Супрамолекулярные комплексы химотрипсина с наночастицами селена и серебра тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Плющенко Анна Викторовна

• Плющенко Анна Викторовна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Плющенко Анна Викторовна

Оглавление

Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Иммобилизация ферментов

1.1.1 Методы обратимой иммобилизации ферментов

1.1.2 Методы необратимой иммобилизации ферментов

1.1.3 Носители для иммобилизации ферментов

1.1.4 Наночастицы как носители для иммобилизации ферментов

1.2 Комплексы ферментов с наночастицами

1.2.1 Комплексы протеолитических ферментов с наночастицами различной природы

1.2.2 Комплексы ферментов с наночастицами серебра (НЧ-Ag)

1.2.3 Комплексы ферментов с наночастицами селена (НЧ^)

1.3 Методы получения НЧ-Ag и НЧ^

1.3.1 Методы получения НЧ-Ag

1.3.2 Методы получения НЧ^

Глава 2 Материалы и методы исследования

2.1 Материалы

2.2 Методы исследования

2.2.1 Получение супрамолекулярных комплексов ХТ с НЧ^ ^-ХТ)

2.2.2 Получение НЧ^

2.2.3 Получение супрамолекулярных комплексов ХТ с НЧ-Ag (Ag-ХТ)

2.2.4 Приготовление универсального буферного раствора

2.2.5 Исследование седиментационной устойчивости супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ в зависимости от рН среды

2.2.6 Определение протеолитической активности нативного ХТ и ХТ в составе супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ

2.2.7 Исследование кинетики накопления продукта реакции гидролиза для нативного ХТ и ХТ в составе супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ

2.2.8 Исследование антибактериальной активности ХТ в составе супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ

2.2.9 Определение константы скорости реакции образования красного аморфного Se

2.2.10 Обработка результатов многократных измерений и оценка их погрешности48

2.2.11 УФ- и видимая спектрофотометрия

2.2.12 Динамическое рассеяние света (ДРС)

2.2.13 Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

2.2.14 рН-метрия

Глава 3 Результаты и обсуждение

3.1 Супрамолекулярные комплексы ХТ с НЧ-Se и НЧ-Ag как модельные объекты для изучения межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами различной природы

3.1.1 Получение супрамолекулярных комплексов Se-ХТ

3.1.2 Получение супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ

3.2 Спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ

3.2.1 Спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ

3.2.2 Спектральные и размерные характеристики НЧ-Ag

3.2.3 Спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-! и Ag-ХТ-П

3.3 Исследование размерных характеристик НЧ-Se и НЧ-Ag в составе супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ методом ПЭМ

3.3.1 Размерные характеристики НЧ-Se в составе комплексов Se-ХТ

3.3.2 Размерные характеристики НЧ-Ag в составе супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-! и Ag-ХТ-П

3.4 Механизм роста НЧ-Ag

3.5 Исследование размерных характеристик супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ методом ДРС

3.5.1 Размерные и спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ в зависимости от температуры проведения реакции и концентрации Se

3.5.2 Размерные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ в зависимости от соотношения концентраций Se и ХТ

3.5.3 Размерные характеристики супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-П

3.6 Седиментационная устойчивость супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ

3.6.1 Седиментационная устойчивость и спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ в зависимости от рН среды и концентрации Se

3.6.2 Седиментационная устойчивость супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-I и их спектральные и размерные характеристики в зависимости от рН среды

3.7 Модели взаимодействия ХТ с НЧ^е и НЧ-Ag

3.7.1 Модель взаимодействия ХТ с НЧ^е

3.7.2 Модель взаимодействия ХТ с НЧ-Ag

3.8 Протеолитическая активность ХТ в составе супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ

3.8.1 Протеолитическая активность ХТ в составе супрамолекулярных комплексов Se-ХТ

3.8.2 Протеолитическая активность ХТ в составе супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ

3.9 Антибактериальная активность НЧ-Ag в составе супрамолекулярных

комплексов Ag-ХТ-1

Заключение

Список сокращений и условных обозначений

Благодарности

Список литературы

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ПРИЛОЖЕНИЕ В

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

ПРИЛОЖЕНИЕ Д

ПРИЛОЖЕНИЕ Е

ПРИЛОЖЕНИЕ Ж

Введение

За последние несколько десятилетий широкое распространение получили терапевтические и диагностические системы на основе наночастиц. При этом обнаружилось, что введение наночастиц в физиологическую систему приводит к адсорбции биомолекул (в основном белков) на поверхности наночастиц. Образование так называемой белковой «короны» не только приводит к снижению эффективности наносистем, но и оказывает значительное влияние на взаимодействие наночастиц с клетками [1, 2]. В связи с этим актуально исследование межмолекулярных взаимодействий наночастиц различной природы с белками, а также свойств образующихся супрамолекулярных комплексов.

Протеолитические ферменты являются модельными объектами для исследований физико-химических изменений, происходящих при взаимодействиях между наночастицами и белками. Наиболее часто используемым ферментом в такого рода исследованиях является а-химотрипсин (ХТ), при этом его химическая структура и механизм действия хорошо изучены [3]. Поэтому для исследования межмолекулярных взаимодействий наночастиц с белками в качестве модельного объекта был выбран ХТ.

Связывание ферментов с наночастицами осуществляют как ковалентно (напрямую - хемосорбция, или посредством связующего агента - спейсера), так и нековалентно (физическая адсорбция). При этом используют как немодифицированные наночастицы, так и наночастицы, модифицированные различными функциональными группами. Для исследования особенностей образования супрамолекулярных комплексов наночастиц с белками в биологических средах особенно актуальным представляется изучение межмолекулярных взаимодействий, возникающих при адсорбции ферментов непосредственно на поверхности наночастиц без использования дополнительных связующих агентов.

В литературе имеется большое число работ, посвященных исследованиям взаимодействий протеолитических ферментов, в частности ХТ, с магнитными

наночастицами [4-11]. Однако слабо представлены исследования физико-химических взаимодействий протеолитических ферментов с наночастицами, обладающими собственной биологической активностью, такими как наночастицы диоксида титана, сульфида цинка, золота, серебра, селена. Особое внимание привлекают наночастицы серебра (НЧ-Ag), исследованиям антимикробных свойств, механизмов и спектра действия которых посвящено большое число научных работ [12-18], а также наночастицы селена (НЧ^е), проявляющие противоопухолевую и антимикробную активность в отношении бактерий и грибов и способность разрушать биопленки [19-20]. В настоящий момент в мировой литературе практически отсутствуют исследования межмолекулярных взаимодействий, возникающих в результате непосредственной адсорбции протеолитического фермента ХТ на поверхности НЧ-Ag и НЧ^е.

Вместе с тем, создание комплексов для использования в качестве модельных систем при исследовании межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами различной природы, возникающих в результате физической адсорбции в биологических системах, а также изучение физико-химических свойств супрамолекулярных комплексов, в которых каждая составляющая обеспечивает различную биологическую активность, являются актуальными задачами современной молекулярной биофизики. Исследование физико-химических взаимодействий протеолитических ферментов с наночастицами, обладающими антибактериальной активностью, позволит создать основы для разработки лекарственных препаратов, сочетающих протеолитические и антибактериальные свойства.

Цель работы состояла в разработке условий получения и определении физико-химических свойств супрамолекулярных комплексов ХТ с НЧ^е и НЧ-Ag в качестве модельных систем для исследования межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать условия получения супрамолекулярных комплексов ХТ с НЧ^е и НЧ-Ag для использования в качестве модельных систем при исследовании

межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами (гидрофобных, электростатических, гидрофобных в сочетании с электростатическими).

2. Показать формирование супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ и определить их спектральные характеристики методом УФ- и видимой спектрофотометрии.

3. Определить методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического рассеяния света размерные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ.

4. Определить влияние рН среды на седиментационную устойчивость супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ.

5. Оценить протеолитические свойства супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и А^ХТ.

6. Оценить антибактериальную активность супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ.

Объектами исследования диссертационной работы являлись полученные автором диссертации супрамолекулярные комплексы Se-ХТ и Ag-ХТ.

Предметом исследования являлась природа межмолекулярных взаимодействий фермента ХТ с НЧ^е и НЧ-Ag и физико-химические свойства модельных супрамолекулярных комплексов.

Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые разработаны условия получения супрамолекулярных комплексов протеолитического фермента ХТ с НЧ-Ag и НЧ^е, обладающих полифункциональной биологической активностью, для использования в качестве модельных систем при исследовании межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами различной природы, возникающих в результате физической адсорбции. В работе впервые изучено влияние межмолекулярных взаимодействий протеолитического фермента ХТ с НЧ^е и НЧ-Ag на характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ методами УФ- и видимой спектрофотометрии, просвечивающей электронной микроскопии и динамического рассеяния света, определены условия седиментационной устойчивости супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ.

Впервые установлено повышение протеолитической активности ХТ в составе супрамолекулярных комплексов в сравнении с нативным ферментом при рН 11.0, а также установлена антибактериальная активность НЧ-Ag в составе комплексов А^ХТ.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость диссертационной работы заключается в том, что результаты проведенных исследований могут быть использованы для изучения межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами различной природы, возникающих в результате физической адсорбции в биологических системах. Полученные супрамолекулярные комплексы на основе ХТ и НЧ-Ag являются основой для создания раневого покрытия, обладающего как антибактериальной, так и протеолитической активностью, что обусловливает практическую значимость диссертационной работы.

Методология и методы исследования

Супрамолекулярные комплексы ХТ с НЧ^е и НЧ-Ag были исследованы методами УФ- и видимой спектрофотометрии, динамического рассеяния света, а также просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Обработку микрофотографий, полученных методом ПЭМ, осуществляли с помощью программы ImageJ 1.52п.

Положения, выносимые на защиту:

1. Супрамолекулярные комплексы Se-ХТ могут быть использованы в качестве модельной системы при исследовании гидрофобных межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами. Супрамолекулярные комплексы Ag-ХТ могут быть использованы в качестве модельной системы при исследовании как преимущественно электростатических взаимодействий белков с наночастицами, так и гидрофобных взаимодействий в сочетании с электростатическими.

2. Реализация гидрофобных взаимодействий между ХТ и НЧ^е может приводить к изменению условий седиментации комплексов в сравнении с нативным ферментом, зависящих от концентрации Se. Сочетание двух типов

межмолекулярных взаимодействий (гидрофобных и электростатических) при формировании супрамолекулярных комплексов Ag-XT-I может предотвращать агрегацию НЧ-Ag, в результате чего комплексы Ag-XT-I сохраняют седиментационную устойчивость в диапазоне рН среды от 3.0 до

3. Удельная протеолитическая активность XT в составе комплексов Se-XT в сравнении с нативным ферментом, а также протеолитическая активность комплексов Ag-XT-II/1 в сравнении с нативным XT и комплексами Ag-XT-I увеличиваются при рН 11.0. При этом увеличение концентрации Se в комплексе приводит к ускорению ферментативной реакции гидролиза и повышению протеолитической активности XT.

4. НЧ-Ag в составе супрамолекулярных комплексов с XT проявляют антибактериальную активность в отношении культур S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. faecalis, E. coli. Изменение концентрации XT не влияет на проявление антибактериальных свойств НЧ-Ag. Минимальная концентрация НЧ-Ag, подавляющая рост микроорганизмов, составляет 0.1 мг/мл вне зависимости от концентрации XT.

Достоверность полученных результатов обусловлена соответствием используемых методов поставленным задачам с учетом особенностей изучаемых объектов, воспроизводимостью результатов и согласованностью данных различных методов, принципиальным согласием с существующими в литературе представлениями о потенциальных возможностях подобных взаимодействий при комплексообразовании наночастиц с белками и применением методов статистического анализа данных.

Личный вклад автора.

Лично автором были выполнены анализ и обобщение имеющихся в литературе данных по теме диссертационного исследования, поставлены цели и задачы работы, определены условия получения седиментационно устойчивых супрамолекулярных комплексов, исследованы их спектральные и размерные характеристики методами УФ- и видимой спектрофотометрии и динамического

рассеяния света, исследована протеолитическая активность, обработаны и проанализированы экспериментальные данные.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Супрамолекулярные комплексы химотрипсина с наночастицами селена и серебра»

Апробация работы

Основное содержание диссертационной работы изложено в 24 научных публикациях из них 17 по материалам конференций.

Основные результаты диссертационного исследования были представлены на следующих конференциях: международная научно-техническая конференция «Нанотехнологии функциональных материалов (НФМ'12)» (Санкт-Петербург, 2012); Вторая Всероссийская молодежная научно-техническая конференция с международным участием "Инновации в материаловедении" (Москва, 2015); VI и VIII Всероссийская научная конференция студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2016, 2018); VI Международная конференция с элементами научной школы для молодежи "Функциональные наноматериалы и высокочистые вещества" (Суздаль, 2016 (2 доклада)); XIV и XV Российская ежегодная конференция молодых научных сотрудников и аспирантов «Физико-химия и технология неорганических материалов» (Москва, 2017, 2018); Всероссийский симпозиум с международным участием «Физико-химические проблемы адсорбции в нанопористых материалах» (Москва-Клязьма, 2018); Четвертый междисциплинарный научный форум с международным участием "Новые материалы и перспективные технологии" (Москва, 2018); XLIV, XLV, XLVI и XLVII конференции с международным участием «Неделя науки СПбПУ» (Санкт-Петербург, 2015 (2 доклада), 2016, 2017, 2018 (2 доклада)); Международная научно-техническая конференция молодых ученых «Инновационные материалы и технологии» (Минск, 2019).

