Технология выделения флавоноидов винограда Vitis vinifera сорта "Изабелла" для косметики и изучение их свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Птицын, Андрей Владимирович

• Птицын, Андрей Владимирович
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Птицын, Андрей Владимирович

1. Список используемых сокращений.

2. Введение.

3. Обзор литературы: Флавоноиды красного винограда: нахождение в природных источниках сырья, биологические свойства, анализ, выделение, очистка.

3.1. Структура флавоноидов.

3.2. Полифенолы, содержащиеся в ягоде винограда.

3.2.1. Фенолокислоты.

3.2.2. Флавонолы.

3.2.3. Антоцианы.

3.2.4. Катехины, лейкоантоцианидины, проантоцианидины.

3.3. Содержание фенольных соединений в винограде.

3.3.1. Содержание катехинов и танинов.

3.3.2. Содержание лейкоантоцианинов.

3.3.3. Содержание антоцианов.

3.3.4. Содержание флавонолов.

3.4. Окислительный стресс.

3.4.1. Классификация АФК.

3.4.2. Функции радикалов кислорода.

3.4.2.1. Супероксид.

3.4.2.2. Окись азота.

3.4.2.3. Действие радикала коэнзим Q.

3.4.3. Методы изучения свободных радикалов.

3.4.3.1. Биохимические методы.

3.4.3.2. Биофизические методы.

3.4.4. ПОЛ.

3.4.5. Биологические последствия ПОЛ.

3.5. Свойства полифенолов красного винограда, определяющие их. перспективность для косметики.

3.5.1. Ингибирование СРО полифенолами красного винограда.

3.5.2. Определение антиоксидантной активности отдельных компонентов экстракта винограда. Индекс активности антиоксиданта.

3.5.3. Антиоксидантные свойства полифенолов винограда in vivo.

3.5.4. Зависимость антиоксидантной активности от структуры полифенолов.

3.5.5. Зависимость антирадикальной активности от структуры полифенолов.

3.5.5.1. Использование метода (^БАИ при анализе антирадиальной активности флавоноидов.

3.5.6. Влияние олигомерного проантоцианидина на волокна коллагена.

3.5.7. Влияние олигомерного проантоцианидина на коллаген и эластин.

3.5.8. Солнцезащитное действие.

3.5.9. Противовоспалительное действие.

3.5.10. Р - Витаминная активность.

3.5.11. Антимикробные свойства.

3.5.12. Противопухолевая активность.

3.5.13. Антимутагенная активность.!.

3.6. Методы выделения и очистки полифенолов винограда.

3.6.1. Предварительная очистка субстрата.

3.6.2. Экстракция.

3.6.3. Хроматографическая очистка.

3.6.4. Разделение в двухфазных системах.

3.7. Стабильность антоцианов.

3.7.1. Термическая устойчивость антоцианов.

3.7.2. рН-устойчивость полифенолов.

3.8. Определение полифенолов винограда.

3.8.1 Определение суммы полифенолов.

3.8.2. Определение антоцианов.

3.8.3. Определение катехинов.

3.8.4. Определение флавонолов.

3.8.5. Определение лейкоантоцианидинов.

3.8.6. Методы качественного определения полифенолов винограда.

3.9. Применение флавоноидов в косметике.

3.9.1. Синергизм антиоксидантов.

4. Обсуждение результатов.

4.1. Определение полифенолов.

4.2. Идентификация веществ.

4.2.1. Определение полифенолов.

4.3. Технология получения антоцианов из виноградного жмыха.

4.3.1. Подготовка сырья.

3.3.2. Подбор экстрагента.

4.3.3. Поиск оптимального температурного режима.

4.3.4. Характеристика "Комплекса биофлавоноидов красного винограда"

4.3.5. Дробная экстракция виноградного жмыха.

4.3.6. Очистка антоцианов с помощью сорбции на тальке.

4.3.7. Выделение танинов красного винограда.

4.3.8. Колоночная хроматография полифенолов на силикагеле.

4.3.9. Осаждение кофейного эфира М-З-г.

4.3.10. Технологическая схема выделения флавоноидов.

4.4. Свойства полифенолов винограда.

4.4.1. Определение антиоксидантной активности регистрацией МА.

4.4.2. Определение антирадикальной активности по скорости восстановления ДФПГ .;.

4.4.3. Связь структуры и антирадикальной активности.

4.4.4. Определение гидрофобности флавоноидов.

4.4.5. Способность к ингибированию 8асЬаготусе$ сегЫ$1ае.

4.4.6. Защита кожи от УФ-излучения.

4.4.7. Влияние экстракта красного винограда на набухание эпидермиса.

4.4.8. Влияние экстракта красного винограда на спонтанную сократительную активность кровеносных сосудов кожи и связь ее с антиоксидантной активностью

4.4.9. Устойчивость антоцианов к окислению в косметических композициях.

4.4.10. Устойчивость флавоноидов красного винограда при различных рН.

5. Экспериментальная часть.

5.1. Материалы и методы.

5.2. Выделение полифенолов винограда.

5.2.1. Подготовка сырья.

5.2.2. Экстракция.

5.2.2.1. Подбор растворителя.

5.2.2.2. Определение оптимального температурного режима экстракции.

5.2.2.3. Дробная экстракция.

5.3. Применение хроматографических методов.

5.3.1. Очистка антоцианов с помощью флэш-хроматографии на тальке.

5.3.2. Сорбция антоцианов на тальке.

5.3.3. Хроматография антоцианов на силикагеле.

5.3.4. Определение растворимости антоцианов в хроматографических системах.

5.3.5. Разделение антоцианов красного винограда. Разделение антоцианов красного винограда.

5.3.6.Выделение 3',4'-дигидроксифенил 3,4-дигидро-2Н-хромен-3,5,7-триола.

5.3.7. Выделение 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона.

5.3.8. Выделение 4',3,5,7-тетрагидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорида.

5.4. Очистка веществ осаждением.

5.4.1. Осаждение 3-0-Р-0-глюкозилокси-(б-0-(3,4-дигидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3 ',5 '-диметоксифлавилиум хлорида.

5.4.2. Получение 1,3,7-триметилксантана.

5.5. Определение антоцианов методом ТСХ в сочетании с оптической денситометрией

5.6. Определение редуцирующих веществ по Бренстеду.

5.7. Определение нелетучих веществ.

5.8. Определение термической устойчивости антоцианов в кремах.

5.9. Определение коэффициента распределения флавоноидов в системе октанол-вода

5.10. Изучение свойств полученных веществ.

5.10.1. Определение ПОЛ.

5.10.2. Определение антирадикальной активности по отношению к ДФПГ.

5.10.3. Способность антоцианов к ингибированию Sacharomyces cerevisiae.

5.10.4. Определение солнцезащитных свойств фракции антоцианов.

5.10.5. Исследование явлений резонанса кожи при увлажнении и набухании эпидермиса.

5.10.6. Исследование вазомоторной активности кожи.

5.11. Статистическая обработка результатов.

6. Выводы.

7. Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Технология выделения флавоноидов винограда Vitis vinifera сорта "Изабелла" для косметики и изучение их свойств»

В настоящее время доказано разрушительное действие свободных радикалов как на организм в целом, так и на кожу в частности, поэтому ведется активный поиск и исследование веществ с антиоксидантным действием, богатейшим источником которых оказались растения. Флавоноиды - вторичные метаболиты растений представляют собой широкий спектр ароматических соединений, подразделяющихся на несколько групп структурно-сходных полифенолов и насчитывающих более 5000 индивидуальных веществ [1, 2]. Особый интерес представляют полифенолы красного винограда (рис. 1),. обладающие наиболее высокой биологической активностью и подразделяющиеся по основным группам:

1. фенолокислоты (производные гидроксибензойной и гидроксикоричной кислот)

2. флавонолы (кверцетин)

3. катехины (в том числе и их полимеры - проантоцианидины, танины)

4. лейкоантоцианидины

5. антоцианы (М-З-г) он он он он п-Гидроксибензойная кислота Кофейная кислота Лейкоцианидин осн, он

Мальв идин-3-глкжозид

Катехин он

Кверцетин Проантоцианидин В1

Рис.1. Структурные формулы наиболее распространенных флавоноидов винограда

Флавоноиды сочетают в себе не только антиоксидантные, бактерицидные и солнцезащитные свойства [3], но и обладают рядом других полезных качеств: известна высокая капилляропротетекторная (Р-витаминная активность) флавоноидов винограда [4]. Кроме того, в последнее время изучают противоопухолевые [5, 6], противовоспалительные и антимутагенные свойства. Известно о способности флавоноидов винограда укреплять волокна коллагена и эластина [6, 7], защищать от солнечного УФ [2, 7,9]. Имеются данные и об использовании флавоноидов для лечения лучевой болезни [10]. Данные свойства флавоноидов красного винограда, по нашему мнению, имеют большое значение для косметики.

Основная поставленная перед нами задача состояла в выделении наиболее биологически активных индивидуальных флавоноидов или их смесей. Промышленное производство концентратов содержащих флавоноиды требовало отработки технологичных и дешевых методов их получения.

Использование, полученных нами продуктов в антивозрастной косметике выявило необходимость определения антиоксидантной активности флавоноидов в модельной системе перекисного окисления мультиламеллярных везикул фосфолипидов, моделирующих биологические мембраны и антирадикальной активности флавоноидов по способности восстанавливать стабильный радикал - ДФПГ.

Перед введением флавоноидов в косметические композиции необходимо было провести экспериментальное исследование таких физико-химических свойств флавоноидов как: распределение в системе октанол-вода и устойчивость их во времени и, в том числе, при различных рН.

Существует мнение, что для косметики более перспективным является использование очищенных флавоноидов, так как цельные растительные экстракты по уровню физиологической активности уступают препаратам очищенных флавоноидов и не отвечают требованиям, предъявляемым к косметическим препаратам [2]. Поэтому при разработке наших продуктов мы сравнивали антиоксидантную активность суммы выделенных флавоноидов с активностью индивидуальных веществ, тем более, что из литературных данных [8] известно о синергизме антиоксидантов, в частности, между витаминами С, Е и проантоцианидинами.

Важной, и наиболее наглядно демонстрирующей практическую значимость, частью работы является изучение влияния антиоксидантов на тонус кожи, микроциркуляцию крови в капиллярах и на кожу пораженную УФ. Для этого мы оценивали влияние флавоноидов, обладающих антиоксидантными свойствами, на набухание эпидермиса, спонтанную сократительную активность гладкой мускулатуры кожи и на развитие эритемы после облучения УФ.

3. Обзор литературы: Флавоноиды красного винограда: нахождение в природных источниках сырья, биологические свойства, анализ, выделение, очистка

3.1. Структура флавоноидов

Флавоноидами называется группа природных биологически активных соединений - производных бензо-у-пирона, в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С6-СЗ-С6 углеродных единиц. Это гетероциклические соединения с атомом кислорода в кольце (рис 2.).

В | V у-пирон беюо - у- пирон флавон

Рис.2. Структурные единицы, входящие в состав флавоноидов

Под общим названием флавоноидов объединены различные соединения, генетически связанные друг с другом, но обладающие различным фармакологическим действием [2]. Название произошло от лат. /1а\тз - желтый, т.к. первые флавоноиды имели желтую окраску.

3.2. Полифенолы, содержащиеся в ягоде винограда

Виноград - вид пищевых плодов семейства УНасеае. Основная, в настоящее время используемая, разновидность винограда - УШз \inifera относится к европейским сортам и составляет до 95% производства винограда [1]. Виноград - богатейший источник флавоноидов, содержащий множество полифенольных соединений. Немецкие ученые [11], анализировавшие красное вино сорта Рислинг с помощью ВЭЖХ обнаружили в нем 73 вещества, относящиеся к фенольным соединениям. К настоящему времени было идентифицировано более 500 полифенолов содержащихся в винограде, причем около 160 из них относятся к сложным эфирам. Состав и количество полифенольных соединений зависит от разновидности виноградников, от погоды, типа почвы, и методов культивирования [12].

3.2.1. Фенолокислоты

В красном винограде содержатся два типа фенолокислот (рис. 3): производные гидроксибензойной и гидроксикоричной кислот. К производным гидроксибензойной кислоты относятся: присутствующая в незначительных количествах салициловая кислота, несколько более распространенные: галловая, протокахетовая и п-гидроксибензойная кислоты. Также в винограде были найдены: ванилиновая, сиреневая, гентизиновая и о-пирокахетовая кислоты. Из гидроксикоричных кислот в винограде наиболее распространены: п-кумариновая, синаповая, кофейная и феруловая кислоты. Красный виноград значительно более богат фенолокислотами чем белый. Большинство фенолокислот содержатся в виде эфиров, которые распадаются при гидролизе.

СООН

Название Я »1 п- Гидроксибензойная Н Н Название Я

Протокахетовая ОН Н Салициловая Н Н

Ванилиновая ОСН3 Н о-Пирокахетовая ОН Н

Галловая ОН ОН Гентизиновая Н ОН

Сиреневая ОСН3 ОСН3

Название п - Кумаровая Кофейная

Я Н ОН

СН=СНСООН 1 Н н

Название

Феруловая

Синаповая

И.

ОСН3 ОСН3 Н

ОСН3

Рис. 3. Фенолокислоты красного винограда 3.2.2. Флавонолы

Флавоны (рис. 2) с гидроксильной группой в 3 положении (3-гидроксифлавоны) обычно рассматривают как отдельную группу и называют флавонолами. К этой группе принадлежит кверцетин - 3,3',4',5,7-пентагидроксифлавон (рис. 4). я

Название Я

Кемпферол Н Н

Кверцетин ОН н

Изорамнетин ОСН3 н

Мирицетин ОН он

Рис. 4. Флавонолы красного винограда

Кверцетин-З-глюкозид был обнаружен в белом винограде, позднее были найдены кемпферол, мирицетин и их гликозиды. Основным флавонолом виноградной грозди является кверцетин-3-глюкозид его содержание составляет до 56-58% от общей суммы флавонолов. Флавонолы находятся в красном и белом винограде примерно в равных количествах [13]. 3.2.3. Антоцианы

Цвет ягоды красного винограда также как и многих ягод и цветущих растений обеспечивается антоцианами (рис. 5). Антоцианы - это растворимые в воде гликозиды, обычно Б-глюкозиды [2, 13] полигидроксифлавилиумхлорида и их эфиры с производными бензойных и гидроксикоричных кислот. Наиболее распространены сложные эфиры антоцианов ацилированные кумаровой, феруловой, кофейной и уксусной кислотами. Находятся антоцианы в винограде в виде сложных эфиров кумаровой, кофейной или уксусной кислот [13]. По сравнению с флавонолами, система из 8 сопряженных двойных связей флавилиумхлорида приводит к. образованию 8 возможных резонансных структур, что и объясняет многообразие цветовых возможностей этих соединений. Цвет антоцианов зависит не только от характера заместителей, значения рН но также и от образования комплексных соединений с ионами металлов, в том числе и металлов переменной валентности: Са2+, М§2+, Ре2+, Си2+, Мп2+ [2]. Антоцианы сосредоточены в кожице виноградной ягоды, и красный виноград значительно более богат антоцианами, чем белый [13].

