Технология получения и методы применения биопрепаратов на основе клубеньковых бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Косульников Юрий Витальевич

• Косульников Юрий Витальевич
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Косульников Юрий Витальевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Применение препаратов клубеньковых бактерий (инокулянтов) как элемент биологизированных технологий возделывания бобовых агрокультур

1.1.1 Роль симбиотической азотфиксации в повышении продуктивности агроценозов

1.1.2 Эффективность бобово-ризобиального симбиоза

1.1.3 Преимущества биологического азота над азотом минеральных удобрений и эффективность их совместного применения

1.2 Систематика, морфология и метаболизм клубеньковых бактерий

1.2.1 Систематика азотфиксаторов

1.2.2 Морфология клубеньковых бактерий

1.2.3 Метаболизм углерода у свободноживущих ризобий

1.2.4 Метаболизм азота у свободноживущих ризобий

1.2.5 Экология клубеньковых бактерий

1.3 Биотехнология клубеньковых бактерий

1.3.1 Современные формы инокулянтов

1.3.2 Технология получения препаратов ризобий

1.3.3 Устойчивость клубеньковых бактерий к химическим протравителям семян

1.3.4 Динамика сокращения числа жизнеспособных ризобий на инокулированных семенах

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Материалы исследований

2.1.1 Штаммы медленнорастущих и быстрорастущих видов симбиотических азотфиксаторов

2.1.2 Характеристики ферментеров

2.1.3 Сорта зернобобовых культур

2.1.4 Марки пестицидных протравителей

2.1.5 Виды водорастворимых полимеров, полисахаридов и сахаридов

2.2 Методы исследований

2.2.1 Метод приготовления бактериальных культур

2.2.2 Методы проведения опытов с бактериальными культурами

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Построение кривых роста медленнорастущих видов ризобий при периодическом и полунепрерывном режимах культивирования в ферментере объемом 500 л

3.2 Изучение влияния материала упаковки на динамику титра медленнорастущих видов ризобий в процессе хранения инокулянтов в складских условиях

3.3 Изучение факторов, влияющих на токсичность химических пестицидов для быстрорастущих и медленнорастущих видов ризобий при совмещении операций протравливания и инокуляции семян в один прием

3.4 Создание протектора медленнорастущих видов ризобий на инокулированных семенах на основе композиции водорастворимых полимеров, полисахаридов и сахаридов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ

По данным Организации экономического сотрудничества и развития к 2030 г. с использованием биотехнологий будет выпускаться более 50% сельскохозяйственной продукции. По решению Правительственной комиссии по высоким технологиям и инновациям от 1 апреля 2011 г. была разработана Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации №1853п-П8, утвержденная Председателем Правительства РФ. Данная Программа призвана заложить системные основы развития биотехнологии и биоэкономики в России, а также обеспечить базу для индустриального развития технологий микробного синтеза, нацеленных, в том числе, на выпуск биопрепаратов для сельского хозяйства. К данному направлению относится широкий спектр продуктов, таких как биоконсерванты растительного сырья (силосные закваски), пищевые добавки для скота и птицы на основе микроорганизмов (пробиотики), биологические средства защиты растений (биопестициды) и микробные удобрения на основе ассоциативной и симбиотической микрофлоры (Коломиец Э.И. Микробные биотехнологии как основа экологизации и повышения продуктивности сельскохозяйственного производства. Минск, 2018. Т. 10. С. 3-11; Соколенко Г.Г., Лазарев Б.П., Миньченко С.В. Пробиотики врациональном кормлении животных. 2015. №1. С. 72-78).

В качестве основы для создания биопрепаратов для растениеводства используются штаммы микроорганизмов, отличающихся высокой скоростью роста, экологической безопасностью и низкой чувствительностью к неблагоприятным почвенно-климатическим факторам (Kleinhempel H. Biological plant protection. 1990. V. 10, N6. P. 495-499). Ведущим направлением в разработке биопрепаратов нового поколения является создание стабильных микробных ассоциаций комплексного действия, в том числе на основе микроорганизмов с взаимодополняющими свойствами (Муродова С.С., Давранов К.Д. Комплексные микробные препараты. Применение в сельскохозяйственной практике. 2014. V.7, N6. С. 92-1010).

На сегодняшний день наблюдается тенденция замены дорогостоящих и экологически небезопасных минеральных удобрений микробными биопрепаратами. В качестве основы данных препаратов используются культуры ассоциативных фосфор- и калиймобилизующих микроорганизмов, а также симбиотических азотфиксаторов. В аграрно-развитых странах прием предпосевной инокуляции семян клубеньковыми бактериями обеспечивает сокращение потребления минеральных азотных удобрений на 25-40%. Лидерство по объемам производства инокулянтов сохраняется за биотехнологическими фирмами США, Франции и Великобритании. Практика предпосевной инокуляции широко распространяется и в Китае, где большинство провинций имеет биофабрики по выпуску инокулянтов (Itelima J.U. et al. A review: Biofertilizer - A key player in enhancing soil fertility and crop productivity. 2018. V. 2 (1). С. 22-28; Berger L.R. et al. Plant and soil characteristics affected by biofertilizers from rocks and organic matter inoculated with diazotrophic bacteria and fungi that produce chitosan. 2013. V. 13(3). С. 592-603).

Все большее распространение получают препараты азотфиксаторов и в странах СНГ, при этом, особое внимание уделяется созданию обширных коллекций микроорганизмов и селекции перспективных штаммов на повышение их активности и вирулентности. Специалисты Института микробиологии НАН Беларуси осуществили скрининг ассоциативных и азотфиксирующих микроорганизмов и разработали комплекс эффективных приемов использования бактерий для повышения продуктивности агробиоценозов (Шапошников А. И. Взаимодействие ризосферных бактерий срастениями: механизмы образования и факторы эффективности ассоциативных симбиозов. 2011. №3. C. 16-22). На базе указанных приемов созданы микробные удобрения с азотфиксирующей активностью («Ризобактерин», «Гордебак», «АгроМик», «Ризофос») для повышения урожайности зерновых и зернобобовых культур. Адаптация технологий получения препаратов к условиям производства и сырью, имеющемуся в Беларуси, обеспечивает их низкую себестоимость и, соответственно, потребительскую стоимость (2 у.е./га) (Благова Д.К. Искусственные

ассоциативные симбиозы между томатом и ризобиями, обладающими фунгистической активностью. 2015. Т. 50, №1. С. 107-114).

В Российской Федерации особое внимание уделяется разработке и производству препаратов клубеньковых бактерий для сои, так как в большинстве почв отсутствуют соответствующие микробные симбионты и необходимо искусственное обогащение почв этими микроорганизмами (Тильба В.А. Аборигенная популяция ризобий сои основной соесеющей зоны России. 1998. - 47 с.) Высокий спрос на инокулянты обуславливает широкое распространение контрафактной продукции, которая не удовлетворяет критериям качества биопрепарата, таким как близкая к 100% микробиологическая чистота, высокий титр целевого микроорганизма и его высокая хозяйственная эффективность. Однако, даже использование высококачественных инокулянтов с высоким титром не гарантирует образование обильных клубеньков на корнях инокулируемых растений, поскольку клубеньковые бактерии не способны образовывать защитную форму (спору, цисту и тд.) и, как следствие, их клетки характеризуются повышенной чувствительностью к многочисленным стрессам, которыми подвергаются бактерии в течение всего срока хранения инокулянта (недостаток кислорода, перепад температур, накопление в среде токсичных продуктов бактериальной жизнедеятельности и тд.) (Jan A. C. Vriezen, Frans J. de Bruijn, К. Nuslein. Responses of Rhizobia to Desiccation in Relation to Osmotic Stress, Oxygen, and Temperature. - 2007. - №11 vol 73. - p. 3451-3459). Кроме того, существует постоянный риск контаминации (заражения) продукции посторонней микрофлорой, способной в значительной степени снизить качество препарата.

Продолжая описание причин низкой эффективности промышленных инокулянтов стоит особенно отметить, что эффективность инокулянта зависит не только от поддержания стерильности производственных линий и соблюдения надлежащих условий хранения произведенных препаратов, но и от строгого следования научно-обоснованной методике применения препарата. Помимо указанного, необходимо:

1. совмещать приемы инокуляции семян с их протравливанием только теми пестицидными протравителями, которые не обладают сильно-выраженной токсичностью по отношению к ризобиям инокулянта;

2. завершать посев инокулированных семян в течение одних суток после их обработки, ввиду гибели ризобий на поверхности семян.