По теме диссертации было опубликовано 7 статей в рецензируемых изданиях:

1. Боровикова, Л.Н. Стабилизация наночастиц селена химотрипсином: влияние рН и концентрационного соотношения наночастица-фермент на стабильность нанокомплексов / Л.Н. Боровикова, А.В. Титова (Плющенко), Н.А. Матвеева, О.А.

Писарев // Журн. Физ. Химии. - 2013. - Т.87. - №6. - C.1008-1011. (Borovikova, L.N. Stabilizing selenium nanoparticles with chymotrypsin: The effect of pH and nanoparticle-enzyme concentration ratios on the stability of nanocomplexes / L.N. Borovikova, A.V. Titova, N.A. Matveeva, O.A. Pisarev // Russian Journal of Physical Chemistry A. - 2013. - V.87. - №6. - P. 998-1001.)

2. Боровикова Л.Н. Влияние температуры синтеза на спектральные и размерные характеристики нанокомплексов селен-химотрипсин / Л.Н. Боровикова, А.В. Титова (Плющенко), А.И. Киппер, О.А. Писарев // Журн. Физ. Химии. - 2015. -Т.89. - №.3. - С.467-469. (Borovikova, L.N. Effect of the temperature of synthesis on the spectral and dimensional characteristics of selenium-chymotrypsin nanocomplexes / L.N. Borovikova, A.V. Titova, A.I. Kipper, O.A. Pisarev // Russian Journal of Physical Chemistry A. -2015. -V.89. -№3. - P. 469-471.)

3. Писарев, О.А. Иммобилизация химотрипсина на наночастицах серебра / О.А. Писарев, А.В. Титова (Плющенко), Л.Н. Боровикова, А.И. Киппер, Т.М. Ворошилова, Е.Ф. Панарин // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2016. - № 3. - С. 790-793. (Pisarev, O.A. Immobilization of chymotrypsin on silver nanoparticles / O.A. Pisarev, A.V. Titova, L.N. Borovikova, A.I. Kipper, E.F. Panarin, T.M. Voroshilova // Russian Chemical Bulletin - 2016. - V.65. - №3. - P. 790-793.)

4. Titova (Плющенко) A. Immobilization of chymotrypsin on selenium nanoparticles / A. Titova (Plyushchenko), L. Borovikova, A. Kipper, O. Pisarev // Chemistry Research Journal. -2017. - V.2. -№5. - P. 204-214.

5. Плющенко, А.В. Протеолитическая активность химотрипсина, иммобилизованного на наночастицах селена / А.В. Плющенко, Л.Н. Боровикова, О.А. Писарев // Прикладная биохимия и микробиология. - 2018. - Т. 54. - №4. - С. 362-365. (Plyushchenko, A.V. Proteolytic Activity of Chymotrypsin Immobilized on Selenium Nanoparticles / A.V. Plyushchenko, L.N. Borovikova, O.A. Pisarev // Applied Biochemistry and Microbiology. -2018. -V. 54. -№. 4. - P. 375-378.)

6. Плющенко, А.В. Поверхностный плазмонный резонанс и агрегативная стабильность комплексов наночастиц серебра с химотрипсином / А.В. Плющенко, К.А. Митусова, Л.Н. Боровикова, А.И. Киппер, О.А. Писарев // Оптика и

спектроскопия. - 2018. - Т. 125. - №2. - С. 234-239. (Plyushchenko, A.V. Surface Plasmon Resonance and Aggregate Stability of Silver Nanoparticle Complexes with Chemotripsin / A.V. Plyushchenko, K.A. Mitusova, L.N. Borovikova, A.I. Kipper, O.A. Pisarev // Optics and Spectroscopy. - 2018. - V. - 125. - №2. - P. - 243-248.) 7. Плющенко, А.В. Влияние способа синтеза нанокомплексов на протеолитическую активность химотрипсина, иммобилизованного на наночастицах серебра / А.В. Плющенко, Л.Н. Боровикова, О.А. Писарев // Прикладная биохимия и микробиология. - 2019. - Т. 55. - №5. - С. 460-464. (Plyushchenko, A.V. Effect of the method of nanocomplex synthesis on the proteolytic activity of chymotrypsin immobilized on silver nanoparticles / A.V. Plyushchenko, L.N. Borovikova, O.A. Pisarev // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2019. - V. 55. -№5. - P. 514-517.)

Глава 1 Обзор литературы 1.1 Иммобилизация ферментов

Химические реакции в живых системах протекают с высокой скоростью благодаря ферментам - белкам, выполняющим роль катализаторов. Как и другие катализаторы, ферменты понижают энергию активации реакции, т.е. количество энергии, необходимое для ее протекания. При этом ферменты не подвергаются необратимым изменениям и не расходуются в процессе реакции. Также они повышают скорость реакции, не приводя к изменению равновесия между реагентами и продуктами [21]. Тем не менее, использование нативных ферментов обычно связано с недостатками, обусловленными чувствительностью к условиям среды, низкой стабильностью или склонностью к ингибированию высокими концентрациями продуктов ферментативной реакции [22, 23]. Малый срок эксплуатации большинства нативных ферментов, вызванный их нестабильностью, а также технически сложный процесс восстановления и повторного использования ферментов затрудняет их промышленное применение [24].

Различные способы иммобилизации ферментов позволяют регулировать их свойства и облегчают их применение в биотехнологических процессах. Под иммобилизацией ферментов подразумевают искусственное ограничение свободы движений фермента с сохранением его каталитических свойств. Эта методика существенно упрощает работу с биокатализатором и обеспечивает повышение стабильности фермента в условиях хранения и эксплуатации [22, 23]. Также иммобилизация дает возможность улучшать свойства ферментов, такие как эффективность в органических растворителях, специфичность, устойчивость к изменению рН, термостабильность и т. д. [25, 26]. Это является результатом структурных изменений, которым подвергаются молекулы фермента вследствие процесса иммобилизации, а также создания микроокружения, в котором работает фермент, отличном от раствора нативного фермента [27]. Все это делает применение иммобилизованных ферментов эффективнее, экономичнее и конкурентоспособнее в сравнении с использованием нативных ферментов.

Методы иммобилизации основываются на том факте, что входящие в состав ферментов аминокислоты обладают различными свойствами, в результате чего функциональные группы в боковых цепях этих аминокислот могут быть вовлечены в связывание с носителем посредством различных типов межмолекулярных взаимодействий. По механизму взаимодействия методы иммобилизации ферментов можно разделить на два типа: физические и химические методы [23, 28, 29]. В физических методах реализуется нековалентное связывание ферментов с носителями за счет водородных связей, гидрофобных взаимодействий, сил Ван-дер-Ваальса, аффинного связывания, ионного связывания фермента с носителем или механического удерживания фермента в носителе. В химических методах ковалентное связывание достигается посредством эфирных, тиоэфирных, амидных, дисульфидных или карбаматных связей между ферментом и материалом носителя. Также методы иммобилизации можно разделить на обратимые и необратимые.

1.1.1 Методы обратимой иммобилизации ферментов

Особенностью этих методов является то, что обратимо иммобилизованные ферменты могут быть отделены от носителя в мягких условиях. Обратимая иммобилизация ферментов особенно важна для иммобилизации лабильных ферментов и использования в биоаналитических системах [30]. К обратимым методам иммобилизации относятся физическая адсорбция, хелатирование (металлическое связывание) и образование дисульфидных связей.

а) Физическая адсорбция

Простейшим методом иммобилизации является неспецифическая физическая адсорбция (ионная и неионная). При ионном связывании ферменты прикрепляются к носителю посредством электростатических взаимодействий, в то время как при неионной адсорбции - посредством водородных связей, ван-дер-ваальсовых сил или гидрофобных взаимодействий (рисунок 1.1). Природа сил, участвующих в нековалентной иммобилизации, допускает обратимость

процесса при изменении условий, влияющих на силу взаимодействия (рН, ионная сила, температура или полярность растворителя). Важным преимуществом иммобилизации путем физической адсорбции является возможность удалять ферменты с носителя при снижении их активности в мягких условиях, что позволяет регенерировать носитель и загружать его свежими ферментами. Основным недостатком данного метода является десорбция фермента с носителя в случае относительно слабых взаимодействий [23, 29].

Рисунок 1.1 - Иммобилизация фермента посредством ионной и неионной адсорбции на носителе

В случае иммобилизации ферментов посредством гидрофобных взаимодействий сила связывания зависит от степени гидрофобности адсорбента и белка. Регуляция гидрофобных взаимодействий между ферментом и носителем осуществляется путем изменения рН и температуры во время иммобилизации фермента [23, 31].

Аффинное связывание также можно рассматривать как один из физических методов иммобилизации ферментов [29, 32]. Принцип аффинного связывания основан на селективности между комплементарными биомолекулами. Примерами комплементарного связывания являются взаимодействия антител и антигенов или гаптенов, лектинов и свободных сахаридных цепей или гликозилированных макромолекул, нуклеиновых кислот и связывающих нуклеиновые кислоты белков, гормонов и их рецепторов, авидина и биотина, полигистидиновых меток и ионов

металлов и т. д. Ключевыми преимуществами этого метода являются высокая селективность взаимодействия, контролируемая ориентация иммобилизованных ферментов и минимальные конформационные изменения, вызванные этим типом связывания, при высоком сохранении активности иммобилизованного фермента. Однако для этого метода требуется ковалентное связывание дорогостоящего аффинного лиганда (например, антитела или лектина) с носителем [33, 34].

б) Хелатирование или металлическое связывание

В этом методе связующим звеном между носителем и ферментом является металл. Соли переходных металлов или гидроксиды, осажденные на поверхности органических носителей, образуют координационные связи с нуклеофильными группами на носителе. Соль или гидроксид металла осаждают на носитель (например, целлюлозу, хитин, альгиновую кислоту, носители на основе диоксида кремния) путем нагревания или нейтрализации. Из-за стерических факторов носитель не может занять все координационные положения металла, и поэтому некоторые из этих положений остаются свободными для координационного связывания с функциональными группами ферментов. Метод достаточно прост в осуществлении, и иммобилизованные таким образом ферменты сохраняют относительно высокую активность (30-80 %). Однако стабильность системы при ее эксплуатации непостоянна, и трудно добиться хорошей воспроизводимости результатов [28].

в) Образование дисульфидных связей

Уникальность метода состоит в том, что, несмотря на образование стабильной ковалентной связи между носителем и ферментом, эта связь может быть разрушена реакцией с подходящим агентом, таким как дитиотреитол, в мягких условиях. Кроме того, поскольку реакционная способность тиольных групп может регулироваться путем изменения рН, ферменты, иммобилизованные посредством дисульфидных связей, обычно сохраняют высокую активность при условии использования подходящих высоко специфичных тио-реактивных адсорбентов [35, 36].

1.1.2 Методы необратимой иммобилизации ферментов

При необратимой иммобилизации невозможно отделить фермент от носителя, не нарушая биологическую активность фермента и структуру носителя. Наиболее распространенными способами необратимой иммобилизации фермента являются хемосорбция с образованием ковалентной связи, включение фермента в полимерные сети или полупроницаемые микрокапсулы (entrapment) и сшивание молекул фермента между собой (cross-linking).

а) Образование ковалентной связи

Методы иммобилизации, основанные на формировании ковалентных связей, являются одними из наиболее широко используемых. Преимущество этих методов состоит в том, что из-за устойчивого характера связей, образующихся между ферментом и носителем, фермент не высвобождается в раствор при его использовании. Это особенно актуально в тех случаях, когда существует строгая необходимость отсутствия фермента в продукте. Фермент обычно закрепляется в нескольких точках, что делает его более стабильным и менее подверженным денатурации в неблагоприятных условиях (температура, рН, ионная сила, органический растворитель). Также ковалентно иммобилизованные ферменты нередко более устойчивы к деградации в результате протеолиза [37].

Наиболее часто используемые реакции включают такие боковые цепи аминокислот, как лизин (s-аминогруппа), цистеин (тиольная группа), аспарагиновая и глутаминовая кислоты (карбоксильная группа), которые не являются существенными для каталитической активности фермента [28]. Активность ковалентно связанного фермента зависит от размера и формы материала носителя, природы связи, состава материала носителя и конкретных условий во время реакции. Обычно используемые реакции приводят к связыванию ферментов с носителем посредством амидных, эфирных, тиоэфирных или карбаматных связей. Подобная связь фермента с носителем во многих случаях приводит к его стабилизации. Однако ввиду ковалентного характера

связи при потере ферментом каталитической активности носитель необходимо утилизировать вместе с ферментом [29, 37].

