Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Михайлова, Валерия Вадимовна

• Михайлова, Валерия Вадимовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Михайлова, Валерия Вадимовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. G-актин

2. Полимеризация G-актина

3. F-актин

4. Взаимодействие актина с другими белками

4.1 Кофилин

5. Тепловая денатурация актина

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Препаративные методы

1.1. Получение ацетонового порошка для выделения актина из скелетных мышц кролика

1.2. Выделение актина из ацетонового порошка

1.3. Определение концентрации белка

1.4. Получение F-актина и его стабилизация

2. Используемые методы исследования

2.1. Исследования термодинамических характеристик тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)

2.2. Исследование агрегации F-актина методом светорассеяния

2.3. Аналитическое соосаждение

2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS

2.5. Метод флуоресцентной спектроскопии

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Исследование тепловой денатурации актиновых филаментов. 41 1.1. Влияние состава буфера на процесс тепловой денатурации

F-актина.

1.2. Влияние нуклеотидов на характер тепловой денатурации актиновых филаментов.

1.3. Зависимость тепловой денатурации F-актина от концентрации белка.

1.4. Предполагаемый механизм тепловой денатурации актинового филамеита.

1.5. Данные литературы, свидетельствующие в пользу «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина.

1.6. Тепловая агрегация актина.

1.7. Исследование процесса тепловой денатурации актина при помощи гидрофобного флуоресцентного зонда ANS.

1.8. Влияние малых белков теплового шока на агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации.

Глава 2. Влияние кофилина на тепловую денатурацию актина.

2.1. Эффекты кофилина в насыщающих концентрациях.

2.2. Эффекты кофилина в концентрациях ниже насыщающих. Кооперативная дестабилизация F-актина.

2.3. Влияние стабилизаторов F-актина на тепловую денатурацию его комплексов с кофилином.

2.4. Два противоположных эффекта кофилина на тепловую денатурацию F-актина: обсуждение результатов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина»

Актин является одним из самых распространенных белков в природе. Он присутствует во всех эукариотических клетках, а в последнее время актино-подобные белки были обнаружены и у прокариот. Актин — глобулярный белок с молекулярной массой 42 кДа, который может существовать как в виде мономера (G-актин), так и в виде длинных полярных филаментов (F-актин), образующихся в результате полимеризации G-актина. Актиновые филаменты являются одним из главных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения и множества иных процессов биологической подвижности. Полимеризация актина (образование филаментов F-актина из мономерного G-актина) представляет собой обратимый динамический процесс, который сопровождается гидролизом АТФ и контролируется множеством актин-связывающих белков. Особое место среди них занимает белок кофилин, способный взаимодействовать как с мономерным G-актином, так и с филаментами F-акгина, вызывая фрагментацию филаментов и значительно повышая скорость их деполимеризации. В последнее время множество работ было посвящено свойствам этого белка - главным образом, его влиянию на структуру актиновых филаментов и на динамику их полимеризации-деполимеризации.

