Сульфатированные производные пектиновых полисахаридов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Витязев, Фёдор Васильевич

• Витязев, Фёдор Васильевич
• кандидат химических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат химических наук Витязев, Фёдор Васильевич

Содержание

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Сульфатированные полисахариды

1.2. Гликозаминогликаны

1.2.1. Гиалуроповая кислота

1.2.2. Хондроитинсульфаты

1.2.3. Дерматансульфат

1.2.4. Кератансульфаты

1.2.5. Гепарин

1.3. Сульфатированные полисахариды растительного происхождения

1.3.1. Полисахариды бурых водорослей

1.3.2. Полисахариды красных водорослей

1.3.3. Полисахариды зеленых водорослей

1.4. Синтез сульфатированных полисахаридов

1.5. Определение компонентов в сульфатированных полисахаридах

1.5.1. ИК-спектроскопия

1.5.2. ЯМР спектроскопия сульфатированных полисахаридов

1.5.3. Методы количественного определения сульфатных групп

в полисахаридах

1.5.3.1. Колориметрический метод

1.5.3.2. Гравиметрический метод

1.5.3.3. Турбидгшетрический метод

1.5.3.4. Количественное определение сульфата по методу Додэ/ссона

1.5.3.5. Ионно-хроматографический метод

1.6. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов

1.6.1. Влияние сульфатных групп на антикоагулянтную активность

1.6.2. Влияние локализации сульфатных групп

1.7. Пектиновые полисахариды

1.7.1. Линейная область

1.7.2. Разветвленные области

1.7.3. Рамногалактуронан 1

1.7.4. Рамногалактуронан II

1.8. Физиологическая активность пектинов

1.9. Заключение

2. Обсуждение результатов

2.1. Получение галактуронана из пектина бадана толстолистного и его характеристика

2.2. Дериватизация галактуронана и пектинов

2.3. Сульфатирование галактуронана

2.4. Сульфатирование пектинов

2.5. ИК-спектроскопия пектинов и их сульфатированных производных

2.6. ЯМР спектроскопия сульфатированных производных пектинов

2.7. Растворимость пектинов и их сульфатированных производных

2.8. Физиологическая активность пектинов и их сульфатированных производных

2.9. Заключение

3. Экспериментальная часть

3.1. Реактивы и материалы

3.2. Экспериментальные условия

3.2.1. Общие экспериментальные условия

3.2.2. Аналитические методы

3.2.3. Получение галактуронанов из пектина бадана толстолистного Bergenia crassifolia L (ВС)

3.2.4. Получение триэтиламмониевой соли пектиновых полисахаридов и галактуронана

3.2.5. Получение монометил сульфата пиридина

3.2.6. Сульфатирование галактуронана ВСН

3.2.6.1. Метод I. Сульфатирование галактуронана ВСН монометилсульфатом пиридина

3.2.6.2. Метод II. Сульфатирование галактуронана ВСН

пиридинсульфотриоксидом

3.2.6.3. Метод III. Сульфатирование галактуронана ВСН хлорсульфоновой кислотой

3.2.7. Сульфатирование пектиновых полисахаридов

3.2.8. Фракционирование сульфатированных производных пектинов

3.2.9. Определение физиологической активности

3.2.10. Статистический анализ

Выводы

Список литературы

Условные обозначения

вэжх гжх

ДМФА

дмсо

ФА

ТФУ

ваІА

ПС

Шш

Ага

Хуі

Мап

ас

ваі МеО

ИК-спектр

ЯМР-спектр

Мп

вен

ВС

ьм

РЫ

СР

Ш

ТУБ

МБ

РБ

ЛПНП ББ

Тб-ОН

БЮ

ШЗ-І

АЧТВ

ТВ

ПВ

- высокоэффективная хроматография

- газожидкостная хроматография

- А^іУ-диметилформамид

- диметилсульфоксид

- формамид

- трифторуксусная кислота

- галактуроновая кислота

- полисахарид

- рамноза

- арабиноза

- ксилоза

- манноза

- глюкоза

- галактоза

- метоксильные группы

- сульфатные группы

- инфракрасный спектр

- спектр ядерного магнитного резонанса

- среднечисловая молекулярная масса

- средневесовая молекулярная масса

- галактуронан, полученный из пектина бадана толстолистного

- пектин бадана толстолистного

- пектин ряски малой

- пектин рдеста плавающего

- пектин сабельника болотного

- пектин борщевика Сосновского

- пектин пижмы обыкновенной

- пектин плодов яблони домашней

- пектин плодов сливы домашней

- липопротеины низкой плотности

- степень сульфатирования

- толуолсульфоновая кислота

- рамногалактуронан

- рамногалактуронан I

- тест частичного активированного тромбопластинового времени

- тест тромбинового времени

- тест протромбинового времени

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сульфатированные производные пектиновых полисахаридов»