в) Включение фермента в полимерную сеть и микроинкапсуляция (entrapment)

Метод основан на физическом ограничении свободы фермента путем заключения в полимерные сети или микрокапсулы с полупроницаемой мембраной, которые позволяют проникать через них субстрату и продуктам, но задерживают фермент (микроинкапсуляция) (рисунок 1.2) [38-41]. Этот способ отличается от описанных выше способов иммобилизации тем, что фермент не связан с носителем.

Рисунок 1.2 - Иммобилизация фермента путем включения в полимерную сеть и микроинкапсуляции в полупроницаемой мембране

Как правило, метод позволяет улучшить механическую стабильность и минимизировать утечку ферментов, при этом фермент химически не взаимодействует с полимером; поэтому денатурация обычно не происходит [41]. Также метод позволяет модифицировать инкапсулирующий материал, что делает возможным создание оптимального микроокружения для фермента. Тем не менее, практическое использование этого метода ограничено пределами массопереноса субстрата или аналита к активному центру фермента [39]. К недостаткам данного метода также относят возможность высвобождения фермента, которая может

произойти, когда поры носителя слишком велики, деактивацию фермента в процессе иммобилизации, низкую степень загрузки ферментом и истирание материала носителя во время использования [38, 40].

г) Сшивание молекул фермента (cross-linking)

Сшивание - метод необратимой иммобилизации ферментов, не требующий использования носителя [24, 42]. В данном случае фермент действует как свой собственный носитель, что устраняет как преимущества, так и недостатки, связанные с носителями. В частности, использование носителей неизбежно приводит к снижению концентрации ферментов, и, следовательно, активности, за счет введения значительной части некаталитического балласта. Технически сшивание осуществляется путем образования поперечных связей между молекулами фермента с помощью би- или многофункциональных реагентов. Наиболее часто используемым сшивающим реагентом является глутаровый альдегид, поскольку он экономичен и легко доступен в больших количествах [24, 43].

1.1.3 Носители для иммобилизации ферментов

Стабильность и физико-химические свойства иммобилизованных ферментов зависят от многих факторов, включая химическую структуру носителя, его морфологические и физические характеристики (например, размер пор, гидрофильность/гидрофобность, химия поверхности) и природу его взаимодействия с ферментом, место связывания фермента с носителем и количество связей, свободу изменения конформации в носителе, микроокружение молекулы фермента и условия иммобилизации [29, 44]. Также при выборе носителей должны быть учтены такие свойства, как инертность и высокая аффинность по отношению к ферментам, устойчивость к действию микроорганизмов, механическая прочность и жесткость, возможность регенерации фермента, нетоксичность, биосовместимость, способность к биодеградации, а также их стоимость.

Носители можно разделить на органические и неорганические в соответствии с их химическим составом, а в случае полимеров - на натуральные и синтетические полимеры. Среди природных полимерных материалов в качестве носителей обычно используют целлюлозу, альгинат, хитин, коллаген, агарозу, каррагинан, хитозан, крахмал, сефарозу, пектин и другие природные полимерные материалы, а также модифицированные природные полимеры, такие как карбоксиметилцеллюлоза и модифицированная сефароза [29, 32, 44]. Кроме природных полимеров, в качестве носителей также применяют различные синтетические полимерные материалы, так как они обладают хорошей механической прочностью и легко модифицируются, например, ионообменные смолы, акриловые полимеры, полианилин и другие полимеры [29, 32, 44]. Для иммобилизации ферментов также используют различные неорганические носители, такие как оксид алюминия, диоксид кремния и мезопористые диоксиды кремния, цеолиты, активированный уголь, глина, титан, диатомовая земля, гидроксиапатит, керамика, модифицированное пористое стекло [29, 32, 44].

Пористые материалы, обладающие большой площадью поверхности, привлекают внимание в качестве носителей для иммобилизации ферментов в связи с возможностью увеличения загрузки ферментом на единицу массы, а также повышенной защитой иммобилизованного фермента от окружающей среды. Параметры пор и размер частиц носителя определяют общую площадь поверхности и, таким образом, критически влияют на способность связывания ферментов [39, 45].

Поверхность, на которой иммобилизуют фермент, играет важную роль в поддержании третичной структуры фермента, а сохранение каталитически активной третичной структуры фермента также является важным фактором в повышении стабильности и реакционной способности фермента в его иммобилизованном состоянии. В связи с этим можно ожидать, что активность иммобилизованных ферментов будет либо повышаться, либо снижаться при иммобилизации [23, 25, 28, 29]. Было обнаружено, что многие ферменты, иммобилизованные с помощью различных методов иммобилизации, обладают

более высокой активностью, чем нативные ферменты. Например, эпоксигидролаза, адсорбированная на ДЭАЭ-целлюлозе посредством ионной связи, была более чем в два раза активнее, чем нативный фермент [46], а липаза, иммобилизованная в гелевой матрице п-винил-2-пирролидона, проявляла в 51 раз большую активность, а также большую термоустойчивость в сравнении с нативным ферментом [47]. Однако активация путем иммобилизации часто рассматривается как дополнительное преимущество, а не основная цель иммобилизации ферментов.

Недостатком использования полимеров в качестве носителей для иммобилизации ферментов является возможное затруднение диффузионного доступа субстрата к активному центру фермента, приводящее к снижению его каталитической активности. Например, снижение активности может наблюдаться при высокой загрузке ферментом [48].

Зачастую для сохранения высокой активности ферментов требуется трудоемкий подбор условий иммобилизации, таких как степень загрузки ферментом, рН, тип носителя и природа связывания [25].

1.1.4 Наночастицы как носители для иммобилизации ферментов

Иммобилизация ферментов на твердых макромасштабных носителях часто ограничивается низкой загрузкой ферментом, затрудненным доступом к субстрату и невыгодной ориентацией фермента на носителе. Наибольшее значение проблема диффузии имеет в случае, когда субстратами выступают высокомолекулярные вещества [49, 50]. В связи с этим в настоящее время, несмотря на высокую стоимость, наноразмерные материалы, такие как наночастицы, нановолокна, нанотрубки и нанокомплексы, являются перспективными для использования в качестве носителей для иммобилизации и стабилизации ферментов [50]. Особенно актуальной является возможность регулирования каталитической активности и селективности ферментов, адсорбированных на наночастицах [51-53]. Повышение эффективности

иммобилизованных на наночастицах ферментов может быть обусловлено рядом факторов.

а) Площадь поверхности и морфология наночастиц

При иммобилизации путем адсорбции или ковалентного связывания степень заполнения поверхности молекулами фермента значительно влияет на его биологическую активность. В случае малого количества молекул фермента, адсорбированных на большой поверхности, они стремятся к межбелковым взаимодействиям и тем самым претерпевают конформационные изменения, что приводит к снижению их активности. Дезактивация вследствие конформационных изменений также происходит и при переполнении поверхности слишком большим количеством молекул фермента. Поэтому значение ферментативной активности увеличивается по мере добавления молекул фермента на заданную поверхность до достижения оптимальной концентрации, а затем по мере дальнейшего увеличения плотности фермента его активность начинает уменьшаться [54, 55]. Следовательно, увеличение удельной площади поверхности носителя позволит повысить его загрузку ферментом. Наноструктуры являются очень эффективными материалами для иммобилизации ферментов, поскольку обладают большой удельной площадью поверхности и хорошими механическими свойствами, что позволяет обеспечить эффективную загрузку ферментом с минимальными диффузионными затруднениями [51, 56-58]. Кроме того, вследствие большой кривизны наночастиц, эти материалы позволяют увеличивать межцентровые расстояния между соседними иммобилизованными ферментами, ограничивая при этом неблагоприятные межбелковые взаимодействия [59, 60].

б) Подвижность наночастиц

При иммобилизации ферментов на носителях микронного размера требуется встряхивание или перемешивание в реакторе периодического действия. Связанные же с ферментом наночастицы, диспергированные в растворах, согласно современным исследованиям, демонстрируют броуновское движение [61]. Это приводит к тому, что подвижность самих наночастиц усиливает

взаимодействия между субстратом и ферментом, что может быть причиной высокой активности, получаемой при иммобилизации ферментов на наночастицах в сравнении с несвязанными ферментами [53, 55, 62].

в) Повышение локальной концентрации ферментов в заданном объеме в результате адсорбции нескольких молекул фермента на одной наночастице также может способствовать увеличению активности иммобилизованных на наночастицах ферментов в сравнении с нативными [63].

г) Притяжение между субстратом и наночастицами

Согласно описанным в литературе исследованиям, при каждом столкновении между иммобилизованными на наночастицах ферментами и свободно плавающим субстратом слабое притяжение между субстратом и наночастицей приводит к многократным фермент-субстратным взаимодействиям на одной наночастице до того, как субстрат перемещается в другое место, что также обусловливает увеличение активности иммобилизованных на наночастицах ферментов [64]. Эта предполагаемая ассоциация субстрата с наночастицами или притяжение впоследствии приводит к повышенной концентрации субстрата вблизи периферии наночастиц, что также приводит к повышению активности иммобилизованных на наночастицах ферментов в сравнении с нативными [53, 60, 65].

д) Ориентация ферментов на поверхности наночастиц

Возможность осуществления функционализации поверхности наноматериалов и выбора функциональных групп, участвующих в связывании фермента, позволяет стратегически ориентировать субстрат-связывающий центр иммобилизованного фермента от поверхности НЧ и в направлении субстрата для обеспечения сохранения активности фермента [66].

Таким образом, в сравнении с традиционными методами преимуществами использования наноразмерных материалов для иммобилизации ферментов являются большая удельная площадь поверхности, эффективная загрузка ферментом, подвижность, высокая механическая прочность и минимизация диффузионных затруднений.

Существует также возможность регенерации иммобилизованных на наночастицах ферментов для их повторного использования. Например, свойства углеродных нанотрубок обеспечивают легкое отделение и повторное использование иммобилизованных ферментов путем фильтрации или центрифугирования [67, 68]. Однако, в случае наноразмерных систем обычно требуется ультрацентрифугирование, а нанофильтрация с помощью мембран является дорогостоящей, что осложняет регенерацию иммобилизованных на наночастицах ферментов. В связи с этим дополнительным преимуществом обладают магнитные наночастицы, которые позволяют легко отделить иммобилизованный фермент с помощью внешнего магнитного поля [56].

Иммобилизация ферментов на наноматериалах способствует лучшему сохранению активности, обеспечивает увеличение загрузки ферментом и позволяет повысить производительность в экстремальных условиях. Совместная иммобилизация нескольких ферментов на наночастицах делает возможным реализацию каскадных ферментативных реакций [69]. Использование же в качестве носителей для иммобилизации ферментов наночастиц, обладающих собственными полезными биологическими свойствами, позволит создавать полифункциональные нанокомплексы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Плющенко Анна Викторовна, 2021 год

(х - X у

г =1

(N -1)

(2.5)

Стандартную (среднеквадратическую) ошибку среднего рассчитывали по формуле (2.6):

^ =

5

1

(х - X У

г =1

N (N -1)

(2.6)

Случайную составляющую погрешности результата измерений определяли по формуле (2.7):

А* = 5х tNP■.

(2.7)

X

г =1

N

N

где и,? - коэффициент Стьюдента для числа измерений N и доверительной вероятности Р = 0.95.

2.2.11 УФ- и видимая спектрофотометрия

Применение спектрофотометрии в УФ- и видимой областях спектра основано на поглощении электромагнитного излучения соединениями, содержащими хромофорные (например, С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСНз, ОН, ЫН и др.) группы. Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронной оболочки р- и п-орбиталей), точнее, с переходом электронов валентных оболочек атомов в молекуле между молекулярными уровнями или с переходом электрона с высшей занятой молекулярной орбитали на низшую вакантную молекулярную орбиталь [166]. Ослабление параллельного монохроматического пучка света при распространении его в поглощающей среде описывается законом Бугера-Ламберта-Бера (формула (2.8)):

где В - измеренная оптическая плотность в отн. ед.;

1о - интенсивность падающего света при данной длине волны в Вт/м2;

I - интенсивность света, прошедшего слой вещества толщиной L в Вт/м2;

с - концентрация вещества, поглощающего излучение в моль/дм3;

в - молярный коэффициент экстинкции при данной длине волны в м2/моль.

Регистрацию спектров поглощения наночастиц и супрамолекулярных комплексов проводили на спектрофотометре СФ-256УВИ (ЛОМО Фотоника, Россия) в диапазоне длин волн от 200 до 700 нм в кварцевых кюветах 1х1 см, в качестве образца сравнения использовали дистиллированную воду, дополнительно фильтрованную через стеклянный фильтр №16.

В соответствии с паспортом Ю-30.67.101 ПС спектрофотометра СФ-256УВИ пределы допускаемой абсолютной погрешности спектрофотометра при измерении коэффициентов направленного пропускания составляли:

(2.8)

- в спектральном диапазоне от 400 до 750 нм: ±0.25 % (для коэффициентов пропускания от 1 до 30 %) и ±0.5 % (для коэффициентов пропускания от 30 до 100 %);

- в остальном спектральном диапазоне: ±1.0 % (для коэффициентов пропускания от 1 до 100 %).

Пределы допускаемой абсолютной погрешности установки длин волн составляли ±1.0 нм.

Поверку спектрофотометра СФ-256УВИ проводили один раз в год.