Изучение тепловой денатурации белков позволяет получать новую ценную информацию об их структуре и о тех конформационных перестройках, которые происходят в белках при моделировании процессов их функционирования. Для этого применяется метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), позволяющий подробно изучать процесс тепловой денатурации белка. Этот метод уже давно успешно применяется в нашей лаборатории для структурно-функциональных исследований мышечных белков [Левицкий и др., 1998; Левицкий, 2004]. При этом, однако, до сих пор практически не проводились систематические исследования тепловой денатурации F-актина. Очевидно было лишь то, что это очень сложный процесс, не поддающийся описанию с использованием имеющихся моделей тепловой денатурации белка. Несмотря на значительное количество опубликованных к настоящему времени данных, механизм тепловой денатурации актиновых филаментов до сих пор оставался неизвестным, и требовалось множество дополнительных экспериментов для его изучения. Еще меньше было известно о том, как взаимодействие с различными актин-связывающими белками отражается на тепловой денатурации актиновых филаментов. Именно поэтому главной целью предпринятого нами исследования стало изучение тепловой денатурации F-актина и влияния актин-связывающих белков на этот процесс.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые предложен механизм тепловой денатурации F-актина, главной особенностью которого является то, что актиновый филамент не денатурирует целиком как единое целое, как зачастую считалось ранее. Напротив, необратимой тепловой денатурации актиновых субъединиц в филаменте предшествуют, по крайней мере, две обратимые стадии - диссоциация субъединиц с концов актиновых филаментов и высвобождение из них прочно связанной АДФ. Результаты экспериментов, проведенных методом ДСК, впервые позволили выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина. Показано, что при стехиометрическом связывании (т.е. при полном насыщении актина кофилином) кофилин заметно увеличивает термостабильность как мономерного G-актина, так и филаментов F-актина. Оказалось, однако, что при низких концентрациях кофилин дестабилизирует актиновые филаменты, заметно смещая максимум теплового перехода F-актина в сторону более низких температур. Дестабилизация F-актина кофилином происходит с очень высокой кооперативностью и наблюдается даже при очень низких концентрациях кофилина (при молярном отношении кофилин/актин, равном 1:100 - 1:200). На основании этих данных был сделан вывод о том, что при взаимодействии с актином кофилин стабилизирует те его субъединицы, с которыми он связывается непосредственно, но при этом он с высокой кооперативностью дестабилизирует множество свободных от кофилина соседних субъединиц в актиновом филаменте.

Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации сложных олигомерных белков и их комплексов и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Дестабилизация F-актина кофилином, обнаруженная нами впервые методом ДСК, может играть важную роль в динамике актиновых филаментов в живой клетке, способствуя выполнению кофилином его главных, уже описанных в литературе функций - ускорению деполимеризации актиновых филаментов и их фрагментации. Калориметрические подходы, разработанные при исследованиях комплексов актина с кофилином, могут в дальнейшем успешно использоваться для изучения взаимодействия мономерного G-актина и филаментов F-актина с другими актин-связывающими белками.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Актин, один из основных структурных белков клетки, был открыт в 1942 г. как белок мышц, активирующий АТФазную активность миозина, что и определило его название. Актины — это целое семейство высококонсервативных цитоплазматических белков. Они являются структурными белками любых клеток эукариот, в том числе дрожжей и клеток растений. Также были найдены бактериальные гомологи актина: РагМ и МгеВ. Актины принимают участие во множестве клеточных процессов: подвижности одноклеточных и многоклеточных организмов, цитокинезе, секреции, сортировке белков, экспорте матричной РНК, передаче сигнала, дифференцировке и делении клеток [Cossart, 1995; Tirion & ben-Avraham, 1993; Lasa et al., 1998; Lippincott-Schwartz, 1998].-Актиновые филаменты играют ключевую роль в биологической подвижности как существенные партнеры миозиновых "моторных" систем и как главная составная часть цитоскелета.

В клетках актин встречается в виде глобул и фибрилл. Фибриллярный актин (F-актин) представляет собой спиральный полимер, состоящий из мономеров актина (G-актин). В условиях in vitro G-актин спонтанно образует длинные полярные филаменты при добавлении нейтральных солей. Полимеризация G-актина сопровождается гидролизом АТФ с последующим отщеплением неорганического фосфата. В условиях in vivo процесс полимеризации актина обусловлен не только связыванием с нуклеотидом и последующим его гидролизом, но и взаимодействием с огромным количеством актин-связывающих белков, регулирующих динамику актинового ■ филамента. Уникальная физиологическая роль актина во многом обусловлена тем, что между мономерным и полимерным актином существует динамическое равновесие.

1. G-актин

Мономерный актин (G-актин) - глобулярный белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 42 кДа. Большинство актинов содержит 375 аминокислотных остатков, причем на N-конце цепи наблюдается большое количество отрицательно заряженных групп. Эта часть белка является наиболее вариабельной, хотя существуют и другие участки вариабельности. В основном эти участки представляют собой области взаимодействия молекулы с нуклеотидами, с актин-связывающими белками и другими молекулами актина. Клетки высших эукариот содержат шесть изоформ актина (а-скелетномышечный, а-сердечный и а-гладкомышечный, р- и у-цитоплазматические и у-гладкомышечный), отличающихся друг от друга по аминокислотному составу не более чем на 10%. В клетке поддерживается определенное соотношение между разными изоформами актина, которые специфически локализованы в компартментах клетки, выполняют различные задачи и не могут замещать друг друга, не изменяя морфологию и функции клетки [Хайтлина, 2007]. Однако в целом первичная структура молекулы актина имеет высокую степень консервативности, что говорит о многофункциональности данного белка.

