Свойства резорбируемых матриксов из полигидроксиалканоатов различного химического состава тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Николаева, Елена Дмитриевна

• Николаева, Елена Дмитриевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Николаева, Елена Дмитриевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Требования, предъявляемые к материалам биомедицинского назначения.

1.2 Матриксы и другие изделия, способы получения и характеристики.

1.3 Полигидроксиалканоаты - перспективный класс природных биополимеров.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Синтез и выделение ПГА.

2.3. Определение свойств ПГА.

2.4 Конструирование полимерных матриксов для культивирования клеток.

2.4.1 Изготовление 2D матриксов.

2.4.2 Изготовление прессованных объемных матриксов.

2.4.3 Изготовление матриксов в виде ультратонкого волокна

2.4.4 Получение микрочастиц.

2.4.5 Покрытие сетчатых хирургических эндопротезов.

2.5. Стерилизация полученных матриксов.

2.6 Оценка свойств полученных матриксов.

2.7. Оценка токсичности полимерных матриксов in vitro.

2.8. Оценка токсичности матриксов из ПГА in vivo.

2.9. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ИЗДЕЛИЙ ИЗ ПГА РАЗЛИЧНОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ.

3.1. Характеристика ПГА, использованных для получения полимерных изделий различной геометрии.

3.2. Характеристики двумерных (2D) ПГА матриксов.

3.3. Конструирование полимерных изделий из ПГА методами нанотехнологии.

3.4 Характеристики объемных (3D) конструкций, сформированных из ПГА.

РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА 4. МОДИФИКАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ ПГА МАТРИКСОВ

ОБРАБОТКОЙ Н202-ПЛАЗМ0Й.

4.1. Оценка влияния обработки Н202-плазмой на характеристики матриксов из ПГА.

4.2 Оценка влияния обработки матриксов Н202-плазмой в культуре клеток.

РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ИЗДЕЛИЙ, СКОНСТРУИРОВАНННЫХ ИЗ ПГА РАЗЛИЧНОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА, В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК.

5.1 Исследований биологической совместимости 2D полимерных матриксов из ПГА различного химического состава.

5.2 Оценка биосовместимости и потенциала полимерных микрочастиц из ПГА в качестве клеточных носителей.

5.3. Исследование биосовметимости и остеогенного потенциала 3D объемных форм, полученных на основе ПГА

РЕЗЮМЕ.

ГЛАВА 6. БИОСОВМЕСТИМОСТЬ 2D МАТРИКСОВ,

ИЗГОТОВЛЕННЫХ ИЗ ПГА РАЗНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ

СТРУКТУРЫ, В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO.

6.1 Исследование реакции тканей на имплантаты, изготовленные из ПГА разного химического состава.

6.2. Динамика деструкции полимерных матриксов в ходе 6месячной подкожной имплантации.

РЕЗЮМЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Свойства резорбируемых матриксов из полигидроксиалканоатов различного химического состава»

Современная биотехнология позволяет получать широкий спектр экологичных материалов с полезными свойствами для различных сфер человеческой деятельности. Наиболее актуальной областью применения биоматериалов является биомедицина, остро нуждающаяся в биосовместимых материалах для изготовления медицинского инструментария, систем депонирования и доставки лекарственных средств, эндопротезов, сорбентов, биоконструкторов органов и тканей (Платэ, 1977; Nair, Laurencin, 2006).

Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен на создание эквивалентов тканей и органов, представляющих собой сложные конструкции из функционирующих клеток, закрепленных на клеточных носителях (каркасах, матриксах, скаффолдах). Успех этого направления зависит во многом от свойств матриксов, используемых в качестве носителей клеток (Wang et al., 2002; Хенч, Джонс, 2007).

Все необходимые свойства матрикса определяются свойствами исходного материала и технологией его переработки. Поэтому ключевой проблемой для успеха создания эффективных биоконструкций является наличие адекватного биодеградирующего и биосовместимого материала. Для конструирования матриксов используют биостабильные и биодеградируемые материалы неорганической и органической природы (металлы/сплавы, полимеры, керамику, гидроксиапатиты, композитные материалы, кораллы, коллаген, желатин, эластин, фибронектин, альгинат, хитозан и др.). В связи с тем, что имплантируемый матрикс с функционирующими клетками действует как временный каркас, способствующий формированию зрелой ткани, использование биодеградируемых матриксов является предпочтительным. При использовании не разрушаемых матриксов могут иметь место осложнения, связанные с длительным присутствием чужеродного материала в организме. Среди изучаемых материалов - полимеры монокарбоновых кислот: молочной, гликолиевой, алкановых (масляной, валериановой и др.).