Калибровку прибора проводили в соответствии с руководством по эксплуатации Ю-30.67.101 РЭ спектрофотометра СФ-256УВИ с периодичностью 3-6 месяцев.

2.2.12 Динамическое рассеяние света (ДРС)

Значения гидродинамических радиусов (Дь) супрамолекулярных комплексов определяли методом динамического рассеяния света (ДРС) [167, 168].

Флуктуации локальной концентрации частиц, вызванные броуновским движением дисперсных частиц или макромолекул в жидкости, приводят к локальным неоднородностям показателя преломления и, соответственно, к флуктуации интенсивности рассеянного света при прохождении лазерного луча через такую среду. Коэффициент диффузии частиц обратно пропорционален характерному времени релаксации флуктуаций интенсивности рассеянного света, которое соответствует времени затухания экспоненциальной временной корреляционной функции рассеянного света, измеряемой с помощью цифрового коррелятора. Таким образом, анализ корреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света позволяет определить коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости. Далее, из коэффициента диффузии рассчитывают радиус наночастиц.

Принципиальная схема установки ДРС представлена на рисунке 2.1. Кювету с исследуемым раствором помещали в кюветное отделение анализатора. Свет от

лазера, рассеянный на дисперсных частицах, поступал на фотоприемник, сигнал с выхода которого поступал на вход коррелятора. Коррелятор накапливал корреляционную функцию флуктуаций интенсивности рассеянного света. По завершении выбранного времени измерения корреляционная функция передавалась в компьютер, где посредством специального програмного обеспечения происходила обработка измеренной корреляционной функции.

Рисунок 2.1 - Принципиальная схема установки ДРС (Li, L2 - линзы, do, di -

диафрагмы)

Измерения проводили на установке "Photocor Complex" (ООО «Фотокор», Россия) с коррелятором реального времени "Photo Cor-FC" (288 каналов) в режиме "multiple-т" и одномодовым гелий-неоновым лазером с длиной волны 632.8 нм, мощностью ~20 мВ. Анализ полученной временной автокорреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света проводили с помощью программы "DynaLS" (Фирма Гелиос, Россия), позволяющей получить распределение частиц в исследуемом растворе по временам релаксации т, что в свою очередь дает возможность получить распределение по коэффициентам диффузии D*. Из полученных коэффициентов диффузии D* находили гидродинамический радиус эквивалентной сферы Rh по уравнению (2.9) Эйнштейна-Стокса:

Rh =

52

k Т

(2.9)

где к* - константа Больцмана,

щ - вязкость растворителя,

Т - температура.

Допускаемая приборная погрешность установки при измерении гидродинамического радиуса частиц составляла ±1 %.

Поверку установки для ДРС проводили один раз в год.

Юстировку установки проводили в соответствии с руководством по использованию коррелятора Р^осог^С по мере необходимости.

Усреднение экспериментальных данных и оценку погрешности для каждого образца осуществляли в соответствии с пунктом 2.2.10 по пяти значениям Rh, полученным в результате накопления (по 300-500 сек) и программной обработки пяти автокорреляционных функций флуктуации интенсивности.

2.2.13 Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Микрофотографии НЧ^е и НЧ-Ag получали на просвечивающем электронном микроскопе BS-500 (Tesla, Чехия). Для приготовления образцов использовали медную сетку, покрытую формваром, образцы сушили на воздухе. Значения диаметров наночастиц получали путем обработки полученных ПЭМ-изображений с помощью программы ImageJ 1.52п.

2.2.14 рН-метрия

Для измерения рН растворов использовали рН-метр-милливольтметр лабораторный типа рН-673 М (Измерительная техника, Россия).

Глава 3 Результаты и обсуждение

3.1 Супрамолекулярные комплексы ХТ с НЧ-Se и НЧ-Ag как модельные объекты для изучения межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами различной природы

Поскольку молекула ХТ обладает как заряженными радикалами аминокислот, так и гидрофобными участками, то взаимодействие ХТ с наночастицами различной природы может осуществляться посредством как гидрофобных, так и электростатических взаимодействий. НЧ^е, образованные нуль-валентными атомами ^е0), являются гидрофобными. НЧ-Ag, образованные нуль-валентными атомами (Ag0), также являются гидрофобными. Однако благодаря формированию на поверхности НЧ-Ag так называемого поверхностного плазмонного резонанса под действием электромагнитного поля [169, 170], НЧ-Ag также способны проявлять электростатические свойства.

3.1.1 Получение супрамолекулярных комплексов Se-ХТ

С целью изучения гидрофобных межмолекулярных взаимодействий белков на примере ХТ с наночастицами были получены супрамолекулярные комплексы протеолитического фермента ХТ с НЧ^е. Формирование супрамолекулярных комплексов Se-ХТ возможно за счет взаимодействия гидрофобных НЧ^е с гидрофобными доменами молекулы ХТ, суммарная площадь которых составляет 3 нм2 [3]. Известно, что ХТ может находиться в различных конформационных состояниях, зависящих от температуры и рН среды (рисунок 3.1) [3]. Критерием для выделения главных конформационных состояний белка служит степень свертывания макромолекулы. Так, в кислой среде ХТ находится в «развернутом» конформационном состоянии, а в щелочной среде его конформация характеризуется более плотной внутренней упаковкой [3]. Можно полагать, что рН среды будет влиять на «доступность» гидрофобных фрагментов ХТ и, соответственно, на возможность образования комплекса между ХТ и НЧ^е.

Рн

Рисунок 3.1 - Диаграмма состояний для а-химотрипсина. А, В, С - условные

обозначения конформационного состояния белка (устойчивой области конформера). Да, Аь, Ас, Да, Af- условные обозначения подсостояний. Стрелками указаны переходы из одного состояния в другое. Заштрихованные области

соответствуют ширине перехода [3]

Супрамолекулярные комплексы Se-ХТ получали путем физической адсорбции ХТ на НЧ^е в процессе проведения реакции образования нуль-валентного красного аморфного Se в присутствии ХТ. В первом случае НЧ^е были получены в процессе реакции восстановления селенистой кислоты аскорбиновой кислотой по реакции (3.1), во втором случае - в процессе реакции восстановления селенистой кислоты 2-меркаптоэтанолом по реакции (3.2).

H2SeOз + 2СбШОб ^ Se + 3ШО + 2СбШОб (3.1)

4CHзCH2SH + H2SeOз ^ Se + 2CHзCH2SSCH2CHз (3.2)

В результате реакции (3.1) в отсутствие ХТ происходило образование золя нуль-валентного красного аморфного Se и дегидроаскорбиновой кислоты [171]. Полученный красный аморфный Se выпадал в осадок в течение 24 часов. Кроме того, через 7-10 суток цвет осадка Se становился серым.

Введение ХТ в реакцию (3.1) приводило к получению дисперсных систем красновато-оранжевого цвета с рН от 2.8 до 3.4, которые сохраняли

седиментационную устойчивость в течение по меньшей мере 6 месяцев, при этом после осаждения комплексов Se-ХТ изменения цвета осадка не наблюдалось [172]. В присутствии ХТ реакция (3.1) образования красного аморфного Se завершалась в течение 24 часов.

При получении красного аморфного Se в щелочной среде (рН от 9.0 до 10.5) по реакции (3.2) формирование супрамолекулярных комплексов Se-ХТ не осуществлялось и образующийся красный аморфный Se немедленно выпадал в осадок.

Можно заключить, что гидрофобные участки молекулы ХТ доступны для взаимодействия с НЧ-Бе только в кислой среде. Поэтому для дальнейших исследований комплексы Se-ХТ получали по реакции (3.1). Реакцию образования НЧ-Бе проводили при температуре 20 °С.

Было также исследовано влияние ХТ на кинетику образования НЧ-Бе. Величины констант скорости (к) реакции формирования красного аморфного Se и комплексов Se-ХТ были рассчитаны по формуле (2.3) (см. пункт 2.2.9). По мере образования комплексов значение оптической плотности при длине волны 320 нм постепенно нарастало и в равновесии достигало постоянного значения. Время установления равновесия находилось в диапазоне от 18 до 24 часов.

На рисунке 3.2 показаны зависимости константы скорости реакции образования красного аморфного Se от его весовой концентрации в отсутствии и присутствии ХТ. В присутствии стабилизирующего фермента наблюдался рост константы скорости, начиная с СБе = 0.01 масс.%. До этой точки константы скорости были близки во всех изученных образцах.

С_ масс.%

Рисунок 3.2 - Константы скорости реакции образования красного аморфного Se (к) без ХТ (1) и в присутствии 0.1 масс.% (2) и 0.01 масс.% ХТ (3) в зависимости от концентрации Se (СБе)

Таким образом, показано, что супрамолекулярные комплексы Бе-ХТ способны формироваться только в кислой среде, когда ХТ имеет конформацию, при которой гидрофобные участки молекулы белка доступны для межмолекулярного взаимодействия с НЧ-Бе. При этом использование ХТ в качестве стабилизатора НЧ-Бе приводило к увеличению константы скорости их образования.

3.1.2 Получение супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ

Для моделирования электростатических межмолекулярных взаимодействий в сочетании с гидрофобными супрамолекулярные комплексы Ag-ХТ получали путем введения ХТ в реакцию (3.3) образования НЧ-Ag одновременно с другими реагентами (рисунок 3.3 метод I, комплексы Ag-ХТ-I).

AgNОз + NaBH4 + Н2О = Ag + №N03 + В(ОН)3 + Н2 (3.3)

Поскольку при отсутствии дополнительного стабилизатора агрегативная устойчивость НЧ-Ag может быть обеспечена за счет присутствия избыточного количества боргидрид-анионов, осуществляющих электростатическую

стабилизацию НЧ-Ag, для моделирования преимущественно электростатических межмолекулярных взаимодействий супрамолекулярные комплексы Ag-ХТ получали путем введения ХТ в реакцию (3.3) образования НЧ-Ag через заданные промежутки времени после начала реакции (метод II, комплексы Ag-ХТ-II).

Рисунок 3.3 - Методы получения супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ: (а) - метод I (комплексы Ag-ХТ-I); (б) - метод II (комплексы Ag-ХТ-II)

3.2 Спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и

Ag-ХТ

3.2.1 Спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов

Se-ХТ

При изучении конформационных изменений в белках широко применяется метод УФ- и видимой спектрофотометрии. Он позволяет получать информацию о количестве хромофорных групп, их микроокружении и взаимодействии с растворителем. Можно полагать, что взаимодействия между молекулами ХТ и НЧ-Бе будут проявляться в спектральных различиях в поглощении хромофоров нативного и адсорбированного на НЧ-Бе ХТ.

На рисунке 3.4 представлены спектры поглощения растворов ХТ, золя красного аморфного Бе и дисперсии комплексов Бе-ХТ, полученных при

температуре 20 °С (V = 1; Cse = Схт = 0.01 масс.%). Поскольку реакция образования НЧ-8е в присутствии ХТ завершалась в течение 24 часов, спектры поглощения дисперсии комплексов были сняты через одни сутки после начала реакции. Максимум оптической плотности комплексов соответствовал длине волны 270 нм в отличие от нативного ХТ, максимум оптической плотности которого соответствовал длине волны 280 нм. Известно, что положение максимума поглощения зависит от энергии электронных переходов в хромофорных группах молекулы белка [173]. Можно полагать, что взаимодействие между молекулами ХТ и НЧ-8е способствовало изменению энергии электронных переходов в хромофорных группах молекул ХТ, которое приводило к гипсохромному сдвигу максимума поглощения ХТ.

О, отн.ед

300 400 500 600 700 X, НМ Рисунок 3.4 - Спектры поглощения раствора ХТ (1), золя красного аморфного 8е (2) и дисперсии комплексов 8е-ХТ с V = 1 (3) ф - оптическая плотность;

X - длина волны)

Для исследования изменений во времени спектральных характеристик дисперсий супрамолекулярных комплексов 8е-ХТ были сняты их спектры поглощения на 1-е и 21-е сутки после начала реакции образования НЧ-8е (рисунок 3.5). При этом абсолютное значение оптической плотности дисперсной системы при длине волны максимума поглощения (270 нм) на 21-е сутки понизилось менее, чем на ~4%.

D, отн.ед.

Рисунок 3.5 - Спектры поглощения дисперсии комплексов Se-ХТ с V = 1 на 1-е (1) и 21-е (2) сутки после проведения реакции их образования (О - оптическая плотность;

X - длина волны)

Таким образом, методом УФ- и видимой спектрофотометрии показано образование комплексов ХТ с НЧ^е. Спектральные характеристики полученных дисперсий супрамолекулярных комплексов Se-ХТ практически не изменялись с течением времени, что свидетельствовало о прочности межмолекулярных взаимодействий ХТ с НЧ^е.

3.2.2 Спектральные и размерные характеристики НЧ-Ag

Наличие поверхностного плазмонного резонанса (ППР) НЧ-Ag в спектрах поглощения позволяет систематически исследовать свойства НЧ-Ag методом УФ- и видимой спектрофотометрии. Показано, что форма, положение и интенсивность полосы ППР значительно зависят от размеров и формы НЧ-Ag, а также от их диэлектрического окружения и взаимодействия со стабилизатором [169, 170]. Соответственно, исследование и сравнение спектров поглощения НЧ-Ag и супрамолекулярных комплексов на их основе позволит получить информацию о взаимодействиях между НЧ-Ag и молекулами ХТ. Для этого предварительно были изучены спектральные и размерные характеристики НЧ-Ag, полученных в отсутствие ХТ.

