali E. et al., Comparative studies of Avipox-GM-CSF versus recombinant GM-CSF protein as immune adjuvants with different vaccine platforms. Vaccine, 2005. 23(22). p: 2909-2921.

Serafini P. et al., High-dose granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing vaccines impair the immune response through the recruitment of myeloid suppressor cells. Cancer Res, 2004. 64(17). p: 6337-6343.

Parmiani G. et al., Opposite immune functions of GM-CSF administered as vaccine adjuvant in cancer patients. Ann Oncol, 2007. 18(2). p: 226-232.

Bonnekoh B. et al., Ex vivo and in vivo adenovirus-mediated gene therapy strategies induce a systemic anti-tumor immune defence in the B16 melanoma model. J Invest Dermatol, 1998. 110(6). p: 867-871.

Guo S.Y. et al., TK gene combined with mIL-2 and mGM-CSF genes in treatment of gastric cancer. World J Gastroenterol, 2003. 9(2). p: 233-237.

Robson T. and D.G. Hirst, Transcriptional Targeting in Cancer Gene Therapy. J Biomed Biotechnol, 2003. 2003(2). p: 110-137.

Saukkonen K. and A. Hemminki, Tissue-specific promoters for cancer gene therapy. Expert Opin Biol Ther, 2004. 4(5). p: 683-696.

Easty D.J. and D.C. Bennett, Protein tyrosine kinases in malignant melanoma. Melanoma Res, 2000. 10(5). p: 401-411.

Lee S.E. et al., Development of a new plasmid vector with PSA-promoter and enhancer expressing tissue-specificity in prostate carcinoma cell lines. Anticancer Res, 2000. 20(lA).p: 417-422.

158.

159.

160.

161.

162.

163.

164,

165,

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

Yamamoto M. et al., Characterization of the cyclooxygenase-2 promoter in an adenoviral vector and its application for the mitigation of toxicity in suicide gene therapy of gastrointestinal cancers. Mol Ther, 2001. 3(3). p: 385-394.

Zhu Z.B. et al., Transcriptional targeting of tumors with a novel tumor-specific survivin promoter. Cancer Gene Ther, 2004. 11(4). p: 256-262.

Rothfels H. et al., Evaluation of combined gene regulatory elements for transcriptional targeting of suicide gene expression to malignant melanoma. Exp Dermatol, 2003. 12(6). p: 799-810.

Adachi Y. et al., A midkine promoter-based conditionally replicative adenovirus for treatment of pediatric solid tumors and bone marrow tumor purging. Cancer Res, 2001. 61(21). p: 7882-7888.

Gu J. and B. Fang, Telomerase promoter-driven cancer gene therapy. Cancer Biol Ther, 2003. 2(4 Suppl 1). p: S64-70.

Lu B. et al., Evaluation of tumor-specific promoter activities in melanoma. Gene Ther, 2005. 12(4). p: 330-338.

Rein D.T. et al., Evaluation of tissue-specific promoters in carcinomas of the cervix uteri. J Gene Med, 2004. 6(11). p: 1281-1289.

Van Houdt W.J. et al., The human survivin promoter: a novel transcriptional targeting strategy for treatment of glioma. J Neurosurg, 2006. 104(4). p: 583-592. Alekseenko I.V. et al., Activity of the upstream component of tandem TERT/survivin promoters depends on features of the downstream component. PLoS One, 2012. 7(10). p: e46474.

Maida Y. et al., Direct activation of telomerase by EGF through Ets-mediated transactivation of TERT via MAP kinase signaling pathway. Oncogene, 2002. 21(26). p; 4071-4079.

Li F. and D.C. Altieri, Transcriptional analysis of human survivin gene expression. Biochem J, 1999.344 Pt2. p: 305-311.

Johnson M.E. and E.W. Howerth, Survivin: a bifunctional inhibitor of apoptosis protein. Vet Pathol, 2004. 41(6). p: 599-607.