Название Я

Пеларгонидин Н он

Цианидин ОН н

Пеонидин ОСН3 н

Дельфинидин ОН он

Петунидин он ОСНз

Мальвидин ОСНз ОСНз

Рис. 5. Антоцианы красного винограда

3.2.4. Катехины, лейкоантоцианидины, проантоцианидины

Катехины (рис. 6) - вещества с двумя ассиметрическими атомами углерода: Сг и Сз, поэтому для каждого катехина существует четыре изомера и два рацемата.

ОН

ОН

Эпикатехин (-3-0-) галла!

Рис. 6. Катехины красного винограда

Так, для простейшего катехина известны следующие изомеры: (-)-катехин, (+)-катехин, (+)-эпикатехин, (-)-эпикатехин, а также рацематы: (±)-катехин и (±)-эпикатехин [13].

В винограде присутствуют значительно более сложные вещества на основе катехинов. Продукты полимеризации катехинов и лейкоантоцианидинов принято называть танинами, которые относятся к дубильным веществам. Олигомеры катехинов, лейкоантоцианидинов и галловой кислоты - называются проантоцианидинами (рис. 7). Наиболее богата проантоцианидинами и танинами виноградная косточка [13].

Американские ученые опредлили состав полифенолов виноградной косточки как смесь (+)- катехина; (-)-эпикатехина и (-)- эпигалокатехин галлата [14]. В косточке также в значительных количествах содержится димер, состоящий из двух молекул флаван-3-ола, который часто называют проантоцианидином, вследствии того, что эти димеры в противоположность мономерным флаван-3-ол молекулам, распадаются при кислотном гидролизе до цианидина [15, 16]. Исследователям, изучавшим проантоцианидины, [17] удалось выделить из красных вин и охарактеризовать пять различных димеров (В1, В2, ВЗ, В4, В5) и два стереоизомерных тримера. Эти димеры и тримеры представляют собой конденсированные катехин и эпикатехин.

Позднее ВЭЖХ послужила надежным инструментом для разделения и изучения состава проантоцианидинов [18]. Группой ученых [19] было выделено из виноградной косточки и идентифицировано с помощью ВЭЖХ 11 мономеров, димеров и тримеров 17 различных типов сорта УШб уШ/ега (рис. 7). Хотя мономерные флаван-3-ол молекулы всегда присутствуют в винограде, превалируют в нем димеры и тримеры. Степень полимеризации может достигать 16 единиц [19].

ОН

Проантоцианидин В1

Проантоцианидин С1

Рис. 7. Проантоцианидины красного винограда

Лейкоантоцианами или лейкоантоцианидинами (рис. 8) называются мономерные флаван-3,4-диолы, которые содержатся в винограде в небольших количествах и также конденсируются в танины. Лейкоантоцианидины, как мономеры так и полимеры, при нагревании с кислотой в присутствии кислорода воздуха легко окисляются до соответствующих им антоцианов [20].

И.

ОН ОН

Название Я

Лейкопеларгонин н н

Лейкоцианидин он н

Лейкодельфинидин он он

Рис. 8. Лейкоантоцианидины красного винограда

3.3. Содержание фенольных соединений в винограде

Фенольные вещества является третьими наиболее распространеными составляющими среди всех веществ винограда после углеводов и органических кислот. Флавоноиды в значительных количествах содержатся во всех органах виноградной лозы: ягоде (кожица, косточка, сок), а также в стебле и гребне.

Общие фенольные вещества виноградной ягоды, подлежащие экстракции, распределяются в следующем соотношении: 10% в мякоти, 60 - 70% - в семенах, 28 -35% в кожице. В семенах содержание фенольных веществ варьирует от 5 до 8% по массе. Однако, наибольшее количество фенольных веществ винограда сорта Каберне Совиньон содержится в кожице [21].

Содержание и состав фенольных веществ в винограде красных сортов отличается от их содержания в белых сортах. Американскими учеными [22] показано, что фенольные соединения белого винограда представлены преимущественно эфирами кумаровой кислоты, катехинами и проантоцианидинами, в том числе катехингаллатом и катехинкатехингаллатом. Среди фенольных веществ винограда красных сортов превалируют гидроксибензойные и гидроксикоричные кислоты, проантоцианидины, антоцианы и гликозиды флавонолов.

На рис. 9 показано распределение полифенолов в различных органах виноградной ягоды.

Косточки содержат: 83% танинов или проантоцианидинов (олигомеров катехинов и лейкоцианидинов различного размера)

Мякоть

Фенолокислоты. галловая, кофейная, кумаровая, феруловая кислоты

Кожица Антоцианидины: мальвидин, цианидин дельфинидин, пеларгонидин

Флавонолы: кверцетин, мирицетин, кэмпферол

Флаван-З-олы: катехин, эпикатехин зпикатехингаллат

Рис. 9. Распределение флавоноидов в виноградной ягоде 3.3.1. Содержание катехинов и танинов

Содержание катехинов в гребнях от 0,7 до 3,5%, в кожице от 0,3 до 4,3%, в семенах от 2 до 3% [23]. Сравнение 15 винных сортов красного винограда, одного и того же уровня зрелости позволило выяснить, что общее содержание катехинов и проантоцианидинов составляет от 414 до 2593 мг/кг винограда [24]. Из этих сортов винограда сорта Винсент и Пино Ноа характеризуются максимальным содержанием катехинов и проантоцианидинов в семенах и в ягодах в целом.

Данные таблицы 1 иллюстрируют состав катехинов (катехин и эпикатехин) и проантоцианидинов (В1, В2, ВЗ, В4) в различных сортах винограда вида УШ.ч \inifera, произрастающем в Ниагарском регионе Онтарио, Канада [18].

Таблица 1. Состав катехинов и их олигомеров в семенах различных сортов винограда УШв уМ/ега

Содержание, мг/100 г

Сорт УШ/ега Цвет Мономеры Димеры Димеры галлатов Тримеры

Кабернэ (Франция) Красный 232 169 43 26

Кабернэ (США) Красный 125 95 11 32

Кабернэ Савиньон Красный 228 375 108 67

Мерло Красный 143 97 37 23

Пино Нойр Красный 437 235 41 84

Шардонэ Белый 141 126 17 9

Рислинг Белый 49 54 4 7

Бако нойр Красный 204 292 54 53

Винсент Красный 439 238 54 28

Бригтс 12 Красный 75 40 14 9

В 65115 Красный 119 30 7 18

Сейвал Белый 44 16 -

Конкорд Красный 125 98 13 10

Элвира Белый 95 45 7 5

Ниагара Белый 155 49 10 17

Согласно приведенным данным большая часть фенольных веществ приходится на мономерные частицы.

Извлечение суммы танина косточек и гребней винограда, проведенное Валуйко с сотрудниками [13], показало, что препараты семян и гребней идентичны по набору катехинов (табл. 2). В танине косточек преобладает (+)-катехин и (-)-эпикатехин, в танине гребней (-)-эпигаллокатехин и (+)-катехин.

Таблица 2. Состав мономерных полифенолов по данным группы Валуйко [13]

Катехины Содержание, %

В препаратах танина косточек В препаратах танина гребней

-)-Эпигаллокатехин 10,36 18,07

- Галлокатехин 10,13 8,01

-)-Эпикатехин 13,32 4,30

-Гатехин 11,69 12,89

-)-Эпикатехингаллат 4,51 6,77

Сумма 50,02 50,08

3.3.2. Содержание лейкоантоцианинов

Наиболее распространены лейкоантоцианов в семенах, затем в гребнях и кожице, меньше всего их в мякоти. Вследствие склонности к полимеризации лейкоантоцианидины содержатся в винограде, в основном, в полимерной форме. Количество конденсированных лейкоантоцианидинов может достигать в красном винограде 1500-2000 мг/кг [13].

3.3.3. Содержание антоцианов

Максимального содержание антоцианов винограда УШя \inifera сорта Каберне Совиньон и Саперави достигает к концу сентября - на это время приходится промышленный сбор винограда (табл. 3). Затем наблюдалось некоторое уменьшение количества антоцианов из-за начинающегося распада пигментов [13].

Таблица 3. Содержание антоцианов в красном винограде в зависимости от времени сбора

Сорт винограда Содержание красящих веществ, мг/г по данным:

6 сентября 1965 27 сентября 1965 24 августа 1966 23 сентября 1966

Каберне Совиньон. 583 1500 180 951

Саперави 1479 2018 497 1131

Основным пигментом винограда европейских сортов является М-З-г и его производные, составляющие более 50% общего количества антоцианов, в некоторых сортах его доля достигает 90%. Дурмишидзе с сотрудниками [25] показал, что виноград европейских сортов УШз \inifera содержит, в основном, моногликозиды мальвидина -70,6%, дельфинидина - 11%, петунидина - 11%, пеонидина - 7,4% от общего количества антоцианов. 3.3.4. Содержание флавонолов

Количественный анализ показал, что наиболее богаты флавонолами гребни: общее содержание флавонолов в них почти в 2 раза больше чем в кожице (табл. 4), соответственно 0,193 и 0,103%. Как в гребнях, так и в кожице большая часть (примерно 98%) флавонолов представлена гликозидами.

Таблица 4. Содержание флавонолов в красном винограде

Флавонолы Саперави Ркацители гребни кожица гребни кожица

Содержание флавонолов, на сухую массу, %

Кверцетин 0,005 0,009 0,004 0,019

Мирицетин - 0,008 -

Сумма агликонов 0,005 0,017 0,004 0,019

Кверцетрин 0,075 0,020 0,076 0,012

Кверцетин-3-глюкозид 0,104 0,032 0,113 0,072

Мирицетин-3-глюкозид - 0,085 -

Сумма глюкозидов 0,179 0,137 0,189 0,084

Сумма флавонолов 0,184 0,154 0,193 0,103

3.4. Окислительный стресс 3.4.1. Классификация АФК

СРО является цепным самоиндуцирующимся процессом непосредственного переноса кислорода на субстрат с образованием перекисей, альдегидов, кетонов [26].

СРО вызывают СР - особый класс химических веществ, различных по своему атомарному составу, но характеризующихся наличием в молекуле непарного электрона. Чаще всего инициируют СРО так называемые АФК, такие как супероксидный радикал *00" и продукты его метаболизма: НгО^СЮ" и НО* [27].

Согласно применяемой классификации, большинство радикалов, образующихся в организме человека, можно разделить на природные и чужеродные (табл. 5). Природные радикалы подразделяют, в свою очередь, на первичные (природные, табл. 5Б), вторичные (повреждающие, табл. 5) и третичные (радикалы антиоксидантов). Образование первичных радикалов осуществляется при участии определенных ферментных систем. Эти радикалы выполняют полезные для организма функции. Из первичного радикала - супероксида, а также в результате других реакций в организме могут образоваться весьма активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Под действием ионов металлов переменной валентности, с первую очередь ионов Ре , из этих веществ образуются вторичные свободные радикалы, такие, как радикал гидроксила и радикалы липидов, которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры [28] (табл. 5).

Таблица 5. Радикалы образующиеся в клетках человека

Природные радикалы А Первичные Семихионы Супероксид Нитроксид

Вторичные Гидроксил Радикалы липидов

Третичные Радикалы антиоксидантов

Чужеродные радикалы Б Образовываются под воздействием: Радиации Радикалы воды и биомолекул

УФ Радикалы хромофоров

Ксенобиотиков Радикалы токсических веществ

Перечисленные в табл. 5А радикалы можно считать природными, поскольку они в определенном количестве всегда образуются в клетках живых организмах.

При действии ионизирующей и ультрафиолетовой радиации, а также при превращениях некоторых неприродных соединений, попавших в организм человека, в клетках и тканях также могут образовываться радикалы (табл. 5 Б). Вызвать усиление ПОЛ способен и стресс. Эксперименты на крысах с применением электорокожного раздражения вызывало эмоционально-болевой стресс и способствовало стресс-индуцированному ПОЛ. Так 30 минутное раздражение электрическим током отразилось на интенсивности ПОЛ в легочной ткани животных. Количество гидроперекиси липидов увеличилось в 7 раз, МА в 2 раза. Скорость спонтанного ПОЛ повысилась в 2 раза, а индуцированного аскорбат-зависимого ПОЛ более чем в 3 раза [29]. 3.4.2. Функции радикалов кислорода

Человеку, как и всякому многоклеточному организму, приходится бороться с микробами, попавшими внутрь его тела в кровь. Эту борьбу ведут специализированные клетки - фагоциты, к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые клетки - макрофаги. Эти клетки, соприкасаясь с поверхностью клеток бактерий, начинают энергично выделять свободные радикалы в результате переноса электрона от НАДФН-оксидазного ферментного комплекса, встроенного в мембраны фагоцита, на растворенный молекулярный кислород.

НАДФН + 20=0 -► НАД* + 2(*00") (супероксид анион-радикал).

При этом каждая молекула НАДФН, окисляясь, отдает один за другим два электрона двум молекулам кислорода, в результате чего образуется два анион-радикала супероксида [28]. 3.4.2.1. Супероксид

Супероксид-радикалы могут нанести вред, как самим фагоцитам, так и другим клеткам крови и, разумеется, микробам, вызвавшим активацию макрофага. Естественно, что все эти клетки, в качестве защиты от супероксид-радикалов, вырабатывают фермент - СОД. Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализируют одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного радикала: *00 + *00" + 2Н+ Супероксиддомуша-„ 0г + НООН

При этом супероксид превращается в кислород и перекись водорода. Судьба последней может быть разной. В норме фагоциты используют перекись водорода для синтеза гипохлорита, выделяя специальный фермент - миелопероксидазу. Миелопероксидаза катализирует реакцию:

Н202 + СГ Миелопероксидаза-► Н20 + СЮ" (гипохлорит).

