Теоретическое исследование начальной стадии белок-индуцированного слияния мембран тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Молотковский, Родион Юлианович

• Молотковский, Родион Юлианович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Молотковский, Родион Юлианович

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Часть I. Обзор литературы

Глава 1. Слияние мембран

Глава 2. Механика мембран и ее приложения

Часть И. Форма мембраны в приближении кольцевой розетки слияния

Глава 1. Постановка задачи

Глава 2. Изменение формы и кривизны мембраны под действием белков, 30 индуцирующих спонтанную кривизну, с учетом одной деформационной моды

Глава 3. Изменение формы и кривизны мембраны под действием белков, 48 индуцирующих спонтанную кривизну, при учете двух деформационных мод

Часть III. Вычисление высоты энергетического барьера формирования сталка

Глава 1. Введение 62 Глава 2. Зависимость высоты энергетического барьера формирования сталка от 66 числа белков в кольце

Глава 3 Зависимость высоты энергетического барьера формирования сталка от 79 начальной кривизны мембраны

Часть IV. Формирование розетки белков слияния

Глава 1. Введение

Глава 2 Стабилизация розетки слияния из нескольких белков

Глава 3 Стабилизация розетки белков слияния по радиусу

Часть V. Вычисление линейного натяжения кромки поры

Заключение

Выводы

Список сокращений

Список публикаций

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Теоретическое исследование начальной стадии белок-индуцированного слияния мембран»

Введение

Процесс слияния мембран играет важнейшую роль во многих биологических процессах, таких как экзоцитоз, оплодотворение, секреция, синаптическая передача, вирусное слияние и др. (Evered and Whelan, 1984). На основании экспериментальных данных, полученных при исследовании слияния in vitro, была предложена концепция, согласно которой слияние мембран происходит в несколько этапов, ключевым из которых является формирование сталка — структуры, в которой контактирующие монослои мембран уже слились, а дистальные монослои — еще нет (Kozlov and Markin, 1983; Markin et al., 1984). Для того чтобы в системе из двух мембран образовался сталк, мембранам необходимо преодолеть энергетический барьер, связанный с деформацией и гидратационным отталкиванием. Теоретические оценки, проведенные в ряде работ, показывают, что высота барьера как минимум на порядок превышает энергию, характерную для тепловых флуктуаций (Kuzmin et al., 2001; Efrat et al., 2006). Это означает, что без дополнительного воздействия мембраны в живых системах не сольются за физически разумное время (несколько секунд). В биологических системах такое внешнее воздействие осуществляют специфические белки, называемые белками слияния. Белки слияния содержат домены, внедренные в обе сливающиеся мембраны, и воздействуют на мембраны для понижения высоты барьера. В настоящее время выдвинуты две гипотезы относительно механизма понижения высоты барьера. Согласно первому механизму, белки слияния индуцируют в мембране ненулевую спонтанную кривизну, что приводит к ее искривлению. Согласно второму механизму, белковый комплекс изменяет свою конформацию и стягивает друг с другом домены, находящиеся в разных мембранах, в результате чего мембраны стягиваются и сливаются. Несмотря на большое число экспериментальных и теоретических работ, посвященных исследованию белков слияния (Martens and McMahon, 2008; Chernomordik and Kozlov, 2008; Sudhof and Rothman, 2009), детальный механизм их функционирования до сих пор не выяснен. В частности, неясен относительный вклад двух механизмов — индуцирования спонтанной кривизны и прямого стягивания мембран — в обеспечение плотного контакта сливающихся мембран. Выяснение механизма функционирования белков слияния представляет одну из важнейших задач биофизики мембран, поскольку это позволяет определить возможные способы воздействия на эти белки. В частности, появляется возможность определить способы блокирования начальной стадии вирусного слияния. Это обуславливает актуальность теоретического исследования данного явления.

Высота энергетического барьера формирования сталка определяет скорость течения всего процесса слияния. Поскольку слияние мембран в живых системах происходит относительно быстро, энергетический барьер должен быть достаточно мал. Таким образом, вопрос о высоте энергетического барьера для перехода системы в состояние сталка и о влиянии на нее белков слияния является ключевым для описания слияния мембран в биологических системах.

Часть I. Обзор литературы Глава 1. Слияние мембран

Биологические мембраны играют определяющую роль в процессе жизнедеятельности клетки. Они отделяют и защищают содержимое клетки от внешней среды, обеспечивают транспорт необходимых веществ внутрь и наружу клетки, являются опорой белков и рецепторов и т.д. Процесс жизнедеятельности клетки сопровождается разнообразными преобразованиями мембран: они сливаются, делятся, в них образуются поры и т.д. Особое место среди этих преобразований занимает слияние мембран, т.е. объединение мембран и заключенных в них водных объемов. Слияние мембран играет важнейшую роль во многих биологических процессах, таких как экзоцитоз, оплодотворение, секреция, синаптическая передача и т.д. (Evered and Whelan, 1984).

Хорошо изученным процессом с участием слияния мембран является экзоцитоз (Rothman, 1994; Sudhof and Rothman, 2009). В процессе экзоцитоза везикулы сливаются с цитоплазматической мембраной клетки для того, чтобы высвободить свое содержимое (например, гормоны или нейротрансмиттеры) в межклеточное пространство или чтобы встроить рецепторы, каналы и иные белки в мембрану. Также слияние мембран является ключевым этапом инфицирования клеток вирусом. В зависимости от природы вируса, слияние вирусной мембраны происходит или непосредственно с мембраной клетки (например, в случае вируса герпеса), или с эндосомальной мембраной после того, как клетка поглотила вирус путем эндоцитоза. Слияние по эндосомальному пути происходит, например, в случае вируса гриппа (Lakadamyali et al., 2004).

Слияние мембран играет важную роль и во внутриклеточных процессах. Активно изучается слияние мембран митохондрий, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума и вакуолей в клетках дрожжей (Chan, 2006; Jahn and Scheller, 2006; Martens and McMahon, 2008; Zerial and McBride, 2001). Кроме того, показано слияние цитоплазматических мембран клеток в ходе межклеточного слияния. Широкий спектр процессов мембранного слияния в клетке представлен на рис. 1.1.1.