При своей кажущейся простоте данные положения являются достаточно труднособлюдаемыми в производственных условиях крупного хозяйства. Это связано с тем, что вплоть до настоящего времени не разработана методика эффективного совмещения инокулянтов и химических средств защиты растений (ХСЗР) в баковом растворе. Кроме того, необходима разработка новых методических приемов, обеспечивающих увеличение допустимого срока между обработкой семян и их посевом. Ограничение в 24 часа трудновыполнимо и финансовозатратно на больших посевных площадях. Невозможность эфективной заблаговременной инокуляции семян связана с отсутствием эффективных протекторов, повышающих жизнеспособность бактерий на обработанных семенах.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Технология получения и методы применения биопрепаратов на основе клубеньковых бактерий»

Актуальность темы исследования

Актуальность темы исследования обусловлена необходмостью решения проблемы дефицита белка в рационе населения, а также в птицеводстве и животноводстве путем более широкого возделывания бобовых культур, урожайность которых существенно возрастает в результате предпосевной обработки семян препаратами клубеньковых бактерий (ризобий). Данные препараты (инокулянты) применяют для образования на корнях растений клубеньков, формируемых в результате симбиотического взаимодействия бобовых растений и ризобий. В клубеньках происходит фиксация азота атмосферы и перевод его в биологически активную форму, доступную для растительных хозяев. В результате происходит повышение содержания белка в зеленой массе и зерне растений. Применение биопрепаратов позволяет отказаться от использования дорогостоящих и экологически небезопасных минеральных азотных удобрений.

Для наиболее полного раскрытия потенциала продуктивности бобово-ризобиального симбиоза необходимо использовать инокулянты на основе активных и вирулентных штаммов ризобий с соответствующей хозяйской специфичностью. Лидерство по объемам производства инокулянтов сохраняется за биотехнологическими фирмами США, Франции и Великобритании (Itelima J.U. et al. A review: Biofertilizer - A key player in enhancing soil fertility and crop productivity. 2018. V. 2 (1). С. 22-28; Berger L.R. et al. Plant and soil characteristics affected by biofertilizers from rocks and organic matter inoculated with diazotrophic bacteria and fungi that produce chitosan. 2013. V. 13(3). С. 592-603).

В отечественной сельскохозяйственной практике прием предпосевной инокуляции семян имеет ограниченное распространение. Связано это с тем, что эффективность инокулянтов значительно снижается при переходе с опытного на производственный уровень, который подразумевает промышленную технологию культивирования ризобий, длительное хранение инокулянтов в складских условиях, практику смешения препаратов ризобий с химическими пестицидами, длительную выдержку обработанного семенного материала перед посевом.

Несмотря на большое количество работ, посвященных генетическим аспектам конструирования эффективных бобово-ризобиальных симбиозов (И.А. Тихонович, Н.А. Проворов, М.Л. Румянцева, А.Х. Баймиев и др.) и популяционной экологии клубеньковых бактерий (А.П. Кожемяков, С.А. Четкова и др.), до сих пор не решена проблема низкой интегрированности приема предпосевной инокуляции семян с современными агротехнологиями, что не позволяет раскрыть потенциал продуктивности бобово-ризобиального симбиоза в производственных условиях.

Степень разработанности темы исследования

Проблема низкой эффективности препаратов ризобий в условиях сельскохозяйственного производства является комплексной, так как образование эффективных клубеньков на корнях бобовой агрокультуры является результатом действия целой совокупности факторов. Помимо высокой симбиотической совместимости партнеров и благоприятных почвенно-климатических условий

образования симбиоза, "успех" инокуляции обусловлен такими параметрами как: титр ризобий на момент применения препарата (т.е. использования инокулянта для приготовления рабочего раствора), состав и концентрация ХСЗР в составе рабочего раствора, устойчивость ризобий к химическому стрессу и время контакта бактерий с пестицидами в рабочем растворе, устойчивость ризобий к высыханию на обработанных семенах, эффективность протектора, обеспечивающего защиту бактерий от осмотического стресса и время, прошедшее с момента обработки семян до их заделки в почву.

Каждый из вышеприведенных аспектов изучался различными коллективами исследователей, однако степень разработанности данных факторов существенно варьирует.

Так, проблеме низкого титра бактерий на момент применения биопрепарата посвящено множество исследований, в том числе работы по совершенствованию рецептур питательных сред, обеспечивающих повышенный титр ризобий в жидкой культуре (Sayeda M. Ali, Gamil Amin, Mohammed Fayez, Mahmoud El-Tahan, Mohammed Monib & Nabil A. Hegazi Production of rhizobia biofertilizers using baker's yeast effluent and their application to Leucaena leucocephala. 2005, 51:6, 605-617), а также работы по поиску совместимых с бактериями носителей, обеспечивающих высокий титр сыпучих форм инокулянтов (Ahemad, M., and Kibret, M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: current perspective. 2014. 26, 1-20; Gopalakrishnan, S., Sathya, A., Vijayabharathi, R., Varshney, R. K., Gowda, C. L., and Krishnamurthy, L. Plant growth promoting rhizobia: challenges and opportunities. 2015, 355-377; Matse, D. T., Huang, C., Huang, Y., and Yen, M. Effects of coinoculation of Rhizobium with plant growth promoting rhizobacteria on the nitrogen fixation and nutrient uptake of Trifolium repens in low phosphorus soil. 2020. 43, 739-752; Yadav, A. N., Kour, D., Kaur, T., Devi, R., Yadav, A., Dikilitas, M., et al. Biodiversity, and biotechnological contribution of beneficial soil microbiomes for nutrient cycling, plant growth improvement and nutrient uptake. 2021, 33:102009). Изучены факторы, влияющие на сохранность ризобий в процессе хранения препаратов (Лактионов Ю.В., Попова Т.А., Андреева О.А., Ибаттулина Р.П., Кожемяков А.П. Создание

стабильной формы ростостимулирующих микробиологических препаратов и их эффективность. - Казань, 2013. - 34-38 с). Кроме того, рядом исследователей выявлена возможность модификации жидких культур ризобий различными композициями полимеров, повышающих устойчивость бактерий к различным стресс-факторам, что позволяет увеличить срок хранения инокулянта и, в конечном итоге, обеспечить наибольшее количество жизнеспособных клеток на момент применения препарата (Das, K., Prasanna, R., and Saxena, A. K. Rhizobia: a potential biocontrol agent for soilborne fungal pathogens. 2017. 62, 425-435.).

В связи с продолжающимся трендом на интенсификацию сельского хозяйства большое число исследований посвящено изучению степени токсичности различных марок ХСЗР для ризобий инокулянтов (Yousaf S., Khan S., Aslam M. T. Effect of Pesticides on the Soil Microbial Activity. - 2013. - №№ 45(4). - 1063-1067 р; Alam S., Kumar A., Kumar A., Prasad S., Tiwari A., Srivastava D., Srivastava S., Tiwari P., Singh J., Mathur B. Isolation and Characterization of Pesticide Tolerant Bacteria from Brinjal Rhizosphere. - 2018. - Special Issue- 7. - 4849-4859 р). При этом, недостаточно изученным остается вопрос о том, какие именно компоненты пестицида определяют его токсичность для бактерий, а также каким образом возможно повысить устойчивость ризобий к токсическому стрессу при контакте бактерий с пестицидами в рабочем растворе.

Относительно малоизученным является вопрос о степени устойчивости того или иного штамма ризобий к осмотическому стрессу, которому подвергаются бактерии при их высыхании на обработанных семенах (Vriezen, J. A. C., F. J. de Bruijn, and K. Nusslein. Desiccation responses and survival of Sinorhizobium meliloti USDA 1021 in relation to growth-phase, temperature, chloride and sulfate availability. -2006. - №42. - 172-178 р.; Campbell, G. R., L. A. Sharypova, H. Scheidle, K. M. Jones, K. Niehaus, A. Becker, and G. C. Walker. Striking complexity of lipopolysaccharide defects in a collection of Sinorhizobium meliloti mutants.- 2003. - №185. - 3853- 3862 р; Bhattacharya, I., and H. R. Das. Cell surface characteristics of two halotolerant strains of Sinorhizobium meliloti.- 2003. - №158. - 187- 194 р.). Данный пробел, очевидно, требует восполнения, так как подавляющее большинство современных

агротехнологий возделывания бобовых подразумевает применение инокулянтов с помощью предпосевной обработки семян с их последующей выдержкой (по экономическим и технологическим причинам) в течение нескольких суток перед посевом. В течение данного времени титр ризобий на семени может как незначительно упасть (при условии высокой осмотической устойчивости штамма и эффективности протектора), так и сократиться до нуля ввиду чувствительности бактерий к высыханию и низкой эффективности или полном отсутствии протектора в составе рабочего раствора.