Кристаллизация G-актина связана с определенными трудностями в силу того, что повышение концентрации соли в растворе обычно приводит к образованию актиновых филаментов, которое полностью исключает получение кристаллов. Поэтому для кристаллизации необходимо создать условия, в которых бы полимеризация мономерного актина не происходила. Для этого использовались комплексы G-актина с различными актин-связывающими белками (такими как ДНКаза I, гельзолин, профилин) [Kabsch et al., 1990; Mannherz, 1992; Mannherz et al., 1992; Schutt et al., 1993] или с органическими токсинами [Klenchin et al., 2003]. Кроме того, для этой цели использовались препараты G-актина, которые вследствие химических модификаций [Otterbein et al, 2001; Graceffa & Dominguez, 2003; Kudryashov et al., 2005], мутаций [Rould et al., 2006] или специфического ограниченного протеолиза [Klenchin et al., 2006] утрачивали способность к спонтанной полимеризации. Были получены доказательства того, что такие модификации, как и образование комплексов G-актина с актин-связывающими белками, не оказывают существенного влияния на третичную структуру белка [Klenchin et al., 2006].

Рис. 1. Трехмерная структура молекулы актина [Kabsch et al., 1990]. Отмечены первые и последние аминокислотные остатки в а-спиралях и fJ-складках. В вертикальной щели между "большим" (слева) и "малым" (справа) доменами показано положение нуклеотида (АТФ) и двухвалентного катиона (в виде шарика).

Первая кристаллическая структура глобулярного актина, полученная в комплексе G-актина с ДНКазой I, была опубликована в 1990 году [Kabsch et al 1990]. Было показано, что молекула G-актина состоит из двух хорошо различимых доменов (рис. 1). Их принято называть "малым" и "большим" доменами G-актина, хотя различие их по размерам незначительно. Малый домен содержит как N-конед, так и С-конец полипептидной цепи и состоит из участков, ограниченных аминокислотными остатками 1-144 и 338-375, а большой домен образуют аминокислотные остатки с 145 по 337. Это означает, что полипептидная цепь дважды пересекает область между большим и малым доменами [Mannherz, 1992], Тот факт, что домены соединяются только двумя нитями полипептидной цепи, обеспечивает их высокую подвижность друг относительно друга. Именно поэтому данную область называют шарнирным участком молекулы [Tirion & ben-Avraham, 1993]. Домены разделены глубокой щелью, в которой располагаются катион-связывающий и нуклеотид-связывающий центры. Как правило, молекула актина содержит прочно связанную АТФ (или АДФ), которая может свободно обмениваться с нуклеотидом в растворе или замещаться другими нуклеотидами, и двухвалентный катион (Са2+ или Mg2+).

Каждый из доменов G-актина в свою очередь подразделяют на два субдомена: "малый" домен состоит из субдоменов 1 и 2, а "большой" - из субдоменов 3 и 4. В субдомене 2 расположена так называемая «ДНКаза I-связывающая петля» (в литературе часто можно встретить и другие ее названия: «ДНКазная петля» или «D-петля»), играющая важную роль в образовании актипового филамента. В частности, в результате расщепления G-актина бактериальной протеазой ЕСР32 в единственном месте - между аминокислотными остатками Gly42 и Val43, расположенными на этой петле, содержащий ион Са2+ G -актин утрачивает в обычных условиях способность к полимеризации, индуцируемой добавлением нейтральных солей [Khaitlina et al, 1993; Klenchin et al, 2006].