Введение

Одной из важных и актуальных задач биоорганической химии является исследование высокомолекулярных биорегуляторов и выяснение взаимосвязи между их структурой и биологической активностью. Пектины и сульфатированные полисахариды являются физиологически активными биополимерами, строение макромолекул которых обусловливает их активность [1-3]. Наличие сульфатных групп и их распределение обусловливает не только полианионный характер сульфатированных полисахаридов, но и их антикоагулянтные свойства [4, 5]. В клинической практике в качестве антикоагулянта используется гепарин, сульфатированный полисахарид животного происхождения, существенными недостатками применения которого являются сложность стандартизации его состава и возможность передачи споровых форм бычьего энцефалита человеку [6, 7]. Поэтому ведется поиск аналогов гепарина среди полисахаридов растительного происхождения. Однако антикоагулянтная активность исследованных к настоящему времени природных и синтетических сульфатированных полисахаридов, полученных на основе целлюлозы [8], декстранов [9] и пуллуланов [10], ниже активности гепарина. Вероятно, антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов обусловлена не только наличием сульфатных групп и их распределением, но и строением углеводных цепей полисахаридов, присутствием других функциональных заместителей, их положением и распределением. Большинство синтетических аналогов гепарина представляют собой производные нейтральных полисахаридов, и строение их макромолекул отличается от строения гепарина, в состав которого входят остатки гликуроновых кислот. Остатки галактуроновой кислоты являются главными структурными компонентами углеводных цепей пектиновых полисахаридов, поэтому сульфатирование пектинов позволит получить производные, максимально приближенные по структуре к гепарину. Более того, манипуляция условиями экстракции дает возможность получать пектины гомогенные по составу и молекулярной массе.

Цель работы:

Получение сульфатированных производных пектинов и определение влияния сульфатных групп на их свойства.

Задачи исследования:

1. Разработать метод сульфатирования пектиновых полисахаридов.

2. Получить набор сульфатированных производных с различной молекулярной массой и степенью сульфатирования на основе пектинов, отличающихся строением углеводных цепей.

3. Определить влияние степени замещения сульфатированных производных пектинов на их физико-химические свойства.

4. Определить влияние степени сульфатирования и молекулярной массы полученных производных пектинов на их способность связывать липопротеины низкой плотности.

5. Установить влияние степени сульфатирования полученных производных пектинов на их антикоагулянтную активность.

Положения, выносимые на защиту:

1. Сульфатирование пектиновых полисахаридов хлорсульфоновой кислотой обеспечивает получение производных с высокой степенью замещения.

2. В процессе сульфатирования пектиновых полисахаридов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты.

3. Степень связывания липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) зависит от количества сульфатных групп и молекулярной массы сульфатированных производных пектинов. Наибольшей способностью связывать липопротеины низкой плотности обладают сульфатированные производные пектинов с молекулярной массой выше 200 кДа, содержащие две сульфатные группы в одном мономерном звене.

4. Сульфатирование пектинов приводит к появлению аптикоагулянтной активности, нехарактерной для пектинов, которая зависит от количества сульфатных групп, введенных в состав их макромолекулы.

Научная новизна. Впервые на основе пектиновых полисахаридов получен набор сульфатированных производных с различной молекулярной массой и с различным содержанием сульфатных групп.

Впервые показано, что при сульфатировании пектиновых полисахаридов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты.

Впервые установлено, что сульфатированные производные пектиновых полисахаридов обладают антикоагулянтной активностью, отсутствующей у исходных пектинов.

Впервые установлено, что способность сульфатированных производных пектинов связывать ЛПНП зависит от степени их сульфатирования и молекулярной массы.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования вносят вклад в понимание взаимосвязи между структурой полисахаридов, их физико-химическими свойствами и физиологической активностью. Выявлено, что введение сульфатных групп в макромолекулу пектинов изменяет их реологические свойства и физиологическую активность. Присутствие сульфатных групп в макромолекуле пектинов уменьшает их характеристическую вязкость и увеличивает растворимость в воде, а также приводит к появлению у них антикоагулянтных свойств, не характерных для пектинов. Кроме того, введение сульфатных групп повышает способность пектинов связывать ЛПНП, при этом степень связывания зависит от количества сульфатных групп и от молекулярной массы полисахарида.

Разработан оптимальный метод сульфатирования пектинов и показано, что, манипулируя условиями реакции сульфатирования, можно регулировать глубину замещения и получать на основе пектиновых полисахаридов

сульфатированные производные с разным содержанием сульфатных групп. При сульфатировании пектинов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты с преимущественным первоначальным замещением по второму положению.

Полученные результаты позволяют расширить исследования по созданию антикоагулянтных препаратов на основе пектиновых полисахаридов.