Стоит отметить, что данные по эффективности различных веществ в качестве протектора ризобий, защищающих бактерии от высыхания на обработанных семенах носят отрывочный и, зачастую, противоречивый характер (Воцелко С.К., Гвоздяк Р.1., Данкевич Л.А., Литвинчук О.О., Патика В.П. ЕПАА - ушверсальний бюлопчний прилипач пестицидiв i регуляторiв росту рослин. К., 2007. - 26 с.; Леонова Н.О., Гергало И.С., Титова Л.В., Воцелко С.К., Иутинская Г.А. Влияние липкогена «ЭПАА» и гелевых композиций на жизнеспособность клубеньковых бактерий сои. - Минск: Изд. И.П. Логвинов, 2008. - Т. 2. - С. 81-84; Rivera D., Obando M., Barbosa H., Rojas-Tapias D. Evaluation of polymers for the liquid rhizobial formulation and their influence in the Rhizobium-Cowpea interaction. - 2014. - №19(3). - 265-275 р.; Титова Л.В., Бровко И.С., Леонова Н.О., Воцелко С.К., Иутинская Г.А., Патыка В.Ф. Роль липкогенных компонентов в повышении физиологической активности ризобий и продуктивности соево-ризобиального симбиоза. - 2012. - №2 4 (6), - С. 9-16.).

Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в совершенствовании технологии получения и применения препаратов клубеньковых бактерий, с последующей оценкой ее эффективности в производственных условиях.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1. сравнить производительность периодического и полунепрерывного (отъемно-доливного) режимов культивирования медленнорастущих видов

клубеньковых бактерий;

2. определить степень стабильности препаратов ризобий в процессе полугодового хранения жидких инокулянтов в герметичных пластиковых канистрах и в двойных поливинилхлоридных пакетах, поддерживающих газообмен с окружающей средой;

3. выработать рекомендации по эффективному совмещению в один технологический прием метода обработки семян инокулянтами быстро- и медленнорастущих видов клубеньковых бактерий и метода обработки семян широко применяемыми химическими фунгицидами;

4. оценить перспективность введения в состав биопрепаратов водорастворимых полимеров, полисахаридов или сахаридов, применение которых должно позволить увеличить допустимый временной интервал между обработкой семян и их посевом.

Объект и предмет исследования

Объектами исследования являлись клубеньковые бактерии различных видов зернобобовых агрокультур (соя, люпин, горох, чечевица), упаковки для жидких инокулянтов (герметичные пластиковые канистры, двойные поливинилхлоридные пакеты), марки пестицидных протравителей семян (Беномил, Бенорад, Фундазол, Синклер, Оплот, Тирад, Максим, Протект, Протект Форте), водорастворимые полимеры, полисахариды и сахариды (поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, трегалоза).

Предметом исследования служили режимы промышленного культивирования клубеньковых бактерий, приемы поддержания жизнеспособности ризобий в процессе хранения инокулянтов, методики совмещения бактериальных препаратов с химическими средствами защиты растений (ХСЗР), методы оценки токсичности химических пестицидов для бактерий инокулянтов, а также приемы повышения жизнеспособности ризобий на инокулированных семенах.

Научно-практическая новизна исследования:

1. впервые для производства препаратов медленнорастущих видов ризобий использован полунепрерывный режим культивирования в ферментерах с рабочим объемом 500 л. Показано, что полунепрерывный режим культивирования является более производительным в сравнении с периодическим режимом;

2. впервые в качестве упаковочного материала для хранения препаратов ризобий сои и люпина использован пакет из двойной поливинилхлоридной пленки, что способствует сохранению высокого титра клеток клубеньковых бактерий в процессе полугодового хранения жидких биопрепаратов;

3. впервые проведено сравнение эффективности водорастворимых полимеров, полисахаридов и сахаридов в качестве протектора нанесенных на семена клубеньковых бактерий. Благодаря добавлению данных веществ к раствору инокулянта, на обрабатываемых им семенах образуется защитная пленка, снижающая скорость сокращения числа жизнеспособных ризобий, что позволяет осуществлять эффективную заблаговременную инокуляцию семян;

4. впервые определено, что температура бакового раствора, содержащего химический фунгицид и клубеньковые бактерии, значительно влияет на жизнеспособность последних. Впервые показано, что протравители на основе одного и того же действующего вещества (флудиоксонил), но произведенным по различным технологиям («Максим» и «Протект») могут различаться по токсическому воздействию, оказываемому на клетки быстро- и медленнорастущих видов ризобий.

Часть исследований защищена патентами №2728471 (Инокулянт для семян сои) и №2738726 (Способ получения инокулянта для нута).

Теоретическая и практическая значимость исследования

Показана высокая производительность полунепрерывного режима культивирования при производстве препаратов ризобий медленнорастущих видов B. japonicum шт. 634б и B. 1ирт шт. 363а. Оценена стабильность биопрепаратов в процессе их полугодового хранения в упаковках из различных материалов в складских условиях. Оценена токсичность широко применяемых пестицидных

протравителей семян для клубеньковых бактерий инокулянтов. Показано, что быстрорастущие виды ризобий более чувствительны к токсическому действию фунгицидов, чем медленнорастущие. Тем не менее, для быстрорастущих видов ризобий могут быть подобраны условия, повышающие их устойчивость к химическим пестицидам. Определена эффективность применения ряда водорастворимых полимеров, полисахаридов и сахаридов в качестве добавок, защищающих бактерии от высыхания на обработанных семенах и повышающие устойчивость ризобий к токсическому действию пестицидных протравителей.

Методология и методы исследования

Культуры изучаемых видов клубеньковых бактерий получали посредством их выращивания в ферментерах на полусинтетической питательной среде на основе маннита, дрожжевого экстракта и солей. Материалом для посева в ферментер являлись бактериальные клетки изучаемого штамма, которые микробиологической петлей отбирали с соответствующих 3-х месячных косяков, приготовленных на основе агаризованной маннитно-дрожжевой среды и переносили в колбу с 250 мл питательной средой с последующим выращиванием культуры на качалке при 180 об./мин при температуре 28°С в течение 7 суток Далее, содержимое колб пересевали в стеклянные бутыли с 3 л стерильной питательной среды (таб. 1). Бутыли помещали на качалку для выращивания культуры в течение 7 суток с последующим помещением в холодильник на хранение. Содержимое бутыли в объеме 3 л переносили в ферментер с предварительно подготовленной питательной средой объемом 50 л по стандартной технологии с соблюдением мер асептики.

Культивирование бактерий в ферментере проводили при 28°С, при интенсивности аэрации (1 л воздуха/1 л среды в мин.) и при оборотах мешалки 180200 об./мин. После 7 суток культивирования часть бактериальной суспензии разливали в асептических условиях по 250 мл в стерильные колбы, которые закрывали ватными пробками и помещали в холодильник на хранение.

Для построения кривых роста штаммов медленнорастущих видов ризобий при различных режимах культивирования осуществляли периодической отбор

проб бактериальной культуры из ферментера. Далее готовили серии 10-кратных разведений культуры с последующим высевом на чашки Петри с агаризованной питательной средой (таб. 1) в микробиологическом ламинаре, которые затем помещали в термостат (1=28°0). Спустя 3-5 суток для быстрорастущих видов ризобий и 7-10 суток для медленнорастущих видов подсчитывали число колониеобразующих единиц (КОЕ) и определяли титр бактерий в изначально отобранных пробах. Повторность опыта - трехкратная.