Следует отметить, что существует целое суперсемейство актино-подобпых белков, называемых еще белками-АТФазами, так как все они содержат АТФ-связывающий участок. Кроме актинов, в него входят белок теплового шока Hsp70, гексокиназа, Агр и прокариотические актино-подобные белки МгеВ и РагМ. Все белки данного семейства состоят из двух больших доменов, соединенных между собой шарнирным участком, а в щели между доменами располагается нуклеотид-связывающий сайт. Несмотря на значительные различия первичных структур, третичные структуры таких белков-АТФаз обладают заметным сходством, особенно в области нуклеотид-связывающего сайта. Предполагается, что подобное сходство обусловлено тем, что эти белки используют один и тот же механизм гидролиза АТФ и освобождения продуктов реакции, хотя и для осуществления совершенно различных процессов, происходящих в клетках [Flaherty et al., 1991]. Структуры белков этого семейства, содержащих связанный нуклеотид (АТФ или АДФ), характеризуются закрытым состоянием междоменной щели, в то время как для белков без нуклеотида щель остается открытой. Подробные исследования гексокиназы показали, что наиболее заметные конформационные изменения в структуре молекулы белка вызывает переход между открытым и закрытым состоянием нуклеотид-связывающей щели. Поэтому, на основании сходства третичных структур, можно предположить, что подобное утверждение будет справедливым и для других представителей данного суперсемейства, в частности и для G-актина [Reisler & Egelman, 2007].

К настоящему времени опубликовано около 25 кристаллических структур G-актина, но лишь для одной из них (комплекс G-актина с профилином [Chik et al1996]) нуклеотид-связывающая щель показана в открытом состоянии. Актин, закристаллизованный в комплексе с профилином, заметно отличается от остальных кристаллических структур, имеющих сходные конформации. Переход между открытым и закрытым состоянием щели сопровождается вращением большого домена относительно малого на -9,6°, а также поворотом субдомена 2. При этом субдомены 1 и 2 ведут себя как две независимые единицы. Помимо этого, происходят локальные конформационные изменения в гидрофобном кармане, окружающем цистеин 374, на N-конце и в области ДНКаза1-связывающей петли [Chik et al., 1996]. Существует предположение, что нуклеотид-связывающая щель в молекуле G-актина должна быть в действительности закрыта намного сильнее, чем это наблюдается в большинстве известных к настоящему времени кристаллических структур. Это, по-видимому, связано с тем, что необходимые для кристаллизации актип-связывающие белки, токсины или химические вещества препятствуют не только полимеризации G-актина, но и вращению большого домена и/или субдомена 2, связываясь непосредственно в области между доменами, в нуклеотид-связывающей щели или с субдоменами 2 и 4. В результате не происходит достаточного сближения субдомена 2 и субдомена 4, и нуклеотид-связывающая щель закрывается не полностью [Takamoto et al., 2007].

Ведется множество споров о том, может ли открытие щели быть связано с заменой связанного нуклеотида с АТФ на АДФ, и происходят ли при этом другие конформационные изменения в субъединицах актина. Анализируя огромное количество данных по регуляции динамики актинового филамента посредством гидролиза АТФ и отщепления фосфата, а также данных по взаимодействию с актии-связывающими белками, можно прийти к выводу, что определенные изменения в структуре молекулы актина происходить должны [Reisler & Egelman, 2007]. Несмотря на это, при сравнении кристаллических структур АТФ-G-aKTHHa и АДФ-в-актина не было обнаружено значительных конформационных перестроек или смещения доменов друг относительно друга. Некоторые изменения структуры наблюдались в области связывания у-фосфата АТФ, а также петли, содержащей His-73, и субдомена 2. Существуют ли различия в области ДНКаза I-связывающей петли, в настоящее время достоверно неизвестно. Возможно, структура этой петли не является строго организованной [Rould et al., 2006]; имеются, однако, данные о том, что ДНКазная петля дезорганизована только в АТФ-содержащем актине, а в случае АДФ-актина она представляет собой достаточно стабильную а-спираль [Graceffa & Dominguez, 2003].