Среди множества исследуемых биоматериалов полигидроксиалканоаты (ПГА) заслуживают особого внимания. ПГА - линейные полиэфиры бактериального происхождения, обладают рядом ценных свойств, среди которых способность в биодеструкции без образования токсичных продуктов разрушения и высокая биосовместимость, что позволяет использовать ПГА во многих сферах: медицине, фармакологии, сельском хозяйстве и т.д. Новое и актуальное направление исследований ПГА ориентировано на решение задач для клеточной и тканевой инженерии. Многообещающей представляется перспектива использования этих полимеров для регенерации поврежденных кожных покровов и нервов, закрытия дефектов мягких и костной тканей, имплантатов кровеносных сосудов и клапанов сердца и др. (Williams et al., 1999; Williams, Martin, 2004; Chen, Wu, 2005; Волова с соавт., 2006).

Однако до недавнего времени исследования ПГА, как за рубежом, так и в России, проводились на двух представителях данного класса полимеров: гомополимере поли-3-гидроксимасляной кислоте (поли-3-гидроксибутират, ПЗГБ), и на сополимере 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом.

ПЗГБ характеризуется высокой биосовместимостью, это связано с тем, что гидроксимасляная кислота является естественным метаболитом клеток и тканей высших животных и человека (Reusch et al., 1992). Недостатком этого типа ПГА является высокая степень кристалличности (свыше 70 %), а также то, что он не кристаллизуются упорядоченно, его весьма сложно перерабатывать в изделия, которые характеризуются низкой ударной прочностью, жесткостью и «старятся» во времени (Lakshmi, Laurencin, 2007).

Особо ценным в ПГА является возможность синтеза полимеров различного состава, образованных мономерами с различной длиной С-цепи. Сополимерные ПГА более перспективы, так как в зависимости от соотношения мономеров их базовые свойства могут изменяться в достаточно широких пределах (Volova, 2004; Волова с соавт., 2006; Sudesh et al., 2000). Но наличие в ПГА, помимо гидроксимасляной кислоты, других мономеров делает необходимым проверку биосовместимости материала в полном объеме.

Следующим по изученности представителем ПГА стали сополимеры 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом, которые имеют пониженную степень кристалличности (50-60 %) и более удобные технологичные свойства. Однако понадобилось около 10 лет для доказательства биосовместимости этого типа ПГА (Gogolewski et al., 1993; Севастьянов и др., 2001; Шишацкая и др., 2000; Volova et al., 2003; 2004; Kôse et al., 2005).

Относительно других типов ПГА информация весьма отрывочна и противоречива. Например, в США компанией Tepha проводят исследования резиноподобного с низкой температурой плавления (40-60 °С) полимера 3-гидроксиоктановой кислоты (полигидроксиоктаноата, ПГО) (Williams, Martin, 2001; 2003). Группа ученых в Китае активно исследует сополимеры 3-гидроксибутирата с 3-гидроксигексаноатом (ПЗГБ/ЗГГ) (Chen, 2009). Имеются немногочисленные данные о трехкомпонентных ПГА, образованных мономерами масляной, валериановой и гексановой кислот (Ji et al., 2008; Ji et al., 2009; Wang et al., 2010). Одним из перспективных, но мало изученным ПГА, является сополимер З-гидроксибутирата/4-гидроксибутирата, для которого характерны высокие скорости биодеградации in vivo, он является эластомером, имеет более высокие показатели удлинения при разрыве и относительно высокий предел прочности на разрыв в отличие от большинства общеизвестных полимеров этого класса (Martin, Williams, 2003; Cheng et al., 2008).

Немногочисленные исследования биосовместимости ПГА различного химического состава выполнены в основном в культурах клеток, при этом эксперименты на животных еще менее представительны. Опубликованные к настоящему моменты результаты не дают однозначного ответа о биосовместимости того или иного типа ПГА. Связано это с тем, что в экспериментах были использованы различные типы ПГА, различной степени очистки (об этом важном моменте информация в публикациях не представлена). Анализируемые изделия (пленки, мембраны и др.) были изготовлены различными методами, и далеко не во всех работах биосовместимость матриксов оценена комплексно, то есть с учетом физикохимических свойств полимеров, структуры и свойств поверхности. Поэтому для ответа на вопрос о том, какие типы ПГА безопасны и наиболее перспективны для применения, необходимы комплексные исследования.