Оценку влияния условий хранения на стабильность биопрепаратов проводили по результатам анализа титра жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий сои и люпина в процессе полугодового хранения жидких инокулянтов на их основе в складских условиях. Приготовленную, согласно ранее описанной технологии, бактериальную культуру разливали по упаковочным тарам в предварительно обработанном УФ боксе. Наполненные полиэтиленовые канистры объемом 3 л и 5 л складировали по 6 шт. в пенопластовые короба. Наполненные двойные поливинилхлоридные пакеты объемом 3 л помещали по системе bag-in-box в картонные коробки, которые затем по 9 шт. складировали в пенопластовые короба. Короба закрывали пенопластовыми крышками и помещали на склад, где они хранились при температуре 15-17^ в течение всех 6 мес. проведения эксперимента. Жизнеспособность клубеньковых бактерии оценивали путем периодического, с интервалом в 2 мес., определения титра бактериальных клеток в канистрах и пакетах. Повторность опыта - трехкратная.

Для изучения токсического воздействия пестицидов на клубеньковые бактерии готовили баковый раствор (многокомпонентный раствор, используемый для обработки семян сразу несколькими препаратами), который содержал бактериальную культуру и химический протравитель. Через определенные интервалы времени (1, 2, 4, 8, 24 часа) делали посевы вариантов баковых растворов различных инокулянтов с фунгицидами на чашки Петри с агаризованной питательной средой для последующего определения титра жизнеспособных бактерий. Для марок фунгицидов с формуляцией КС (концентраты суспензий) дополнительно изучали влияние температуры на жизнеспособность бактерий в

баковом растворе с пестицидом. С этой целью баковые растворы выдерживали в холодильной камере (2-5°C), при комнатной температуре (16-18°C) и в термостате (30 °C).

Обработку семян разными вариантами баковых растворов осуществляли следующим образом:

1. готовили навески семян в чашке Петри по 25 г;

2. семена обрабатывали бактериальной суспензией объемом 50 мкл, разбавленной в водопроводной воде (контрольный вариант), или в баковом растворе, включавшем протравитель или протектор (опытные варианты).

Определение числа клеток жизнеспособных бактерий на обработанных семенах проводили по авторской методике следующим образом:

1. 8 инокулированных семян, через определенные интервалы времени после обработки, помещали в пробирку с 8 мл стерильной воды, далее пробирку встряхивали в течение 1 мин на вортексе для приготовления смыва с семян. Повторность - трёхкратная;

2. проводили посев серии разведений отобранных смывов с семян на чашки Петри с агаризованной питательной средой (таб. 1). Повторность - трехкратная;

3. осуществляли подсчет числа образовавшихся бактериальных колоний с использованием полученных данных для определения числа жизнеспособных клеток ризобий на 1 семени. Статистическую обработку данных проводили с использованием метода дисперсионного анализа.

Для исследования возможности использования водорастворимых полимеров, полисахаридов или сахаридов в качестве протекторов ризобий на инокулированных семенах готовили баковый раствор из исследуемого вещества и бактериальной культуры, которым осуществляли обработку семян с последующим приготовлением с них смывов и определением титра жизнеспособных клеток по ранее описанной методике.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel 10 методом дисперсионного анализа

Основные положения, выносимые на защиту:

1. полунепрерывный режим культивирования по сравнению с периодическим является более производительным способом получения бактериальных препаратов на основе ризобий медленнорастущих видов;

2. двухслойная поливинилхлоридная пленка перспективна в качестве материала упаковочной тары для хранения жидких инокулянтов в складских условиях, поскольку обеспечивает сохранность более высоких титров жизнеспособных клеток ризобий медленнорастущих видов;

3. пестицидные протравители на основе одного и того же действующего вещества, но произведенные по разной технологии (разное производства), могут значительно различаться по своей токсичности в отношении ризобий медленнорастущих и быстрорастущих видов;

4. введение водорастворимых полимеров, полисахаридов или сахаридов в баковый раствор с инокулянтом способствует сохранению высоких значений титра жизнеспособных клеток ризобий на обработанных семенах, что позволяет увеличить допустимый временной интервал между обработкой и посевом семян.

Достоверность полученных результатов исследования обеспечивается за

счет:

- поэтапного описания полученных результатов и методов исследования

- использования дисперсионного анализа для обработки результатов

- публикации полученных результатов в виде научных статей в журналах, в том числе, рекомендованных ВАК

- апробации полученных результатов в форме докладов на различных международных и отечественных научно-практических конференция.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Применение препаратов клубеньковых бактерий (инокулянтов) как элемент биологизированных технологий возделывания бобовых агрокультур 1.1.1 Роль симбиотической азотфиксации в повышении продуктивности агроценозов

Современные технологии возделывания сельскохозяйственных культур включают в себя применение высоких доз минеральных удобрений, интенсивные приемы обработки почв, частые обработки вегетирующих культур химическими средствами защиты растений - гербицидами, фунгицидами, инсектицидами. Все более возрастающая антропогенная нагрузка на агроценозы приводит к нарушению экологического равновесия, вследствие чего активизируются такие неблагоприятные процессы как обеднение почв элементами питания растений, снижение запаса почвенного гумуса, ухудшение структуры почв, ухудшение фитосанитарной обстановки на полях и, как следствие, снижение почвенного плодородия, урожайности и качества сельскохозяйственный продукции.

На сегодняшний день в России 56 млн. га пашни характеризуется пониженным содержанием гумуса, около 28 млн. га - недостатком фосфора и до 11,5 млн. га - калия (Постников Д.А. Сравнительная агроэкологическая оценка применения традиционных и перспективных сидеральных культур в Московкой области. - 2014. - №8. - 38-43 с.). Среднегодовой дефицит гумуса в пахотном слое в последние годы в среднем по России составляет 0,52 т/га, а по отдельным регионам достигает 0,25-0,72 т/га. При этом замкнутость циклов по азоту, фосфору и калию редко превышает 50%, что может привести к катастрофическим экологическим последствиям (Wilhelm R. Neuere Erkenntnisse zur Phosphataufnahme von Pflanzen. -2006. - №52 (1). - P. 1-17.)

В сложившихся социально-экономических условиях наиболее перспективным выходом из сложившегося положения является перенос элементов традиционных систем земледелия на биологическую основу. Научно-обоснованная биологизация, помимо ослабления антропогенной нагрузки на агроэкосистемы,

обеспечивает благоприятные условия для использования их естественного биопотенциала (Лошаков В.Г. Биологическая активность почвы в специализированном зерновом севообороте при использовании пожнивного сидерата и соломы в качестве удобрения. - 1986. - Вып.4. - 10-17 с).

Биологизация агроприемов преследует своей целью восстановление нарушенной почвенной структуры, повышение почвенного плодородия и урожайности сельскохозяйственных культур, сохранение водных ресурсов, сокращение материально-технических затрат через использование естественного биопотенциала агроэкосистем, широкое применение органических удобрений и биопрепаратов, максимальную интесификацию биологической фиксации самого дефицитного элемента в современной земледельческой практике - азота (Мудрых Н.М. Биологизация земледелия - основа сохранения плодородия почв нечерноземной зоны. - 2017. - №9 (155). - 28-34 с.; Лукманов А.А. Биологизация земледелия - дешевый источник повышения плодородия почв. - 2015. - №2. - 6-9 с.).

Биологизация земледелия начинается с перехода на малоотходные энергосберегающие технологии, подразумевающие максимальное использование естественных источников повышения продуктивности агроценозов, таких как микробиологическая фосфор- и калиймобилизация, ассоциативная и симбиотическая азотфиксация (Жученко А.А. Биологизация, экологизация, энергосбережение, экономика современных систем земледелия. - 2015. - №S2 - 913 с.). У российских сельхозтоваропроизводителей повышенный интерес к энергосберегающим технологиям вызван тем, что в отечественном сельском хозяйстве удельный расход энергоресурсов на единицу урожая значительно превышает таковой у зарубежных стран (Пожарский И.Ю. Проблемы энергосбережения в региональном агропромышленном комплексе. - 2013. - №7. -74-80 с.), что приводит к повышению себестоимости произведенной сельскохозяйственной продукции. Одним из важнейших условий модернизации отечественной агроэкономики является снижение энергоемкости валового внутреннего продукта, что требует формирования эффективных местных,

региональных и федеральных механизмов повышения эффективности использования энергетических и материальных ресурсов.