Marioni G. et al., Survivin multifaceted activity in head and neck carcinoma: current evidence and future therapeutic challenges. Acta Otolaryngol. 130(1). p: 4-9. Fukuda S. and L.M. Pelus, Survivin, a cancer target with an emerging role in normal adult tissues. Mol Cancer Ther, 2006. 5(5). p: 1087-1098.

Ambrosini G. et al., A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med, 1997. 3(8). p: 917-921.

Takakura M. et al., Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and cancer cells. Cancer Res, 1999. 59(3). p: 551-557.

Xu R. et al., Spl and Sp3 regulate basal transcription of the survivin gene. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 356(1). p: 286-292.

Li Y. et al., The expression of antiapoptotic protein survivin is transcriptionally upregulated by DEC1 primarily through multiple spl binding sites in the proximal promoter. Oncogene, 2006. 25(23). p: 3296-3306.

Li F. et al., Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature, 1998. 396(6711). p: 580-584.

Liu N. et al., A new model of cell cycle-regulated transcription: repression of the cyclin A promoter by CDF-1 and anti-repression by E2F. Oncogene, 1998. 16(23). p: 2957-2963. Philips A. et al., CHF: a novel factor binding to cyclin A CHR corepressor element. Oncogene, 1999. 18(46). p: 6222-6232.

179. Dasgupta P. et al., Nicotine inhibits apoptosis induced by chemotherapeutic drugs by up-regulating XIAP andsurvivin. Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(16). p: 6332-6337.

180. Jiang Y. et al., Aberrant regulation of survivin by the RB/E2F family of proteins. J Biol Chem, 2004. 279(39). p: 40511-40520.

181. Raj D. et al., Survivin repression by p53, Rb and E2F2 in normal human melanocytes. Carcinogenesis, 2008. 29(1). p: 194-201.

182. Semba S. et al., Fhit modulation of the Akt-survivin pathway in lung cancer cells: Fhit-tyrosine 114 (Y114) is essential. Oncogene, 2006. 25(20). p: 2860-2872.

183. Xu Z.X. et al., Promyelocytic leukemia protein 4 induces apoptosis by inhibition of survivin expression. J Biol Chem, 2004. 279(3). p: 1838-1844.

184. Wagner M. et al., Transcriptional regulation of human survivin by early growth response (Egr)-l transcription factor. Int J Cancer, 2008. 122(6). p: 1278-1287.

185. Kim P.J. et al., Survivin and molecular pathogenesis of colorectal cancer. Lancet, 2003. 362(9379). p: 205-209.

186. Moon R.T. et al., The promise and perils of Wnt signaling through beta-catenin. Science, 2002. 296(5573). p: 1644-1646.

187. Aoki Y. et al., Inhibition of STAT3 signaling induces apoptosis and decreases survivin expression in primary effusion lymphoma. Blood, 2003. 101(4). p: 1535-1542.

188. Gritsko T. et al., Persistent activation of stat3 signaling induces survivin gene expression and confers resistance to apoptosis in human breast cancer cells. Clin Cancer Res, 2006. 12(1). p: 11-19.

189. Cosgrave N. et al., Growth factor-dependent regulation of survivin by c-myc in human breast cancer. J Mol Endocrinol, 2006. 37(3). p: 377-390.

190. Korinek V. et al., Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- colon carcinoma. Science, 1997. 275(5307). p: 1784-1787.

191. Zhu N. et al., KLF5 Interacts with p53 in regulating survivin expression in acute lymphoblastic leukemia. J Biol Chem, 2006. 281(21). p: 14711-14718.

192. Peng X.H. et al., Cross-talk between epidermal growth factor receptor and hypoxia-inducible factor-Ialpha signal pathways increases resistance to apoptosis by up-regulating survivin gene expression. J Biol Chem, 2006. 281(36). p: 25903-25914.

193. Van Antwerp D.J. et al., Inhibition of TNF-induced apoptosis by NF-kappa B. Trends Cell Biol, 1998. 8(3). p: 107-111.