Таблица 6. Первичные радикалы, образующиеся в организме человека

Радикал Структура радикала Ферментная система образования радикала Биологическая функция

Супероксид* *оо- НАДФН-оксидаза Антимикробная защита

Нитроксид ГЮ-синтаза Фактор расслабления сосудов

Семихиноны: Коэнзим флавосемихиноны Н(2* Цепь переноса электронов Переносчики электронов

Супероксид может образовываться также как вторичный радикал при взаимодействии радикалов семихинонов с молекулярным кислородом (табл. 7). Это может быть одной из причин их токсического действия соединений - производных фенола. Супероксид образуется также в цепях переноса электронов при их повреждении.

Таблица 7. Пути образования вторичных радикалов

Структура Образуется в реакции

Радикал гидроксила ♦ОН Бе^ + НООН -►Ре^+НО- + *ОН

Ре2+ + С10~ - — Ре3+ + СГ+*ОН 1

Липидные радикалы Ш* Бе2+ + ЬООН -► Ре3+ + НО" + ЬО*

Ь* ЬО* + ЬН — — ЬН + Ь*

ШО* Ь* + 02 -- 1ХЮ*

Супероксид «00- *Н + 02 -- С) + *оо~

Гипохлорит разрушает стенку бактериальной клетки и, тем самым, убивает бактерии. Перекись водорода диффундирует в клетки, но там разрушается в результате активности ферментов каталазы и глутатионпероксидазы (СБН-пероксидазы), которые катализируют соответственно такие реакции: 2н2О2™^--Н20 + 02

Н202 + 2СБН Глутатионпероксидаза-^ С88С + 2^0

В присутствии ионов двухвалентного железа перекись водорода разлагается с образованием гидроксильного радикала (НО*): Н202 + Бе2*-► Ре3+ + НО" + ОН*

Эта реакция, реакция Фентона, приводящая к поражению окружающих клеток. Радикал гидроксила чрезвычайно активен химически и разрушает почти любую встретившуюся ему молекулу. Действуя на БН-группы, гистидиновые и другие аминокислотные остатки белков, НО* вызывает денатурацию последних и инактивирует ферменты. В нуклеиновых кислотах НО* разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, таким образом, разрывает цепи ДНК и РНК, в результате чего происходят мутации и гибель клеток. Внедряясь в липидный слой клеточных мембран, радикал гидроксила инициирует реакции цепного окисления липидов, что приводит к повреждению мембран, нарушению их функций и гибели клеток. Гидроксильный радикал образуется не только в реакции Фентона. А.Н. Осипов показал, что радикалы гидроксила образуются также при взаимодействии ионов железа (Ре2+) с гипохлоритом [30]. При этом радикал гидроксила выделяется даже с более высоким выходом, чем в реакции Фентона:

СЮ" + Ре2+ + Н+-► Ре3+ + С1" + ОН*

Возвращаясь к реакциям утилизации перекиси водорода, можно сказать, что первая из них - реакция, полезная для организма человека, вторая и третья защитные, а последняя, безусловно, вредна для окружающих клеток и тканей [28].

3.4.2.2. Окись азота

Второй СР, синтезируемый живыми клетками, — это монооксид азота *Ж). N0 образуется клетками стенок кровеносных сосудов (эндотелия), фагоцитами, нервными и многими другими клетками. Эта реакция катализируется гемсодержащими ферментами Ш-синтазами. В присутствии соединений, содержащих БН-группы, из N0 образуется выделяемый эндотелием "фактор расслабления" [28]. Он играет ключевую роль в регуляции тонуса сосудов и кровяного давления: его недостаток приводит к гипертонии, избыток - к гипотонии. Именно нарушением метаболизма фактора расслабления объясняют гипертонию и другие болезни, связанные с нарушением нормального кровяного давления. N0 выделяется также клетками-фагоцитами и вместе с радикалами супероксида используется для борьбы с микробами (преимущестенно грибковой природы). Полагают, что цитотоксическое действие N0 обусловлено его реакцией с супероксидом:

Ы=0 + *0-0" + Н+ -► 0=Ы-0-0Н (пероксинитрит).

Пероксинитрит, образующийся в этой реакции, может разлагаться с образованием *0Н: ОЫ-О-ОН -► 0=Ы-0* + *0Н (радикал гидроксила).

Образование пероксинитрита и радикала гидроксила приводит к повреждению клеток. Повреждающее действие системы (N0* + супероксид) должно быть направлено на болезнетворные микроорганизмы, а не на свои собственные клетки и ткани. Поэтому в тех участках кровяного русла, где выделяется N0* (как необходимый регулятор кровяного давления), не должно быть супероксидных радикалов. Для этого, в частности, в этих местах синтезируется фермент СОД, который удаляет супероксид. 3.4.2.3. Действие радикала коэнзим О

На конечном этапе окисления субстратов в клетках электроны переносятся от НАДН и НАДФН по дыхательной цепи на кислород. В состав дыхательной цепи митохондрий входят флавопротеиды, комплексы негемового железа, убихинон и гемопротеиды (цитохромы а, Ъ и с и цитохромоксидаза). Важным звеном цепи переноса электронов служит убихинон (коэнзим (})

В норме этот радикал не более чем рядовой участник процесса переноса электронов, но при нарушении работы дыхательной цепи он может стать источником других, менее безобидных радикалов - радикалов кислорода.

Фактором, усиливающим окислительный. стресс, является закисление среды, вызываемое происходящей при гипоксии активацией гликолиза. В тканях, лишенных кислорода, гликолиз призван, хотя бы частично компенсировать недостаток АТФ. Однако это приводит к накоплению кислых продуктов (молочная кислота), которые в условиях нарушения кровообращения накапливаются в тканях. Закисление среды приводит к высвобождению ионов железа, способных индуцировать перекисное окисление [31].

3.4.3. Методы изучения свободных радикалов 3.4.3.1. Биохимические методы

Радикалы обладают высокой реакционной способностью, и изучать их обычными химическими методами невозможно: стандартные процедуры вроде хроматографии или центрифугирования бесполезны. Важную роль при решении таких вопросов играет так называемый ингибиторный анализ. Классическим примером может служить применение фермента СОД. Постепенно СОД стали широко использовать во всех исследованиях, где изучают роль супероксида в том или ином процессе, будь то индивидуальная биохимическая реакция или развитие болезни у лабораторных животных или человека. Если добавление СОД тормозит изучаемый процесс, значит, для его протекания необходим супероксид-радикал. Остается выяснить, в какой именно реакции этот радикал участвует. Ингибиторный анализ используют и для изучения реакций с участием других радикалов [28]. 3.4.3.2. Биофизические методы

Прямой метод изучения свободных радикалов - это метод ЭПР [32]. По наличию, амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно судить о существовании непарных электронов в образце, определять их концентрацию, а иногда и выяснить, какова химическая структура радикалов, которые эти непарные электроны содержат.

Эффективным методом изучения реакций с участием радикалов оказался метод ХЛ [33]. При взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая может излучаться в виде квантов света. Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы, и, следовательно, показывает изменение их концентрации по ходу реакции. Надо отметить, что чувствительности этих методов часто бывает недостаточно. В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах не велики, зато велики скорости исчезновения этих радикалов, поэтому концентрация радикалов в каждый данный момент времени обычно мала. Выход из положения заключается в использовании так называемых спиновых ловушек в методе ЭПР и активаторов свечения в методе хемилюминесценции. В первом случае к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества, называемые спиновыми ловушками. Например, для захвата радикалов гидроксила НО* используют ФБН,рис. 10.

Рис 10. Схема захвата радикала гидроксила ФБН

При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название спинового аддукта. Сигналы ЭПР спиновых адцуктов разных радикалов слегка различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе. Для улавливания других радикалов используют другие ловушки. 3.4.4. ПОЛ

Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии [28]. Реакция протекает в несколько стадий, которые получили название "инициирование", "продолжение", "разветвление" и "обрыв" цепи. Инициирование цепной реакции начинается с того, что в липидный слой мембран или липопротеинов внедряется СР. Чаще всего это радикал гидроксила. Будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, он способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом образуются липидные радикалы: НО* + LH --H20 + L*

Липидный радикал (L*) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом, при этом образуется новый CP - радикал липоперекиси (LOO*): L* + 02-- LOO*

Этот радикал атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L*: LOO* + LH -► LOOH + L*

Чередование двух последних реакций и представляет собой цепную реакцию ПОЛ. Существенное ускорение ПОЛ наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe2+ с гидроперекисями липидов: Fe2+ + LOOH-- Fe3+ + НО" + LO*

Образующиеся радикалы LO* инициируют новые цепи окисления липидов:

LO* + LH -► LOH + L*;

L* + 02 -► LOO* ит д.

В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но, в конце концов, цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe2+) или друг с другом:

LOO* + Fe2+ + Н+-- LOOH,

LOO* + InH

LOO* + LOO* -- молекулярные продукты.

Последняя реакция особенно интересна, поскольку она сопровождается свечением - ХЛ. Интенсивность сверхслабого свечения отражает скорость ПОЛ в изучаемом биологическом материале, и измерение хемилюминесценции довольно часто используется при изучении ПОЛ в различных объектах [34]. 3.4.5. Биологические последствия ПОЛ

Увеличенное образование свободных радикалов в организме (которое иногда называют окислительным стрессом) и связанное с этим усиление процессов ПОЛ липидов сопровождаются нарушениями в свойствах биологических мембран и функционировании клеток. Наиболее изучены три прямых следствия ПОЛ.

Первое следствие - ПОЛ сопровождается окислением тиоловых (сульфгидридных) групп мембранных белков (Рг). Это может приводить в результате к неферментативной реакции БН-групп со свободными радикалами липидов. При этом образуются сульфгидридные радикалы, которые затем взаимодействуют с образованием дисульфидов либо окисляются кислородом с образованием производных сульфоновой кислоты:

Рг-БН + Ь*' -- ЬН + Рг-Б*,

РГ1-Б* + Ргг-Б* -► РггББ- Рг2

Рг-Б* + Ог-► Рг-БОг*-► молекулярные продукты

Связанное с ПОЛ окисление белков и образование белковых агрегатов в хрусталике глаза заканчиваются его помутнением. Этот процесс играет важную роль в развитии старческой и других видов катаракты у человека. Большую роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очередь Са2+-АТФазы [35]. Инактивация этого фермента приводит к замедлению откачивания ионов кальция из клетки и, наоборот, к входу кальция в клетку, увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки. Наконец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии - ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембран.

Второй результат ПОЛ связан с тем, что продукты ПОЛ обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Так, показано, что продукты ПОЛ делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция. Это приводит к потере митохондриями способности осуществлять синтез

АТФ, и клетка оказывается в условиях энергетического голода. Одновременно в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры.

Третий результат ПОЛ - это уменьшение стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны собственным мембранным потенциалом, то есть под действием разности электрических потенциалов, существующей на мембранах живой клетки. Электрический пробой приводит к полной потере мембраной ее барьерных функций [36].

Для живых клеток наибольшую опасность представляет окисление полиненасыщенных жирных кислот - ПОЛ. В реакциях ПОЛ образуется большое количество липидных гидроперекисей, которые обладают высокой реакционной способностью и оказывают мощное повреждающее действие на клетку [36]. Негативное действие свободных радикалов проявляется в ускорении старения организма, провоцировании воспалительных процессов в мышечных, соединительных и других тканях, неправильном функционировании различных систем организма: циркуляционной, нервной (включая клетки мозга) и иммунной системы. Эти нарушения связаны, прежде всего, с повреждением клеточных мембран - ПОЛ, а результат разрушительного воздействия - окислительный стресс. Свободные радикалы могут также проявлять мутагенные свойства, связанные с нарушением структуры молекул ДНК [36].

Цепные реакции с участием свободных радикалов также могут являться причиной таких заболеваний - как астма, диабет, артриты, варикозное расширение вен, атеросклероз, болезни сердца, флебиты, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, депрессии и т. д. [29].

3.5. Свойства полифенолов красного винограда, определяющие их перспективность для косметики

3.5.1. Ингибирование СРО полифенолами красного винограда

В биологических системах присутствуют антиоксиданты - вещества, способные ингибировать процессы СРО. Полифенолы составляют большую группу веществ растительного происхождения, содержащие ароматические кольца и гидроксильные заместители. Эти вещества из-за своей химической структуры являются в своем большинстве мощными антиоксидантами - донорами протонов и электронов, необходимыми для клеточного метаболизма в растениях [37]. Исследования антиоксидантной активности флавоноидов винограда in vitro, показали, что они являются более мощными антиоксидантами, чем витамины С и Е. Кроме того, также как полифенолы так и их комплексы с медью и железом замедляют скорость реакций СРО, несмотря на то, что оба металла ускоряют протекание ПОЛ [38,39].

Механизм действия полифенольного антиоксиданта состоит в обрывании цепи СРО: они легко отдают протон, превращая радикал, с которым они прореагировали, в молекулярный продукт, а сами при этом превращаются в слабый феноксил-радикал, который уже не способен участвовать в продолжении цепной реакции (рис. 11,12) [40].

Рис. 12. Схема ингибирования ПО полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав ЛНП катехином

Полифенолы, в частности антоцианы, известны способностью перехватывать О2 [41], ОН* [42] и, ЯООН [43], N0 радикалы [44], предотвращать ПОЛ индуцированное Си2+, аскорбиновой кислотой [45], УФ и Бе2* [42] и доксорубицином [46]. Также

Рис. 11. Атака СР полиненасыщенных жирных кислот в ЛНП 1 обнаружено, что экстракт винограда защищает ткань от окисления лучше, чем витамины С и Е (рис. 13) или бета-каротин [47].

Исследование СРО мембранных липидов клеток человека in vitro, вызванного продуктами горения табака, показало, что виноградный экстракт, содержащий преимущественно олигопроантоцианидины обладал большей антиоксидантной активностью, чем витамины С и Е даже в случае их совместного применения [48].

Рис. 13. Витамины Е и С

Было доказано, что флавоноиды винограда замедляют окисление ЛНП. Причем виноградные полифенолы оказались вдвое эффективнее а-токоферола при одинаковой концентрации. Мощные антиоксиданты полифенольной структуры обнаружены во всех исследуемых сортах красного винограда произраставшем в Калифорнии [49].