Регулярное применение высоких доз органических удобрений также является важным компонентом системы продуктивного биологического земледелия (Коган В.Е. Экологически-безопасные удобрения - основа рационального природопользования. - 2017. - № 08 (62). - 63-66 с.). Применение органических удобрений позволяет повторно вовлекать в круговорот питательных веществ те элементы питания, которые ранее были отчуждены из почвы с урожайной частью сельскохозяйственных культур (Маругина Н.И. Эффективность органических удобрений в севообороте по природным сельскохозяйственным зонам РФ. - 2012. - №8. - 18-20 с.). Регулярное внесение органических удобрений повышает содержание гумуса в почвах и улучшает их структуру, снижает интенсивность вымывания почвенных элементов питания, повышает эффективность применения минеральных удобрений и улучшает фитосанитарную обстановку на полях (Белоус И. Н. Влияние сочетания органических и минеральных удобрений в севообороте на продуктивность сельскохозяйственных культур и плодородие почвы. - 2015. -№8.3. - С. 4-10). Рациональное применение рганических удобрений в севооборотах повышает урожайность сельскохозяйственных культур и улучшает качественные характеристики растениеводческой продукции (Соснина И.Д. Влияние видов органических и минеральных удобрений на урожайность зерновых продуктивность пашни и сохранения плодородия почвы. - 2013. - №5. - 32-36 с.). При этом доля удобренных почв в России составляет лишь 24%, а органические удобрения вносят только на 2% пашни, при общем потенциале производства органических удобрений в 100 млн. т органического вещества, внесение которого способно повысить сбор зерновых единиц на 20-25 млн. т (Еськов А.И. Техническое обеспечение

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Косульников Юрий Витальевич, 2022 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Аксенова Ю.В. Роль многолетних трав в сохранение и повышении плодородия орошаемых лугово-черноземных почв / Ю.В. Аксенова // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - №3. - 12-14 с.

2. Агафонов Е.В. Применение минеральных и бактериальных удобрений под сою / Е.В. Агафонов, Л.Н. Агафонова, С.А. Гужвин // Агрохимический вестник. - 2005. - №5. - С. 18-20.

3. Адамень Ф. Ф. Эффективность инокуляции сои / Ф. Ф. Адамень. -Симферополь: Таврида, 1995. - 42 с

4. Андреюк, Е.И. Цианобактерии / Е.И. Андреюк, Ж.П. Коптева, В.В. Занина. - Киев: Наука, 1990. - 199 с.

5. Белоус И. Н. Влияние сочетания органических и минеральных удобрений в севообороте на продуктивность сельскохозяйственных культур и плодородие почвы / И.Н. Белоус, В.Б. Коренев, Л.А. Воробьева // Молодой ученый. - 2015. - №8.3. - С. 4-10.

6. Бородычев В.В. Минеральное питание сои / В.В. Бородычев, М.Н. Лытов // Агрохимический вестник. - 2005. - №5. - С. 20-22.

7. Борзенкова Г.А.Применение эффективных протравителей и инокулянтов в технологии возделывания различных сортов сои / Г.А. Борзенкова,

A.Г. Васильчиков // Земледелие. - 2014. - №4. - 37-39 с.

8. Бегун С.А., Тильба В.А. Способы, приёмы изучения и отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Методы аналитической селекции. / С.А. Бегун, В.А. Тильба. - Благовещенск: «Зея», 2005. - 70 с

9. Борзенкова Г.А., Васильчиков А.Г. Применение эффективных протравителей и инокулянтов в технологии возделывания различных сортов сои. / Г.А. Борзенкова, А.Г. Васильчиков // Земледелие. - 2014. - №4. - 37-39 с.

10. Багаева О. С., 1ваниця В. О., Багаев О. К., Беспалов I. М. Комплект обладнання для ферментацп мiкроорганiзмiв на рщких середовищах / О. С. Багаева,

B. О. 1ваниця, О. К. Багаев, I. М. Беспалов // Наук. розробки Одес. нац. ун-ту. — Одеса: Астропринт, 2004. — С. 32-33.

11. Благова Д.К. Искусственные ассоциативные симбиозы между томатом иризобиями, обладающими фунгистической активностью /Д.К. Благова, З.Р.Вершинина, Л.Р. Нигматулина, А.М.Лавина, Ан.Х.Баймиев, Ал.Х.Баймиев // Сельскохозяйственная биология, 2015. Т. 50, №1. С. 107-114

12. Бушиева Н.А. Эффективность совместного применения инокулянтов и фунгицидов при обработке семян сои / Н.А. Бушиева // Масличные культуры. -2019. - № 4 (180). - С. 119-123.

13. Волошин Е.И. Применение удобрений и урожайность сельскохозяйственных культур в Красноярском крае / Е.И. Волошин // Вестник Крас ГАУ. - 2016. - №8. - 150-157 с.

14. Воцелко С.К., Гвоздяк Р.1., Данкевич Л.А., Литвинчук О.О., Патика В.П. ЕПАА - ушверсальний бюлопчний прилипач пестицидiв i регуляторiв росту рослин (Методичш рекомендаций - К., 2007. - 26 с.

15. Гришечкин В.В., Головина Е.В. Использование нового органического пленкообразователя (ППО) для сохранения жизнеспособности ризобий при инокуляции семян сои и влияние их на клубенькообразование и урожайность / В.В. Гришечкин, Е.В. Головина // Зернобобовые и крупяные культуры. - 2014. - №1(9). -41-44 с.

16. Дедов А.В. Влияние многолетних трав на плодородие почвы / А.В. Дедов, М.А. Несмеянова // Агрохимический вестник. - 2012. - №4. - 7-9 с.

17. Еськов А.И. Техническое обеспечение использования органических удобрений / А.И. Еськов, В.В. Рябков // Агрохимический вестник. - 2013. - №4. -13-15 с.

18. Емцев, В.Т. Микроорганизмы и регулирование их деятельности в почве / В.Т. Емцев // Известия ТСХА. - 1982. - №6. - С. 32-33.

19. Жученко А.А. Биологизация, экологизация, энергосбережение, экономика современных систем земледелия / А.А. Жученко // Вестник АПК Ставрополья. - 2015. - №S2 - 9-13 с.

20. Золотарев В.Н. Состояние травосеянье и перспективы развития семеноводства многолетних трав в России и нижневолжском регионе / В.Н.

Золотарев, Н.И. Переправо // Известия Нижневолжского агроуниверситетского комплекса: наука и высшее профессиональное образование. - 2016. - №1(41). - 93101 с.

21. Завалин А.А. Биопрепараты, удобрения и урожай / А.А. Завалин. - М: Изд-во ВНИИА, 2005. - С. 10-33.

22. Коган В.Е. Экологически-безопасные удобрения - основа рационального природопользования / В.Е. Коган, К.Г. Карапетян // Международный научно-исследовательский журнал. Сельскохозяйтсвенные науки. - 2017. - № 08 (62). - 63-66 с. ГО1: https://doi.org/10.23670/IRJ.2017.62.019

23. Ковда В.А. Биогеохимия почвенного покрова. / В.А. Ковда. - М.: Наука, 1985. - 264 с.

24. Крутило Д.В. особливост поширення бульбочкових бактерш в рiзних регюнах Украши / Д.В. Крутило, Т.М. Ковалевська // Агроэколопчний журнал. -2003. - № 3. - С. 59-63.

25. Кожемяков, А.П. Продуктивность азотофиксации в агроценозах / А.П. Кожемяков // Микробиология. - 1997. - №4. - С. 22-28.

26. Калининская, Т.А. Изучение азотофиксирующей активности почв. -М.: Наука, 1973. - С. 44-51.

27. Кожемяков А.П. Агротехнологические основы создания усовершенствованных форм микробных биопрепаратов для земледелия / А.П. Кожемяков, Ю.В. Лактионов, Т.А. Попова, А.Г. Орлова, А.Л. Кокорина, О.Б. Вайшля, Е.В. Агафонов, С.А. Гужвин, А.А. Чураков, М.Т. Яковлева // Сельскохозяйственная биология. - 2015. - №3 том 50. - 369-376 с.

28. Коломиец Э.И. Микробные биотехнологии как основа экологизации и повышения продуктивности сельскохозяйственного производства / Э. И.Коломиец // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. / НАН Беларуси, Ин-т микробиологии; под ред. Э. И.Коломиец, А.Г.Лобанка. - Минск, 2018. Т. 10. С. 3-11.

29. Лошаков В.Г. Биологическая активность почвы в специализированном зерновом севообороте при использовании пожнивного

сидерата и соломы в качестве удобрения / В.Г. Лошаков, В.Т. Емцев, Л.К. Ницэ // Известия ТСХА. - 1986. - Вып.4. - 10-17 с.