Исходя из этого, целью работы было конструирование матриксов из полигидроксиалканоатов различного химического состава (поли-3-гидроксибутирата и сополимеров 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибутиратом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом) исследование биологической совместимости в культурах клеток и экспериментах на лабораторных животных и закономерностей биоразрушения in vivo.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

1. Сконструировать семейство клеточных матриксов различной геометрии и структуры из ПГА различного химического состава: гомогенного поли-3-гидкросиубтирата и сополимеров 3-гидрокисбутирата с 4-гидрокисбутиратаом, 3-гидроксивалератом, 3-гидркосигексаноатом.

2. Исследовать свойства матриксов из ПГА в сопоставлении с контрольным матриксом из полимолочной кислоты (полилактида, ПМК).

3. Изучить возможность модификации поверхности матриксов обработкой Н202-плазмой.

4. Исследовать биологическую совместимость и функциональные свойства матриксов из ПГА различного химического состава в культурах клеток.

5. Исследовать биосовместимость и закономерности биоразрушения ПГА различного химического состава в эксперименте на лабораторных животных.

Научная новизна:

Впервые из ПГА различного химического состава (ПЗГБ и сополимеров ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ) с применением различных технологий сконструированы и исследованы матриксы в виде плотных и пористых пленок, объемных форм, микрочастиц, нетканого полотна, сформированного ультратонкими волокнами. Установлено, что на свойства поверхности матриксов влияет химический состав ПГА и техника переработки полимера. Показана возможность модификации поверхности матриксов обработкой Н2О2-плазмой, что положительно сказывается на адгезии и жизнеспособности функционирующих клеток. В культурах клеток и в экспериментах на лабораторных животных показана биологическая безопасность всех типов матриксов, изготовленных из ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ, на уровне клеток, тканей и организма Доказано отсутствие цитотоксичности всех исследованных типов ПГА при прямом контакте с пролиферирующими клетками; по адгезивным свойствам и способности поддерживать пролиферацию клеток все матриксы сопоставимы с полистиролом и превосходят полимолочную кислоту. В хроническим 6-ти месячном эксперименте впервые исследованы последствия подкожной имплантации матриксов из ПГА различного химического состава и показана, что ответная реакция тканей однотипна и характеризуется не продолжительным посттравматическим воспалением без образования выраженных фиброзных капсул и иных неблагоприятных реакций. Установлено, что активность биоразрушения ПГА in vivo возрастает в ряду ПЗГБ/ЗГГ > ПЗГБ/4ГБ > ПЗГБ/ЗГВ >ПЗГБ, и в этом процессе активное участие принимают макрофаги и гигантские клетки инородных тел. С применением ВЭЖХ показано, что наибольшие изменение молекулярной массы и полидисперности ПГА имеют место у быстро разрушающихся сополимеров ПЗГБ/4ГБ и ПЗГБ/ЗГГ, для которых характерна более выраженная на ранних сроках гиганто-клеточная реакция тканей.

Практическая значимость. Разработано семейство матриксов различной геометрии и структуры из охарактеризованных и высокоочищенных образцов ПГА различного химического состава, отвечающих требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям биомедицинского назначения. Разработан способ модификации поверхности матриксов и стерилизации с применением Н202-плазмы, позволяющий повысить гидрофильность поверхности и улучшить эксплуатационные свойства. Физико-химические и биологические свойства матриксов позволяют рекомендовать их для клеточных технологий и тканевой инженерии, а также в качестве барьерных средств для реконструктивной хирургии.

Положения, выносимые на защиту:

1 .Сконструированнное и охарактеризованное семейство матриксов из ПГА различного химического состава (ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГТ).

2. Возможность модификации поверхности матриксов обработкой Н202-плазмой и повышением адгезионных свойств поверхности по отношению к культивируемым клеткам.

3. Доказанная высокая биологическая совместимость матриксов, изготовленных из ПГА различного химического состава в культурах клеток и 6-ти месячном эксперименте на лабораторных животных.

4. Закономерности биоразрушения матригсов из ПГА различного химического состава (ПЗГБ, ПЗГБ/4ГБ, ПЗГБ/ЗГВ, ПЗГБ/ЗГГ) ш vivo.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (2006, 2011), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (2010), на Международном научном семинаре «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (2011).