НЧ-Ag получали в ходе реакции восстановления нитрата серебра (AgNOз) боргидридом натрия (ЫаВНд). При отсутствии дополнительного стабилизатора

агрегативная устойчивость НЧ-Ag может быть обеспечена за счет присутствия избыточного количества боргидрид-анионов, осуществляющих

электростатическую стабилизацию НЧ-Ag [174, 175]. В связи с этим НЧ-Ag получали при 24-кратном избытке количества №ВШ относительно количества AgNOз (см. пункт 2.2.2).

На рисунке 3.6 представлена кинетика изменения спектров поглощения полученной дисперсии НЧ-Ag. Абсолютная величина оптической плотности НЧ-Ag на 2-е сутки после начала реакции их образования снизилась на ~12 %, а на 23-и сутки - на ~22 % от исходного значения. При этом на 2-е сутки после начала реакции наблюдался сдвиг полосы ППР с 390 до 400, а также ее уширение [176]. Согласно литературным данным, такие эффекты, как понижение оптической плотности, увеличение ширины полосы поглощения наночастиц и ее сдвиг в длинноволновую область на спектрах поглощения связывают с увеличением размера частиц [169, 177].

Рисунок 3.6 - Спектры поглощения дисперсии НЧ-Ag на 1-е (1), 2-е (2) и 23-и сутки (3) после начала реакции их образования ф - оптическая плотность;

X - длина волны)

В спектрофотометрии для оценки ширины полосы поглощения используют критерий, называемый Q-фактором и вычисляемый как отношение интенсивности

полосы поглощения ф) к ее ширине на полувысоте (Wl/2):Q . Эта величина

"1/2

характеризует степень полидисперсности частиц золей металлов. На рисунке 3.7 представлена кинетика изменения Q-фактора для НЧ-Ag.

Рисунок 3.7 - Кинетика изменения Q-фактора для дисперсий НЧ-Ag ^ - время)

Полученная зависимость показывает, что степень полидисперсности частиц золя, выражаемая через Q-фактор, имела тенденцию к увеличению со временем.

Для оценки размерных характеристик НЧ-Ag использовали метод ДРС. На рисунке 3.8 представлена кинетика изменения гидродинамического радиуса НЧ-Ag. Каждое значение Rh получали путем усреднения пяти значений Rh, полученных в результате накопления (по 300-500 сек) и программной обработки пяти автокорреляционных функций флуктуации интенсивности. Происходило постепенное укрупнение образовавшихся частиц, начальный размер которых составлял 23±1 нм. Размер НЧ-Ag устанавливался в течение одной недели и составлял примерно 40±2 нм.

Рисунок 3.8 - Кинетика изменения гидродинамического радиуса ^ь) НЧ-Ag ^ -

время)

Следует также отметить, что с течением времени в дисперсии НЧ-Ag наблюдалось появление осадка. Поэтому снижение оптической плотности дисперсии НЧ-Ag можно связать с уменьшением количества частиц в дисперсной системе, вызванным их осаждением.

Для изучения формы и размеров НЧ-Ag применяли метод ПЭМ. Согласно ПЭМ-изображениям, представленным в Приложении А (рисунок А.1), в исследованном образце присутствовали как отдельные квазисферические НЧ-Ag с диаметром от 4 до 8 нм, так и образованные ими агрегаты эллиптической формы с наибольшим диаметром от 9 до 28 нм, а также более крупные агрегаты. На рисунке 3.9 представлен образец полученного ПЭМ-изображения. Наблюдаемое скопление НЧ-Ag вызвано, по-видимому, особенностями методики подготовки образцов для ПЭМ.

Рисунок 3.9 - ПЭМ-изображение НЧ-Ag. Длина масштабного отрезка составляет

100 нм

Таким образом, показано, что агрегация НЧ-Ag со временем приводила к увеличению гидродинамического радиуса частиц, а также к сдвигу пика ППР в длинноволновую область и увеличению значения Q-фактора.

3.2.3

Спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов

Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-П

Известно, что взаимодействие со стабилизатором оказывает значительное влияние на форму, положение и интенсивность полосы ППР НЧ-Ag [169, 170]. Поэтому исследование спектральных характеристик комплексов Ag-ХТ в сравнении с НЧ-Ag позволит получить информацию о взаимодействии между НЧ-Ag и молекулами ХТ.

Комплексы Ag-ХТ получали двумя способами, описанными в пункте 3.1.2 (рисунок 3.2). На рисунке 3.10 представлены спектры поглощения раствора нативного ХТ, дисперсии НЧ-Ag и дисперсии комплексов Ag-ХТ-I. Спектры поглощения дисперсии комплексов Ag-ХТ-I характеризовались двумя пиками поглощения: при 275 нм и при ~ 420 нм. Максимум поглощения раствора нативного ХТ находился при длине волны 280 нм, а пик ППР НЧ-Ag - в области 400 нм. Таким образом, при образовании комплексов Ag-ХТ-I наблюдался гипсохромный сдвиг пика поглощения ХТ на ~5 нм и батохромный сдвиг полосы ППР НЧ-Ag на ~15-20 нм [176]. Можно полагать, что взаимодействие между молекулами ХТ и НЧ-Ag способствовало как изменению энергии электронных переходов в хромофорных группах молекул ХТ, так и изменению ППР НЧ-Ag.

Рисунок 3.10 - Спектры поглощения раствора нативного ХТ (1), дисперсии НЧ-Ag (2) и дисперсии комплексов Ag-ХТ-I (3) ф - оптическая плотность;

X - длина волны)

На рисунке 3.11 представлены спектры поглощения дисперсий комплексов Ag-ХТ-П, полученных путем введения ХТ в реакционную смесь через 30 мин, 1 час и 4 часа после начала реакции образования НЧ-Ag. Во всех исследованных образцах пик ППР НЧ-Ag находился при длине волны 405 нм, а пик поглощения ХТ - при длине волны 280 нм [176].

Рисунок 3.11 - Спектры поглощения дисперсий комплексов Ag-ХТ-П. ХТ был добавлен в реакционную смесь через 30 мин (1), 1 час (2) и 4 часа (3) после начала реакции образования НЧ-Ag ф - оптическая плотность; X - длина волны)

Таким образом, в случае комплексов Ag-ХТ-П ППР НЧ-Ag изменялся в меньшей степени, чем в случае комплексов Ag-ХТ-I, а пик поглощения ХТ приходился на длину волны, соответствующую пику поглощения нативного ХТ, в то время как в случае комплексов Ag-ХТ-I наблюдался гипсохромный сдвиг пика поглощения ХТ. Известно, что к факторам, значительным образом влияющим на положение полосы ППР НЧ-Ag, относятся диэлектрические свойства окружающей среды и взаимодействие со стабилизатором [169, 170, 178, 179]. Можно полагать, что наблюдаемые отличия спектральных характеристик комплексов обусловлены различиями во взаимодействиях молекул ХТ с НЧ-Ag в зависимости от способа получения комплексов.

По-видимому, в случае комплексов Ag-ХТ-I молекулы ХТ взаимодействовали с НЧ-Ag как заряженными, так и гидрофобными радикалами аминокислот, к которым в том числе относится остаток триптофана, что, по-видимому, обусловливало сдвиг максимума поглощения ХТ в комплексе. В

случае комплексов Ag-ХТ-II стабилизация НЧ-Ag до добавления в реакционную смесь ХТ обеспечивалась ионной оболочкой, образованной боргидрид-анионами и другими ионами, присутствующими в дисперсной системе. Вероятно, в этом случае взаимодействие ХТ со стабилизированными боргидрид-анионами НЧ-Ag осуществлялось преимущественно за счет заряженных функциональных групп фермента, поэтому положение максимума поглощения ХТ сохранялось, а величина сдвига полосы ППР НЧ-Ag была меньше, чем в случае комплексов Ag-ХТ-I.

Для оценки ширины полосы ППР комплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II были рассчитаны значения Q-фактора. Известно, что величина Q-фактора характеризует степень полидисперсности наночастиц [169, 177]. Поэтому, увеличение значения Q-фактора для комплексов Ag-ХТ-II (0.01 отн.ед./нм) в сравнении с комплексами Ag-ХТ-I (0.008 отн.ед./нм) может свидетельствовать об увеличении полидисперсности НЧ-Ag в составе этих комплексов.

Также было исследовано изменение во времени спектральных характеристик дисперсий комплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II, полученных путем добавления ХТ через 1 час после начала реакции образования НЧ-Ag (комплексы Ag-ХТ-II/1). На рисунке 3.12 и 3.13 представлены спектры поглощения дисперсий комплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II/1, соответственно, на 2-е, 7-е, и 21-е сутки после начала реакции. Независимо от метода получения комплексов на 21-е сутки наблюдалось снижение абсолютного значения оптической плотности в области ППР НЧ-Ag на ~37 % от исходного значения. При этом положение полосы ППР НЧ-Ag для комплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II/1 сохранялось. Поскольку в пункте 3.2.2 было показано, что увеличение размеров НЧ-Ag с течением времени за счет их агрегации отражалось на спектрах поглощения дисперсии НЧ-Ag сдвигом пика ППР в длинноволновую область, можно полагать, что взаимодействие ХТ с НЧ-Ag препятствовало их агрегации.

Рисунок 3.12 - Спектры поглощения дисперсии комплексов Ag-ХТ-I на 2-е (1), 7-е (2) и 21-е сутки (3) после начала реакции образования НЧ-Ag (О - оптическая

плотность; X - длина волны)

Рисунок 3.13 - Спектры поглощения дисперсии комплексов Ag-ХТ-II/1 на 2-е (1), 7-е (2), и 21-е сутки (3) после начала реакции образования НЧ-Ag (О - оптическая

плотность; X - длина волны)

Таким образом, методом УФ- и видимой спектрофотометрии показано образование комплексов ХТ с НЧ-Ag. Наблюдаемые отличия спектральных характеристик комплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-II, по-видимому, обусловлены различиями во взаимодействиях молекул ХТ с НЧ-Ag, реализуемых при их формировании. На основании сопоставления кинетики изменения спектральных характеристик комплексов Ag-ХТ и НЧ-Ag можно полагать, что взаимодействие ХТ с НЧ-Ag препятствовало их агрегации.

3.3 Исследование размерных характеристик НЧ^е и НЧ-Ag в составе супрамолекулярных комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ методом ПЭМ

3.3.1 Размерные характеристики НЧ^е в составе комплексов Se-ХТ

Для изучения формы и распределения по размеру НЧ^е в составе комплексов применяли метод ПЭМ. Согласно ПЭМ-изображениям, представленным в Приложении Б (рисунок Б.1), НЧ^е в составе комплексов Se-ХТ, представляли собой квазисферические частицы, часть из которых образовывали скопления. На рисунке 3.14 представлен образец полученного ПЭМ-изображения.

Рисунок 3.14 - ПЭМ изображение НЧ^е в составе комплексов Se-ХТ с V = 1. Длина масштабного отрезка составляет 100 нм

В результате обработки ПЭМ-изображений, представленных на рисунке Б.1, в программе ImageJ 1.52п было получено 200 значений диаметров НЧ^е в составе комплексов Se-ХТ в диапазоне от ~17 до ~75 нм (рисунок 3.15).

Диаметр НЧ^е, нм

Рисунок 3.15 - Гистограмма распределения по размерам НЧ^е в составе комплексов Se-ХТ с V = 1, полученная в результате обработки ПЭМ-изображений

в программе ImageJ 1.52п

Таким образом, НЧ^е в составе комплексов Se-ХТ представляли собой квазисферические частицы, диаметр которых изменялся в диапазоне от ~17 до ~75 нм.

3.3.2 Размерные характеристики НЧ-Ag в составе супрамолекулярных

комплексов Ag-ХТ-I и Ag-ХТ-П

Поскольку реакция образования НЧ-Ag протекает в течение некоторого времени, можно предположить, что введение ХТ в реакционную смесь на различных этапах формирования НЧ-Ag приведет к увеличению диаметра наночастиц и позволит регулировать размер образующихся комплексов.

Для оценки размерных характеристик НЧ-Ag в составе комплексов использовали метод ПЭМ. Согласно ПЭМ-изображениям, представленным в Приложении В (рисунок В.1), большая часть НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-I представляли собой квазисферические частицы с диаметром от 3 до 4 нм. Также присутствовали более крупные агрегаты НЧ-Ag, однако их количество было незначительно по сравнению с количеством частиц с диаметром до 4 нм. На рисунке 3.16 представлен образец полученного ПЭМ-изображения.