30. Лукманов А.А. Биологизация земледелия - дешевый источник повышения плодородия почв / А.А. Лукманов, Р.Р. Гайров, Л.З. Каримова // Агрохимический вестник. - 2015. - №2. - 6-9 с.

31. Линков С.А. Влияние сидеральных культур на агрофизические свойства почвы и урожайность подсолнечника / С.А. Линков, А.С. Закараев // Вестник Курской государственной сельскохозяйтсвенной академии. - 2015. - №8. -140-143 с.

32. Лактионов Ю.В., Попова Т.А., Андреева О.А., Ибаттулина Р.П., Кожемяков А.П. Создание стабильной формы ростостимулирующих микробиологических препаратов и их эффективность. / Ю.В. Лактионов, Т.А. Попова, О.А. Андреева, Р.П. Ибаттулина, А.П. Кожемяков // В сб.: Современные подходы в биотехнологии Республики Татарстан. - Казань, 2013. - 34-38 с.

33. Леонова Н.О., Гергало И.С., Титова Л.В., Воцелко С.К., Иутинская Г.А. Влияние липкогена «ЭПАА» и гелевых композиций на жизнеспособность клубеньковых бактерий сои // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. - Минск: Изд. И.П. Логвинов, 2008. - Т. 2. - С. 81-84.

34. Маругина Н.И. Эффективность органических удобрений в севообороте по природным сельскохозяйственным зонам РФ / Н.И. Маругина // Земледелие. - 2012. - №8. - 18-20 с.

35. Максимов Д.А. Результаты исследования поверхностного способа внесения жидкого органического удобрения / Д.А. Максимов, А.С. Оглуздин, Э.В. Васильев // Технологии и технологические средства механизированного производства продукции растениеводства и животноводства. - 2012. - №83. - 9399 с.

36. Марченко Н.М. Состояние и перспективы механизации применения органических удобрений в Российской Федерации / Н.М. Марченко, Г.И.Личман, А.Ю. Измайлов, Н.Е. Евтюшенков, А.Н. Марченко, С.Н. Щербаков // Кн.:

Агроэкологические проблемы использованиея органических удобрений на основе отходов промышленного животноводства. - Владимир, 2006. - 34-39 с.

37. Мудрых Н.М. Биологизация земледелия - основа сохранения плодородия почв нечерноземной зоны / Н.М. Мудрых // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2017. - №9 (155). - 28-34 с.

38. Муродова С.С., Давранов К.Д. Комплексные микробные препараты. Применение всельскохозяйственной практике / Biotechnologia acta. 2014. V.7, N6. С. 92-101

39. Новицкая Н.В. Влияние минеарального азота на эффективность симбиотической азотфиксации и урожайность бобовых культур в лесостепи Украины / Н.В. Новицкая, И.Т. Барзо, Л.Н. Горбач // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2014. - №9(119). - 17-21 с.

40. Пожарский И.Ю. Проблемы энергосбережения в региональном агропромышленном комплексе / И.Ю. Пожарский, А.Н. Цацулин // Управленческое консультирование. - 2013. - №7. - 74-80 с.

41. Постников Д.А. Сравнительная агроэкологическая оценка применения традиционных и перспективных сидеральных культур в Московкой области / Д.А. Постников, С.К. Темирбекова, В.Г. Лошаков, М.С. Норов, А.А. Курило // Достижения науки и техники АПК. - 2014. - №8. - 38-43 с.

42. Соснина И.Д. Влияние видов органических и минеральных удобрений на урожайность зерновых продуктивность пашни и сохранения плодородия почвы / И.Д. Соснина // Достижения науки и техники. - 2013. - №5. -32-36 с.

43. Сутягин В.П., Белышева Ж.Б, Петров В.Н. Севообороты с короткой ротацией в центрально нечерноземной зоне / Земледелие. - 2010. - №5. - 5-6 с.

44. Смуров С.И. Оценка различных видов культур и их сочетаний в качестве парозанимающих сидератов / С.И. Смуров, Т.В. Попова // Достижения науки и техники АПК. - 2015. - №11 том 29. - 74-77 с.

45. Ступина Л.А., Мосина А.С. Влияние карбоксиметилированных препаратов и ризоторфина на микробиологическую активность черноземов

Приобской лесостепи и симбиотическую активность сои / Л.А. Ступина, А.С. Мосина // Вестник КрасГАУ. - 2016. - №3. - 84-89 с.

46. Соколенко Г.Г., Лазарев, Б.П., Миньченко, С.В. Пробиотики врациональном кормлении животных / Технологии пищевой иперерабатыва- ющей промышленности АПК - продукты здорового питания. 2015. №1. С. 72-78.

47. Санко Г.М., Бушнева Н.М., Совместимость фунгицидных протравителей сои с инокулянтами // Научно-исследовательский бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур - 2018. № 3 (175), - С. 124-127.

48. Сытников Д. М. Биотехнология микроорганизмов азотфиксаторов и перспективы применения препаратов на их основе // Бютехнолопя. — 2012. — Т. 5, № 4. - 34-45 с.

49. Тильба В.А. Аборигенная популяция ризобий сои основной соесеющей зоны России: дис. д-ра. биол. наук в виде науч. докл. / Владимир Арнольдович Тильба. - Владивосток: ТИБОХ ДВО РАН, 1998. - 47 с.

50. Титова Л.В., Бровко И.С., Леонова Н.О., Воцелко С.К., Иутинская Г.А., Патыка В.Ф. Роль липкогенных компонентов в повышении физиологической активности ризобий и продуктивности соево-ризобиального симбиоза // Мшробюл., журн. - 2012. - № 4 (6), - С. 9-16.

51. Хотянович, А.В. Методы культивирования азотофиксирующих бактерий, способы их получения и применение препаратов на их основе. - Л.: Б.и., 1991. - 60 с.

52. Шапошников А. И.Взаимодействие ризосферных бактерий срастениями: механизмы образования и факторы эффективности ассоциативных симбиозов / А. И. Шапошников, А. А.Белимов, Л.В.Кравченко, Д.М.Виванко // Сельскохозяйственная биология. 2011. №3. С. 16-22.

53. Якименко М.В., Бегун С.А. Совместное применение штаммов ризобий сои и некоторых препаратов для предпосевной обработки семян сои / М.В. Якименко, С.А. Бегун // Земледелие. - 2016. - №6. - 46-48 с.

54. Якименко М.В., Бегун С.А., Сорокина А.И. Совместимость местных

коллекционных штаммов ризобий сои с фунгицидами и ростостимулирующими препаратами // Дальневосточный аграрный вестник. - 2016. - № 2 (38). - С. 38-41.

55. Alam S., Kumar A., Kumar A., Prasad S., Tiwari A., Srivastava D., Srivastava S., Tiwari P., Singh J., Mathur B. Isolation and Characterization of Pesticide Tolerant Bacteria from Brinjal Rhizosphere. / Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. - 2018. - Special Issue-7. - 4849-4859 р.

56. Ausubel F. M., Buikema W. J., Earl C. D., Kligensmith B. T., Nixon B. T., Szeto W. W. In: H. J. Evans, P. J. Bottomley, W. E. Newton (eds.) Nitrogen Fixation Research Progress, Martinus Nijhoff, Dordrecht, - 1985. - p. 167-179.

57. Ahemad, M., and Kibret, M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: current perspective. J. King Saud Univ. Sci. 2014, 26, 1-20. doi: 10.1016/j.jksus.2013.05.001

58. Bhattacharya, I., and H. R. Das. Cell surface characteristics of two halotolerant strains of Sinorhizobium meliloti. // Microbiol. Res. - 2003. - №158. - 187194 р.

59. Burris R. H. Roberts G. P. Biological Nitrogen Fixation. // Annu. Rev. Nutr.-H 1993. - V. 13. - 317-335 p.

60. Berger L.R. et al. Plant and soil characteristics affected by biofertilizers from rocks and organic matter inoculated with diazotrophic bacteria and fungi that produce chitosan // J.Soil Science Plant Nutrition. 2013. V. 13(3). С. 592-603

61. B.D.W Jarvis, Gillis M., De Ley J. Int. J. Syst. Bacteriol. - 1986. V. 36, p. 129-138.

62. Campo R. J., Araujo R. S., Hungria M. Nitrogen fixation with the soybean crop in Brazil: Compatibility between seed treatment with fungicides and bradyrhizobial inoculants. / SYMBIOSIS. - 2009. - №48. - 154-163 р.