Животная клетка

Инфицирование вирусом

Репарация цитоплазмагической мембраны

f // \

Jf Слияние

миюмшдрий ^^

Клетка дрожжей

о Комплексы SNARE о Регуляторные факторы

о Дисферлин, миоферлин о Ig-белки

А Вирусный белок слияния о Митофузин

в OPAl/Mgml в HOPS

© Синаптотагмин Актиновые цепи

Рис. 1.1.1. Процессы слияния мембран в клетке (Martens and McMahon, 2008). Представлены основные события, связанные со слиянием мембран в живой клетке, в т.ч. Ca -зависимый экзоцитоз и инфицирование клетки вирусом.

Во всех этих процессах происходит топологическая перестройка мембран, в результате которой две мембраны становятся одной. Такая перестройка не может быть осуществлена просто путем разрыва бислоев и последующего замыкания их в новой топологии. Если барьерная функция мембран нарушается, то это, как правило, свидетельствует о каком-либо патологическом процессе (Kroemer et al., 2007). Для слияния мембраны должны быть сближены друг с другом до образования плотного контакта, на что указывают экспериментальные данные. Так, в работе (da Silva and Nogueira, 1977) с помощью электронной микроскопии были получены изображения областей контакта мембран при слиянии везикул с зооспорами Phytophthora palmivora. Полученные изображения показывают, что мембраны контактируют друг с другом в нескольких отдельных местах; контакт мембран приводит к формированию и расширению бислойной мембранной диафрагмы при отсутствии посторонних частиц. Однако контакт больших областей мембран друг с другом невозможен, поскольку известно, что при сближении мембран на расстояние порядка нанометра между ними возникает сильное гидратационное отталкивание. Это отталкивание обусловлено взаимодействием упорядоченных слоев воды, связанных с липидными головками в сливающихся мембранах (Frolov and Zimmerberg, 2010). Экспериментальные исследования, проведенные на модельных липидных системах (Rand, 1981;

Chernomordik et al., 1985), помогли сформулировать концепцию, согласно которой слияние происходит в несколько этапов через локальные нестационарные контакты между взаимодействующими мембранами (Kozlov and Markin, 1983; Chernomordik et al., 1987; Leikin et al., 1987).

Согласно предложенной концепции, после беспрепятственного сближения на расстояние порядка 2-3 нм мембраны формируют локальные выпуклости друг напротив друга. В первых работах рассматривались модельные плоские мембраны и предполагалось, что формирующиеся выпуклости являются следствием тепловых флуктуаций (Leikin et al., 1987). Поскольку гидратационное отталкивание мембран пропорционально площади их контакта, небольшие выпуклости должны испытывать его в значительно меньшей степени, чем большие области бислоев. Локальное сближение мембран приводит к увеличению энергии системы. В результате становится энергетически выгодным локальное разрушение контактирующих монослоев мембран на вершинах выпуклостей и образование так называемых гидрофобных дефектов, т.е. областей мембран с экспонированными в воду углеводородными хвостами (Rand and Parsegian, 1986; Helm et al., 1989). Эти дефекты представляют собой зародыши будущего контакта цис-монослоев мембран, поскольку они локально разупорядочивают гидратационные слои, что приводит к притяжению между мембранами. Притяжение увеличивается с уменьшением расстояния между дефектами, что в конце концов приводит к их слиянию. В результате образуется структура в форме песочных часов, в которой контактирующие монослои мембран уже слились, а дистальные монослои — еще нет. Эта структура была названа сталком (Kozlov and Markin, 1983; Markin et al., 1984). Диаметр сталка увеличивается, в результате чего приходят в контакт дистальные монослои и образуется так называемая триламеллярная структура, или диафрагма слияния. Затем в ней образуется пора, и слияние мембран завершается. Стадии процесса слияния схематически показаны на рис. 1.1.2.

Контактные монослои

а б в г д

Рис. 1.1.2. Стадии процесса слияния мембран (Jahn and Fasshauer, 2012). а — сближение контактирующих мембран; б — локальная дестабилизация мембран и образование сталка; в — расширение сталка и формирование диафрагмы слияния; г, д — образование поры слияния и ее расширение.

Считалось, что именно образование сталка является скорость-лимитирующей стадией во время мембранного слияния, поэтому к этой стадии было привлечено повышенное внимание. В

ранних исследованиях сталк был гипотетическим интермедиатом, однако в дальнейшем были получены экспериментальные свидетельства в пользу его существования. Так, в работе (Frolov et al., 2000) с помощью электронной микроскопии наблюдалось формирование выпуклостей и их плотный контакт при слиянии мембран эритроцитов и клеток линии НАЬ2, экспрессирующих на своей мембране белок слияния вируса 1риппа гемагглютинин. Кроме этого, трехмерное распределение электронной плотности в сталке наблюдалось в серии экспериментов по дифракции рентгеновских лучей на липидной фазе, содержащей сталки (Yang and Huang, 2002; Aeffner et al., 2012). Наличие сталка было показано также в экспериментах по численному моделированию процесса слияния в различных системах при разных начальных условиях (Marrink et al., 2009; Baoukina and Tieleman, 2010). Более того, недавно полученные результаты указывают на формирование похожих структур в процессе мембранного деления (Bashkirov et al., 2008). В дальнейшем во многих моделях первоначальная концепция сталка подверглась некоторым изменениям. Так, в работе (Efrat et al., 2007) предполагается, что гидрофобные дефекты образуются в мембранах до начала их сближения, что приводит к характерной вулканообразной форме мембранных выпуклостей. В результате силы гидратационного отталкивания действуют на меньшей площади, что дает некоторый выигрыш в энергии. Численное моделирование методами молекулярной динамики указывает на возможную некруговую форму сталка (см, например, обзор (Markvoort and Marrink, 2011)). Существуют и полностью альтернативные гипотезы. Например, в работе (Lee, 2010) на основе электронно-микроскопических исследований был сделан вывод о том, что после сближения мембран вируса гриппа и клетки в мембране клетки образуется пора. Мембранная воронка с порой на конце соприкасается с мембраной вируса, что приводит к образованию структуры полуслияния и, затем, к полному объединению сливающихся мембран. Автор считает, что мембрана вируса не будет сильно деформироваться, поскольку она связана с жестким белковым каркасом. Тем не менее, в настоящее время концепция сталка как ключевого этапа в слиянии мембран является общепризнанной.