Все эти изменения носят, однако, локальный характер, и кристаллические структуры АТФ-G-aKTHHa и АДФ-G-aKTHiia практически не отличаются. В то же время данные, полученные при исследованиях поведения белка в растворе, свидетельствуют о заметной разнице между актинами, содержащими АТФ или АДФ. Это может объясняться тем, что в процессе кристаллизации белка происходит закрытие междоменной щели в G-актине, тогда как для актина, находящегося в растворе, щель открыта из-за наличия связанного в ней нуклеотида. Таким образом, исследования кристаллической структуры G-актина демонстрируют явные противоречия между наблюдаемыми структурами и реальной структурой незакристаллизованного белка [Reisler & Egelman, 2007].

Что касается двухвалентных катионов, связывающихся с G-актином в области щели, то исследования показали, что ион Mg2+ (в природном актине) или Са2+ (на который замещается Mg2+ в процессе выделения) сначала связывается с молекулой АТФ и лишь затем - с актином, образуя тройной комплекс. Нуклеотид-связывающая щель между субдоменами 2 и 4 в случае Mg-АТФ-актина находится в более закрытом состоянии, чем в случае Са-АТФ-актина [Takamoto et al., 2007]. Комплекс Са-АТФ связывается с актином в 3-5 раз сильнее, чем комплекс Mg-АТФ. Так же, как и нуклеотид, связанный катион может обмениваться со средой, хотя диссоциация происходит достаточно медленно. Кроме того, молекула актина имеет еще 5-9 центров связывания ионов Са2+, Mg2+, К+ и др., однако сродство этих центров к ионам металла на несколько порядков ниже, чем в комплексе с нуклеотидами, имеющих сродство 109М"'. Связывание ионов с низкоафинными сайтами приводит к активации одного из самых важных процессов - полимеризации мономерного глобулярного актина с образованием нитей полимерного F-актина [Carlier, 1991]. К такой полимеризации способен как АТФ-О-актин, так и АДФ-О-актин, а в определенных условиях - даже G-актин, вообще не содержащий нуклеотида и являющийся крайне нестабильным в этом состоянии. Однако полимеризация таких актинов происходит с разными скоростями и при различных критических концентрациях белка, необходимых для начала полимеризации.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Михайлова, Валерия Вадимовна

выводы

1. При исследованиях тепловой денатурации филаментов актина (F-актина) методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) показано, что термостабильность F-актина существенно возрастает с увеличением концентрации белка, а также при увеличении концентрации добавленного нуклеотида (АДФ). Эффект АДФ является высокоспецифичным, поскольку он не проявляется в присутствии других нуклеозиддифосфатов.

2. На основании полученных данных предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации F-актина, согласно которому необратимой стадии денатурации (и последующей агрегации) белка предшествуют как минимум две обратимые стадии — диссоциация коротких олигомеров с концов актиновых филаментов и высвобождение нуклеотида (АДФ) из нуклеотид-связывающих центров субъединиц актина.

3. С помощью метода ДСК впервые выявлены два противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина: стабилизация (увеличение термостабилыюсти) актиновых филаментов при насыщающих концентрациях кофилина и дестабилизация (значительное снижение термостабильности) филаментов при низких концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения всех актиновых субъединиц в филаменте.

4. Показано, что дестабилизация актиновых филаментов имеет место даже при очень низких концентрациях кофилина, когда на 100-200 актиновых субъединиц приходится одна молекула кофилина. Предполагается, что при взаимодействии с F-актином кофилин стабилизирует только те субъединицы актина, с которыми он непосредственно связывается, но дестабилизирует множество свободных от кофилина соседних субъединиц в актиновом филаменте.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение, подведем главные итоги проведенных исследований. Во-первых, предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации F-актина, главной особенностью которого является то, что необратимой тепловой денатурации F-актина предшествуют, по крайней мере, две обратимые стадии - высвобождение прочно связанной АДФ из субъединиц актина и отщепление коротких олигомеров актина с концов актиновых филаментов. Во-вторых, применение метода ДСК впервые позволило выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина, а именно стабилизацию актиновых филаментов при насыщающих концентрациях кофилина и сильную дестабилизацию филаментов при низких концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения кофилином всех актиновых субъединиц в филаменте. Завершая анализ полученных результатов, попробуем объединить их воедино и объяснить эффекты кофилина в свете «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина.