100 нм

Рисунок 3.16 - ПЭМ-изображение НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-I. Длина

масштабного отрезка составляет 100 нм

Согласно ПЭМ-изображениям, представленным в Приложении Г (рисунок Г.1), НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-II/1 представляли собой квазисферические частицы. На рисунке 3.17 представлен образец полученного ПЭМ-изображения. В результате обработки ПЭМ-изображений, представленных на рисунке Г.1, в программе ImageJ 1.52п было получено 420 значений диаметров НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-П/1 в диапазоне от ~4 до ~15 нм (рисунок 3.18). Следовательно, повышение значения Q-фактора дисперсий комплексов Ag-ХТ-II/1 в сравнении с комплексами Ag-ХТ-I, показанное в пункте 3.2.3, обусловлено увеличением полидисперсности НЧ-Ag.

■

Рисунок 3.17 - ПЭМ-изображение НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-П/L Длина

масштабного отрезка составляет 100 нм

Рисунок 3.18 - Гистограмма распределения по размерам НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-ПЛ, полученная в результате обработки ПЭМ-изображений в

программе ImageJ 1.52п

Таким образом, в сравнении с комплексами Ag-ХТ-I в случае комплексов Ag-ХТ-II/1 наблюдалось увеличение полидисперсности НЧ-Ag, что также отражалось на спектрах поглощения этих дисперсных систем повышением значения Q-фактора.

60

5 10 15 20 25 30 35 40

Диаметр НЧ-Ад, нм

3.4 Механизм роста НЧ-Ag

Известны два механизма формирования металлических наночастиц: последовательный и параллельный [180, 181]. В процессе последовательного роста частицы формируются посредством присоединения на каждой стадии одного атома металла (рисунок 3.19а). Случайный процесс присоединения, происходящий на каждой последующей стадии с равной вероятностью, приводит к образованию продукта, подчиняющегося нормальному (Гауссову) распределению (формула 3.4). В процессе параллельного роста частиц из двух атомов формируется димер, два димера образуют тетрамер, два тетрамера -октамер и т. д. (рисунок 3.19б). Случайный процесс, в котором реализуется параллельный механизм роста, приводит к образованию продукта, подчиняющегося логарифмически нормальному распределению (формула 3.5) [180].

Рисунок 3.19 - Схематичное изображение последовательного (а) и параллельного

(б) механизмов роста наночастиц

Функции плотности вероятности нормального и логарифмически нормального распределений описываются формулами 3.4 и 3.5, соответственно:

/М = —е

— 2р

(х-т)2 2—2

(3.4)

/ (х )

(1п х-т)2

2—2

х—

42Р

(3.5)

1

е

где х - диаметр отдельной наночастицы;

^ - выборочное среднее для нормального распределения;

е^ - выборочное среднее для логарифмически нормального распределения;

а - стандартное отклонение;

а2 - выборочная дисперсия.

Как правило, при образовании наночастиц в реальных условиях одновременно реализуются оба механизма роста частиц. Анализ характера распределения НЧ-Ag в полученных комплексах позволит оценить вклад каждого типа процессов при формировании наночастиц и описать механизм их роста.

Для определения механизма формирования получаемых НЧ-Ag были использованы данные о распределении НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-II/1 по размерам, полученные в результате обработки ПЭМ-изображений, представленных на рисунке Г.1, в программе ImageJ 1.52п (рисунок 3.18).

Проверку гипотез о принадлежности экспериментальных данных нормальному или логарифмически нормальному распределению проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Параметры теоретических распределений определяли по экспериментальным данным методом максимального правдоподобия (таблица 3.1).

Для нормального распределения случайной величины оценки среднего и дисперсии (а2) определяли по формулам 3.6 и 3.7, соответственно:

1 Ы

т = — х, (3.6)

М г =1

1 N

*2 = 1 (хг -т)2, (3.7)

М г=1

где N - объем выборки.

Для логарифмически нормального распределения случайной величины оценки среднего (ец) и дисперсии (а2) определяли по формулам 3.8 и 3.9, соответственно:

73 1 Ы

ехр(т) = ехр — 1п, (3.8)

N г=1

1 N

а2 = — (1п х-т)2. (3.9)

Таблица 3.1 - Параметры теоретических распределений, полученные по экспериментальным данным методом максимального правдоподобия

Тип распределения Параметры распределения

Оценка среднего Оценка дисперсии

Логарифмически нормальное распределение 7.77 0.165

Нормальное распределение 8.52 0.173

Алгоритм проверки гипотез о виде распределения величины диаметра НЧ-Ag с помощью критерия Колмогорова-Смирнова в программме Scilab представлен в приложении Д (рисунок Д.1). На рисунке 3.20 представлены графики экспериментальной функции распределения и теоретических функций распределения диаметров НЧ-Ag, параметры которых получены по экспериментальным данным. В таблице 3.2 представлены полученные значения статистики критерия Колмогорова-Смирнова для нормального и логарифмически нормального распределений.

логарифмически нормального (2) и нормального (3) распределений, полученных

по экспериментальным данным о диаметрах НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-II/1 (х - диаметр наночастиц; F (х) - значение функции распределения)

Таблица 3.2 - Значения статистики критерия Колмогорова-Смирнова, полученные в результате обработки данных о диаметрах НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-II/1 (объем выборки N = 420; уровень значимости а = 0.05)

Проверяемое распределение Статистика Колмогорова-Смирнова

Экспериментальное значение Dn Критическое значение D005 = 1.36/-\/П

Логарифмически нормальное распределение 0.049 0.066

Нормальное распределение 0.496

Значение статистики критерия Колмогорова-Смирнова для нормального распределения значительно превышало, а для логарифмически нормального распределения - не превышало критическое значение, поэтому на уровне значимости 0.05 принимается гипотеза о распределении диаметров НЧ-Ag по логарифмически нормальному закону. Следовательно, при используемом способе получения НЧ-Ag преимущественно реализовывался параллельный механизм роста наночастиц (рисунок 3.19б).

3.5 Исследование размерных характеристик супрамолекулярных комплексов

Se-ХТ и Ag-ХТ методом ДРС

3.5.1 Размерные и спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ в зависимости от температуры проведения реакции и

концентрации Se

Известно, что значительное влияние на размер и форму НЧ^е оказывают условия их получения, такие как температура, атмосферное давление, рН среды и т. д. [129]. Можно полагать, что изменение температуры проведения реакции

будет также оказывать влияние на размеры комплексов Se-ХТ. Оценить размерные характеристики образующихся комплексов позволяет метод ДРС.

Было исследовано влияние температуры проведения реакции на гидродинамический радиус Rh комплексов Se-ХТ в зависимости от концентрации Se (таблица 3.3) [182]. Комплексы Se-ХТ получали при температурах 4 °С (температура ледяной бани), 20 °С (комнатная температура) и 37 °С (температура организма, при которой работает фермент). Концентрация ХТ была постоянной и составляла 0.01 масс.%, концентрация Se варьировалась: V = 1.5; 1; 0.5; 0.25.

Таблица 3.3 - Влияние температуры проведения реакции и концентрации Se

на гидродинамические радиусы (Дь) комплексов Se-ХТ

V Температура проведения реакции, °С

4 20 37

Rh, нм ±2 рН Rh, нм ±2 рН Rh, нм ±2 рН

0.5 44 3.8 45 3.4 44 3.2

1 28 3.4 33 3.2 38 3.0

1.5 45 3.2 38 3.0 39 2.9

Примечание - Усреднение экспериментальных данных и оценку погрешности для каждого образца осуществляли в соответствии с пунктом 2.2.10 по пяти значениям Rh, полученным в результате накопления (по 300-500 сек) и программной обработки пяти автокорреляционных функций флуктуации интенсивности

Как видно из таблицы 3.3, для каждого значения V изменение температуры проведения реакции незначительно влияло на величины гидродинамических радиусов комплексов Se-ХТ. Комплексы с наименьшими размерами формировались при температуре 4 °С и концентрационном соотношении компонентов V = 1.

Для оценки изменений во взаимодействиях между молекулами белка и наночастицами в зависимости от температуры проведения реакции использовали метод УФ-спектрофотометрии. Было исследовано влияние температуры

проведения реакции на спектральные характеристики комплексов Se-ХТ. Максимумы поглощения наблюдались при одинаковых длинах волн для всех значений V и составляли 256, 270 и 285 нм при температуре проведения реакции 4, 20 и 37 °С, соответственно (рисунок 3.21).

Рисунок 3.21 - Спектры поглощения дисперсий комплексов Se-ХТ с V = 0.5 (а), V = 1 (б) и V = 1.5 (в). Температура проведения реакции: 1 - 4 °С; 2 - 20 °С;

3 - 37 °С (О - оптическая плотность; X - длина волны)

Поскольку спектры поглощения дисперсий нестабилизированного красного аморфного Se различались в зависимости от температуры их получения (рисунок 3.22), можно полагать, что сдвиг максимума поглощения дисперсий комплексов в длинноволновую область с увеличением температуры проведения

реакции связан с различиями во взаимодействиях между ХТ и НЧ^е, обусловленными изменениями в структурной организации НЧ^е в зависимости от температуры.

Рисунок 3.22 - Спектры поглощения дисперсий красного аморфного Se, полученных при 4 °С (1), 20 °С (2) и 37 °С (3) (О - оптическая плотность;

X - длина волны)

Таким образом, изменение температуры проведения реакции не оказывало значительного влияния на размерные характеристики комплексов Se-ХТ. Сдвиг максимума поглощения комплексов в длинноволновую область с увеличением температуры проведения реакции свидетельствовал об изменении во взаимодействиях между ХТ и НЧ^е.

3.5.2 Размерные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ в зависимости от соотношения концентраций Se и ХТ

Поскольку молекулы ХТ стабилизируют НЧ^е в водной среде, можно полагать, что при недостатке ХТ НЧ^е будут претерпевать агрегацию, что приведет к изменению размеров комплексов Se-ХТ. Оценить размерные характеристики образовавшихся комплексов позволяет метод ДРС. Комплексы получали при температуре 20 °С. Для определения минимального количества ХТ, необходимого для стабилизации НЧ^е было исследовано влияние количества ХТ при фиксированной концентрации Se на размер комплексов Se-ХТ (таблица 3.4).

D, отн. ед. 265 нм

0.5

1.0

300 400 500 600 700 X, НМ

Таблица 3.4 - Влияние концентрации ХТ (Схт) на гидродинамические радиусы (Rh) комплексов Se-ХТ при Cse = 0.01 масс.%

Схт, масс.% V Rh, нм ±2 Состояние дисперсии комплексов через 24 часа рН

0.001 10.0 48 Мутная дисперсия 3.2

0.00125 8.0 45 То же 3.2

0.00167 6.0 43 » 3.2

0.0025 4.0 42 » 3.1

0.005 2.0 39 Прозрачная дисперсия 3.3

0.01 1.0 38 То же 3.2

0.1 0.1 38 » 3.1

Примечание - Усреднение экспериментальных данных и оценку погрешности для каждого образца осуществляли в соответствии с пунктом 2.2.10 по пяти значениям Rh, полученным в результате накопления (по 300-500 сек) и программной обработки пяти автокорреляционных функций флуктуации интенсивности

С увеличением количества ХТ размеры комплексов постепенно уменьшались (с ~48 до ~38 нм), значение рН при этом практически не изменялось. При концентрациях ХТ от 0.001 до 0.0025 масс.% дисперсные системы становились мутными и впоследствии наблюдалось осаждение комплексов в течение недели. Таким образом, дефицит стабилизатора наблюдался при V > 2.

Поскольку выше было показано, что при V = 1 образовывались устойчивые дисперсии комплексов Se-ХТ, можно предположить, что варьирование количества ХТ и Se при V = 1 также позволит получить устойчивые дисперсные системы. Поэтому было исследовано влияние концентрации Se и ХТ при V = 1 на размер образующихся комплексов (таблица 3.5).

Таблица 3.5 - Влияние концентрации Se (Сse) и ХТ (Схт) на гидродинамические радиусы ^^ комплексов Se-ХТ с V = 1

Сse, масс.% Схт, масс.% Rh, нм рН

0.001 0.001 112±5 4.1

0.005 0.005 46±2 3.1

0.01 0.01 33±2 2.8

0.05 0.05 33±2 2.5

0.1 0.1 28±2 2.3

Примечание - Усреднение экспериментальных данных и оценку погрешности для каждого образца осуществляли в соответствии с пунктом 2.2.10 по пяти значениям Rh, полученным в результате накопления (по 300-500 сек) и программной обработки пяти автокорреляционных функций флуктуации интенсивности

Комплексы с наибольшими размерами образовывались при Сse = Схт = 0.001 масс.% (~112 нм). В диапазоне концентраций Se и ХТ от 0.005 до 0.1 масс.% наблюдалось постепенное уменьшение размеров комплексов (от ~46 до ~28 нм). При этом значение рН дисперсных систем изменялось от 4.1 до 2.3. Можно полагать, что изменение рН дисперсных систем при малых концентрациях Se и ХТ приводило к агрегации комплексов и, соответственно, к увеличению их размеров.

Таким образом, определены соотношения концентраций Se и ХТ, при которых образуются устойчивые дисперсии комплексов Se-ХТ.