Эффект улавливания свободных радикалов in vitro флавоноидами может быть зарегистрирован несколькими способами, один из которых, тест с голубым п-нитро тетразолиумхлоридом (НТХ, рис. 14). Такая оценка особенно эффективна при определении ингибирования супероксид-радикалов. В присутствии антиоксидантов захват супероксид-радикалов сопровождался восстановлением НТХ, с образованием окраски голубого цвета, которая количественно определяется колориметрически при длине волны 560 нм.

Маскуилер с сотрудниками [50] проводил исследование способности различных полифенолов и витаминов к ингибированию супероксид-радикала с помощью НТХ.

НО

Витамин Е

Витамин С

Рис. 14 НТХ

Ниже приведена таблица, показывающая насколько тот или иной антиоксидант эффективен при ингибировании супероксида кислорода.

Таблица 8. Эффективность ингибирования супероксида кислорода рядом антиоксидантов [50]

N Вещество Ингибирование, %

1 димер катехин - катехин 78

2 димер катехин - эпикатехин 72

3 димер эпикатехин - эпикатехин 63

4 эпикатехин 30

5 катехин 25

6 глюкозид мальвидина 32

7 хлорогеновая кислота 25

8 гликозид рутина 24

9 кофейная кислота 20

10 аскорбиновая кислота (витамин С) 4

Результаты, представленные в таблице 8, свидетельствуют, что димерный проантоцианидин (димер катехина) при улавливании радикала супероксида кислорода почти в 20 раз более эффективен, чем витамин С. Также видно, что глюкозид мальвидина обладает наибольшей эффективностью среди мономеров.

Авторы статей [51] сравнивали антиоксидантную активность в отношении I ингибирования Си -индуцируемого окисления ЛНП человека in vitro. Для этого определяли активность полифенолов двадцати различных вин разбавленных в 1000 раз до концентрации общих полифенолов 10 мкМ с а-токоферолом в той же концентрации. Показано, что Си -индуцируемое перекисное окисление липопротеинов низкой плотности уменьшалось в пределах от 50 до 98% раз в зависимости от сорта.

Эксперимент показал, что и а- токоферол и полифенолы способны защитить ЛНП от окисления, причем суммарная активность красного вина оказалась намного выше чем а-токоферола. ПОЛ вызванное указанной системой, было измерено на ЛНП выделенных из печени крысы. В этой системе образовывался гидроксильный радикал, который реагировал с полиненасыщенными, жирными кислотами в микросомальных мембранах, вызывая отрыв водорода с последующим пуском цикла автоокисления жирных кислот. Перекисное окисление измеряли, регистрируя накопление малонового альдегида, высвобождающегося в результате разложения липопероксидов. Преимуществом флавоноидов также является способность образовывать комплексные соединения с ионами металлов с переменной валентностью, не давая им запустить каскад свободнорадикальных реакций.

В таблице 9 рассмотрены антиоксидантные и антирадикальные свойства индивидуальных антиоксидантов и экстрактов, содержащие антоцианы и олигопроантоцианидины. ПОЛ вызывали Бе2* и аскорбатом. Антирадикальную активность в отношении супероксид радикала исследовали с помощью НТХ.

Таблица 9. Ингибирование ПОЛ в микросомах печени различными антиоксидантами

Антиоксидант Концентрация 50% ингибирования, мг/мл

Ингибирование ПОЛ Ингибирование супероксид-радикала

Олигомеры проантоцианидина из косточек винограда УгШ \inifera 0,016 0,010

Олигомеры проантоцианидина Сиргеьзез зетрешгепз 0,075 0,041

Антоцианы из сока винограда УШб \inifera 0,090 0,039

Антоцианы ягоды Уассшшт туйШиэ 0,095 0,041

Смесь флавоноидов вделенная из цитрусовх 0,260 0,147

Цианидин 0,018 0,019

Экстракт Гинко-Билоба 0,25 а-Токоферол 0,034

Результаты, представленные в таблице 9, показывают превосходство препаратов винограда, и особенно, олигопроантоцианидинов и антоцианов красного винограда, в качестве ингибиторов СРО [52].

Проантоцианидины в концентрациях от 0,05 до 1 мг/л способны препятствовать окислению фосфолипидов индуцированному Ре , включаясь в липосомы, благодаря взимодействию с полярными группами фосфолипидов [53]. Также проантоцианидины В1, В2, элаговая кислота, антоцианы и их агликоны в концентрациях 10-20 мкМ ингибировали Си -индуцированное окисление фосфолипидов и белков (бычьего альбумина, лактоальбумина и казеина) в липосомах [54].

3.5.2. Определение антиоксидантной активности отдельных компонентов экстракта винограда. Индекс активности антиоксиданта

Для определения антиоксидантной способности сложных смесей различных типов вин, экстрактов виноградной ягоды и биологических жидкостей применяют различные методы. Однако важно подчеркнуть, что анализ антиоксидантной способности in vitro обеспечивает только приблизительное отображение действия биологически активного вещества в живой клетке (in vivo). Кроме того, антиоксидантная способность препарата - является не только результатом суммы его различных антиоксидантов, но также зависит от окружающей микросреды, и синергетического или антагонистическиго влияния составляющих частей препарата. Определение антиоксидантной активности флавоноидов выражают в эквивалентах витамина Е, с использованием в качестве стандарта Тролокса (рис. 15) -спирторастворимого аналога витамина Е.

СН3

Н3СГ ^Г О' СН3

Рис 15. Тролокс

Индекс активности, или полную реакционную способность антиоксиданта, определяют, измеряя концентрацию свободных радикалов, не нейтрализованных изучаемым образцом и способность антиоксиданта к замедлению окисления ЛНП, результаты которого выражаются как процент ингибирования окисления ЛНП, по сравнению с контролем [55]. На основе информации о составе полифенолов винограда и данных, полученных от ЭААТ, получают антиоксидантную активность химически чистого вещества. С помощью полученной зависимости антиоксидантной активности от концентрации вычисляют концентрацию вещества, требуемого, для получения 50% (IC50) ингибирования свободных радикалов и 50% ингибирования ПОЛ [50].

Этот анализ позволяет получить адекватную информацию об антиоксидантном вкладе каждого из веществ [49,56].

Значительное количество работ было посвящено выявлению полифенолов, вносящих наиболее значительный вклад в антиоксидантные свойства красного винограда.

Определяя ингибирование окисления ЛНП Франкель с сотрудниками [49], проводил эксперименты с 20 винами Калифорнии и получил данные ингибирования ПОЛ от 46 до 100% для красных и от 3 до 6% и белых вин. Относительная активность антиоксидантов винограда коррелировала с общим содержанием фенолов, коэффициентом корреляции (г = 0,94), концентрацией галловой кислоты (г = 0,92), катехина (г = 0,76), мирицетина (г = 0,70), кверцетина (г = 0,68), кофейной кислоты (г = 0,63), рутина (г = 0,50), эпикатехина (г = 0,45), цианидина (г = 0,43), и М-З-г (г = 0,38). Каждое из этих производных фенола вносит различный вклад к антиоксидантной активности вина.

Позже та же группа исследователей [57] сравнила экстракты полифенолов 14 различных сортов винограда по ингибированию окисления in vitro ЛНП человека. Относительная активность антиоксидантов, коррелировала с концентрацией для общих фенолов (г = 0,89), антоцианов (г = 0,56) флавонолов (г = 0,54). В случае дробления виноградной косточки, экстрагировали более высокие количества флаван-3-олов и гидроксибензоатов.

Другие авторы [58, 59, 60, 61] выделили и анализировали различные фракции красного винограда и идентифицировали полифенольные компоненты, ответственные за антиоксидантную активность. Препараты были получены с использованием различных методов (табл. 10), а антиоксидантную активность оценивали по способности полифенолов ингибировать ПОЛ. Согласно этим результатам, антоцианы красного винограда играют основную роль в антиоксидантном эффекте смеси.

Таблица 10. Сравнение эффективности различных фракций полифенолов

Автор сообщения Способ выделения полифенолов Система определения антиоксидантной активности Результат

Абу-Амша [58] Тонкослойная хроматография Ге2+ - аскорбат -индуцируемое окисление ЛНП Фракции с высокой активностью не содержали флавоноидов. В них была идентифицированы кумаровая, кофейная и прокатехиновая кислоты

Урзини [59] Колоночная хроматография Бе - аскорбат -индуцируемое окисление ЛНП Антиоксидантная активность на 55% зависела от антоцианов, на 25% от танинов. 15% вклад привносят флавонолы и 5% растворимые в воде фенолокислоты.

Керри [60] Колоночная хроматография Катализируемое Си2+ окисление ЛНП Фракция, содержащая антоцианы и катехин была более активна, чем феноловые кислоты, флавонолы или проантоцианидины.

Жизелли [61] Двухфазная экстракция жидкость/ жидкость Деактивация ПОЛ индуцированного ААПГ Фракция, содержащая антоцианы, была более активна. Две. другие фракции, содержащие феноловые кислоты, кверцетин-3-глюкозид, проантоцианидин и катехин менее активны.

По данным исследователей [62], антирадикальная активность флавоноидов винограда, определенная по скорости восстановления ДФПГ коррелирует с содержанием общих полифенолов, но не коррелирует с содержанием антоцианов.

3.5.3. Антиоксидантные свойства полифенолов винограда in vivo

Известно, что анализ антиоксидантной способности in vitro обеспечивает только приблизительное отображение действия биологически активного вещества в живой клетке (in vivo). Исследователи [51] сообщают о влиянии 250 мл красного вина, принимаемого с пищей уже в течение 30 мин., на антиоксидантный статус организма, в группе участвующих добровольцев. Показано увеличение антиоксидантной активности плазмы крови через 68 мин. на 332 мкМ в эквиваленте Тролокса по сравнению с контрольной группой и поддержания его постоянной на протяжении 90 мин.

Несмотря на то, что путь усвоения полифенолов еще полностью не ясен, исследователи предполагают, что только агликоны могут усваиваться в желудочно-кишечном тракте, в то время как, гликозиды, должны предварительно гидролизоваться при участии кишечной флоры до агликонов [63]. Однако в статье [64], приводятся доказательства, что гликозиды могут быть непосредственно поглощены тонкой кишкой. Причем различные гликозиды кверцетина поглощаются с разной эффективностью [65]. В работах [66, 67] сравнивали влияние красного и белого вина на окисление плазматическую ЛНП. Клиническое испытание, проведенное на двух группах мужчин в возрасте 25-45 лет, одна половина которых получала 400 мл в день красного вина, а вторая половина такое же количество белого вина, без изменений в обычной диете подтвердило на порядок большее влияние на антиоксидантный статус организма флавоноидов красного винограда.

Авторы [68] предположили, что фенольные вещества в красном вине способны образовывать связи с ЛНП, уплотняя его структуру, предохраняя от окисления, что является дополнительным механизмом проявления антиоксидантных свойств. Это предположение подтверждается, тем, что на антиоксидантную активность в большей степени влияют именно полифенолы красного винограда, и она в меньшей степени связана с другими антиоксидантами: каротеноидами, витамином А и а-токоферолом, выступающими в качестве добавочных пищевых факторов.

3.5.4. Зависимость антиоксидантной активности от структуры полифенолов

Из литературы [69] известно, что существует зависимость между структурой различных флавоноидов и их антиоксидантной активностью. Способность флавоноидов реагировать с АФК такими как гидроксил-, пероксил-, и супероксид радикалами: ингибировать ПОЛ зависит от способности отдавать атом водорода ОН-группы фенольного кольца, и устойчивость образующегося феноксильного радикала (рис. 16).

6-6-6-6

Рис. 16. Резонансные структуры, образующиеся вследствие отрыва атома водорода от фенола

Основным фактором, влияющим на антиоксидантную активность, является степень гидроксилирования в кольце "В". В показанных ниже структурах видна прямая зависимость антиоксидантной активности, указанной на рис. 17 в скобках, в зависимости от степени гидроксилирования кольца "В". он

Кризин (0,089)

Апигенин (0,161) М

Л юте один (1,008) ЭН

Пеларгонвдин (0,509)

Цианвдин (0,940)

Дельфинвдин (1,642)

НО.

4/4 он он он он

Эпикатехин (1,882) Эпикатехингалиат (2,022) Эпигаллокатехингаллат (2^239)

Рис. 17. Зависимость антиоксидантной активности от структуры флавоноидов

Эффективность индивидуальных флавоноидов в сравнении с тролоксом и выражена в ЭААТ. Антиоксидантная активность тролокса принята за 1,00. Тенденция роста антиоксидантной активности от степени гидроксилирования фенольных колец прослеживается, в том числе, и на олигомерах проантоцианидинов [69].

Согласно исследованиям [70, 71] антиоксидантная активность флавоноидов зависит не только от числа и положения гидроксильных групп, но также увеличивается при наличии оксо-группы в 4-м положении и ненасыщенной связи между 2 и 3-м атомам углерода. Исследователи, изучавшие антиоксидантную активность флавоноидов нескольких групп таких как: флавонолов, флавонов, флавононов, дигидрофлавонолов, изофлавонов, бифлавонов измеряли антиоксидантные свойства согласно ингибированию флавоноидами тестовой системы: р-каротин-линоленовая кислота, ПОЛ индуцировали нагреванием [72,73].

Таблица 11. Структура испытываемых флавоноидов и антиоксидантная активность в отношении перекисного окисления Р-каротина и линоленовой кислоты

Ъ О

N Название й Яз Яб * АО, %

1 Кемпферол ОН ОН он Н ОН н 65,3

2 Галангин ОН ОН он Н н н 64,9

3 Кверцетин ОН ОН он ОН ОН н 63,6

4 Морин ОН ОН он ОН ОН 63,5

5 Робинетин ОН Н ОН он ОН он 61,7

6 Фитезин ОН Н ОН он он н 61,6

7 Кемфирид ОН ОН ОН н ОМе н 60,0

8 3-гидрокси-флавон ОН н Н н н н 59,4

9 Ларицитрин ОН ОН ОН он он ОМе 28,5

10 Ларицитрин-З'-О-глюкозид ОН ОН ОН н ОН ОМе 26,2

11 Мирицетин ОН он ОН он он ОН 18,4

12 3,5,7,3 ,4 " гексаметокси- флавон ОМе ОМе ОМе ОМе ОМе ОМе 2,6

13 3,5,7,3',4'- Пентаметокси флавон ОМе ОМе ОМе ОМе ОМе Н 1,1

14 Ларицитрин-3,3'-0- диглюкозид О-глю-козид ОН ОН О-глю- козид он ОМе 1,

15 Кверцетин-3- О-глюкозид-7- О-рамнозид О-глю-козид ОН Н О-глю-козид он Н -6,2 •

16 Ларицитрин- 3,7,3'-0- триглюкозид О-глю-козид ОН О-рам-нозид ОН он ОМе -6,2

17 Рутин О-рути-озид ОН ОН н он Н -10,2

18 Флавон н Н н н н Н -1,5

19 5-гидрокси-флавон Н ОН н н н Н -4,0

20 7-гидрокси-флавон Н Н он н н Н 0,0

21 Хризин Н ОН он н н Н -20,8

22 Лютеолин-7-О-глюкозид Н ОН О-глю-козид н он ОН -25,3

АО - антиоксидантная активность

Отрицательные значения означают возможность прооксидантного действия флавоноидов.