В теоретических исследованиях слияния мембран следует выделить две основных стратегии, применяющиеся для описания процесса слияния (Chernomordik and Kozlov, 2008). Первая стратегия — так называемый континуальный подход — основана на моделировании мембран как макроскопических объектов, которые могут быть описаны методами классической физики, в частности теорией упругости липидных монослоев или теорией самосогласованного среднего поля. Вторая стратегия — так называемый симуляционный подход — использует компьютерные симуляции процесса слияния мембран и основана на современных методах численного расчета, таких как молекулярная динамика крупночастичных или атомных моделей липидов или метод Монте-Карло. В обоих подходах сталк присутствует как ключевой этап в

последовательности событий при слиянии мембран, и они взаимно дополняют друг друга при исследовании их слияния. Так, континуальный подход позволяет объяснить экспериментально наблюдаемую зависимость среднего времени ожидания монослойного слияния от липидного состава сливающихся мембран. Было показано (Chernomordik et al., 1985), что при добавлении в контактный монослой мембраны из фосфатидилхолина лизолипида время ожидания резко увеличивается, а при добавлении фосфатидилинозита — уменьшается. Эту зависимость удалось объяснить, рассмотрев влияние геометрии различных липидов на характеристики мембраны в целом. В цитированной работе было сделано предположение о том, что форма монослоя, составленного из липидов определенного сорта, зависит от их геометрической характеристики, так называемого параметра упаковки f, определяемого как /= V/(ah), где V— молекулярный объем, а — площадь полярной головки, a h — максимальная длина углеводородного хвоста липида. Если / < 1 (например, в случае лизолипидов), то молекула имеет форму инвертированного конуса (см рис. 1.1.3,1а); если1, то молекула имеет форму цилиндра, как в случае диолеоилфосфатидилхолина (DOPC) (см рис. 1.1.3, IIa); если же/> 1, то молекула имеет форму конуса, как в случае диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) (см рис. 1.1.3, Illa). Рассмотрим бислойную мембрану, составленную из липидов определенного вида. Если липиды, составляющие мембрану, имеют форму инвертированного конуса, то мембрана будет стремиться принять форму гидрофильной поры (см рис. 1.1.3, le); если липиды имеют форму цилиндра, то мембрана будет стремиться принять форму плоского бислоя (см рис. 1.1.3, Не); если же липиды имеют форму конуса, то мембрана будет стремиться принять форму полусталка (см рис. 1.1.3, Шв). Ясно поэтому, что чем больше параметр f, тем вероятнее слияние контактных монослоев мембран и образование сталка.

I II III

e игл

¿Pm UUDU VVVYV

Рис. 1.1.3. Форма липидных молекул и предпочтительные структуры монослоя и бислоя. а — эффективная форма липидных молекул; б — энергетически выгодные структуры, создаваемые липидами различной формы в монослое; в — энергетически выгодные структуры, создаваемые липидами различной формы в бислое. Римскими цифрами обозначены: I — липиды в форме обратных конусов (например, лизолипиды); II — липиды в форме цилиндров (например, DOPC); III — липиды в форме конусов (например, DOPE). Черным закрашены полярные головки липидных молекул.

Основной заслугой симуляционного подхода при исследовании процесса слияния мембран надо признать визуализацию сталка и остальных стадий слияния в различных системах (Kasson and Pande, 2007; Baoukina and Tieleman, 2010). Было найдено, что, в отличие от традиционного пути расширения симметричного сталка, могут наблюдаться и другие пути слияния. Например, в работе (Smeijers et al., 2006) использование симуляционного подхода позволило показать, что в окрестности сталка в мембране образуется пора; сталк со временем окружает эту пору и расширяется анизотропно, что приводит к формированию анизотропной диафрагмы слияния.

Чтобы из мембран образовался сталк, системе необходимо преодолеть энергетический барьер, связанный с деформацией мембран и гидратационным отталкиванием. В расчетах с использованием континуального подхода высота барьера по порядку величины составляет 50100 кТ, где кТ ~ 4-Ю-21 Дж. Так, в работе (Kuzmin et al., 2001) мембранные выпуклости аппроксимируются сферическими сегментами; энергия, необходимая для создания таких сегментов, составляет примерно 200 кТ. В работе (Efrat et al., 2007) показано, что если выпуклости имеют заостренную вулканообразную форму, то энергетический барьер формирования сталка составляет от 50 до 80 кТ. В расчетах, проведенных с использованием теории среднего поля, получаются значительно меньшие величины; так, например, барьер в

и

случае слияния везикул радиусом приблизительно 15 нм в работе (Lee and Schick, 2008) составляет 13 кТ. Симуляционный подход также дает небольшие величины для энергетического барьера. Так, в работе (Kasson et al., 2006) найдено, что для везикул из пальмитоилфосфатидилхолина (POPE) радиусом 14 нм разница в свободной энергии между сталком и исходным состоянием мембран составляет всего 6 кТ. В работе (Norizoe et al., 2010) авторы, используя метод термодинамического интегрирования, получили для двух плоских бислоев без растворителя свободную энергию сталка увеличенной на 16 кТ по сравнению с начальным состоянием. Последние две величины — 6 кТ и 16 кТ — не являются барьерами, поскольку в их определении отсутствует траектория перехода; тем не менее, они позволяют оценить минимальную высоту барьера в соответствующей системе. Существенная разница в найденных величинах барьера для работ с симуляционным и континуальным подходами объясняется разницей исследуемых систем. В симуляционных подходах не может быть смоделирована большая система из-за ограниченности вычислительных мощностей. В результате слияние моделируется на везикулах малого размера, которые сильно искривлены. В то же время рассматриваемая в рамках линейной теории упругости мембрана не может быть сильно искривленной, поскольку в этом случае применение такого приближения неправомерно. В любом случае, в большинстве работ энергетический барьер для перехода системы из двух мембран в состояния сталка значительно превышает величину в несколько единиц кТ, характерную для энергии тепловых флуктуаций. Это означает, что без дополнительного внешнего воздействия мембраны не сольются за физически разумное время. В биологических системах таким внешним воздействием являются специфические белки, называемые белками слияния. Рассмотрим подробнее механизм их воздействия на процесс слияния.