Работа выполнена в рамках плановой тематики НИР Института биофизики СО РАН (№№ государственной регистрации: 01201000937), Сибирского Федерального университета при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки-медицине» (проект № 20.11), Программы Интеграционных программ Сибирского отделения РАН (проекты 14 «Стволовые клетки - основа клеточных биотехнологий будущего»; № 96 «Фундаментальные основы биотехнологического получения целевых продуктов и препаратов»); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы», проекты №№ 2.1.1.528; РНП-11); по мега-проекту (постановление Правительства РФ № 220 от 09.04.2010 «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих учёных в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (договор №11 .G34.31.0013).

Автор благодарит своего научного руководителя Шишацкую Екатерину Игоревну и руководителя Лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Волову Татьяну Григорьевну за постоянное внимание и участие в работе, сотрудников Института биофизики СО РАН О.Г. Беляеву, Н.О. Жила, А.Н. Бояндина, A.B. Гореву за помощь в проведении экспериментов. Отдельная благодарность сотрудникам Лимнологического института СО РАН Е.В. Лихошвай и В.И. Егорову за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Николаева, Елена Дмитриевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа посвящена исследованиям физико-химических и биологических свойств матриксов, сконструированных из полигидроксиалканоатов (ПГА) -биоразрушаемых полиэфиров природного происхождения.

На первом этапе работы сконструирован ряд матриксов из ПГА различного химического состава (поли-3-гидроксибутират и сополимеры 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибутиратом, 3-гидроксивалератом, 3-гидроксигексаноатом). С использованием различных методов (испарение растворителя, солевое выщелачивание, холодное прессование, электростатическое формование) из данных образцов полимеров получены 2Б и ЗЭ матриксы: пленки, прессованные компактные и пористые формы, ультратонкие волокна и микрочастицы. Установлено, на структуру матриксов и физико-химические свойства поверхности влияют состав полимеров, техника изготовления, введение дополнительных компонентов (гидроксиапатит, полиэтиленгликоль). В зависимости от состава исследуемых ПГА показаны изменения таких параметров поверхности, как пористость, структура рисунка поверхности матриксов, при этом средние значения шероховатости матриксов из разных типов ПГА имели близкие значения. Наиболее гидрофобным представителем ПГА определен гомополимер ПЗГБ, у ПГА с включением 4-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата или 3-гидроксигексаноата отмечено снижение контактных краевых углов смачивания. Добавление ГАП и ПЭГ к полимеру приводило к изменению топографии поверхности, увеличению пористости матриксов и смачиваемости поверхности изделий.

Показано, что обработка Н202-плазмой матриксов, изготовленных из ПГА, повышает гидрофильность поверхности, способствует адгезии клеток и в дальнейшем положительно сказывается на их пролиферации и жизнеспособности, а также может быть использована в качестве способа стерилизации.

В исследованиях in vitro на примере фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ показано, что матриксы, изготовленные из исследованных типов ПГА, не оказывают цитотоксического воздействия при прямом контакте и пригодны для изготовления клеточных носителей и других изделий медицинского назначения. Все исследованные типы ПГА хорошо поддерживали адгезию и пролиферацию клеток по сравнению с другим биоматериалом - полимером молочной кислоты.

Полученные положительные результаты в системах in vitro позволили перейти к исследованиям на лабораторных животных. В ходе медико-токсикологических исследований 2D матриксов при подкожной имплантации в течение 180 суток не было зафиксировано негативного влияния матриксов из ПГА на физиологические и биохимические характеристики животных, их поведение, рост и развитие, а также функции крови. В течение всего периода эксперимента не было отмечено неблагоприятных некротических проявлений, а также гнойного воспаления, кальцификации и малигнизации фиброзной капсулы вокруг полимерных имплантатов. Реакция тканей на ПГА-матриксы была сопоставима с реакцией на полилактид, но существенно менее выражена на ранних сроках после имплантации. Состав полимеров влиял на скорость деградации - наиболее устойчивыми были матриксы из ПЗГБ, наиболее быстро разрушались матриксы из ПЗГБ/4ГБ и ПЗГБ/ЗГГ. При этом деструкция всех полимерных пленок из ПГА была более медленная по сравнению с полилактидом, и сопровождалась более поздним развитием гигантоклеточной реакции. Результаты работы, полученные в экспериментах на клеточных культурах и лабораторных животных говорят о биосовместимости ПГА на клеточном, тканевом и организменном уровнях.

В целом, полученные данные свидетельствуют о пригодности полигидроксиалканоатов для использования в биомедицине.