Полученные данные об антикоагулянтной активности и способности сульфатированных производных пектинов связывать ЛПНП в большей степени, чем гепарин, открывают перспективы для использования их в медицинской практике при гемодиализе.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены лично в виде устных и стендовых докладов на Н-ой Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алма-Ата, Казахстан, 2007 г.), Ш-ей Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2007 г.), Ш-ей Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Уфа, 2008 г.), ХИ-ой Всероссийской молодежной школе-конференции «По актуальным проблемам химии и биологии» (г. Владивосток, 2009 г.), УШ-ой Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2009 г.), У1-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.), УП-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Сыктывкар, 2011 г.), 16-ом Европейском симпозиуме по углеводам (г. Сорренто-Неаполь, Италия, 2011 г.).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе две статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, и один патент Российской Федерации.

Личный вклад автора. Вклад в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в проведении анализа литературы, планировании экспериментов, получении экспериментальных данных, интерпретации и систематизации полученных результатов и оформления их для публикации. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Витязев, Фёдор Васильевич

Выводы.

1. Разработаны методы сульфатирования пектиновых полисахаридов монометилсульфатом пиридина, пиридинсульфотриоксидом, хлорсульфоновой кислотой, и показано, что для получения производных с высокой степенью замещения рационально использовать этерификацию хлорсульфоновой кислотой.

2. Получен набор сульфатированных галактуронанов с содержанием сульфатных групп 9ч-42 % и набор сульфатированных производных пектинов с содержанием сульфатных групп 7^-45 % и с молекулярной массой от 3 до 450 кДа.

3. Установлено, что при сульфатировании пектинов наблюдается замещение остатков галактуроновой кислоты по С2- и СЗ-положению, с преимущественным первоначальным замещением по С2-положению.

4. Независимо от строения способность пектинов связывать липопротеины низкой плотности увеличивается при введении сульфатных групп в их макромолекулы, и зависит от молекулярной массы сульфатированных производных пектинов и от степени их сульфатирования: наибольшей способностью обладают образцы с максимальной степенью сульфатирования, молекулярная масса которых более 200 кДа.

5. Показано, что в отличие от пектинов их сульфатированные производные обладают антикоагулянтной активностью, которая зависит от строения их макромолекул и степени сульфатирования. Наибольшую активность проявляют образцы с максимальной степенью сульфатирования.

2.9. Заключение

В рамках данной работы разработаны методы сульфатирования пектиновых полисахаридов хлорсульфоновой кислотой, пиридинмонометил-сульфатом и пиридинсульфотриоксидом. Показано, что степень замещения пектиновых полисахаридов при сульфатировании зависит от сульфатирующего реагента, его количества в реакционной смеси, а также от времени и температуры проведения реакции. Было установлено, что для сульфатирования пектинов наиболее рационально применять этерификацию хлорсульфоновой кислотой, использование которой позволяет получать производные пектинов с низкой и с высокой степенью замещения (от 0.3 до 2.0) и вызывает наименьшую деструкцию углеводных цепей пектинов. Таким образом, варьируя количество сульфатирующего реагента, время и температуру проведения реакции сульфатирования, можно контролировать глубину замещения и получать сульфатированные производные пектинов с различной степенью замещения.

Методом ЯМР-спектроскопии установлено, что при сульфатировании пектиновых полисахаридов замещаются остатки галактуроновой кислоты по С2- и СЗ-положениям. Таким образом, строение сульфатированных производных пектинов, состоящих главным образом из остатков 1,4-а-Б-галактуроповой кислоты, содержащей по С2- и СЗ-положениям сульфатные группы, приближено к строению гепарину.

Показано, что введение сульфатных групп в макромолекулу пектинов модифицирует их физиологическую активность и физико-химические свойства. Водные растворы сульфатированных производных характеризуются меньшей вязкостью, а их растворимость в воде существенно выше, чем у исходных пектинов. Кроме того, в отличие от исходных пектинов их сульфатированные производные обладают антикоагулянтпой активностью, сравнимой с активностью гепарина. Выявлено, что способность связывать ЛПНП выше у сульфатированных производных, чем у исходных пектинов и у гепарина. Установлено, что способность связывать ЛПНП зависит от молекулярной массы и количества сульфатных групп в макромолекулах сульфатированных производных.

Таким образом, манипулируя условиями реакции сульфатирования пектинов можно получать сульфатированные производные с определенными физико-химическими свойствами и физиологической активностью.