194. Carter B.Z. et al., Cytokine-regulated expression of survivin in myeloid leukemia. Blood, 2001.97(9). p: 2784-2790.

195. Mahboubi K. et al., Interleukin-11 up-regulates survivin expression in endothelial cells through a signal transducer and activator of transcription-3 pathway. Lab Invest, 2001. 81(3). p: 327-334.

196. Cong Y.S. et al., Human telomerase and its regulation. Microbiol Mol Biol Rev, 2002. 66(3). p: 407-425, table of contents.

197. Poole J.C. et al., Activity, function, and gene regulation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT). Gene, 2001. 269(1-2). p: 1-12.

198. Kyo S. et al., Spl cooperates with c-Myc to activate transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT). Nucleic Acids Res, 2000. 28(3). p: 669-677.

199. Horikawa I. et al., Cloning and characterization of the promoter region of human telomerase reverse transcriptase gene. Cancer Res, 1999. 59(4). p: 826-830.

200. Wu K.J. et al., Direct activation of TERT transcription by c-MYC. Nat Genet, 1999. 21(2). p: 220-224.

201. Greenberg R.A. et al., Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c-Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation. Oncogene, 1999. 18(5). p: 1219-1226.

202.

203.

204.

205.

206.

207.

208.

209.

210.

211

212

213

214

215

216

217

218

219

220

221

Oh S. et al., In vivo and in vitro analyses of Myc for differential promoter activities of the human telomerase (hTERT) gene in normal and tumor cells. Biochem Biophys Res Commun, 1999. 263(2). p: 361-365.

Hagen G. et al., Spl-mediated transcriptional activation is repressed by Sp3. Embo J, 1994.13(16). p: 3843-3851.

Wooten L.G. and B. Ogretmen, SpI/Sp3-dependent regulation of human telomerase reverse transcriptase promoter activity by the bioactive sphingolipid ceramide. J Biol Chem, 2005. 280(32). p: 28867-28876.

Yin L. et al., NF-kappa B regulates transcription of the mouse telomerase catalytic subunit. J Biol Chem, 2000. 275(47). p: 36671-36675.

Xu D. et al., Downregulation of telomerase reverse transcriptase mRNA expression by wild typep53 in human tumor cells. Oncogene, 2000. 19(45). p: 5123-5133. Kanaya T. et al., Adenoviral expression of p53 represses telomerase activity through down-regulation of human telomerase reverse transcriptase transcription. Clin Cancer Res, 2000. 6(4). p: 1239-1247.

Hsu C.P. et al., Concordant expression of the telomerase-associated genes in non-small cell lung cancer. Eur J Surg Oncol, 2003. 29(7). p: 594-599.

Ryan P.C. et al., Antitumor efficacy and tumor-selective replication with a single intravenous injection of OAS403, an oncolytic adenovirus dependent on two prevalent alterations in human cancer. Cancer Gene Ther, 2004. 11(8). p: 555-569. Nagayama Y. et al., Enhanced efficacy of transcriptionally targeted suicide gene/prodrug therapy for thyroid carcinoma with the Cre-loxP system. Cancer Res, 1999. 59(13). p: 3049-3052.

Ueda K. et al., Carcinoembryonic antigen-specific suicide gene therapy of cytosine deaminase/5-fluorocytosine enhanced by the cre/loxP system in the orthotopic gastric carcinoma model. Cancer Res, 2001. 61(16). p: 6158-6162.

Kohan D.E., Progress in gene targeting: using mutant mice to study renal function and disease. Kidney Int, 2008. 74(4). p: 427-437.

Mingaleeva R.N. et al., Comparative analysis of herpes simplex virus thymidine kinase gene expression potentiation via HIV-1 Tat-TAR-system and cancer-specific promoters in p53(+) andp53(~) cells. Mol Biol (Mosk), 2010. 44(3). p: 507-514. Kingsman S.M. and A.J. Kingsman, The regulation of human immunodeficiency virus type-1 gene expression. Eur J Biochem, 1996. 240(3). p: 491-507.