63. Chen, M., and M. Alexander. Survival of soil bacteria during prolonged desiccation. // Soil Biol. Biochem. - 1973. - №5. - 213-221 р.

64. Chang, W.S.; Park, K.M.; Koh, S.C.; So, J.S. Characterization of the Bradyrhizobium japonicum galE gene: Its impact on lipopolysaccharide profile and nodulation of soybean. FEMS Microbiol. Lett. 2008, 280, 242-249.

65. Campbell, G. R., L. A. Sharypova, H. Scheidle, K. M. Jones, K. Niehaus, A. Becker, and G. C. Walker. Striking complexity of lipopolysaccharide defects in a collection of Sinorhizobium meliloti mutants. // J. Bacteriol. - 2003. - №185. - 38533862 p.

66. Das, K., Prasanna, R., and Saxena, A. K. Rhizobia: a potential biocontrol agent for soilborne fungal pathogens. Folia Microbiol. 2017. 62, 425-435. doi: 10.1007/sl2223-017-0513-z

67. Deshmukh V.V., Raut B.TMane., S.S., Ingle R.W., Josh M.S. Compatibility of Bradyrhizobium japonicum isolates with agrochemicals. / American International Journal of Research in Formal, Applied & Natural Sciences, March-May. - 2014. - №6(1). - 55- 62

P.

68. Deptula, A.; Mikucka, A.; Gospodarek, E. Effect of growth conditions on cell surface hydrophobicity of multiresistant Pseudomonas aeruginosa strains. Med. Dosw. I Mikrobiol. 2004, 56, 359-364

69. Deaker, R., R. J. Roughley, and I. R. Kennedy. Legume seed inoculation technology—a review. // Soil Biol. Biochem. - 2004. - №36. - 1275-1288 p.

70. Duncan M. J. L-arabinose metabolism in Rhizobia // J. Gen. Microbiol. -1979. - V. 113. - 177-179 p.

71. Dilworth M. J., Arwas R., McKay I. A., Saroso S., Glenn A. R. Pentose Metabolism in Rhizobium leguminosarum MNF300 and in Cowpea Rhizobium NGR234 // J. Gen. Microbiol - 1986. -. V. 132. - 2733-2742 p. (https://doi.org/10.1099/00221287-132-10-2733)

72. Dominguez-Ferreras A, Soto MJ, Perez-Arnedo R, Olivares J, Sanjuan J: Importance of trehalose biosynthesis for Sinorhizobium meliloti osmotolerance and nodulation of Alfalfa roots. J Bacteriol 2009, 191:7490-7499.

73. Espin G., Moreno S., Guzman G. Molecular Genetics of the Glutamine Synthetases in Rhizobium Species // Crit. Rev. Microbiol. - 1994. - V. 20. - 117-123 p.

74. Eardly, B.D., Wang, F.-S. and Van Berkum, P. (1996) Corresponding 16S rRNA Gene Segments in Rhizobiaceae and Aeromonas Yield Discordant Phylogenies. Plant and Soil. - 186. P. 69-74.

75. Ferguson, B. J., Indrasumunar, A., Hayashi, S., Lin, M.-H., Lin, Y.-H., Reid, D. E., et al. Molecular analysis of legume nodule development and autoregulation. J. Integr. Plant Biol. 2010, 52, 61-76. doi: 10.1111/j.l744-7909.2010.00899.x

76. Fox J. E., Gulledge J., Engelhaupt E., Burow M. E., McLachlan J. A. Pesticides reduce symbiotic efficiency of nitrogen-fixing rhizobia and host plants. // PNAS - 2007. - №24. - 10282-10287 p. (Doi/10.1073/pnas.0611710104.)

77. Giller, K. E., and Cadisch, G. "Future benefits from biological nitrogen fixation: an ecological approach to agriculture," in Management of biological nitrogen fixation for the development of more productive and ustainable agricultural systems. Developments in Plant and Soil Sciences, Vol. 65, eds J. K. Ladha, and M. B. Peoples (Dordrecht: Springer), 1995, 255-277. doi: 10.1007/978-94-011-0053-3_13

78. Gopalakrishnan, S., Sathya, A., Vijayabharathi, R., Varshney, R. K., Gowda, C. L., and Krishnamurthy, L. Plant growth promoting rhizobia: challenges and opportunities. 3 Biotech 5, 2015, 355-377. doi: 10.1007/s13205-014-0241-x

79. Hirschman J., Wong P. K., Sei K., Keener J., Kustu S. Products of nitrogen regulatory genes ntrA and ntrC of enteric bacteria activate glnA transcription in vitro: evidence that the ntrA product is a sigma factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1985. -V. 82. - 1167-1171 p.

80. Itelima J.U. et al. A review: Biofertilizer- A key player in enhancing soil fertility and crop productivity // Microbiol. Biotechnol. Rep. 2018. V. 2 (1). C. 22-28.

81. Jan A. C. Vriezen, Frans J. de Bruijn, K. Nuslein. Responses of Rhizobia to Desiccation in Relation to Osmotic Stress, Oxygen, and Temperature // Applied And Environmental Microbiology. - 2007. - №11 vol 73. - p. 3451-3459.

82. Johnson G. V., Evans H. J., Ching T. M. Enzymes of the Glyoxylate Cycle in Rhizobia and Nodules of Legumes // Plant Physiol. - 1966. - V. 41. - 1330-1336 p. (DOI: https://doi.org/10.1104/pp.4L8.1330)

83. Jording D., Uhde C., Schmidt R., Puhler A. The C4-dicarboxylate transport system ofRhizobium meliloti and its role in nitrogen fixation during symbiosis with alfalfa (Medicago sativa) // Experientia. - 1994. - V. 50. - 874-883 p.

84. Katznelson H., Zagallo A. C. Metabolism of rhizobia in relation to

effectiveness // Can. J. Microbiol. - 1970. - V. 3. - 879-884 p.

85. Tikhonovich // Doklady Rosselkhozakademii. - 1998. - V. 6. - 7-10p. (In Russian).

86. Kinzig A. P., Socolow R. H. Is nitrogen-fertilizer use nearing a balance reply // Physics Today. - 1994. - V. 47. - 24-35 p.

87. Kleinhempel H.Biological plant protection / H.Kleinhempel // Acta Biotechnologica. 1990. V. 10, N6. P. 495-499

88. Kuykendall, L. D., Saxena, B., Devine, T. E., Udell, S. E. (1992). Genetic diversity in Bradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a proposal for Bradyrhizobium elkanii sp. nov. CanJ.Microbiol. V. 38, P. 501-505.

89. Lowe R. H., Evans H. Carbon dioxide requirement for growth of legume nodule bacteria // J. Soil Sci. - 1962. - V. 94. - 34-40 p.

90. LPWG. A new subfamily classification of the Leguminosae based on a taxonomically comprehensive phylogeny. Taxon 66, 2017, 44-77. doi: 10.12705/661.3

91. Mary, P., D. Ochin, and R. Tailliez. Growth status of rhizobia in relation to their tolerance to low water activities and desiccation stress. // Soil Biol. Biochem. - 1986. - №18. - 179-184 p.

92. Matse, D. T., Huang, C., Huang, Y., and Yen, M. (2020). Effects of coinoculation of Rhizobium with plant growth promoting rhizobacteria on the nitrogen fixation and nutrient uptake of Trifolium repens in low phosphorus soil. J. PlantNutr. 43, 739-752. doi: 10.1080/01904167.2019.1702205

93. McGuinness M, Dowling D. Plant-Associated Bacterial Degradation of Toxic Organic Compounds in Soi. / Int. J. Environ. Res. Public Health. - 2009. - №6. - 2226-2247p. (doi:10.3390/ijerph6082226)

94. Miller, K. J., and J. M. Wood. Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. // Annu. Rev. Microbiol. - 1996. - №50. - 101-136 p.

95. Martin G. B., Chapman K. A., Chelm B. K. Bradyrhizobium japonicum glnB, a putative nitrogen-regulatory gene, is regulated by NtrC at tandem promoters. // J. Bacteriol. - 1988. - V. 170. - 5452-5459 p. (DOI: 10.1128/jb.171.10.5638-5645.1989)

96. Magasanik B. The regulation of nitrogen utilization in enteric bacteria // J.

Cell. Biochem. - 1993. - V. 51. - 34-40 p.