Наиболее хорошо исследованы белки слияния вирусов, в особенности вируса гриппа, и белки слияния синаптических везикул. Белки слияния вирусов могут быть структурно поделены на три класса (Martens and McMahon, 2008, Harrison, 2008). Белки первого класса в основном состоят из а-спиралей, второго класса — из ß-структур, а белки третьего класса имеют смешанную структуру. Гемагглютинин (ГА), белок слияния вируса гриппа, относится к первому классу. Несмотря на то, что до сих пор нет единого мнения относительно механизма участия этих белков в слиянии вирусов с клеткой, большинство исследователей придерживаются следующей модели. Сначала трансмембранные вирусные белки находятся в неактивном состоянии на поверхности вируса. Затем под воздействием некоторого триггера происходит их активация. В случае вируса гриппа таким триггером служит уменьшение pH среды в эндосоме, в которой находится вирус (Lakadamyali, et al., 2003). В результате вирусные белки слияния претерпевают конформационный переход и экспонируют во внешнюю водную среду гидрофобные участки, называемые пептидами слияния. Последние стремятся внедриться

в мембрану клетки-мишени. Затем белки слияния претерпевают дополнительный конформационный переход, в результате которого трансмембранные домены и пептиды слияния оказываются рядом (Skehel and Wiley, 2000; Gruenke et al., 2002). Поскольку трансмембранные домены находятся в мембране вируса, а пептиды слияния — в мембране клетки-мишени, эти мембраны также стягиваются и, в конце концов, сливаются. Несмотря на то, что белки второго и третьего класса отличаются по своей структуре от белков первого класса, они, скорее всего, работают по такой же схеме с конформационной перестройкой и внедрением в мембрану-мишень пептидов слияния. Пептиды слияния многих вирусных белков слияния внедряются частично в один монослой; на основании этого было сделано предположение, что такое внедрение приводит к созданию выпуклости в мембране клетки-мишени и изгибает ее навстречу вирусной оболочке (Weissenborn et al., 2007; Han et al., 2001). Подтверждает эту гипотезу работа (Kanaseki et al., 1997), в которой наблюдались небольшие выпуклости на мембране липосом, инкубированных с активированным эктодоменом ГА вируса гриппа.

Слияние синаптических везикул с плазматической мембраной является ключевым этапом для высвобождения нейротрансмиттеров и гормонов и, таким образом, необходимо для эффективной межклеточной коммуникации. Экзоцитоз синаптических везикул специализирован в том смысле, что он позволяет нейронам взаимодействовать друг с другом очень быстро и контролируемым образом. Экзоцитоз контролируется притоком ионов кальция в клетку и завершается примерно через 1 мс после его начала (Martens and McMahon, 2008). Кроме того, скорость экзоцитоза определяется тем, какие белки участвуют в его процессе (Geppert et al., 1994). При исследовании процессов экзоцитоза было показано, что непосредственное влияние на его кинетику оказывают белки синаптотагмина и комплексы SNARE, в то время как множество других белков, таких как комплексин или MUNC13, также вовлечены в процесс слияния синаптических везикул с мембраной, но прямого влияния на него не оказывают (Sudhof, 2004; Sorensen, 2004). Комплекс SNARE состоит из нескольких единичных белков, причем как минимум два из них должны содержать трансмембранные домены, внедренные в каждую из сливающихся мембран (Martens and McMahon, 2008). Отдельные белки, входящие в комплекс SNARE, в начальном состоянии развернуты, но во время слияния они спонтанно образуют между мембранами стабильный комплекс из четырех а-спиралей (Sutton et al., 1998), который в литературе носит название «транс-SNARE комплекс», также известный, как SNAREpin. Этот комплекс изменяет свою конформацию и, подобно застежке-молнии, «застегивается» (Weber et al., 1998; Jahn and Scheller, 2006). Тем самым к мембранам прикладывается сила, которая противодействует отталкиванию между ними. В результате мембраны входят в контакт и сливаются.

Белок синаптотагмин-1 имеет единичный трансмембранный домен, встроенный в синаптическую везикулу. Кроме того, каждая молекула белка синаптотагмина-1 содержит два С2-домена, состоящих из ß-структур, соединенных петлями; эти петли создают карманы, которые могут связывать ионы кальция при их поступлении в систему. Существует несколько моделей, объясняющих влияние синаптотагмина-1 на процесс экзоцитоза. В частности, в работе (Martens et al., 2007) была выдвинута модель, согласно которой синаптотагмин со связанным с ним кальцием адсорбируется на мембране клетки, что приводит к сильному ее искривлению. Это, в свою очередь, стимулирует SNARE-зависимое слияние мембран, как было показано авторами in vitro. Авторы приходят к выводу, что искривление мембран, во-первых, уменьшает расстояние между мембранами, а во-вторых, увеличивает внутреннее давление, испытываемое липидами на вершине выпуклости мембраны, что должно уменьшать энергетический барьер для перехода в сталк. В другой работе (Zimmerberg et al., 2006) предполагается, что внедрение в клеточную мембрану синаптотагмина со связанным с ним кальцием изменяет заряд фосфатидилсерина, находящегося в мембране. Это, в свою очередь, изменяет спонтанную кривизну участков мембраны, что, опять-таки, облегчает слияние мембран.