3.5.3 Размерные характеристики супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-I

и Ag-ХТ-П

Поскольку реакция образования НЧ-Ag протекает в течение некоторого времени, можно предположить, что введение ХТ в реакционную смесь на различных этапах формирования НЧ-Ag приведет к увеличению диаметра наночастиц и позволит регулировать размер образующихся супрамолекулярных комплексов. Для оценки размерных характеристик комплексов использовали

метод ДРС. В таблице 3.6 представлена зависимость гидродинамического радиуса комплексов Ag-ХТ от времени введения ХТ в реакционную смесь после начала реакции образования НЧ-Ag.

Таблица 3.6 - Зависимость гидродинамического радиуса комплексов Ag-ХТ от времени введения ХТ в реакционную смесь после начала реакции

образования НЧ-Ag

Время введения ХТ в реакционную смесь после начала реакции образования НЧ-Ag

0 мин* 30 мин 1 час** 2 часа 3 часа 4 часа 5 часов 6 часов 24 часа

Rh, нм ±1 21 23 25 26 27 31 35 32 41

* комплексы Ag-ХТ-I

** комплексы Ag-ХТ-П/1

Примечание - Усреднение экспериментальных данных и оценку погрешности для каждого образца осуществляли в соответствии с пунктом 2.2.10 по пяти значениям Rh, полученным в результате накопления (по 300-500 сек) и программной обработки пяти автокорреляционных функций флуктуации интенсивности

Гидродинамический радиус комплексов Ag-ХТ-I составил 21±1 нм. Увеличение продолжительности реакции образования НЧ-Ag в отсутствии ХТ приводило к постепенному росту размеров комплексов Ag-ХТ-II.

Исследование кинетики изменения гидродинамического радиуса комплексов Ag-ХТ-II/1, показало, что размеры полученных комплексов сохранялись в течение по меньшей мере 20-ти суток (рисунок 3.23). Это свидетельствовало о том, что ХТ стабилизировал НЧ-Ag, препятствуя их агрегации.

<К >, нм

Г1

40 30 20 10 0

0 5 10 15 20 ^ сутки

Рисунок 3.23 - Кинетика изменения гидродинамического радиуса (Дь) комплексов

Ag-ХТ-II/1 (t-время)

Таким образом, введение ХТ в реакционную смесь одновременно с другими компонентами приводило к образованию супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-I с гидродинамическим радиусом ~21 нм. Увеличение продолжительности реакции образования НЧ-Ag в отсутствии ХТ приводило к росту гидродинамического радиуса комплексов Ag-ХТ-П.

3.6 Седиментационная устойчивость супрамолекулярных комплексов Se-ХТ

и Ag-ХТ

Агрегативная и седиментационная устойчивость белков в водной среде обеспечивается благодаря гидратным оболочкам, образуемым дипольными молекулами воды вокруг каждой белковой молекулы. Образование гидратных оболочек обусловлено наличием заряда у молекул белка, суммарная величина которого зависит от соотношения положительно и отрицательно заряженных радикалов аминокислот (СООН-групп дикарбоновых аминокислот, SH-групп цистеина, имидазольного азота гистидина, МН2-групп лизина и др.). Изменение рН среды влияет на степень ионизации кислотных и основных групп и, следовательно, на суммарный заряд белка. В условиях рН, при которых число положительно и отрицательно заряженных радикалов равно и суммарный заряд молекулы равен нулю, белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок [183, 184]. Известно, что нативный ХТ наименее устойчив в растворе и

склонен к выпадению в осадок вблизи значения рН, соответствующего изоэлектрической точке (р! ~8.6). Можно полагать, что межмолекулярные взаимодействия ХТ с НЧ^е и с НЧ-Ag будут оказывать влияние на седиментационную устойчивость супрамолекулярных комплексов.

3.6.1 Седиментационная устойчивость и спектральные характеристики супрамолекулярных комплексов Se-ХТ в зависимости от рН среды и

концентрации Se

Исследование седиментационной устойчивости комплексов Se-ХТ в зависимости от рН среды и концентрации Se проводили на основе визуальной оценки состояния дисперсных систем (наличие осадка, появление мутности) [172]. Эксперимент проводили в соответствии с пунктом 2.2.5. Значения рН дисперсных систем измеряли в течение недели. В 1-е сутки после добавления №ОН все дисперсные системы сохраняли седиментационную устойчивость. На 2-е сутки наблюдалось три состояния дисперсий комплексов Se-ХТ: устойчивая дисперсная система, полное осаждение комплексов и частичное осаждение комплексов. В таблице 3.7 представлены значения рН дисперсных систем на 1-е и 2-е сутки после добавления №ОН.

При добавлении №ОН в дисперсии комплексов Se-ХТ степень ионизации катионных групп ХТ снижалась, а анионных - повышалась, а также происходила нейтрализация ионов Н+, присутствовавших в дисперсной системе в результате реакции получения НЧ^е. При этом, с течением времени наблюдалось понижение значения рН, достигнутого в момент добавления №ОН, вызванное, по-видимому, постепенной перезарядкой кислотных и основных групп ХТ. Были определены интервалы рН среды в зависимости от концентрации Se, при которых комплексы Se-ХТ седиментационно устойчивы.

Таблица 3.7 - Влияние концентрации добавленного №ОН (Сшон) на рН дисперсий комплексов Se-ХТ в зависимости от концентрации Se (рНисх. -

исходное значение рН дисперсных систем)

Сшон, н рН дисперсий комплексов Se-ХТ

V = 0.5 (рНисх. = 3.4) v= 1.0 (рНисх. = 3.0) v= 1.5 (рНисх. = 2.9) V = 2.0 (рНисх. = 2.8)

1-е сутки 2-е сутки 1-е сутки 2-е сутки 1е сутки 2-е сутки 1-е сутки 2-е сутки

0.0002 4.0 3.7 3.4 3.1 3.2 3.1 3.4 2.8

0.0006 6.4 4.6** 4.3 3.4 3.6 3.4 3.2 3.0

0.0010 6.8 6.2** 6.1 3.8** 5.2 3.5* 3.4 3.1

0.0014 6.7 6.8** 6.4 4.1** 5.8 3.6** 4.2 3.3*

0.0020 8.8 7.9 6.4 4.8** 5.6 3.8* 4.6 3.4*

0.0024 - - 6.8 6.2** 5.7 3.9* 4.8 3.5*

0.0026 - - 7.0** 7 0** - - - -

0.0028 - - 7.3 7.2 - - - -

0.0030 9.6 8.8 7.6 7.7 6.1 4 3** 5.0 3.7**

0.0040 10.0 9.0 8.8 7.8 6.6 6.9 5.6 4.2**

0.0050 10.2 9.4 9.4 8.0 8.4 7.4 6.2 6.0**

0.0100 11.1 10.4 10.2 9.8 9.4 8.2 9.2 7.9

0.0200 11.4 11.8 11.8 11.5 11.1 11.0 11.3 11.4

0.0400 11.7 12.1 11.8 12.1 11.4 12.0 11.8 12.0

0.0600 12.2 12.4 12.2 12.3 12.2 12.2 12.0 12.4

* Частичное осаждение комплексов ** Полное осаждение комплексов

Примечание - Осаждение комплексов наблюдалось на 2-е сутки после добавления №ОН

На 2-е сутки после добавления №ОН седиментация комплексов Se-ХТ с V = 0.5 наблюдалась в образцах, значения рН которых на 2-е сутки находились в диапазоне от 4.6 до 6.8, с V = 1.0 - в диапазоне от 3.8 до 7.0, с V = 1.5 - в диапазоне

от 3.5 до 4.3, с V = 2.0 - в диапазоне от 3.3 до 6.0. При других значениях рН комплексы сохраняли седиментационную устойчивость. Таким образом, увеличение концентрации Se приводило к изменению диапазона рН, в котором комплексы Se-ХТ претерпевали седиментацию. Следовательно, взаимодействие молекул ХТ с гидрофобными НЧ^е приводило к изменению условий седиментации комплексов в сравнении с нативным ферментом.

Стоит отметить, что в отличие от нестабилизированного красного аморфного Se, который после осаждения приобретал серый цвет (см. пункт 3.1.1), в случае осаждения комплексов Se-ХТ изменения цвета осадка не наблюдалось, что свидетельствовало о прочности взаимодействия ХТ с НЧ^е.

Поскольку взаимодействия между молекулами ХТ и НЧ^е обусловливают различия в спектрах поглощения раствора нативного ХТ и дисперсий комплексов Se-ХТ, было исследовано влияние рН среды на их спектральные характеристики.

На рисунке 3.24 представлены спектры поглощения растворов нативного ХТ в зависимости от рН среды. Максимум поглощения ХТ приходился на длину волны 280-283 нм вне зависимости от рН среды. В щелочной среде абсолютная величина оптической плотности нативного ХТ возрастала. По-видимому, это связано с изменением конформации белка и увеличением на его поверхности количества функциональных групп, поглощающих при 280 нм [177].

Рисунок 3.24 - Спектры поглощения растворов ХТ в зависимости от рН среды, Схт = 0.01 масс.% ^ - оптическая плотность; X - длина волны): 1 - рН 6.6 (исходный раствор); 2 - рН 3.5; 3 - рН 6.3; 4 - рН 11.2; 5 - рН 12.4

На рисунках 3.25-3.28 представлены спектры поглощения дисперсий комплексов Se-ХТ со значениями V от 0.5 до 2.0 в зависимости от рН среды. В случае осаждения комплексов были сняты спектры поглощения надосадочной жидкости. Следует отметить, что для всех устойчивых дисперсий Se-ХТ вне зависимости от значений рН среды спектры поглощения имели максимум при ~265 нм, либо плато в области от ~240 до ~270 нм, при этом соответствующая абсолютная величина оптической плотности дисперсий изменялась в меньшей степени, чем в случае нативного ХТ. Таким образом, для седиментационно устойчивых комплексов Se-ХТ не наблюдалось значительного влияния рН на их спектральные характеристики.

При осаждении комплексов на спектрах поглощения надосадочной жидкости наблюдался сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область до ~290 нм (в ряде случаев он соответствовал значению длины волны, характерной для нативного ХТ) и уменьшением абсолютного значения оптической плотности. Например, на рисунке 3.26 кривые 1, 4 и 5 соответствуют устойчивым дисперсным системам, кривая 2 характеризует систему, претерпевшую частичное осаждение комплексов, а кривая 3 - полное осаждение комплексов.

Рисунок 3.25 - Спектры поглощения дисперсий комплексов Se-ХТ с V = 0.5 в зависимости от рН среды (О - оптическая плотность; X - длина волны). Значение рН дисперсных систем на 6-е сутки после добавления №ОН: 1 - рН 3.4 (исходная дисперсная система); 2 - рН 3.6; 3 - рН 4.3; 4 - рН 6.9; 5 - рН 7.2; 6 - рН 9.6

Рисунок 3.26 - Спектры поглощения дисперсий комплексов Se-ХТ с V = 1.0 в зависимости от рН среды (р - оптическая плотность; X - длина волны). Значение рН дисперсных систем на 6-е сутки после добавления №ОН: 1 - рН 3.0 (исходная дисперсная система); 2 - рН 3.4; 3 - рН 4.0; 4 - рН 7.0; 5 - рН 9.4

Рисунок 3.27 - Спектры поглощения дисперсий комплексов Se-ХТ с V = 1.5 в зависимости от рН среды (р - оптическая плотность; X - длина волны). Значение рН дисперсных систем на 6-е сутки после добавления №ОН: 1 - рН 2.9 (исходная дисперсная система); 2 - рН 3.4; 3 - рН 4.0; 4 - рН 7.2; 5 - рН 7.8; 6 - рН 12.4

Рисунок 3.28 - Спектры поглощения дисперсий комплексов Se-ХТ с V = 2.0 в зависимости от рН среды (О - оптическая плотность; X - длина волны). Значение рН дисперсных систем на 6-е сутки после добавления №ОН: 1 - рН 2.8 (исходная дисперсная система); 2 - рН 3.0; 3 - рН 3.4; 4 - рН 4.0; 5 - рН 10.8; 6 - рН 12.4

В таблице 3.8 представлены величины длин волн максимумов поглощения надосадочной жидкости дисперсий комплексов Se-ХТ, претерпевших их полное осаждение, в зависимости от концентрации Se и рН среды. Наряду с длиной волны 283 нм, соответствующей максимуму поглощения нативного ХТ, наблюдались максимумы поглощения при длинах волн 275, 290 и 295 нм.

Таблица 3.8 - Влияние концентрации Se (V) и рН среды на величину длины волны максимума поглощения (Хтах) надосадочной жидкости дисперсий

комплексов Se-ХТ, претерпевших их полное осаждение

V Сшон, н рН дисперсных систем на 5-е сутки после добавления №ОН Хтах, нм

0.5 0.0006-0.001 4.3-5.0 280-283

0.0014 6.9 275

1.0 0.001 3.4 283

0.0014-0.002 3.6-4.0 290

1.5 0.0014-0.003 3.2-4.0 290

0.004 6.8 272

2.0 0.002 - 0.004 3.0-4.0 295

Согласно литературным данным, длина волны 275 нм соответствует полосе поглощения тирозина [177]. Также тирозин имеет размытые максимумы в области 267 и 282 нм. Кроме того, для тирозина с диссоциированной гидроксильной группой максимумы поглощения наблюдаются в области 240 и 293 нм. Триптофан в длинноволновой области характеризуется полосой поглощения при

279-280 нм, а также пиком при 288 нм и плечом при 271-273 нм [177]. Появление максимумов поглощения, характерных для тирозина и

триптофана свидетельствовало об изменении конформационного состояния ХТ. Можно полагать, что изменение рН среды, вызывавшее перезарядку поверхностных групп ХТ, приводило как к его частичной десорбции с поверхности комплекса, проявлявшейся в появлении максимума поглощения при

280-283 нм, так и к изменению его конформации, в результате чего становились разрешенными электронные переходы, ранее не реализовывавшиеся.