Стабилизация и дестабилизация F-актина кофилином в свете «диссоциативного» механизма тепловой денатурации актиновых филаментов.

Тепловая денатурация F-актина представляет собой достаточно сложный процесс, поэтому обнаруженные нами эффекты кофилина не могут быть объяснены существующими в настоящее время моделями, применяемыми для описания процесса тепловой денатурации взаимодействующих друг с другом белков. Что касается стабилизирующего эффекта кофилина, то здесь хотя бы приблизительно можно опираться на модели прочных белок-белковых взаимодействий [Brands & Lin, 1990] или прочного связывания лигандов, стабилизирующих нативное состояние белка [Cooper et al., 2000]. Однако не существует модели, которая могла бы объяснить кооперативный эффект дестабилизации актинового филамента кофилином в ненасыщающей концентрации. Действительно, если предположить, что актиновый филамент денатурирует как единое целое, очень трудно представить, каким образом дестабилизированные кофилином субъединицы, денатурирующие при низкой температуре, могут оказывать влияние на тепловую денатурацию других субъединиц в филаменте, свободных от кофилина и денатурирующих при более высокой температуре. Нам удалось объяснить эти эффекты кофилина на тепловую денатурацию F-актина, исходя из предложенного «диссоциативного» механизма тепловой денатурации актинового филамента. Напомним, что одним из важнейших постулатов этого механизма является существование как минимум двух обратимых стадий, предшествующих необратимой денатурации F-актина, причем одной их этих стадий является обратимое отщепление коротких олигомеров актина от «минус»-конца актинового филамента. В свете этого «диссоциативного» механизма эффекты стабилизации и дестабилизации F-актина при связывании его с кофилином можно объяснить следующим образом.

В ходе тепловой денатурации полностью декорированного кофилином актинового филамента насыщенные кофилином короткие олигомеры актина диссоциируют от филамента и, как и в случае стабилизированного кофилином мономерного G-актина, подвергаются необратимой денатурации, демонстрируя высокотемпературный тепловой переход на термограмме F-актина. При концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения актинового филамента, кофилин связывается лишь с некоторыми субъединицами, что приводит к определенным конформационным изменениям в свободных от кофилина субъединицах актина. Мы предполагаем, что, отрываясь от филамента, такие субъединицы будут в течение некоторого времени «помнить» свое измененное конформационное состояние. Вследствие подобной «конформационной памяти», не связанные с кофилином субъединицы сохраняют приобретенную конформацию, которая характеризуется пониженной термостабильностью, что на термограмме F-актина отражается в виде появления низкотемпературного теплового перехода (рис. 21). Таким образом, мы предполагаем, что не связанные с кофилином дестабилизированные субъединицы актина после их диссоциации от филамента не успевают принять нормальную конформацию и быстро денатурируют, находясь в измененном конформациоином состоянии.

Предложенный механизм предполагает, что температурно-зависимое отщепление коротких олигомеров от актинового филамента происходит при температурах меньших, чем температура денатурации. Также представляется вполне вероятным, что связывание с кофилином (в особенности при его ненасыщающих концентрациях) снижает температуру, при которой происходит диссоциация олигомеров. С последним утверждением хорошо коррелируют данные литературы, подтверждающие способность кофилина ускорять диссоциацию актиновых субъединиц с «минус»-концов актиновых филаментов [Carlier et al., 1997; Carlier & Pantaloni, 1997; Carlier et al., 1999]. Следовательно, если короткие олигомеры актина отщепляются от частично декорированного кофилином актинового филамента при относительно низкой температуре (например, при ~55°С), то субъединицы актина, находящиеся в измененном конформациоином состоянии, подвергаются быстрой денатурации, в то время как стабилизированные кофилином субъединицы денатурируют при температурах 63-65°С. Важно отметить тот факт, что температура максимума теплового перехода (Тмакс) стабилизированных актиновых субъединиц смещается в сторону более высоких температур при увеличении молярного соотношения кофилин/актин (таблица 1). Данный эффект может быть частично объяснен с помощью модели, описывающей стабилизацию белка, происходящую при связывании лиганда (в данном случае кофилина) с нативной формой данного белка [Cooper et al., 2000]. Несмотря на то, что эта модель была предложена для обратимо денатурирующих белков, она также может быть применена и для белков, разворачивающихся необратимо. Данная модель предполагает, что индуцируемое лигандом уменьшение скорости денатурации может происходить в том случае, когда связывание лиганда с нативным белком сильнее, нежели его связывание с белком в переходном конформациоином состоянии. По-видимому, данное утверждение справедливо и для отщепляющихся от филамента актиновых субъединиц, связанных с кофилином. Именно таким образом мы можем объяснить, почему Тмакс пика стабилизированного актина возрастает при увеличении концентрации кофилина.