В современной литературе предполагается, что все белки слияния воздействуют на мембрану лишь по одному из двух механизмов (McMahon et al., 2010; Chernomordik and Kozlov, 2008). Согласно первому из них, один из доменов белка внедряется в мембрану на некоторую небольшую глубину и тем самым создает пустое пространство под собой. Углеводородные хвосты соседних липидов занимают это пространство, что приводит к локальному искривлению мембраны (Campelo et al., 2008; Martens and McMahon, 2008; Graham and Kozlov, 2010; Richard et al., 2011). Из результатов экспериментов и данных молекулярно-динамических симуляций известно, что некоторые из белков слияния, например, синаптотагмин, встраиваются в мембрану под острым углом на глубину, примерно соответствующую уровню головок липидов (Herrick et al., 2006; Efremov et al., 2004). Это увеличивает индуцируемую ими кривизну. Локальные искривления от нескольких белковых молекул суммируются, что приводит к глобальному искривлению всей мембраны и образованию выпуклости. Согласно второму механизму, в течение слияния белок изменяет свою конформацию и во время конформационной перестройки передает усилие через трансмембранный домен непосредственно на мембрану (Sudhof and Rothman, 2009). Это силовое воздействие приводит к изгибу мембраны и образованию выпуклости. Индукция белками кривизны в контактном монослое мембраны более распространена, чем прямая передача силового воздействия, хотя нередко эти два механизма формирования выпуклостей задействованы одновременно. В частности, предполагается, что так протекает слияние вирусной и эндосомальной мембран при вирусном инфицировании клетки и Са2+ -зависимое слияние синаптических везикул с

плазматической мембраной (Martens and McMahon, 2008; McMahon et al., 2010). Слияние мембран чисто по второму механизму достоверно подтверждено только в случае клеточного слияния везикул, обусловленного белками SNARE (Martens and McMahon, 2008; McMahon et al., 2010). Однако, как утверждается в работе (Martens and McMahon, 2008), для успешного функционирования белков SNARE всегда необходима помощь со стороны белков, индуцирующих кривизну, например, синаптотагмина.

Глава 2. Механика мембран и ее приложения

В данной главе мы будем исследовать мембрану с позиций континуального подхода, кратко описанного в предыдущей главе; таким образом, мы будем рассматривать мембрану как сплошную упругую среду, подверженную деформациям. В главе будет вычисляться изменение свободной энергии мембраны, необходимое для той или иной ее структурной перестройки. Известно, что мембрана обладает анизотропией физических свойств в латеральном и нормальном направлениях: в латеральном направлении она представляет собой двумерную жидкость, в то время как в нормальном направлении является твердым телом. В этом смысле мембрана представляет собой смектический жидкий кристалл. По аналогии с жидкими кристаллами средняя ориентация углеводородных цепей липидов характеризуется единичным вектором п, который называется директором. Директор будем считать заданным на некоторой разделяющей поверхности, выбранной внутри мембраны. В недеформированном липидном монослое директор совпадает с нормалью к поверхности монослоя. Распределение директора определяет упругую энергию системы в предположении, что деформации малы. Теория упругости жидких кристаллов разработана в классической работе Франка (Frank, 1958). Им было получено выражение для энергии единицы объема деформированного нематического жидкого кристалла в предположении, что направление директора медленно (на расстояниях, намного превышающих молекулярные размеры) меняется по пространству:

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Молотковский, Родион Юлианович, 2013 год

Список литературы

1. Акимов, С. А. Теория линейного натяжения и взаимодействия липидных доменов в бислойных мембранах: дис. канд. физ.-мат. наук:03.01.02 / Акимов Сергей Александрович - М., 2005. - 127 с.

2. Ландау Л. Д. и Лифшиц Е. М. Теоретическая физика. Том VII. Теория упругости. Москва, Наука, Главная редакция физико-математической литературы.

3. Маркин B.C., Козлов М.М. Статистика пор в бислойных мембранах // Биол. мембраны. 1985. Т. 2. С. 205-223.

4. Abidor I.G., Arakelyan V.B., Chernomordik L.V., Chizmadzhev Y.A., Pastushenko V.F., Tarasevich M.R. Electric breakdown of bilayer lipid membrane. The main experimental facts and their qualitative discussions // Bioelectrochem. Bioenerg. 1979. V. 6. P. 37-52.

5. Aeffner S., Reusch 'Г., Weinhaussen В., Salditt T. Energetics о stalk intermediates in membrane fusion are controlled by lipid composition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109(25). P. E1609-E1618.

6. Baoukina S., Tieleman D. P. Direct simation of protein-mediated vesicle fusion: lung surfactant protein В // Biophys. J. 2010. V. 99(7). P. 2134-2142.

7. Bashkirov P. V., Akimov S. A., Evseev A. I., Schrnid S. L., Zimmerberg J., Frolov V. A. GTPase cycle of dynamin is coupled to membrane squeese and release, leading to spontaneous fission//Cell. 2008. V. 135(7).P. 1276-1286.

8. Brewster R., Pincus P. A., Safran S. A. Hybrid lipids as a biological surface-active component // Biophys. J. 2009. V. 97(4). P. 1087-1094.

9. Boucrot E., Pick A., Camdere G., Liska N., Evergren E., McMahon H. Г., Kozlov M. M. Membrane fission is promoted by insertion of amphipathic helices and is restricted by crescent BAR domains // Cell. 2012. V. 149(1). P. 124-136.

10. Campelo F., McMahon H. Т., Kozlov M. M. 'lhe hydrophobic insertion mechanism of membrane curvature generation by proteins // Biophs. J. 2008. V. 95(5). P. 2325-2339.

11. Carr С. M., Kim P. S. A spring-loaded mechanism for the conformational change of influenza hemagglutinin//Cell. 1993. V. 73(4). P. 8283-832.

12. Chan D. C. Dissecting mitochondrial fusion // Dev. Cell. 2006. V. 11 (5). P. 592-594.

13. Chernomordik L. V. and Kozlov M. M. Protein-lipid interplay in fusion and fission of biological membranes // Annu. Rev. Biochem. 2003. V. 72. P. 175-207.

14. Chernomordik L. V., Kozlov M. M. Mechanics of membrane fusion // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. V. 15(7). P. 675-683.

15. Chernomordik L. V., Kozlov M. M., Melikyan G. B., Abidor I. G., Markin V. S., Chizmadzhev Yu. A. The shape of lipid molecules and monolayer membrane fusion // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V. 812(3). P. 643-655.

16. Chernomordik L. V., Leikina E., Kozlov M. M., Frolov V. A., Zimmerberg J. Structural intermediates in influenza haemagglutinin-mediated fusion // Mol. Membr. Biol. 1999. V. 16(1). P. 33-42.