97. McKay I. A., Glenn A. R., Dilworth M. J. Properties of Organic Acid Utilization Mutants ofRhizobium leguminosarum Strain 300 // J. Gen. Microbiol. - 1985.-V. 131. - 2067-2063 p. (https://doi.org/10.1099/00221287-131-8-2059)

98. Martinez De Drets G., Arias A. Metabolism of Some Polyols by Rhizobium meliloti // J. Bacteriol. - 1970. - V. 103. - 97-103 p.

99. Martinez De Drets G., Arias A. Enzymatic Basis for Differentiation of Rhizobium into Fast- and Slow-Growing Groups // J. Bacteriol. - 1972. - V. 109. - 467470 p.

100. Mulongoy K., Elkan G. H. Glucose catabolism in two derivatives of a Rhizobium japonicum strain differing in nitrogen-fixing efficiency. // J. Bacteriol. - 1977. - V. 131. - 179-187 p.

101. Nwanyanwu, C.E.; Abu, G. Influence of growth media on hydrophobicity of phenol-utilizing bacteria found in petroleum refinery effluent. Int. Res. J. Biol. Sci. 2013, 2, 6-11.

102. Noh, J.G.; Jeon, H.E.; So, J.S.; Chang, W.S. Effects of the Bradyrhizobium japonicum waaL (rfaL) Gene on Hydrophobicity, Motility, Stress Tolerance, and Symbiotic Relationship with Soybeans. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 16778-16791.

103. Ngwai, Y.B.; Sabiya, G. Cultivation in different growth media affects the expression of the cell surface hydrophobicity of bacteria. Cameroon J. Exp. Biol. 2007, 3, 26-29.

104. Pawlowski K., Ratet P., Schell J., de Burijn F. Cloning and characterization of nifA and ntrC genes of the stem nodulating bacterium ORS571, the nitrogen fixing symbiont of Sesbania rostrata: Regulation of nitrogen fixation (nif) genes in the free living versus symbiotic state // J. Mol. Gen. Genet. - 1987. - V. 206. - 207-219 p.

105. Rivera D., Obando M., Barbosa H., Rojas-Tapias D. Evaluation of polymers for the liquid rhizobial formulation and their influence in the Rhizobium-Cowpea interaction / D. Rivera, M.Obando, H.Barbosa, D.Rojas-Tapias // Universitas Scientiarum. - 2014. - №19(3). - 265-275 p.

106. Romero-Perdomo F. A., Camelo M., Bonilla R. Response of bradyrhizobium

japonicum to alginate in presence of pelleted fungicides on soybean seeds. / Revista U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica. - 2015. - №18 (2). - 359 - 364 p.

107. Robson R. L., Postgate J. R. Oxygen and Hydrogen in Biological Nitrogen Fixation // Ann. Rev. Microbiol. - 1980. - V. 34. - 183-207 p.

108. Ronson C. W., Astwood P. M., Downie J. A. Molecular cloning and genetic organization of C4-dicarboxylate transport genes from Rhizobium leguminosarum. // J. Bacteriol. - 1984. - V. 160. - 903-909 p.

109. Sayeda M. Ali, Gamil Amin, Mohammed Fayez, Mahmoud El-Tahan, Mohammed Monib & Nabil A. Hegazi Production of rhizobia biofertilizers using baker's yeast effluent and their application to Leucaena leucocephala, Archives of Agronomy and Soil Science, 2005, 51:6, 605-617, DOI: 10.1080/03650340500273732

110. Spaink, H.P. Rhizobial lipo-oligosaccharides: answers and question / H.P. Spaink // Plant Mol. Biol. - 1992. - №20. - P. 832-836.

111. Stephens J.H.J., Rask H.M., Inocilant production and formulation. Field Crops Research 2020, 65(2):249-258

112. Shadab Alam, Adesh Kumar, Arun Kumar, Shambhoo Prasad, Ashutosh Tiwari, Divya Srivastava, Shalini Srivastava, Praveen Tiwari, Jaswant Singh, Bhawana Mathur. Evidence of Fungicides Degradation by Rhizobia. / Agricultural Sciences. - 2014. - №5. - 618-624 p. (DOI: 10.4236/as.2014.57065)

113. Sleesman, J. P., and C. Leben. Bacteria desiccation: effect of temperature, relative humidity, and culture age on survival. // Phytopathology. - 1976. - №66. - 13341338 p.

114. Sprent, J. I., Ardley, J., and James, E. K. Biogeography of nodulated legumes and their nitrogen-fixing symbionts. New Phytol. 2017, 215, 40-56. doi: 10.1111/nph.14474

115. Siczek A, Lipiec J) Impact of faba bean-seed rhizobial inoculation on microbial activity in the rhizosphere soil during growing season. Int J Mol Sci 2016, 17:19

116. Subramaniam Gopalakrishnan, Arumugam Sathya, Rajendran Vijayabharathi, Rajeev Kumar Varshney, C. L. Laxmipathi Gowda, Lakshmanan

Krishnamurthy. Plant growth promoting rhizobia: challenges and opportunities. 3 Biotech. 2015 Aug; 5(4): 355-377. Published online 2014 Aug 3. doi: 10.1007/s13205-014-0241-x

117. Sugawara M, Cytryn EJ, Sadowsky MJ: Functional role of Bradyrhizobium japonicum trehalose biosynthesis and metabolism genes during physiological stress and nodulation. Appl Environ Microbiol 2010, 76:1071-1081.

118. J. A. Thompson, A. Bhromsiri, A. Shutsrirung and S. Lillakan, "Native root-nodule bacteria of traditional soybean-growing areas of northern Thailand", Plant Soil, 1991, V. 135, P. 53-65.

119. Trabelsi D, Mengoni A, Ammar HB, Mhamdi R. Effect of on-field inoculation of Phaseolus vulgaris with rhizobia on soil bacterial communities. FEMS Microbiol Ecol 2011, 77:211-222

120. Vincent, J. M., J. A. Thompson, and K. O. Donovan. Death of root nodule bacteria on drying. // Aust. J. Agric. Res. - 1961. - №13. - 258-270 p.

121. Vriezen, J. A. C., F. J. de Bruijn, and K. Nusslein. Desiccation responses and survival of Sinorhizobium meliloti USDA 1021 in relation to growth-phase, temperature, chloride and sulfate availability. // Lett. Appl. Microbiol. - 2006. - №42. -172-178 p.

122. Vance C. P., Heichel G. H. Carbon in N2 Fixation: Limitation or Exquisite Adaptation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1991. - V. 42. - 373-392 p.

123. Wang, J., Wu, D., Wang, Y., and Xie, D. Jasmonate action in plant defense against insects. J. Exp. Bot. 2019, 70, 3391-3400. doi: 10.1093/jxb/erz174

124. Wilhelm R. Neuere Erkenntnisse zur Phosphataufnahme von Pflanzen // Archives of Agronomy and Soil Science. - 2006. - №52 (1). - P. 1-17.

125. Willems A and Collins M D 1993 Phylogenetic analysis of rhizobia and agrobacteria based on 16S rRNA gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 43, P. 305313.

126. Yousaf S., Khan S., Aslam M. T.. Effect of Pesticides on the Soil Microbial Activity. / Pakistan J. Zool. - 2013. - № 45(4). - 1063-1067 p.

127. Yara Cristiane Buhl Gomes , Flavio Carlos Dalchiavon , Franciele Caroline de

Assis Valadâo. Joint use of fungicides, insecticides and inoculants in the treatment of soybean seeds. // Rev. Ceres, Viçosa. - 2017. - №64(3). - 258-265 p.

128. Yadav J, Verma JP, Rajak VK, Tiwari KN. Selection of effective indigenous Rhizobium strain for seed inoculationof chickpea (Cicer aritenium L.) production. Journal of Bacteriology. 2011;1:24-30.

129. Yadav, A. N., Kour, D., Kaur, T., Devi, R., Yadav, A., Dikilitas, M., et al. Biodiversity, and biotechnological contribution of beneficial soil microbiomes for nutrient cycling, plant growth improvement and nutrient uptake. Biocatal. Agricult. Biotechnol. 2021, 33:102009. doi: 10.1016/j.bcab.2021.102009

130. Young J. P. W., Downer H. L., Eardly B. D. 1991; Phylogeny of the phototrophic Rhizobium strain BTAil by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA gene segment.. Journal of Bacteriology V. 173., P. 2271-2277