Таким образом, показано, что реализация гидрофобных взаимодействий между ХТ и НЧ^е приводила к изменению условий седиментации комплексов в сравнении с нативным ферментом, которые зависели от концентрации Se. При этом, спектральные характеристики седиментационно устойчивых комплексов практически не изменялись.

3.6.2 Седиментационная устойчивость супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-I и их спектральные и размерные характеристики в зависимости от

рН среды

Для исследования влияния рН среды на седиментационную устойчивость, а также спектральные и размерные характеристики НЧ-Ag и комплексов Ag-ХТ-I 1 мл полученных образцов смешивали с 5 мл универсального буфера со значениями рН от 3.0 до 12.0 (см. пункт 2.2.5). На рисунке 3.29 представлены фотографии образцов исследованных дисперсий НЧ-Ag и комплексов Ag-ХТ-I, помещенных в универсальные буферные растворы. В случае НЧ-Ag в зависимости от рН цвет дисперсных систем изменялся от практически

бесцветного к розовому. Дисперсии комплексов Ag-ХТ-I при изменении рН среды сохраняли желто-коричневую окраску. В отличие от НЧ-Ag, осаждение которых наблюдалось на 4-е сутки после помещения их в буферные растворы, комплексы Ag-ХТ-I в диапазоне значений рН среды от 3.0 до 12.0 сохраняли седиментационную устойчивость по меньшей мере в течение одного месяца.

Рисунок 3.29 - Дисперсии НЧ-Ag (а) и комплексов Ag-ХТ-I (б) в зависимости от

рН среды

Для оценки влияния рН среды на взаимодействия между НЧ-Ag и молекулами ХТ были изучены спектральные характеристики дисперсий НЧ-Ag и супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-I [176]. В приложениях Е и Ж представлена кинетика изменения спектров поглощения дисперсий НЧ-Ag и комплексов Ag-ХТ-I, соответственно, в зависимости от рН среды (рисунки Е.1-Е.9 и Ж.1-Ж.10). В сравнении со спектром поглощения дисперсии НЧ-Ag, представленным на рисунке 3.10, спектры поглощения НЧ-Ag, помещенных в буферные растворы, претерпевали значительную трансформацию: наряду с полосой ППР в области 400 нм также появлялась широкая полоса поглощения в видимой области спектров. В отличие от НЧ-Ag в случае комплексов Ag-ХТ-I форма спектров поглощения и положение пика ППР НЧ-Ag сохранялись. Можно полагать, что появление вторых пиков на спектрах поглощения дисперсий НЧ-Ag может быть связано с геометрической анизотропией наночастиц, а также с образованием агрегатов [185]. В случае комплексов Ag-ХТ-I ХТ, образуя комплексы с НЧ-Ag, препятствовал их агрегации.

Выдвинутое предположение подтверждается данными, полученными методом ПЭМ, представленными на рисунках 3.30 и 3.31. После помещения НЧ-Ag в буферный раствор с рН 8.0 (рисунок 3.30а) и рН 11.0 (рисунок 3.30б) НЧ-Ag образовывали агрегаты с диаметром от 12 до 70 нм. Таким образом, появление дополнительного пика на спектрах поглощения дисперсий НЧ-Ag в буферных растворах, по-видимому, обусловлено ППР агрегатов НЧ-Ag. Можно полагать, что под влиянием рН среды стабилизирующий наночастицы слой, образованный боргидрид-анионами и другими ионами, присутствующими в растворе, разрушался, что приводило к агрегации и последующему осаждению частиц.

(а)

(б)

Рисунок 3.30 - ПЭМ-изображения НЧ-Ag, помещенных в буферные растворы с рН 8.0 (а) и рН 11.0 (б). Длина масштабного отрезка составляет 100 нм

После помещения дисперсий комплексов Ag-ХТ-I в буферный раствор с рН 8.0 диаметр НЧ-Ag в составе комплексов в основном не превышал 4 нм (рисунок 3.31). Поскольку форма спектров поглощения комплексов Ag-ХТ-I сохранялась вне зависимости от рН среды, можно полагать, что при других значениях рН размеры НЧ-Ag также не изменялись.

Рисунок 3.31 - ПЭМ-изображение НЧ-Ag в составе супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-I, помещенных в буферный раствор с рН 8.0. Длина масштабного отрезка составляет 100 нм

Таким образом, установлено, что НЧ-Ag, полученные в отсутствии ХТ, претерпевали агрегацию при изменении рН среды, что проявлялось в появлении на спектрах поглощения дисперсий НЧ-Ag дополнительной широкой полосы поглощения в области от 500 до 600 нм. Показано, что при изменении рН среды спектральные характеристики комплексов Ag-ХТ-I и размеры НЧ-Ag в составе этих комплексов сохранялись. Можно полагать, что сочетание двух типов межмолекулярных взаимодействий (гидрофобных и электростатических) при формировании супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ-I предотвращало агрегацию НЧ-Ag, в результате чего комплексы Ag-ХТ-I сохраняли седиментационную устойчивость в диапазоне рН среды от 3.0 до 12.0 в течение по меньшей мере одного месяца.

3.7 Модели взаимодействия ХТ с НЧ^ и НЧ-Ag 3.7.1 Модель взаимодействия ХТ с НЧ^

Формирование супрамолекулярных комплексов Se-ХТ осуществлялось за счет взаимодействия гидрофобных НЧ^е с гидрофобными доменами молекул ХТ. Устойчивость комплексов в водной среде обеспечивалась за счет формирования гидратных оболочек вокруг молекул ХТ, имеющих заряженные радикалы аминокислот. При этом формирование комплексов Se-ХТ осуществлялось только в кислой среде. По-видимому, именно в этих условиях ХТ имеет конформацию, при которой гидрофобные участки молекулы белка доступны для межмолекулярного взаимодействия с НЧ^е.

Таким образом, полученные супрамолекулярные комплексы Se-ХТ являются модельными объектами для изучения гидрофобных межмолекулярных взаимодействий белков с наночастицами.

Согласно данным, полученным методом ПЭМ, наиболее часто встречающееся значение диаметра НЧ^е в составе комплексов Se-ХТ (у=1, Т=20 °С) составляло ~25 нм, а среднее значение диаметра этих комплексов, согласно данным ДРС, составляло ~66 нм. Если предположить, что супрамолекулярный комплекс представляет собой моноядерную структуру, в которой «ядро» образовано одной НЧ^е, то в соответствии с полученными данными и размерами молекулы ХТ (5.5*3.5*3.8 нм), вокруг НЧ^е формировалась многослойная оболочка из молекул ХТ, толщина которой в среднем составляла ~21 нм (рисунок 3.32).

Рисунок 3.32 - Схематичное изображение супрамолекулярного комплекса Бе-ХТ (исходя из предположения о моноядерной модели комплекса)

3.7.2 Модель взаимодействия ХТ с НЧ-Ag

Благодаря свойствам НЧ-Ag, формирование супрамолекулярных комплексов Ag-ХТ возможно за счет гидрофобных и электростатических межмолекулярных взаимодействий. Супрамолекулярные комплексы Ag-ХТ-I, полученные путем введения ХТ в реакционную смесь одновременно с другими реагентами, являются модельными объектами для изучения межмолекулярных взаимодействий ХТ с НЧ-Ag, сочетающих электростатические и гидрофобные взаимодействия. В случае комплексов Ag-ХТ-П стабилизация НЧ-Ag до добавления в реакционную смесь ХТ обеспечивалась ионной оболочкой, образованной боргидрид-анионами и другими ионами, присутствующими в дисперсной системе. Таким образом, супрамолекулярные комплексы Ag-ХТ-II являются модельными объектами для изучения преимущественно электростатических межмолекулярных взаимодействий ХТ с НЧ-Ag.

Согласно данным, полученным методом ПЭМ, наиболее часто встречающееся значение диаметра НЧ-Ag в составе комплексов Ag-ХТ-I и

А§-ХТ-П/1 составляло ~4 и ~8 нм, соответственно, а среднее значение диаметра комплексов А§-ХТ-1 и А§-ХТ-П/1, согласно данным ДРС, составляло ~42 и ~50 нм, соответственно. Если предположить, что супрамолекулярные комплексы представляют собой моноядерные структуры, в которых «ядро» образовано одной НЧ-А§, то в соответствии с полученными данными и размерами молекулы ХТ (5.5^3.5x3.8 нм), вокруг НЧ-А§ формировалась многослойная оболочка из молекул ХТ, толщина которой в среднем составляла ~ 19-21 нм (рисунки 3.33 и 3.34).

Рисунок 3.33 - Схематичное изображение супрамолекулярного комплекса А§-ХТ-1 (исходя из предположения о моноядерной модели комплекса)

Рисунок 3.34 - Схематичное изображение супрамолекулярного комплекса Ag-ХТ-II (исходя из предположения о моноядерной модели комплекса)

3.8 Протеолитическая активность ХТ в составе супрамолекулярных

комплексов Se-ХТ и Ag-ХТ

Известно, что нативный ХТ, оптимальными условиями функционирования которого является среда с рН ~8.0, быстро теряет свою активность при рН ниже 7.0 и выше 9.0. Можно полагать, что межмолекулярные взаимодействия, реализуемые при формировании комплексов ХТ с НЧ-Бе и с НЧ-Ag, будут оказывать влияние на протеолитическую активность фермента в составе супрамолекулярных комплексов. В связи с этим была исследована протеолитическая активность супрамолекулярных комплексов Бе-ХТ и Ag-ХТ при значениях рН, равных 6.0, 8.0 и 11.0, в сравнении с нативным ферментом.

3.8.1 Протеолитическая активность ХТ в составе супрамолекулярных

комплексов Se-ХТ

Была исследована протеолитическая активность комплексов Se-ХТ с V = 0.1 и V = 1, которые получали при температуре 20 °С, в сравнении с нативным ХТ [186]. Удельную протеолитическую активность нативного ХТ и ХТ в составе супрамолекулярных комплексов определяли в соответствии с пунктом 2.2.6. В таблице 3.9 представлены значения удельной протеолитической активности для нативного ХТ и комплексов Se-ХТ при рН 6.0, 8.0 и 11.0.

Как видно из таблицы 3.9, при рН 6.0 значения удельной протеолитической активности нативного ХТ и комплексов Se-ХТ с учетом погрешности были достаточно близки. При рН 8.0 наблюдалось снижение удельной протеолитической активности ХТ в составе комплексов в сравнении с нативным ферментом, что может быть обусловлено адсорбцией некоторого количества наночастиц в области активных центров молекул ХТ, что препятствовало их взаимодействию с субстратом. При рН 11.0 наблюдалось заметное повышение ферментативной активности комплексов Se-ХТ в сравнении с нативным ХТ. Так, удельная протеолитическая активность комплексов Se-ХТ (V = 1) и комплексов Se-ХТ (V = 0.1) превышала соответствующую величину для нативного ХТ в ~2.8 и ~1.5 раза, соответственно.

Таблица 3.9 - Влияние рН на удельную протеолитическую активность

(Аудел.) нативного ХТ и комплексов Se-ХТ

Образец Аудел., Ед./мг

рН6.0 рН 8.0 рН 11.0

ХТ 0.9±0.1 3.2±0.3 1.8±0.2

Se-ХТ(v = 0.1) 0.8±0.1 2.6±0.3 2.7±0.3

Se-ХТ (V = 1) 0.6±0.1 2.3±0.2 4.1±0.4

Примечание - В каждом случае проводили три параллельных эксперимента. Усреднение экспериментальных данных и оценку погрешности осуществляли в соответствии с пунктом 2.2.10 по трем значениям Аудел.

Однако, величины удельной активности фермента, определяемые на начальном этапе реакции в условиях избытка субстрата, не описывают всю картину исследуемых процессов. В связи с этим была изучена кинетика накопления продукта ферментативной реакции для нативного ХТ и ХТ в составе супрамолекулярных комплексов (рисунок 3.35а, б, в). Эксперимент проводили в соответствии с пунктом 2.2.7. На диаграмме (рисунок 3.36) представлены суммарные данные по влиянию рН на величины максимальной концентрации продукта реакции гидролиза.

Рисунок 3.35 - Кинетика накопления продукта реакции гидролиза казеината натрия для комплексов Se-ХТ в сравнении с нативным ХТ при рН 6.0 (а), рН 8.0

(б) и рН 11.0 (в) (P - концентрация продукта реакции гидролиза; t - время реакции): 1 - ХТ; 2 - Se-ХТ (v = 1); 3 - Se-ХТ (v = 0.1)

P , мг/мл

max'