17. Chernomordik L. V., Melikyan G. B., Chizmadzhev Yu. A. Biomembrane fusion: a new concept derived from model studies using two interacting planar lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 906(3). P. 309-352.

18. Cohen F. S., Melikyan G. B. The energetics of membrane fusion from binding, through hemifusion, pore formation, and pore enlargement // J. Membr. Biol. 2004. V. 199. P. 1-14.

19. Efrat A., Chernomordik L. V., Kozlov M. M. Point-like protrusion as a prestalk intermediate in membrane fusion pathway //Biophys. J. 2007. V. 92(8). P. L61-L63.

20. Efremov R. G., Nolde D. E., Konshina A. G., Syrtcev N. P., Arseniev A. S. Peptides and proteins in membranes: what can we learn via computer simulations? // Curr. Med. Chem. 2004. V. 11(18). P. 2421-2442.

21. Evans E., Heinrich V., Ludwig F., Rawicz W. Dynamic tension spectroscopy and strength of biomembranes // Biophys. J. 2003. V. 85(4). P. 2342-2350.

22. Evans E. and Rawicz W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes // Phys. Rev. Lett. 1990. V. 64. P. 2094-2097.

23. Evered D. and Whelan S. Cell fusion. Pitman, London, 1984. P. 355.

24. Fattal D. R. and Ben-Shaul A. A molecular model for lipid-protein interaction in membranes: the role of hydrophobic mismatch // Biophys. J. 1993. V. 65(5). P. 1795-1809.

25. Fournier J.-B. Microscopic membrane elasticity and interactions among membrane inclusions: interplay between the shape, dilation, tilt and tilt-difference modes // Eur. Phys. J. B. 1999. V. 11. P. 21-272.

26. Frank F. C. On the theory of liquid crystals // Discuss. Faraday Soc. 1958. V. 25. P. 19-28.

27. Frolov V. A., Cho M. S., Bronk P., Reese T. S., Zimmerberg J. Multiple local contact sites are induced by GPI-linked influenza hemagglutinin dining hemifusion and flickering pore formation // Traffic. 2000. V. 1(8). P. 622-630.

28. Frolov V. A., Dunina-Barkovskaya A. Y., Samsonov A. V., Zimmerberg J. membrane permeability changes at early stages of influenza hemagglutinin-mediated fusion // Biophys. J. 2003. V. 85(3). P. 1725-1733.

29. Frolov V. A., Zimmerberg J. Cooperative elastic stresses, the hydrophobic effect, and lipid tilt in membrane remodeling // FEBS Lett. 2010. V. 584(9). P. 1824-1829.

30. Galimzyanov T. R., Molotkovsky R. J., Kheyfets B. B., Akimov S. A. Energy of the interaction between membrane lipid domains calculated from splay and tilt deformations // JETP Letters. 2012. V. 96(10). P. 681-686.

31. Gawrisch K., Ruston D., Zimmerberg J., Parsegian V. A., Rand R. P., Fuller N. Membrane dipole potentials, hydration forces, and the ordering of water at membrane surfaces // Biophys. J. 1992. V. 61(5). P. 1213-1223.

32. Geppert M., Goda Y., Hammer R. E„ Li C., Rosahi T. W., Stevens C. F., Sudhof T. C. Synaptotagmin I: a major Ca2+ sensor for transmitter release at a central synapse // Cell. 1994. V. 79(4). P. 717-727.

33. Gibbons D. L., Vaney M.C., Roussel A., Vigouroux A., Reilly B.. Lepault J., Kielia M., Rey F. A. Conformational change and protein-protein interactions of the fusion protein of Semliki Forest virus // Nature. 2004. V. 427(6972). P. 320-325.

34. Glaser R.W., Leikin S.L., Chernomordik L.V., Pastushenko V.F., Soldrko A.I. Reversible electrical breakdown of lipid bilayers: formation and evolution of pores // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 940. P. 275-287.

35. Graham T. R., Kozlov M. M. Interplay of proteins and lipids in generating membrane curvature //Curr. Opin. Cell. Biol. 2010. V. 22(4). P. 430-436.

36. Gruenke J. A., Armstrong R. T., Newcomb W. W., Brown J. C., White J. M. New insights into the spring-loaded conformational change of influenza virus hemagglutinin // J. Virol. 2002. V. 76(9). P. 4456-4466.

37. Hamm M. and Kozlov M. M. Tilt model of inverted amphiphilic mesophases // Eur. Phys. J. B. 1998. V. 6. P. 519-528.

38. Hamm M. and Kozlov M. M. Elastic energy of tilt and bending of fluid membranes // Eur. Phys. J. E. 2000. V. 3. P. 323-335.

39. Han X., Bushweller J. H., Cafiso D. S., Tamm L. K. membrane structure and fusion-triggering conformational change of the fusion domain from influenza hemagglutinin // Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8(8). P. 715-720.

40. Harris A., Cardone G., Winkler D. C., Heymann J. B., Brecher M., White J. M., Steven A. C. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103(50). P. 19123-19127.

41. Harrison S. C. Viral membrane fusion // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. V. 15(7). P. 690-698.

42. Harroun T. A., Heller W. T., Weiss T. M., Yang L., Huang H. W. Theoretical analysis of hydrophobic matching and membrane-mediated interactions in lipid bilayers containing gramicidin//Biophys. J. 1999. V. 76(6). P. 3176-3185.

43. Helfrich W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments // Z. Naturforsch. 1973. V. 28c. P. 693-703.

44. Helm C. A., Israelachvili J. N., McGuiggan P. M. Molecular mechanisms and forces involved in the adhesion and fusion of amphiphilic bilayers // Science. 1989. V. 246(4932). P. 919-922.

45. Herrick D. Z., Sterbling S., Rasch K. A., Hinderliter A., Cafiso D. S. Position of synaptotagmin I at the membrane interface: cooperative interactions of tandem C2 domains // Biochemistry. 2006. V. 45(32). P. 9668-9674.

46. Hui S. W., Stewart T. P., Boni L. T., Yeagle P. L. Membrane fusion through point defects in bilayers// Science. 1981. V. 212(4497). P. 921-923.