По данным таблицы И авторами был сделан вывод о наибольшем влиянии 3-фенольного гидроксила на антиоксидантную активность флавоноидов.

3.5.5. Зависимость антирадикальной активности от структуры полифенолов

Авторами, исследовавшими антирадикальную активность ряда полифенолов по скорости восстановления ДФПГ (рис. 18) были сделаны выводы о том, что антирадикальная активность зависит от способности образующегося феноксильного радикала к стабилизации через водородную связь или делокализацию электронов [73]. В основном противорадикальная активность молекулярной структуры зависит от фенольных гидроксилов и возможности стабилизации образующегося фенольного радикала [74]. no2

-q

V vi

NO, Q o2N Флав OH O2N I-N X) Флав О*

Рис. 18. Схема реакции флавонолами со свободными радикалами на примере ДФПГ

Известно также, что для эффективного антирадикального действия благоприятно наличие структуры с двумя о-гидрокси-группами в кольце В, например, в 3',4'-положении (рис. 19), потому что данная структура может служить более эффективным донором электронов, чем структура с двумя гидрокси-группами в мета- или пара-положениях.

Рис. 19.3,4-Гидрокси-группы кольца В

Также отмечено большое влияние на активность, гидроксильной группы в 3 положении кольца С [75] и двойной связи С2-С3 коньюгированной с оксо-группой, которая также ответственна за делокализацию электрона захваченного кольцом В. Насыщение двойной связи снижает антирадикальное действие флавоноидов [76]. Наличие 3-гидрокси- и 5-гидрокси-групп в комбинации с 4-оксо группой еще более увеличивает антирадикальную активность. В отсутствие о-дигидроксигрупп в кольце В, антирадикальную активность компенсируют сопряженные гидроксигруппы колец А и С [77]. В итоге все эти группы вносят свой вклад в сумму антирадикальной активности исследуемого вещества [78].

3.5.5.1. Использование метода QSAR при анализе антирадиальной активности флавоноидов

В настоящее время среди методов так называемого рационального дизайна широко применяют QSAR (Quantitative Structure - Activity Relationship или «количественное соотношение структура - активность») - математический аппарат, позволяющий проводить корреляции структур химических соединений с их биологической активностью. QSAR предполагает идентификацию и количественное выражение структурных параметров или каких-либо физико-химических свойств физиологически активных веществ в виде дескрипторов с целью выявления факта влияния каждого из них на биологическую активность [79]. Если такая зависимость

ОН 0

ОН имеет место, то возможно составление уравнений, позволяющих предсказать биологическую активность новых аналогов, что в свою очередь, позволит сократить количество соединений, свойства которых должны быть изучены экспериментально.

Исследователи, проводившие анализ взаимосвязи структура - активность по методу С^АЛ на группе из 26 флавоноидов (табл. 12) распределили их по двум группам -16 высокоактивных флавоноидов (с 3-гидрокси и/или 3',4'-дигидроксигруппами) и 11 флавоноидов с низкой активностью (без 3-ОН и 3', 4'- дигидроксигрупп). Таблица 12. Структура и реакционная способность, испытываемых флавоноидов в отношении ДФПГ

В-5

Кг О

N Название 111 1*2 Яз С2=Сз р # 1 СП

1 Морин ОН ОН он он он + 96,5

2 Таксифолин ОН он он он он - 94,8

3 Кемпферол ОН он он н он н + 93,5

4 Фузтин ОН н он он он н - 91,9

5 Галангин ОН он он н н н + 91,8

6 Рутин 0- рут он он он он н + 90,9

7 Кверцетин ОН он он он он н + 89,8

8 Лютеолин-7-О-глюкозид Н он 0- глю н он он + 87,6

9 Кверцетин-3- О-глюкозид-7- О-рамнозид 0- глю он н 0- глю он н + 86,8

10 Ларицитрин ОН он он он он ОМе + 84,6

11 Ларицитрин-З'-О-глюкозид ОН он он н он ОМе + 83,8

12 Робинетин ОН н он он он он + 82,3

13 Фитезин ОН Н ОН ОН ОН Н + 79,0

14 Мирицетин ОН ОН ОН ОН ОН ОН + 72,8

15 Кемпферол- 3,7-0- диглюкозид 0- глю ОН 0-глю ОН Н + 70,6

16 3- Гидроксифлав он ОН Н Н Н Н н + 66,0

17 Апигенин 7-глюкозид ОН 0- глю Н ОН н + 34,8

18 Гесперетин ОН ОН ОН ОМе он - 30,0

19 3,5,7,3',4',5'- Гексаметокси- флавон ОМе ОМе ОМе ОМе ОМе ОМе + 12,6

20 Наренгенин ОН ОН ОН - 6,3

21 Нарингин ОН 0- глю ОН 4,7

22 7- Гидроксифлав он Н Н ОН Н Н Н + 2,8

23 Флаванон - 2,6

24 Флавон Н Н Н Н Н Н + 1,5

25 Хризин Н ОН ОН Н Н Н + 1,1

26 Апигенин ОН ОН ОН + 0,7

27 5- Гидроксифлаво н Я ОН Я Я Я Я + 0,6 глю - глюкозид

Рсл Относительная реакционная способность с ДФПГ,%

Также представляется интересным отсутствие различий в антирадикальной активности флавоноидов с С2-С3 двойной связью или без нее, что должно свидетельствовать о ее незначительном влиянии на антирадикальную активность [80].

3.5.6. Влияние олигомерного проантоцианидина на волокна коллагена

Коллаген - наиболее распространенный белок человеческого тела. Это ключевое вещество соединительной ткани, состоящее из спиральных структур полипептидов, связанных вместе в длинные цепи. Каждая молекула коллагена состоит из тройной спирали. Стабильность коллагена зависит, главным образом, от сшивок существующих между цепями полипептидов. После помещения волокон коллагена в горячую воду, они быстро подвергаются денатурации. Увеличение числа сшивок спирали ведет к увеличению температуры необходимой для денатурации. Важным свойством многих полифенолов является их способность присоединиться к коллагену и стабилизировать его. Эффект стабилизации коллагена полифенолами можно определить по времени и силе сжатия волокон при нагревании.

Масквелиер с сотрудниками исследовал влияние различных флавоноидов винограда на физические свойства волокон коллагена [50]. В этих экспериментах волокна коллагена из говяжьих сухожилий выдерживали в течение 24 ч в водном растворе испытываемых веществ с концентрацией 1 мг/мл. Каждое волокно было 10 см длиной и весом 5 г. Когда необработанные волокна погружали в воду и при 75 °С они сжимались до длины 4 см, в ходе эксперимента регистрировали время сжатия волокон и их расчетную силу сжатия (табл. 13).

Таблица 13. Время сжатия различных обрабатываемых волокон и расчетная сила сжатия

Испытываемое вещество Время сжатия, с Сила сжатия, Н

Необработанные волокна 10 29,4

Катехин 45 6,5

Конденсированный танин 70 4,2

Олигомеры проантоцианидина 210 1,4

Результаты исследования показывают, что олигомеры проантоцианидина наиболее эффективно стабилизируют (предохраняют от деформации) коллаген. 3.5.7. Влияние олигомерного проантоцианидина на коллаген и эластин

Исследования in vivo и in vitro доказали, что присоединение олигомерного проантоцианидина к эластину уменьшает скорость его разложения эластазой [81]. Было выяснено, что нерастворимый эластин с добавкой олигомеров проантоцианидина и (+)катехина был более стоек к гидролизу, вызванному панкреатической эластазой человека. В работе [81] описано, что обработка радиоактивно меченного коллагена кожи морской свинки флавоноидами (+)- катехина делает коллаген стойким к действию коллагеназы, не действуя при этом на коллагеназу и не уменьшая ее активность. (+)-Катехин образует комплекс с коллагеном, и модифицирует его структуру в достаточной степени, чтобы сделать его стойким к разложению ферментом.

Начальная стадия почечной гипертонии сопровождается увеличением сосудистой проницаемости брюшной аорты. Увеличение сосудистой проницаемости имеет разную интенсивность во всех частях организма: больше в коже и в стенке аорты, меньше в мозговых сосудах. Добавление в рацион крыс препаратов, содержащих гликозиды антоцианов в течение 12 дней перед индукцией гипертонии позволила, сохранить на прежнем уровне проницаемость гемоэнцефалического барьера и ограничить увеличение сосудистой проницаемости в коже и стенке аорты. Показано, что коллаген стенок кровеносного сосуда играет важную роль в регулировании сосудистой проницаемости. Взаимодействие коллагена с антоцианами, наряду с Р-капиллярным действием, способствует уменьшению проницаемости сосудов при гипертонии [82].

При исследовании развития артрита [83] у крыс показано, что добавление в их рацион флавоноидов, находящихся в красном вине, также ведет к увеличению устойчивости коллагена хрящей к действию коллагеназы. 3.5.8. Солнцезащитное действие

В небольших дозах мягкое ультрафиолетовое излучение-А (УФ-А) с длиной волны от 315 до 400 нм несет большую пользу для организма. Однако значительные дозы ультрафиолета особенно жесткого УФ-В и УФ-С, с длинами волн 280-315 нм и 200-280 нм опасны, т.к. биомолекулы способны вступать в реакции между собой при поглощении кванта света. Повреждение ДНК, а также и белков, контролирующих репарацию, например, может привести к перерождению нормальной клетки в раковую и к развитию онкологических заболеваний [84].

Поскольку антиоксиданты и, в частности, флавоноиды могут защищать кожу от ПОЛ и предупреждать видимые признаки ее старения, уменьшая разрушительные эффекты ультрафиолетового (УФ) света перспективным считается введение разнообразных антиоксидантов в солнцезащитные средства для предотвращения повреждений наносимых солнечными лучами коже. В одном из описанных в литературе экспериментов, виноградный экстракт, содержащий олигопроантоцианидин, не только проявлял антиоксидантный эффект на одном уровне с витамином Е, защищая полиненасыщенные жирные кислоты от индуцированного УФ ПОЛ, но и синергически взаимодействовал с витамином Е, перерабатывая инактивированную форму витамина Е в активную форму действуя, таким образом, как пролонгатор витамина Е [85].

3.5.9. Противовоспалительное действие

Показано, что смесь антоцианидинов эффективно снимала воспаление, благодаря специфическому антагонизму медиаторам, таким как гистидин. Антоцианы были более эффективны, чем рутин и кверцетин, кроме того, была показана прямая зависимость эффекта от дозы антоцианов [86]. Противовоспалительное действие антоцианидинов проявляется при значительно более высоких концентрациях, чем антиоксидантное. Так для 57% ингибирования ПОЛ достаточно цианидина в концентрации 2 мМ, а для 50% ингибирования воспаления от 60 до 90 мМ. Воспаление индуцировали соответственно: простагландин Н эндопероксид синтазой 1 и простагландин Н эндопероксид синтазой 2 [86,87]

3.5.10. Р - Витаминная активность

Итальянские исследователи показали, что экстракт виноградной косточки позволяет облегчить течение варикозной болезни. Эксперимент проводили на двадцати четырех пациентах, больных хронической венозной недостаточностью, которые получали ежедневно экстракт косточки винограда, содержащий гликозиды антоцианов в дозе по 100 мг. Улучшения в состоянии были заметны через 10 дней: у 70 процентов пациентов уменьшился отек, у 50 процентов пациентов уменьшились болевые ощущения. При том их эффективность была выше чем у рутина [88]. Известно, что Р-витаминной активностью обладают индивидуальные вещества: рутин, кверцетин, изокверцетин, (+)-катехин, (-)-галлокатехин, неокисленный танин винограда и антоцианы [13, 89]. Р-Витаминная активность катехинов в 2 раза выше, чем у рутина при одинаковой концентрации. Катехины восстанавливают нарушенную микроциркуляцию крови, улучшают эластичность сосудов, оказывают гипохолестеринемическое действие, обладают атеросклеротическим свойством [89]. Советские исследователи [90] показали, что препарат танина и (-)-эпикатехина обладает Р-витаминным действием. Катехины чайного листа повышают резистивность стенок кровеносных сосудов и способствуют усвоению аскорбиновой кислоты организмом человека и животных.

Показано, что увеличение капиллярной устойчивости проантоцианидинами является следствием их влияния на витамин С. Проантоцианидины способны восстанавливать дегидроаскорбиновую кислоту до аскорбиновой кислоты, которая, в свою очередь, ответственна за увеличение капиллярного кровоснабжения

91].

3.5.11. Антимикробные свойства

К числу важнейших биологических свойств полифенолов относится их антимикробное действие. Катехины зеленого чая обладают бактерицидным и бактериостатическим действием, и эффективны для лечения дизентерии. Дубильные вещества обладают антимикробным действием в отношении широкого спектра микрорганизмов, в частности, к Staphylococcus aureus 209, а танины в дозах 2 г/л незначительно задерживает брожение и угнетает рост Candida mycoderma. Антоциановым пигментам также отводится роль в защите растений от бактериальных заболеваний, в частности, мальвидин обладает бактерицидными свойствами против Escherichia coli. Не все микроорганизмы одинаково реагируют на присутствие антоцианов. Рост одних микроорганизмов ингибируется гликозидами антоцианов, рост других - их агликонами. Наибольшим ингибирующим действием обладает пеонидин -как в форме гликозидов так и в форме агликона. Мальвидин, петунидин и дельфинидин менее активны. Моногликозиды антоцианов тормозят развитие Botrytis cinerea. Агликон пеонидина ингибирует рост Botrytis cinerea. [13].