Marcello A. and I. Giaretta, Inducible expression of herpes simplex virus thymidine kinase from a bicistronic HIV1 vector. Res Virol, 1998. 149(6). p: 419-431. Zhang L. et al., Molecular engineering of a two-step transcription amplification (TSTA) system for transgene delivery in prostate cancer. Mol Ther, 2002. 5(3). p: 223-232. Qiao J. et al., Tumor-specific transcriptional targeting of suicide gene therapy. Gene Ther, 2002. 9(3). p: 168-175.

Koch P.E. et al., Augmenting transgene expression from carcinoembryonic antigen (CEA) promoter via a GAL4 gene regulatory system. Mol Ther, 2001. 3(3). p: 278-283. Kuzmin D.V. et al., Cre-LoxP mediated strong enhancement of pBIRCS promoter driven suicide of cancer cells with CD/UPRT and fluorocytosine. The Open Gene Therapy Journal, 2010. 3. p: 31-39.

Wu C. et al., Combinatorial control of suicide gene expression by tissue-specific promoter and microRNA regulation for cancer therapy. Mol Ther, 2009. 17(12). p: 20582066.

Wu L. et al., Chimeric PSA enhancers exhibit augmented activity in prostate cancer gene therapy vectors. Gene Ther, 2001. 8(18). p: 1416-1426.

222.

223.

224.

225.

226.

227,

228.

229,

230

231

232,

233

234

235

236

237

238

239

240

241

Zhao L. and L.S. Chang, The human POLD1 gene. Identification of an upstream activator sequence, activation by Spl and Sp3, and cell cycle regulation. J Biol Chem, 1997.272(8). p: 4869-4882.

Davis J.J. et al., Oncolysis and suppression of tumor growth by a GFP-expressing oncolytic adenovirus controlled by an hTERT and CMV hybrid promoter. Cancer Gene Ther, 2006. 13(7). p: 720-723.

Wirth T. et al., A telomerase-dependent conditionally replicating adenovirus for selective treatment of cancer. Cancer Res, 2003. 63(12). p: 3181-3188.

Poulsen T.T. et al., A chimeric fusion of the hASHl and EZH2 promoters mediates high and specific reporter and suicide gene expression and cytotoxicity in small cell lung cancer cells. Cancer Gene Ther, 2008. 15(9). p: 563-575.

Farokhimanesh S. et al., Hybrid promoters directed tBid gene expression to breast cancer cells by transcriptional targeting. Biotechnol Prog, 2010. 26(2). p: 505-511. Sambrook J. and D.W. Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd Edition. 2001, Cold Spring Harbour, New York.: CSHL Press.

Slizhikova D.K. et al., [Decrease in expression of human J-chain in lung squamous cell cancer and adenocarcinoma]. Mol Biol (Mosk), 2007. 41(4). p: 659-665. Pleshkan V.V. et al., Methylation of the prominin 1 TATA-less main promoters and tissue specificity of their transcript content. Biochim Biophys Acta, 2008. 1779(10). p: 599605.

Kitamura T. et al., Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J Cell Physiol, 1989. 140(2). p: 323-334.

Хабриев P.У., Руководство no экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Медицина, 2005.

Миронов А.Н., Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К, 2012.

Mityaev M.V. et al., Functional significance of a putative spl transcription factor binding site in the survivin gene promoter. Biochemistry (Mosc), 2008. 73(11). p: 1183-1191.

Collins S.A. et al., Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy? Curr Gene Ther, 2008. 8(2). p: 66-78.

Mizuguchi H. et al., IRES-dependent second gene expression is significantly lower than cap-dependent first gene expression in a bicistronic vector. Mol Ther, 2000. 1(4). p: 376-382.

Yue Y. and C. Wu, Progress and perspectives in developing polymeric vectors for in vitro gene delivery. Biomaterials Science, 2013. 1. p: 152-170.