47. Israelachvili J. N., Mitchell D. J., Ninham B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 470(2). P. 185-201.

48. Israelachvili J. N. and Pashley R. M. Measurement of the hydrophobic interaction between two hydrophobic surfaces in aqueous electrolyte solutions //' J. Colloid Inter!" Sci. 1984. V. 98. P. 500-514.

49. Jahn R. and Fasshauer D. molecular machines governing exocvtosis of synaptic vesicles // Nature. 2012. V. 490(7419). P. 201-207.

50. Jahn R., Scheller R. H. SNAREs — engines for membrane fusion /7 Nat. Rev. Mo!. Cell. Biol. 2006. V. 7(9), P. 631-643.

51. Kanaseki T., Kawasaki K., Marata M., Ikeuchi Y.„ Ohnishi S. Structural features of membrane fusion between influenza virus and liposome as revealed by quick-freezing electron microscopy//J. Cell. Biol. 1997. V. 137(5). P. 1041-1056.

52. Kasson P. M., Kelley N. W., Singhal N., Vrljic M., Brunger A. 1., l'ande V. S. Ensemble molecular dynamics yields submillisecond kinetics and intermediates of membrane fusion // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2006. V. 103(32). P. 11916-11921.

53. Kasson P. M., Pande V. S. Control of membrane fusion mechanism by lipid composition: predictions from ensemble molecular dynamics // PLoS Comput. Biol. 2007. V. 3(11). P. e220.

54. Kim K. S., Neu J., Oster G. Curvature-mediated interactions between membrane proteins // Biophys. J. 1998. V. 75(5). P. 2274-2291.

55. Kozlov M. M. and Chernomordik L. V. A mechanism of protein-mediated fusion: coupling between refolding of the influenza hemagglutinin and lipid rearrangements // Biophys. J. 1998. V. 75(3). P. 1384-1396.

56. Kozlov M. M., Leikin S., Rand R. P. Bending, Hydration and Interstitial Energies Quantitatively Account for the Hexagonal-Lamellar-Hexagonal Reentrant Phase-Transition in Dioleoylphosphatidylethanolamine //Biophys. J. 1994. V. 67. P. 1603-161 i.

57. Kozlov M. M. and Markin V. S. Possible mechanism of membrane fusion // Bioflzika. 1983. V. 28(2). P. 242-247.

58. Kozlovskv Y. and Kozlov M. M. Stalk model of membrane fusion: Solution of energy crisis // Biophys. J. 2002. V. 82. P. 882-895.

59. Kroemer G., Galluzzi L., Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death // Physiol. Rev. 2007. V. 87(1). P. 99-163.

60. Kuzmin P. I., Akinzov S. A., Chizmadzhev Y. A., Zimmerberg .T., Cohen f. S. Line tension and interaction energies of membrane rafts calculated from lipid splay and tilt // Biophys. J. 2005. V. 88(2). P. 1120-1133.

61. Kuzmin P. I., Zimmerberg J., Chizmadzhev Y. A.. Cohen F. S A quantitative model for membrane fusion based on low-energy intermediates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98(13), P. 7235-7240.

62. Lakadamyali M., Rust M. }., Babcock H. P., Ziiuang X. Visualizing infection of individual influenza viruses // P/oc. Nad. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100(16). I'. 92880-9285.

63. Lakadamyali M., Rust M. J., Zhuanq X. Bndocytosu of influenza viruses // Microbes Infect. 2004. V. 6(10). P. 929-936.

64. Lee J. Y., Schick M. Calculation of free energy barriers to the fusion of small vesicles // Biophys. J. 2008. V. 94(5). P. 1699-1706.

65. Lee K. K. Architecture of a nascent viral fusion pore // EMBO J. 2010. V. 29(7). P. 1299-1311.

66. Leikin S. L., Kozlov M. M., Chernomordik L. V., Chizmadzhev Y. A. Membrane fusion: overcoming of the hydration barrier and local restructuring H J. Theor. Bioi. 1987. V. 129(4). V. 411-425.

67. Leikin S., Kozlov M. M., Fuller N. L., Rand R. P. Measured effects of diacylglycerol on structural and elastic properties of phospholipid membranes // Biophys. J. 1996. V. 71. P. 26232632.

68. Lipowsky R. Generic Interactions of Flexible Membranes. Elsevier B. V. 2004. P. 521.

69. MacKintosh F. C., Lubensky T. C. Orientational Order, Topology and Vesicle Shapes // Phys. Rev. Lett. 1991. V. 67. P. ] 169-1172.

70. Markin V. S., Albanesi J. P. Membrane fusion: stalk model revisited // Biophys. J. 2002. V. 82(2). P. 693-712.

71. Markin V. S., Kozlov M. M., Borovjagin V. L. On the theory of membrane fusion. The stalk mechanism// Gen. Physiol. Biophys. 1984. V. 3(5), P. 361-377.

72. Markvoort A. J., Marrink S. J. Lipid acrobatics in the membrane arena // Curr. Top. Membr. 2011. V. 68. P. 259-294.

73. Marrink S. J., de Vries A. H., Tieleman D. P. Lipids on the move: simulations of membrane pores, domains, stalks and curves // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1788(1). P. 149-168.

74. Martens S., Kozlov M. M., McMahon H. T. How synaptotagmin promotes membrane fusion // Science. 2007. V. 316(5828), P. 1205-1208.

75. Martens S. and McMahon II. T. Mechanisms of membrane fasion:disparate players and common principles // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2008. V. 9(7). P. 543-556.

76. May S. and Ben-Shaul A. Molecular theory of lipic-protein interaction and the L-alpha-H-II transition//Biophys. J. 1999. V. 76. P. 751-767.

77. McMahon H. T., Kozlov M. M., Martens S. Membrane curvature in synaptic vesicle fusion and beyond// Cell. 2010. V. 140(5). P. 601-605.

78. Melikov K.C., Frolov V.A., Shcherbakov A.., Sarnsonov A.V., Chhmaclzhev Y.A., Chernomordik L.V. Voltage-induced ronconductive pre-pores and metastable single pores in unmodified planar lipid bilayer // Biophy«, J. 2001. V. 80. P. 1329-1836.