Подкисленные экстракты антоцианов значительно эффективнее проявляли бактерицидные свойства, чем экстракты с нейтральным рН. Положительные результаты применения катехинов были получены при различных инфекционных заболеваниях кожи и глаз. Экстракты, содержащие катехины в концентрациях от 250 мг/л, задерживают рост кариогенных бактерий, в том числе стрептококковых способствующих разрушению зубной эмали, ингибируя бактериальный синтез глюканов [89].

Было изучено действие дигликозидов антоцианов на вирусы гриппа А и Б. 3-0-а-Ь-Рамнозилпиранозил-р-В-глюкопиранозил-цианидин и 3-О-Р -D-глюкопиранозил-цианидин показали более высокую противовирусную активность чем З-0-a-L-рамнозилпиранозил-р-О-глюкопиранозил-дельфинидин и 3-0-Р-Е)-глюкопиранозил-дельфинидин. Производные дельфинидина не инактивировали вирусы, но замедляли заражение клеток и препятствовали размножению вирусов в зараженных клетках.

92]. Также показано, что катехины обладают инактивируют вирусы гриппа и герпеса [89]. Японские ученые обнаружили, что эпигаллокатехингаллат блокирует инвазионную способность ретро - и энтеровирусов in vitro. Галлированные катехины показали выраженный эффект на распостранение вирусов в тканях, замедляя его на

96%. Некоторые из полифенолов являются ингибиторами обратной транскриптазы вируса человеческого имунодефицита [89].

3.5.12. Противопухолевая активность

Исследование УФ-индуцированного канцерогенеза на мышах показало, что эпигаллокатехигалат способен предупреждать развитие опухолей кожи. Так у первоначально здоровых мышей, облученных УФ, в дозе 30 мДж/см2 и предварительно получивших 6,5 мкмоль эпигаллокатехигалата вероятность развития злокачественных опухолей уменьшилась с 66 до 55% по сравнению с контролем. Также возросла частота апоптоза злокачественных новообразований с 72 до 87%. [93]. Использование экстрактов проантоцианидинов из косточек винограда с пищей, содержащей от 0,2 до 0,5 весовых процентов, предупреждает злокачественное превращение папилом в карциномы [94] на 45%; уменьшая количество карцином на 65%, и уменьшая размер карцином в 75% случаев. Антиопухолевые свойства антоцианов изучали влияние цианидин-З-О-Р-Б-глюкозида, выделенного в чистом виде из кожицы красного винограда на развитие опухолевых клеток лейкемии человека, культуры Molt 4 В. Добавление антоциана вело к появлению морфологических изменений, характерных для апоптоза клеток лейкемии с четко выраженной зависимостью эффекта от концентрации. Таким образом, японскими учеными [95] было установлено, что антоцианы вызывают апоптоз клеток лейкемии. Синтез ароматазы играет большую роль в пролиферации клеток рака груди и перспективным способом предотвращения рака груди является подавление образующихся эстрогенов [96]. Ингибиторами ароматазы являются многие полифенолы, известны в этом качестве и антоцианы, экстрагируемые из красного винограда. Показано что способность антоцианидинов, вызывать апоптоз клеток лейкемии, связана с . их способностью проявлять прооксидантные свойства [97,98]

3.5.13. Антимутагенная активность

Группой исследователей показано, что кверцетин (0,5 - 8 нмоль) и аскорбиновая кислота (0,1 - 100 ммоль) проявляли антимутагенные свойства, которые усиливались при их совместном применении, т.е. проявлялся синергический эффект, также наблюдалась явная зависимость эффекта от их концентраций. Показана четкая корреляция антимутагенных свойств с антиоксидантной активностью [99].

3.6. Методы выделения и очистки полифенолов винограда

3.6.1. Предварительная очистка субстрата

Предварительная обработка биомассы низкокипящим петролейным эфиром или гексаном позволяет освободить материал от стеролов, каротеноидов, хлорофиллов и т.д. [100]. Авторы [101,102] предлагают вести очистку антоцианов от прочих менее полярных флавоноидов реэкстракцией примесей этилацетатом полученного ранее и сконцентрированного водно-метанольного экстракта.

Для удаления гидрофобных примесей перед экстракцией антоцианов также используют сжиженную двуокись углерода [103].

3.6.2. Экстракция

Чаще всего растительный материал высушивают перед экстракцией [101]. Выбор экстрагента для выделения флавоноидов зависит от полярности экстрагируемых веществ. Ягода винограда содержит флавоноиды с различной полярностью: как менее полярные соединения - олигомерные проантоцианидины и флавонолы, так и более полярные - катехины, лейкоантоцианидины, гликозиды флавонолов, а также антоцианы. Гликозиды флавоноидов извлекают из виноградного жмыха с помощью подкисленных соляной или сернистой кислотами спиртов, ацетона, воды или водными смесями спиртов и ацетона [104]. Антоцианы также экстрагируют полярными растворителями, например, метанолом с небольшим с содержанием соляной или муравьиной кислот [105]. Распространена экстракция антоцианов метанолом с добавлением соляной кислоты до концентрации 0,12 М [106], так как понижение рН предотвращает разрушение антоциановых пигментов. Недостатком экстракции в кислотной среде является то, что даже в низкой концентрации, кислота вызывает частичный гидролиз гликозидов антоцианов. Применяют также [100] водную экстракцию антоцианов с добавлением соляной кислоты до концентрации 0,12 М. В сравнении с экстракцией подкисленным метанолом экстракция ацетоном позволяет избежать проблем с загрязнением экстракта пектинами и позволяет удалять экстрагент при более низкой температуре [104]. Для выделения максимального количества антоцианов имеет значение и количество последовательных экстракций: так троекратная экстракция 95% этиловым спиртом, при обычной для экстракции температуре 40-60°С, позволяет извлечь из сырья около 95% пигмента [107].

3.6.3. Хроматографическая очистка

Для выделения индивидуальных антоцианов ранее применяли БХ и ТСХ на силикагеле и полиамиде [108]. Для разделения полифенолов красного винограда использовали чаще всего системы содержащие воду, метиловый, этиловый, изопропиловый спирты и кислоты: муравьиную, соляную, уксусную, трихлоруксусную. Также в хроматографических системах использовали гидрофобный растворитель, например, бутанол, этилацетат, бутилацетат, бензол или толуол [13, 108]. Выделение антоцианов БХ обычно проводили в две стадии: разделение антоцианов в системах растворителей БУВ с различным соотношением компонентов. Затем проводили хроматографию в 15% водном растворе уксусной кислоты для отделения продуктов окисления [13, 102, 108]. При БХ иногда использовали электрофорез [105]. В качестве сорбентов для ТСХ используют микрокристаллическую целлюлозу, полиамид или силикагель.

Из методов колоночной хроматографии нашли применение распределительная и ионообменная хроматография, основными сорбентами, для которых служат силикагель, окись алюминия, целлюлоза и ионообменные смолы. В качестве элюентов обычно используют водные растворы муравьиной и уксусной кислот, водно-спиртовые или водно-метанольные растворы с добавлением соляной или трихлоруксусной кислот. Известен метод выделения смеси антоцианов из экстракта сорбцией на твердом носителе Cis картриджах. Антоцианы с большим количеством незамещенных гидроксильных групп хорошо адсорбируются и, в последствии, элюируются полярными растворителями [109]. В другом методе растительный экстракт, содержащий антоцианы, последовательно пропускают через три колонки с алюмогелем марки A-I а при температуре 70°С. Десорбцию проводят в противотоке спиртовым раствором 10% лимонной кислоты [110]. При применении ионообменных смол и микрокристаллической целлюлозы получали смесь антоцианов со степенью обогащения до 88% [111, 112]. Советскими исследователями был предложен способ выделения антоцианов с помощью сорбции на тальке. Для этого из экстракта удаляли спирт, смешивали полученный раствор с тальком и фильтровали. Примеси, в том числе танины, смывали с талька дистиллированной водой. Затем антоцианы смывали подкисленным спиртом [13]. Танины с молекулярным весом более 500 Да можно отделить от антоцианов с помощью гель-хроматографии на сефадексе-25 [113]. Известен способ разделения антоцианов на колонке с несколькими сорбентами: силикагеле G, поливинилпирролидоне, и силикагеле с последующим градиентным элюированием водой, муравьиной кислотой и метанолом [114].

Наилучшего разделения антоцианов достигали с помощью полупрепаративной ВЭЖХ - этот метод получил наибольшее распространение для разделения антоцианов. Использование Cis (19 * 150 мм) колонки позволяет добиться наилучшего разделения и идентифицировать различные флавоноиды. Обычно применяют градиентное элюирование смесями метанола и ацетонитрила с добавками муравьиной, уксусной, фосфорной или трифторуксусной кислот [115,116].

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Птицын, Андрей Владимирович

6. Выводы

1. Подобран наиболее эффективный экстрагент и оптимальный температурный режим для получения водно-пропиленгликолевого экстракта жмыха красного винограда УШэ \inifera сорта "Изабелла" для последующего применения в косметике. Найдены условия разделения антоцианов с помощью дробной экстракции.

2. Разработана технологическая схема выделения как смеси, так отдельных антоцианов красного винограда с использованием внедренных нами методов:

А)) Очистка смеси антоцианов сорбцией совмещенной с флэш-хроматографией на тальке позволяет на 15-20% сократить потери антоцианов по сравнению с применением сорбции на тальке. Б) Хроматографическое разделение антоцианов колоночной и флэш-хроматографией на силикагеле в системах бутанол-уксусная кислота-вода и этилацетат-уксусная кислота-вода, отличающиеся от предшествующих методов простотой процесса и тем, что постоянный состав элюирующей системы облегчает регенерацию смеси растворителей. В) Осаждение эфира кофейной кислоты М-З-г хлористым метиленом из спиртовых растворов.

3. Исследован состав флавоноидов красного винограда УШэ \inifera сорта Изабелла. Выделены и идентифицированы индивидуальные флавоноиды этого сорта винограда: 3-0-р-0-глюкозилокси-4',5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид; З-О-Р-Б-глюкозилокси-(6-0-(4-гидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид; 3-0-р-0-глюкозилокси-(б-0-(3,4-дигидроксициннамоил))-4',5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид; 3',4'-дигидроксифенил-3,4-дигидро-2Н-хромен-3,5,7-триол; 4',3,5,7-тетрагидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорид и 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавон.

4. Дополнены известные ранее данные об антиоксидантной и антирадикальной активности полифенолов и флавоноидов красного винограда. Определен вклад основных структурных единиц (количество фенольных групп, наличие оксо-группы в С4 положении, наличие двойной С2-С3 связи) на антирадикальную активность. Показано, что экстракт красного винограда УШз уМ/ега проявляет более высокие антиоксидантную и антирадикальную активность, чем индивидуальные вещества.

5. Показано, что полифенолы, обладающие антиоксидантными и антирадикальными свойствами, повышают спонтанную сократительную активность кровеносных сосудов кожи после гипоксии и препятствуют набуханию эпидермиса вызванного действием прооксидантов. Также показано наличие прямой зависимости между антирадикальной активностью флавоноидов и увеличением спонтанной сократительной активностью кровеносных сосудов кожи с коэффициентом корреляции г2 = 0,71

6. Показано, что УФ-протекторные свойства антоцианов, введенных в кремовую основу, вызваны их антиоксидантным действием, а не способностью поглощать УФ. Также показано наличие прямой зависимости УФ-протекторных свойств от концентрации при их содержании от 0,16 до 0,72 мг/мл.

7. Для подтверждения устойчивости флавоноидов в косметических композициях и хранении были определены полупериоды окисления флавоноидов при различных значениях рН и показана динамика окисления при нагревании до 40°С в течении месяца. При этом не было обнаружено наличия прямой зависимости между скоростью окисления и антиоксидантной активностью. Показано, что экстракт красного винограда, введенный в косметические композиции, обладает на 59% большей устойчивостью при хранении, чем смесь антоцианов.

8. Показано, что смесь мальвидин-3-глюкозида и его эфиров более чем на 70% ингибирует рост ЪасЬаготусеь сегЫз1ае расы 14 22*103 кл./мл при концентрации антоцианов - 0,3 мг/мл в культуральной среде.

7. Благодарности

Генеральному директору ЗАО НПО "Техкон" доктору физико-математических наук Мухтарову Эдгару Илаловичу за консультации при разработке продуктов относительно их актуальности и перспектив применения в косметике, а также возможность проводить экспериментальные исследования в НТЦ при ЗАО НПО "Техкон".

Заведующему кафедры биотехнологии МИТХТ Швецу Виталию Ивановичу.

Заведующему лаборатории Биофизики ЗАО НПО "Техкон'Тимофееву Александру Борисовичу.

Заведующей лаборатории Микробиологии ЗАО НПО "Техкон" Пичугиной Татьяне Викторовне.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Птицын, Андрей Владимирович, 2007 год

1. Mazza G. Anthocyanins in grapes and grape products // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1998, V.35. N.4. P. 341-371.

2. Бранд-Гарнис Э., Вандансик П. Флавоноиды в косметике // Косметика и медицина. 2001, N. 5. С. 22-45.

3. Сизова Н.В. Биофлавоноиды антиоксиданты, имуномодуляторы, капиляропро- в косметологии: антиоксидантное,бактерицидное и солнцезащитное действие. Тезисы на IX международной научно-практической конференции // Сырье и упаковка. 2001, N. 22. Р. 17-18.

4. Sokoloff В., Walter Н.Е., Redd J.B. The biological activity of a flavonoid (vitamin "P") compound // Clin Invest. 1951, V. 30. N. 4. P. 395-400.

5. Hou D.X., Ose Т., Lin S., Harazoro K., Imamura I., Kubo M., Uto T.,Terahara N., Yoshimoto

6. M., Fujii M. Anthocyanidins induceapoptosis in human promyelocytic leukemia cells: structureactivity relationship and mechanisms involved // Int. J. Oncol. 2003, V. 23. P. 705712.

7. Gu M, Singh RP, Dhanalakshmi S, Agarwal C, Agarwal R. Silibinin inhibits inflammatory and angiogenic attributes in photocarcinogenesis in SKH-1 hairless mice // Cancer Res. 2007, V. 67. N.7. P. 3483-3491.

8. Tixier G.R., Godeau R., Hornbeck. Evidence by In Vivo and In Vitro Studies that Binding of

9. Pycnogenols to Elastin Affects its Rate of Degradation by Elastases // Biochem. Pharmacol. 1984, V. 33, N. 24, P. 3933-3939.