Конформационные изменения распространяются вдоль филамента иа значительные расстояния от стабилизированных кофилином субъединиц к субъединицам, свободным от кофилина. Очевидно, что при малых концентрациях кофилина данные изменения ослабевают при увеличении расстояния между стабилизированными субъединицами, непосредственно связанными с кофилином. Именно этим можно объяснить то, что индуцируемая кофилином дестабилизация наиболее заметна при концентрациях кофилина от 2 до 16 мкМ (рис. 21, таблица 1). В том случае, когда стабилизированных кофилином субъединиц актина достаточно много, а, следовательно, и расположены они относительно недалеко друг от друга, тогда и свободные от кофилина субъединицы располагаются достаточно близко к стабилизированным субъединицам, а происходящие в них конформационные изменения наиболее заметны. При диссоциации от филамента короткие олигомеры актина содержат субъединицы, которые «запомнили» значительные конформационные изменения, что приводит к снижению термостабильности белка и его необратимой денатурации при существенно меньшей температуре по сравнению с нативным актином.

При обсуждении модели, объясняющей стабилизирующий и дестабилизирующий эффекты кофилина на тепловую денатурацию актинового филамента с помощью предложенного нами «диссоциативного» механизма, нельзя не отметить недавно опубликованную статью Бобкова с соавторами [Bobkov et al., 2006]. В своей работе они повторили наши эксперименты по изучению термостабильности актинового филамента в присутствии насыщающих и ненасыщающих концентраций кофилина и получили практически такие же результаты. Сходные результаты были получены этими авторами и при использовании F-актина, в котором остатки Gln-41 и Cys-374 соседних в продольном направлении протомеров (вдоль оси филамента) были ковалентно сшиты друг с другом бифункциональным реагентом 7У-(4-азидо-2-нитрофенил) путресцином (ANP). По мнению авторов, такая сшивка исключала отщепление мономеров или коротких олигомеров от актинового филамента в процессе его тепловой денатурации. Было показано, что сшитый ANP F-актин демонстрирует большую термостабильность по сравнению с нативным белком (кривая теплопоглощения смещалась на 3,2°С в сторону более высоких температур). При добавлении кофилина в насыщающих концентрациях термостабильность такого сшитого ANP F-актина увеличивалась на ~6°С, а в присутствии кофилина в ненасыщающих концентрациях на термограмме F-актина одновременно обнаруживались, как и в нашем случае, два тепловых перехода с температурами максимумов на 5°С ниже и на б°С выше температуры максимума сшитого F-актина в отсутствие кофилина [Bobkov et al., 2006]. Таким образом, представленные в этой статье результаты калориметрических экспериментов хорошо коррелируют с нашими данными, за исключением того, что получены они были на F-актине, протомеры которого были продольно сшиты между собой. Опираясь на то, что в сшитом ANP F-актине ингибирована, по-видимому, диссоциация субъединиц от актинового филамента, А.А. Бобков с соавторами утверждают несостоятельность предложенной нами модели. Мы, однако, считаем, что двойственный эффект, оказываемый малыми концентрациями кофилина на термостабильность F-актина, невозможно объяснить иначе, как фрагментацией актинового филамента, предшествующей его необратимой денатурации. По указанным выше причинам нам представляется крайне маловероятной возможность плавления дестабилизированных кофилином субъединиц актина в составе длинного филамента. Поэтому мы предполагаем, что фрагментация актинового филамента имеет место, и олигомеры, содержащие стабилизированные или дестабилизированные субъединицы актина, отщепляются от филамента и плавятся раздельно. Что касается ковалентной сшивки актиновых протомеров, то вряд ли ANP обеспечивает 100-процентное связывание всех субъединиц в филаменте, и разрыв нити F-актина происходит, по-видимому, в местах отсутствия ковалентной сшивки. Возможно, влияние сшивки ANP на процесс тепловой денатурации актиновых филаментов в присутствии кофилина было бы более заметным при меньших молярных отношениях кофилина к актину, чем те, которые представлены в этой статье (1:2). Кроме того, подобная сшивка филамента должна отразиться на зависимости температуры максимума теплового перехода от концентрации актина. К сожалению, авторы не приводят соответствующих данных.