79. Min D., Kim K., Hyeon C., Cho Y. H., Shin Y. K.. Yocn T. Y. Mechanical unzipping and rezipping of a single SNARE complex reveaJs hysteresis as a force-generj.tin^ mechanism // Nat. Commun. 2013. V. 4. P. 1705-171«.

80. Muller M., Katsov K., Scincl; M. A new mecnar.,sr/; of mcdei membrane fusion determined from Monte Carlo simulation // Bioph>s. J. 2003. V. 85(3). P. 1611-1623.

81. Niggemann G., Kummrow M.. Helfrich W. The bending rigidity of phosphatidylcholine bilayers - dependences on experimental method, sample cell sealing and temperature // J. de Physique II. 1995. V. 5. P. 413-425.

82. Norizoe Y., Daoulas K. Ch., Muller M. Measuring excess free energies of self-assembled membrane structures // Faraday Discuss. 2010. V. 144. P. 369-391.

83. Olbrich K., Rawicz W., Needham D., Evans E. Water permeability and mechanical strength of polyunsaturaied lipid bilayers !! Biophys. J. 2000. V. 79. P. 321-327.

84. Pinto da Silva P. and Nogueira M. L. Membrane fusion during secretion. A hypothesis baed on electron microscope observation of Phytophthora Palmivora zoospores during encystment // J. Cell. Biol. 1977. V. 73(1), P. 161-181.

85. Potter H. Molecular genetic applications of electroporation. Electroporation and electrofusion in cell biology. Edited by Neumann E., Sowers A.E., Jordan C.A. New York and London: Plenum Press, 1989. P. 331-342.

86. Rand R. P. Interacting phospholipid bilayers: measured forces and induced structural changes // Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1981. V. 10. P. 277-314.

87. Rand R. P., Parsegian V. A. Mimcry and mechanism in phospholipid models of membrane fusion // Annu. Rev. Physiol. 1986. V. 48, P. 201-212.

88. Rand R. P., Parsegian V. A. Hydration forces between phospholipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 988. P. 351-376.

89. Rawicz W.. Olbrich K. C., Mcintosh T., Needham D., Evans E. Effect of chain length and unsaturation on elasticity of lipid bilayers // Biophys. J. 2000. V. 79 P. 328-339.

90. Reynwar B. J., Illya G., Harmandaris V. A., Muller M. M., Kiemer K., ,Deserno M. Aggregation and \esiculation of membrane protein« by curvaiure ■ radiated inie;actions // Nature. 2007. V. 447(7143 ). P 461-464.

91. Richard J. P., Leikma £., Langen R., Henne W. M.. Popova M„ iiaiJu T„ McManon H. T., Koziov M. M., Chemomordik L V. Intracellular ci'rvature-generai:ing proteins in cell-to-cell fusion//Biochem. j. 20ii. V. 440(2;. P. 185-193.

92. Roxhman J. E. Intracellular merrorane fusion /7 Auv. Second Messenger Pho^phcprotcin Res. 1994. V. 29. P. 81-96.

93. Siegel D. P. Energeiies of intermediates in membrane fusion: comparison of stalk and inverted micellar intermediate mechanisms // Biophys. J. 1993. V. 65(5). P. 2124-2140.

94. Siegel D. P. The Gaussian curvature elastic energy of intermediate^ ir membrane fusion // Biophys. J. 2008. v. 95(11). P. 5200-5215.

95. Siegel D. P, Koziov M. M. The gaussian curvature elastic modrJu" of N-noriomethylated dioleoylphosphatidylethanomme: rele\'ance to membrane fusion and lipid phase behavior // Biophys. J. 2004. V. 87(1). P. 366-374

96. Skehel J. J., Wiley D. C. Receptor binding and membrane fusion ;n \irui entry me influenza hemagglutinin // Annu. Rev. Biochem. 2000. V. 69. P. 531-569.

97. Skehel J. J., Wiley D. C. Influenza hemagglutinin // Vaccine. 2002. t'. 20. P. S51-S54.

98. Smeijers A. F., Markvoort A. J., Pieterse K.. Hilbers P. A. A detailed look at vesicle fusion // J. Phys. Chem. B. 2006. V. 110(26), P. 13212-13219.

99. Sollner T. Intracellular and viral membrane fusion: a uniting mechanism // Curr. Opin. Cell. Biol. 2004. V. 16(4). P. 429-435.

100. Sorensen J. B. Formation, stabilization and fusion of the readily releasable pool of secretory vesicles // Pflugers Arch. 2004. V. 448(4). P. 347-362.

101. Sudhof T. C. The synaptic vesicle cycle // Annu. Rev. Neurosci. 2(KH. V. 27. P. 509-547.

102. Sudhof T. C., Rothman J. E. Membrane fusion: grappliing with SNARE and SM proteins // Science. 2009. V. 323(5913). P. 474-477.

103. Sutton R. B., Fasshauer D., Jahn R., Brunger A. T. Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 A resolution // Nature. 1998. V. 395(6700). P. 347-353.

104. Weber T., Zemelman Q. V., McNew J A., Westennann B , Grrach1 M., Pgr)ati F., So'lncr T. H., Rothman J. E. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion // Cell. 1998. V. 92(6). P. 759-772.

105. Weikl T. R., Kozlov M. M., He't'rich W. Interaction of conical membrane inclusions: Effect of lateral tension//Phys. Rev. E. 1998. V. 57(6). P. 6988-6995.

106. Weissenhorn \V„ Hmz A., GauJm Y. Virus membrane fusion // F.'JBb L ett. 2007. V. 581(11). P. 2150-2155.

107. Yang L., Huang H. W. Observation of a membrane fusion intermediate structure //Science. 2002. V. 297. P. 1877-1879.

108. Zimrnerberg J., Akimcv S. A., Frolov V. Syraptotagmiii: fusogenic role for calcium sensor? // Nat. Struct. Mol. Biol. 2006. V. 13(4). P. 301-303.

109. Zhelev D.V.. iieedharn D. Pension-stabilized pores in giant vesicles: determination of size and pore line tension // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1147. P. 89-104.