10. Detre Z, Jellinek H, Miskulin M, Robert AM. Studies on vascular permeability in hypertension: action of anthocyanosides // Clin. Physiol. Biochem. 1986, N.4. P. 143-149

11. Stapleton A.E., Walbot V. Flavonoids can protect maize DNA from the induction of ultraviolet radiation damage // Plant Physiol. 1994, V.105. N. 3. P. 881-889.

12. Кондакова H.B., Заичкина С.И., Розанова O.M. Сахарова В.В. Противолучевые свойства лекарственного средства "диквертин" по микроядерному тесту in vivo при умеренных малых дозах ионизирующей радиации // Вопр. биол. мед. фарм. хим., 2002, N. 4. С. 46-49.

13. Edelmann A., Diewok J., Schuster К.С., Lendl. В., Rapid method for the discrimination of red wine cultivars based on mid-infrared spectroscopy of phenolic wine extracts // J. Agric. Food Chem. 2001, V. 49. N. 3. P. 1139-1145.

14. McDonald M.S., Hughes M., Burns J. Survey of the free and conjugated myricetin and quercetin content of red wines of different geographical origins // J. Agric. Food Chem. 1998, V. 46. P. 368-375.

15. Валуйко Г.Г. Биохимия и технология красного вина. М., Пищевая промышленность, 1973,256 с.

16. Su Т.С., Singleton, V.L. Identification of three flavan-3-ols from grapes // Phytochemistry. 1969, V. 8. P. 1553-1558.

17. WeingesK., Piretti M.V. Isolation of procyanidin В1 from grapes//Justus Liebigs Ann. Chem. 1971, V. 748. P. 218-220.

18. Haslam E. Natural proanthocyanidins. In The Flavonoids. Ed by Harborne, J.B., Mabry T.J. Mabry H. Chapman and Hall, London. 1975,505 p.

19. Lea G.H., Bridle A.P., Timberlake C.F., Singleton V.L. The procyanidins of white grapes and wines // Am. J. Enol. Vitic. 1979, V. 30. N.4. P. 289-300.

20. Fuleki Т., Silva R.D. Catechin and procyanidan composition of seeds from grape culfivars grown in Ontario // J. Agric. Food Chem. 1997, V. 45. P. 1156-1160.

21. Prieur C., Rigaud J., Cheynier V., Moutounet M. Oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds // Phytochemistry, 1994, V. 26. P. 781-784.

22. Ribereau-Gayon P. Les flavonoids de la baie dans le genre Vitis // Compt. Rend. Acad. Sci. France, 1964, N. 258. P. 1335-1337.

23. Singleton L.T. Localization of procyanidins in grape seeds // Am. J. Enol. Vitic. 1994, V. 45. P. 259-262.

24. Lee C.Y., Jaworski A.W. Fractionation and HPLC determination of grape wine // J. Agric. Food Chem. 1987, V. 35, N.2, P. 257-259.

25. Revilla E., Alonso E., Kovac V. The Content of Catechins and Procyanidins in Grapes and Wines as Affected by Agroecological Factors and Technological Practices // American Chemical Society, 1997. P. 69-80.

26. Дурмишидзе C.B., Урушадзе З.Д., Ушакова М.П., Антоциановые пигменты винограда, Сообщения АН Груз. ССР, 1958. Вып. 21. N.6. С. 677-679.

27. Кожевников Ю.Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии // Вопр. мед. химии. 1985, N. 5. С. 2-7.

28. Гусев В.А., Панченко Л.Ф. Супероксидный радикал и СОД в свободнорадикальной теории старения // Вопр. мед. химии. 1982, N. 4. С. 8-25.

29. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. Москва, Наука. 1972,252 с.

30. Нестеров Ю.В. Перекисное окисление липидов в легочной ткани крыс разного возраста в условиях острого эмоционально-болевого стресса // Вестник ОГУ. 2003, N. 6. С. 152-155.

31. Осипов А.Н., Якутова Э.Ш., Владимиров Ю.А. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа // Биофизика. 1993, Т. 38. N. 3. С. 390-396.

32. Болдырев А.А, Окислительный стресс и мозг // Соросовский образовательный журнал. 2001, N. 4. С. 21-28.

33. Блюменфелъд Л.А., Тихонов А. Н. Электронный парамагнитный резонанс // Соросовский Образовательный Журнал. 1997, N. 9. С. 91-99.

34. Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции // Соросовский Образовательный Журнал. 1999, N. 6. С. 25-32.

35. Владимиров Ю.А., Литвин Ф.Ф. Исследование сверхслабых свечений в биологических системах // Биофизика. 1959, Т. 4, N. 5. С. 601-605.

36. Владимиров Ю.А. Кальциевые насосы живой клетки // Соросовский Образовательный Журнал. 1998, N. 3. С. 20-27.

37. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. 1987, Т. 32. N. 5. С. 830-844.

38. Kinsella J.E., Frankel E.N., German В., Kanner J. Possible mechanisms for the protective role of antioxidants in wine and plant foods // Food Technology. 1993, V.47. P. 85-89.

39. Conner E.M., Grisham M.B. Inflammation, free radicals, and antioxidants // Nutrition. 1996, V. 12. N. 4. P. 274-277.

40. Infante R. Polifenoles del vino у oxidabilidad de las lipoproteinas Blanco о tinto. Clin. Invest. Arterioesclerosis. 1997, N. 9. P. 19-22.

41. Aviram M., Interaction of oxidized low density lipoprotein with macrophages in atherosclerosis, and the antiatherogenicity of antioxidants // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1996, V. 34. P. 599-608.

42. Sichel G., CorsaroC., Scalia M., Bilio A. J., Bonomo R.P. In vitro scavenger activity of some flavonoids and melanins against *Ог" // Free Radic. Biol. Med. 1991, N. 1. P. 1-8.

43. Tsuda T, Shiga K, Ohshima K, Kawakishi S, Osawa T. Inhibition of lipid peroxidation and the active oxygen radical scavenging effect of anthocyanin pigments isolated from Phaseolus vulgaris Lll Biochem. Pharmacol. 1996, V. 52 P. 1033-1039.

44. Wang H., Cao G., Prior R.L. The oxygen radical absorbing capacity of anthocyanins // J. Agric. Food Chem. 1997, V. 45. P. 304-309.

45. Sabe V. A., Tromp M., Haenen G., V. Vijgh, Bast A. Flavonoids as scavengers of nitric oxide radical. Biochem. Biophys // Res. Commun. 1995, V. 214. P. 755-759.

46. Vinson J.A., Dabbagh Y.A., Serry M.M., Jang J., Plant flavonoids, especially tea flavonoids, are powerful antioxidants using an in vitro oxidation model for heart disease // J. Agric. Food. Chem. 1995, V. 43. P. 2800-2802.

47. Sabe V. A., Tromp M., Berg V.D., Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids // Free Radic. Biol. Med. 1996, V. P.20. P. 331-342.

48. Bagchi D., Bagchi M., Stohs S., Ray S.D., Cellular protection with proanthocyanidin derived from grape seeds // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002, V. 957. P. 260-270.

49. Bagchi M., Balmoori J., Bagchi D. Smokeless tobacco, oxidative stress, apoptosis, and antioxidants in human oral keratinocytes // Free Radic. Biol. Med. 1999, V. 26. N. 7-8. P. 992-1000.

50. Frankel E.N., Waterhouse A.L., Teissedre P.L. Principal phenolic phytochemicals in selected Califomian wines and their antioxidant activity in inhibiting oxidation of human low-density lipoproteins // J. Agric. Food Chem. 1995, V. 43. P. 890-894.

51. Masquelier J. Procyanidolic oligomers (Leucocyanidins) translated from French. // Parfums Cosmetiques Aromes. 1990, V. 95. N. 4. P. 89-97.

52. Frankel EN, Kanner J, German, et al.: Inhibition of oxidation of human low-density lipoprotein by phenolic substances in red wine // Lancet. 1993, V. 341. P. 454-457.

53. Meunier M.T., Duroux E., Bastide P. Free-Radical Scavenger Activity of Procyanidolic Oligomers and Anthcyanosides with Respect to Superoxide Anion and Lipid Peroxidation. // Plants medicinales h phytotherapie, 1989, V. 23. N.4. P. 267-274.

54. Fang J.Y., Hung C.F., Hwang T.L., Huang Y.L. Physicochemical characteristics and in vivo deposition of liposome-encapsulated tea catechins by topical and intratumor administrations // J. Drug. Target. 2005, V. 13. N.l. P. 19-27.

55. Romay C., Castillo M.C., Pascual C. Evaluation of the total content of antioxidants incomplex mixtures. Ciencia e Cultura // Journal of the Brazilian Association for the Advancement of Science 1996, V. 48. P. 86-95.

56. Price S.F., Breen P.J., Vallado M., Watson B.T. Wine phenolic responses to cluster sun exposure // ASEV Tech 1994 Abstr. 4.

57. Meyer A.S., Yi 0., Pearson D.A., Waterhouse A., Frankel E. Inhibition of human lowdensity lipoprotein oxidation in relation to composition of phenolic antioxidants in grapes // J. Agric. Food Chem., 1997, V. 45, P. 1638-1643.

58. Ursini F., Tubaro F., Rapuzzi P., Zamburlini A., Maiorino M. Wine antioxidants: Effects in vitro and in vivo // Wine and Human Health, 1997, V 6. N. 4, P. 449 450

59. Kerry N.L., Abbey M., Red wine and fractionated phenolic compounds prepared from red wine inhibit low density lipoprotein oxidation in vitro // Atherosclerosis. 1997, V.135. P. 93102.

60. Ghiselli A., Nardini M., Baldi A., Scaccini C., Antioxidant activity of different phenolic fractions separated from an Italian red wine // J. Agric. Food Chem. 1998, V. 46 P. 361-367.

61. Briedis V., Povilaityte V., Kazlauskas S., Venskutonis P.R. Polyphenols and anthocyanins in fruits, grapes juices and wines, and evaluation of their antioxidant activity // Medicina (Kaunas). 2003, V. 39. N. 2. P. 104-112.

62. Bravo L., Polyphenols: Chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance // Nutr. Rev. 1998, V. 56. P. 317-333.

63. Rice-Evans C.A., The identification of flavonoids as glycosides in human plasma // FEBS Letters, 1997, P.401. P. 78-82.

64. Hoilman P .C., Van Trijp J. M., Buysman M.N., Relative bioavailability o f the antioxidant quercetin from various foods in man // FEBS Letters, 1997, V. 418. P. 152-156.

65. Fuhrman B., Lavy A., Aviram M. Consumption of red wine with meals reduces the susceptibility of human plasma and low density lipoprotein to lipid peroxidation // Am. J. Clin. Nutr. 1995, V. 61. P. 549-554.

66. Kondo K., Matsumoto A., Kurata H. Inhibition of oxidation of low-density lipoprotein with red wine // Lancet, 1994, V. 344, P.l 152-1158.

67. Vinson J.A., Jang J., Plant polyphenols exhibit lipoprotein-bound antioxidant activity using in vitro oxidation model for heart disease // J. Agric. Food Chem. 1995, V. 43. P. 2798-2799.

68. Rice-Evans C. Flavonoids and Other Polyphenols (Methods in Enzymology) // Packer, L. Ed. Academic Press, San Diego, 2001, V. 335. P. 266-272.

69. Heim K. E., Tagliaferro A. R., Bobilya D. J. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and sructure-activity relationships//J. Nutr. Biochem. 2002,13. P. 572-584,

70. Terao J., Piskula M., Yao Q., Protective effect of epicatechine epicatechine gallate and quercetine on lipid peroxidation im phospholipids bilayers // Arch. Biochem. Biophys. 1994, P. 278-284.

71. Burda S., Oleszek W., Antioxidant and antiradical activities of flavonoids // J. Agric. Food Chem., 2001, V. 49. P. 2774-2779.

72. Farkas 0., Jakus J., Héberger К., Quantitative Structure Antioxidant Activity Relationships of Flavonoid Compounds // Molecules. 2004, N. 9, P. 1079-1088.

73. Miller NJ, Rice-Evans CA. Cinnamates and hydroxybenzoates in the diet: antioxidant activity assessed using the ABTS radical cation // British Food Journal. 1997, V. 99. P. 5761.

74. Saskia А. В. E., M. J. de Groot, D. J. van den Berg M. N. J. L. Tromp, G. D. O. den Kelder, W. J. F. van der Vijgh, A. Bast. Quantum Chemical Explanation of the Antioxidant Activity of Flavonoids // Chem. Res. Toxicol. 1996. N. 1305 1312.

75. Cao A. G., Sofie E., Prior R. L. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: Structure activity relationships // Free Radical Biol. Med. 1997, V. 22. P. 749-760.

76. Arora A., Nair M. G., Strasburg G. M. Structure-activity relationships for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system // Free Radical. Biol. Med. 1998, V. 24. P. 1355-1363.

77. Heijnen C. G., Haenen G. R. van Acker F.A., van der Vijgh W. J. Bast A. Flavonoids as peroxynitrite scavengers: the role of the hydroxyl groups // Toxicol, in Vitro. 2001, V. 15, N. l.P.3-6.

78. Hansch C., Leo A. Exploring QSAR. Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology, American Chemical Society, Washington, 1995.

79. Amie D., Davidovic D., Beslo D., Trinajstic N. Structure-Radical Scavenging Activity Relationships of Flavonoids // Croat. Chem. Acta. 2003, V. 76. N. 1. P. 55-61.

80. Boniface R., Robert A.M. Effect of anthocyanins on human connective tissue metabolism in humans // Klinische Monatsblatter furAugenheilkunde. 1996, N. 209. P. 368-372.

81. Kuttan, R., Donnelly P., DoFerrante N., Collagen Treated With (+) Catechin Becomes Resistant to the Action of Mammaliam Collagenase // Birkhauser Verlag, Basel, Schweiz, 1981, P. 221-223.

82. Kanner J., Frankel E., Graint R., German J., Kinsella J.E. Natural antioxidants in grape and wine // J. Agric. Food Chem. 1994, V. 42. P. 64-69.

83. Гладкова H.K., О пользе, вреде и защите от солнца // Сырье и упаковка 2003, N. 10 Вып. 39, С. 16-18.

84. Lietti A, Cristoni A, Picci M. Studies on Vaccinium myrtillus anthocyanosides. I. Vasoprotective and antiinflammatory activity// Arzneimittelforschung. 1976, Vol. 26. N. 5. P. 829-832.

85. Wang H., Nair M.G., Strasburg G.M., Chang YC, Booren A.M., Gray J.I., DeWitt D.L, Antioxidant and antiinflammatory activities of anthocyanins and their aglycon, cyanidin, from tart cherries // Am. J. Clin. Nutr. 2005, V. 81. P. 313-316.