Ulasov A.V. et al., Properties of PEI-based polyplex nanoparticles that correlate with their transfection efficacy. Mol Ther, 2011. 19(1). p: 103-112.

Rudolph C. et al., Oligomers of the arginine-rich motif of the HIV-1 TAT protein are capable of transferring plasmid DNA into cells. J Biol Chem, 2003. 278(13). p: 11411-11418.

Wang Y. et al., Expression of thymidine kinase mediated by a novel non-viral delivery system under the control of vascular endothelial growth factor receptor 2 promoter selectively kills human umbilical vein endothelial cells. World J Gastroenterol, 2008. 14(2). p: 224-230.

Yang L. et al., Tumor-specific gene expression using the survivin promoter is further increased by hypoxia. Gene Ther, 2004. 11(15). p: 1215-1223.

Li F. and D.C. Altieri, The cancer antiapoptosis mouse survivin gene: characterization of locus and transcriptional requirements of basal and cell cycle-dependent expression. Cancer Res, 1999. 59(13). p: 3143-3151.

242. Altieri D.C., New wirings in the survivin networks. Oncogene, 2008. 27(48). p: 6276-6284.

243. Mirza A. et al., Human survivin is negatively regulated by wild-type p53 and participates in p53-dependent apoptoticpathway. Oncogene, 2002. 21(17). p: 2613-2622.

244. Hoffman W.H. et al., Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene by wild type p53. J Biol Chem, 2002. 277(5). p: 3247-3257.

245. Shemer J. et al., Tissue-specific transcription start site usage in the leader exons of the rat insulin-like growth factor-I gene: evidence for differential regulation in the developing kidney. Endocrinology, 1992. 131(6). p: 2793-2799.

246. Sverdlov E.D. and T.V. Vinogradova, Core Promoters As an Example of the Effect of Whole Genome Information on the Evolution of Views on Molecular Mechanisms of Vital Activity. Molecular Biology, 2010. 44(5). p: 682-692.

247. Adhya S. and M. Gottesman, Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity. Cell, 1982. 29(3). p: 939-944.

248. Mazo A. et al., Transcriptional interference: an unexpected layer of complexity in gene regulation. J Cell Sei, 2007.120(Pt 16). p: 2755-2761.

249. Shearwin K.E. et al., Transcriptional interference—a crash course. Trends Genet, 2005. 21(6). p: 339-345.

250. Bateman E. and M.R. Paule, Promoter occlusion during ribosomal RNA transcription. Cell, 1988. 54(7). p: 985-992.

251. Briggs M.R. et al., Purification and biochemical characterization of the promoter-specific transcription factor, Spl. Science, 1986. 234(4772). p: 47-52.

252. Reynolds G.A. et al., HMG CoA reductase: a negatively regulated gene with unusual promoter and 5' untranslated regions. Cell, 1984. 38(1). p: 275-285.

253. Mastrangelo I.A. et al., DNA looping and Spl multimer links: a mechanism for transcriptional synergism and enhancement. Proc Natl Acad Sei U S A, 1991. 88(13). p: 5670-5674.

254. Pascal E. and R. Tjian, Different activation domains of Spl govern formation of multimers and mediate transcriptional synergism. Genes Dev, 1991. 5(9). p: 1646-1656.

255. Valerio D. et al., Adenosine deaminase: characterization and expression of a gene with a remarkable promoter. Embo J, 1985. 4(2). p: 437-443.

256. Courey A.J. et al., Synergistic activation by the glutamine-rich domains of human transcription factor Spl. Cell, 1989. 59(5). p: 827-836.

257. Su W. et al., DNA looping between sites for transcriptional activation: self-association of DNA-boundSpl. Genes Dev, 1991. 5(5). p: 820-826.

258. Mirkin S.M., DNA Topology: Fundamentals. Encyclopedia of Life Sciences Nature Publishing Group, 2001.