Таким образом, предложенный «диссоциативный» механизм тепловой денатурации актиновых филаментов может, с некоторыми допущениями, объяснить два столь противоположных эффекта, оказываемых кофилином на процесс тепловой денатурации F-актина.

Так или иначе, стабилизирующий и дестабилизирующий эффекты кофилина являются, по-видимому, очень важными для жизнедеятельности клетки. Дестабилизация F-актина кофилином может играть важную роль в динамике цитоскелета, способствуя выполнению кофилином его главных, уже описанных в литературе функций — ускорению деполимеризации актиновых филаментов и их фрагментации. Имеются данные о том, что кофилин локализован главным образом вблизи клеточной мембраны и его гораздо меньше в центре клетки [dos Remedios et al., 2003]. При этом концентрация кофилина в клетке (~20 мкМ) [Koffer et al., 1988] существенно ниже концентрации актина (-65 мкМ) [dos Remedios et al., 2003]. Следовательно, вблизи мембраны актиновые филаменты будут практически полностью декорированы кофилином и стабилизированы им, тогда как по мере удаления от мембраны к центру клетки все меньше и меньше молекул кофилина будет связано с F-актином. Исходя из наших данных, можно предположить, что актиновые филаменты в центре клетки будут нестабильны, что приведет к их фрагментации и образованию большого количества небольших олигомеров или даже мономеров, которые вновь смогут полимеризоваться в насыщенных кофилином областях клетки вблизи мембраны. Таким образом, как стабилизирующий, так и дестабилизирующий эффекты кофилина, обнаруженные нами впервые методом ДСК, могут играть важную роль в динамике актинового цитоскелета в живых клетках.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Михайлова, Валерия Вадимовна, 2008 год

1. Кремнева Е.В., Николаева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. (2003) Влияниетропонина на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. Биохимия, 68, 976-984.

2. Левицкий Д.И., Хайтлина С.Ю., Гусев Н.Б. (1995) Белки актомиозиновой системыподвижности. В кн.: «Белки и пептиды» (ред. Иванов В.Т., Липкин В.М.), М., «Наука», 1995, с. 249-293.

3. Левицкий Д.И., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А.,

4. Росткова Е.В. (1998) Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия, 63, 381—394.

5. Левицкий Д.И. (2004) Применение метода дифференциальной сканирующейкалориметрии для структурно-функциональных исследований мышечных белков. Успехи биол. химии, 44, 133—170.

6. Остерман Л.А. (1981) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот.

7. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М. Наука.

8. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003) Структура и свойства малых белковтеплового шока. Успехи биол. химии, 43, 59—98.

9. Татунашвили Л.В., Привалов П.Л (1984) Калориметрическое исследованиеденатурации G-актина. Биофизика, 29, 583-585.

10. Хайтлина С.Ю. (2007) Механизмы сегрегации изоформ актина в клетке.1. Цитология, 49, 345-354.

11. Andrianantoandro Е., Blanchain L., Sept D., McCammon J.A. and Pollard T.D. (2001)

12. Kinetic mechanism of end-to-end annealing of actin filaments. J. Mol. Biol., 312, 721-730.

13. Andrianantoandro E. and Pollard T.D. (2006) Mechanism of actin filament turnover bysevering and nucleation at different concentrations of ADF/cofilin. Mol. Cell, 24, 13-23.12.