86. Costantini A, De Bernardi T, Gotti A. Clinical and capillaroscopic evaluation of chronic uncomplicated venous insufficiency with procyanidins extracted from Vitis Vinifera II Minerva Cardioangiol. 1999, Vol. 47. N. 1-2. P. 39-46.

87. Комарова E.JL, Катехины зеленого чая (Camellia sinensis (L.) Kuntze) в косметической продукции, как активные и вспомогательные компоненты // Сырье и упаковка. 2002, N 3. Вып. 22. С. 17-18.

88. Курсанов А.Л.,Букин В.Н., Поволоцкая К.Л., Запрометов М.Н., Сборник: Биохимия чайного производства, 1950, Вып. 6. С. 170-180.

89. Cossins Е., Lee R., Packer L., ESR studies of vitamin С regeneration, order of reactivity of natural source phytochemical preparations. Biochem // Mol. Biol. Int. 1998, V. 45. N. 3. P. 583-597.

90. Knox Y.M., Hayashi K., Suzutani Т., Ogasawara M., Yoshida I., Shiina R., Tsukui A., Terahara N., Azuma M. Activity of anthocyanins from fruit extract of Ribes nigrum L. against influenza A and В viruses // Acta Virol. 2001, V. 45. N. 4. P. 209-215.

91. Yao-Ping Lu, You-Rong Lou, Jian-Guo Xie, Topical applications of caffeine or (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) inhibit carcinogenesis and selectively increase apoptosis in UVB-induced skin tumors in mice // PNAS, V. 99. N 19. P. 12455-12460.

92. Mittal A., Elmets C.A., Katiyar S.K. Dietary feeding of proanthocyanidins from grape seeds preventphotocarcinogenesis in SKH-1 hairless mice: relationship to descreased fat and lipid peroxidation// Carcinogenesis, V. 24, N 8. P. 1379-1388.

93. Pouget С., Lauthier F., Simon A., Fagnere C., Basly J. P., Delage C., Chulia A. J., Flavonoids: structural requirements for antiproliferative activity on Breast cancer cells // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, V. 11. P. 3095-3097.

94. D e-Xing H., T akashi О., S higang L., К azuhiro HIzumi I., M ayumi К., A nthocyanidins induce apoptosis in human promyelocytic leukemia cells: Structure-activity relationship and mechanisms involved. Internat. J. of oncology. 2003, V. 23. P. 705-712.

95. Dickancaite E., Nemeikaite A., Kalvelyte A., Cenas N., Prooxidant character of flavonoid cytotoxicity: structure-activity relationships // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998, V. 45. P. 923930.

96. Geetha Т., Malhotra V., Chopra K., Kaur I.P, Antimutagenic and antioxidant/prooxidant activity of quercetin // Indian J. Exp. Biol. 2005, V. 43. N. 1. P. 61-67.

97. Markham K.R., Mabry T.J. The Flavonoids. Chapman and Hall, London. 1975,1127 p.

98. Asen S. High pressure liquid chromatographic analysis of flavonoid chemicalmarkers in petals from Gerbera flowers as an adjunct for cultivar and germplasm indentification // Phytochem. 1984, V. 23. P. 2523-2526.

99. Harborne J.B. Grayer, R.J. The anthocyanins. In J.B. Harborne, ed, The flavonoids, advances in research since, 1980, Chapman and Hall, London and New York. 530 p.

100. Квасенков О.И., Андронова О.И., Касьянов Г.И., Ломачннский В.А. Линия производства красного пищевого красителя из плодово-ягодных выжимок. Патент РФ N2057153/C1.2001.

101. Garcia-Viguera С., Zafrilla P., Tomas-Barberan, The use of Acetone as an Extraction Solvent for Anthocyanins from Strawberry Fruit Phytochem // Anal. Chim. Acta. 1998, N. 9. P. 270-274.

102. Costa C.T., Horton D., Margolis S.A. Analysis of anthocyanins in food by lipid chromatography, liquid chromatography-mass spectrometry and capillary electrophoresis // J. Chromatog. A. 2000, N. 81. P. 403-410.

103. Revilla E., Ryan J.M.Martin-Ortega. G., J Comparison of several procedures used for the extraction of anthocyanins from red grapes // Agric. Food Chem. 1998, V. 46. P. 4592-4597.

104. Один А.П., Хайрутдинова А.Д., Болотов B.M. Способ получения антоцианового красителя из цветочного сырья, Патент РФ № 2220172/С1,2002.

105. Бандюкова В.А., Шинкаренко А.Л. Тонкослойная хроматография флавоноидов. Методические рекомендации, Пятигорск 1975.

106. Kraemer-Schafhalter A., Fuchs Н., Pfannhauser W. Solid Phase Extraction (SFE) - a comparison of 16 Materials for the Purification of Anthocyanins from Aronia melanocarpa var. Nero // Food Agric. Sci., 1999, V. 78. P. 435-439.

107. Черепнин B.C., Болотов В.М., Зотов А.П., Зуева С.Б., Гаркавцева О.И. Способ получения пищевого флавоноидного красителя из растительного сырья, Патент РФ N 2134280/С1.

108. Freeberg D.R., Gertenbach D., Richheimer S.L., Bailey D.T., Daugeherty F.J., Gourdon G.T., Tempesta M.S. Efficient method for producing compositions enriched in anthocyanins. Patent №. US6780442,2001.

109. Slimestad R. Process for preparation of anthocyanin-containaing products. Patent №. W003039569,1998.

110. Somers T.C. Wine tannins isolated of condensed flavonoid pigments by gel-filtration // Nature. 1966, V. 209. P. 368-370.

111. Johnston T.V., Morris J.R. Separation of Anthocyanin pigments in wine by low pressure column chromatography//J. Food Sci. 1996, V. 61. N. 1. P. 109-111.

112. Nogata Y., Ohta H., Yoza K-I., Berhow M., Hasegawa S. High-performance liquid chromatographic determination of naturally occurring flavonoids in citrus with a photodiode-array detector // J. Chromatogr. A, 1994, V. 667. P. 59-66.

113. Li Y., Che Q. Studies on chemical components of Carthamus tinctorius petals // Yao Xue, Xue Bao. 1998, V. 33. N. 8. P. 626-628.

114. Malien-Albert C.M, Dangles O., Amiot M.J., Influence of Proanthocyanidins on the Color Stability of Oenin Solutions // J. Agric. Food Chem. 2002, V. 50. P. 3299-3305.

115. Дмитриев А.Б., Мезенова Т.А., Тезисы докладов пятого всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям, Таллин, 22-24 сентября 1987.

116. Tang S, et al. Antioxidative effect of added tea catechins on susceptibility of cooked red meat, poultry and fish patties to lipid oxidation // Food Res. Int. 2001, V.34. P. 651-657.

117. Tang S, et al. Antioxidant activity of added tea catechins on lipid oxidation of raw minced red meat, poultry and fish muscle // Int. J Food Sci. Techn. 2001, V. 36. P. 685-692.

118. Tang SZ, et al. Antioxidative mechanisms of tea catechins in chicken meat systems // Food Chem. 2002, V. 76. P. 45-51.

119. Merzlyak M.N., Solovchenko A.E., Gitelson A.A. Reflectance spectral features and nondestructive estimation of chlorophyll. Carotenoid and anthocyanin с ontent in apple fruit // Postharv. Biol, and Technol. 2003, V. 27. P. 197-211.

120. Mozeti В., Treble P., Hribar J. Determination and Quantitation of Anthocyanins and

121. Hydroxycinnaraic Acids in Different Cultivars of Sweet Cherries (Prunus avium L.) from Nova Gorica Region (Slovenia), Food Technol // Biotechnol. 2002, V. 40. N. 3. P. 207212.

122. Harborne J.B., The chromatographic identification of anthocyanin pigments // J. Chromatogr. 1958, V. 1. N. 6. P. 473-488.

123. Porter L. J., Hirstich, L. N., Chan, B. G. The Conversion of Procyanidins and

124. Prodelphinidins to Cyanidin and Delphinidin // Phytochemistry. 1986, V. 25. N. 1. P. 223-230.

125. Луценко Н.Г., Практикум по технологии косметических средств, Биологически активные вещества в косметике, Москва 2004,156с.

126. Martin MR. Photostability of cosmetic ingredients on the skin // Cosmetics&Toiletries. 1997, V. 112. P. 65-72.

127. Yi O.S., Han D., ShinH.Q. Synergistic antioxidative effects of tocopherol and ascorbic acid in fish oil (lecitin)/water system // Ital. J. Biochem. 1981, V. 30. P. 54-62.

128. Harman D. Free radical theory of aging // Mutat Res. 1992, P. 2753-2756.

129. Azam S., Hadi N., Khan N.U., Hadi S.M., Antioxidant and prooxidant properties of caffeine, theobromine and xanthine // Med. Sci. Monit. 2003, V. 9. N. 9. P. 325-330.

130. Gueffroy D. E., Kepner R. E., Webb, A. D. Acylated anthocyanin pigments in Vitis vinifera grapes: Identification of malvidin-3-(6-p-coumaroyl)-glucosid // Phytochemistry, 1971, V. 10. P. 813-819.

131. Птицын A.B., Каплун А.П., Мухтаров Э.И., Швец В.И.Выделение и очистка антоцианов винограда Vitis vinifera сорта Изабелла // Биотехнология. 2007, №2, С.

132. ТУ N. 915412-025-05850619-2006.

133. Птицын А.В, Мухтаров Э.И., Каплун А.П., Мухтарова С.Э. Способ выделениябиологически активных антоцианов. Патент РФ № 2302423,2007.

134. Птицын А.В., Каплун А.П., Мухтаров Э.И., Мухтарова С.Э., Михайлова Н.А., Иванова Г.Л. Выделение и очистка антоцианов красного винограда Vitis vinifera. Тезисы на международный форум "Биотехнология и современность". 2005, Санкт Петербург, С. 52.

135. Сорокоумова Г.М., Селищева А.А., Каплун А.П. Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде. М.: МИТХТ им М. В. Ломоносова, 2000,100 с.

136. Seeram N.P., Henning S.M., Niu Y., Lee R., Scheuller H.S., Heber D. Catechin and caffeine content of green tea dietary supplements and correlation with antioxidant capacity // Agric. Food Chem. 2006, V. 54. N. 5. P. 1599-1603.

137. Azam S., Hadi N., Khan N.U., Hadi S.M. Antioxidant and prooxidant properties of caffeine, theobromine and xanthine // Med Sci Monit. 2003, N. 9. P. 325-330.

138. Doka O., Bicanic D. Determination of total polyphenols content in red wines by means of the combined He-Ne laser optothermal window and Folin-Ciocalteu colorimetry assay//Anal Chem. 2002, V.74. N. 9. P. 2157-2161.

139. Mulder T. P., Rietveld A.G., Amelsvoort J.M. Consumption of both black tea and green tea results in an increase in the excretion of hippuric acid into urine // American Journal of Clinical Nutrition. 2005, V. 81. N. 1. P. 256-260.

140. Pellegrini N., Simonetti P., Gardana C., Brenna O., Brighenti F. Polyphenol Content and Total Antioxidant Activity of Vini Novelli (Young Red Wines) // J. Agric. Food Chem. 2000, V. 48. N. 3. P. 732 -735.

141. Schlesier K., Harwat M., Bhm V., Bitsch R. Assessment of antioxidant activity by; using different in vitro methods // Free Radical Research. 2002, V. 36. P. 177-187.

142. Brand-Williams, W.; Cuvelier, M. E., Berset, C. Use of free radical method to evaluate antioxidant activity// Lebensm. Wiss. Technol. 1995, V. 28. P. 25-30.

143. Lee С., Antioxidant ability of caffeine and its metabolites based on the study of oxygen radical absorbing capacity and inhibition of LDL peroxidation // Clin. Chim. Acta. 2000, V. 295. N. 1-2. P. 141-154.

144. Box G.E.P., Hunter W.G., Hunter J.S // Statistics for experiments. New York: Wiley. 1978.

145. Packer L., Witt E.H., Tritschler H.J. Antioxidant properties and clinical applications of alpha-lipoic a cid a nd d ehydrolipoic a cid // H andbook о f A ntioxidants. N ew Y ork, M arcel Dekker. 1996, P. 545-591.

146. Колчева P.А., Херсонова Л.А., Калунянц К.А., Садова А.И. Химико-технологический контроль пиво-безалкогольного производства. М.: Агропромиздат. 1988.272 с.

147. Тимофеев А.Б., Тимофеев Г.А., Птицын А.В., Фаустова Е.Е., Федорова В.Н. Резонансная реоластография новый метод исследования вазомоций в коже человека // Медицинская техника. 2006, N.5. С. 32-36.

148. Sun B.L., Zhang S.M., Xia Z.L., Yang M.F., Yuan H., Zhang J., Xiu RJ. L-arginine improves cerebral blood perfusion and vasomotion of microvessels following subarachnoid hemorrhage in rats // Clin Hemorheol Microcirc. 2003, V. 29. N. 3-4. P. 391-400.

149. Virdis A., Ghiadoni L., Sudano I., Buralli S., Salvetti G., Taddei S., Salvetti A. Endothelial function in hypertension: role of gender // J. Hypertens. 2002, V. 20. N. 2 P. 1167.

150. Fagrell B. Dynamics of skin microcirculation in humans // J. Cardiovasc Pharmacol. 1985, V. 7. N.3. P. 53-58.

151. Stucker M., Steinbrugge J., Memmel U., Avermaete A., Altmeyer P. Disturbed vasomotion chronic venous insufficiency// J. Vase. Surg. 2003, V. 38. N. 3. P. 522-527.

152. Птицын A.B., Каплун А.П., Пичугина T.B., Тимофеев А.Б., Мухтаров Э.И., Мухтарова С.Э. Антоцианы красного винограда Vitis vinifera: антиоксидантная активность, антимикробное и солнцезащитное действие // Ученые записки МИТХТ, 2005, Вып. 13. С. 58-64.

153. Птицын А.В., Мухтаров Э.И., Каплун А.П., Мухтарова С.Э. Флавоноиды красного винограда Vitis vinifera перспективы применения в медицине и косметике // Косметика и медицина. 2005, N. 3. С. 18-23.

154. Blois M.S. Antioxidant determination by the use of a stable free radical // Nature. 1958, V. 181. P. 1199-1200.