3. Экспериментальная часть

3.1. Реактивы и материалы

Для выполнения диссертационной работы использовали: коммерческие образцы моносахаридов: арабинозы (Sigma, США, 99 %), галактозы (Sigma-Aldrich, США, 95 %), рамнозы (Sigma, США, 99 %), глюкозы (Sigma, США, 99%), маннозы (Sigma, США, 99%), ксилозы (Sigma, США, 99 %), галактуроновой кислоты (Fluka, Германия, 97 %); химические реактивы: пиридин, борная кислота и толуол марки «ч.д.а.», аммиак водный и серная кислота марки «о.с.ч.», ледяную уксусную кислоту, соляную кислоту, барий хлористый, диметилформамид, сульфат калия хлороформ стабилизированный этиловым спиртом марки «х.ч.», этиловый спирт (ОАО «Кировская фармацевтическая фабрика», 95 %), метиловый спирт (Merck, Германия, 99.5 %), трихлоруксусную кислоту (Merck, Германия, 99 %), толуолсульфоновую кислоту (Sigma-Aldrich, США, 95 %), трифторуксусную кислоту (Merck, Германия, 99 %), хлорсульфоновую кислоту (Acros Organics, США, 97%), натрия метаарсенит (Fluka, Германия, 99%), 3,5-диметилфенол (Aldrich, США, 99 %), натрия боргидрид (Sigma-Aldrich, США, 98.5 %), гепарин (ICN Biomedikal, США, 169 Ед./мг); пектиновые полисахариды, выделенные из бадана толстолистного Bergenia crassifolia L. (ВС), ряски малой Lemna minor L. (LM), рдеста плавающего Potamogeton natans L. (PN), борщевика Соснового Heracleum sosnowskyi L. (HS), пектин сабельника болотного Comarum palustre L. (CP), плодов яблони домашней Malus domestica L. (MD) и сливы домашней Prumts domestica L. (PD).

3.2. Экспериментальные условия

3.2.1. Общие экспериментальные условия

Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 (Англия).

Оптическое вращение водных растворов галактуронанов определяли на приборе Polartronic MHZ (Германия) при 20 °С.

Газожидкостную хроматографию (ГЖХ) проводили на хроматографе Varian 450-GC (США) с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке YF-5 ms (0.25 мм 0 х 30 м, Varian), газ-носитель - гелий. ГЖХ aiiemamoe полиолов проводили в программе: от 175 °С (1 мин.) до 250 °С (2 мин.) со скоростью подъема температуры 3 °С/мин. Процентное содержание моносахаридов от суммарного препарата вычисляли из площадей пиков, используя коэффициенты отклика детектора [193].

ИК-спектры образцов полисахаридов, обезвоженных в пистолете Фишера при пониженном давлении над Р2О5 и температуре 60 °С, регистрировали на спектрофотометре Specord М80 (v0 = 4000 см'1, vK = 400 см"1, IT = 1). Образцы по 2 мг анализировали в виде таблеток, полученных прессованием с КВг [165].

Спектры ЯМР снимали в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (Москва) на приборе DRX-500 фирмы Bruker (Германия) для 3 - 5 % растворов полисахаридов в D20 при 55 °С и 70 °С (внутренний стандарт - ацетон, 5„ 2.225 м.д., 5С 31.45 м.д.).

Молекулярную массу образцов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Образец (3 мг) растворяли в 0.15 М NaCl (1 мл), раствор фильтровали через металлический фильтр. Для анализа использовали хроматографическую систему («Shimadzu», Япония): насос LC-20AD, дегазатор DGU-20A3, рефрактометр RID-10А, термостат СТО-1 OAS, колонку Shodex OHpak SB-804 HQ (8.0 мм x 30 см), предколонку Shodex GS-26 7B (7.6 мм х 5 см). Элюирование проводили 0.15MNaCl при 40 °С со скоростью потока 0.4 мл/мин. Для калибровки колонки использовали образцы пуллуланов с молекулярными массами: 1.3, 6, 12, 22, 50, 110, 200, 400, 800 кДа (Sigma, USA).

Определение молекулярно-массовых характеристик образцов полисахаридов проводили с помощью программы «ЬСбоЫюп Уешп 1.22 БРЬ), которая обеспечивает определение времени удерживания, площадей пиков, обработку, построение кривой молекулярно-массового распределения, печать и хранение выходных кривых.

Mw пулланов, кДа t, мин1

1.3 29.566

6.0 27.456

12.0 26.389

22.0 25.230

50.0 23.732

110.0 22.097

200.0 20.904

400.0 19.651

800.0 18.448

1 - время удерживания, определенное по положению максимума пика паллулана с соответствующей молекулярной массой.

Фракционирование пектинов. Сульфатированные производные пектинов по 50 мг растворяли в диет, воде (50 мл), полученные растворы последовательно пропускали через мембраны (полисульфон, Millipore, США) с размерами пор, предусмотренными для прохождения молекул с Mw 300 и 100 кДа. Фракции концентрировали и лиофилизовали.

Центрифугирование растворов проводили на центрифуге с охлаждением марки «Sigma 6К15» (Германия) со скоростью 9000- 11000 об./мин. в течение 10-20 мин.

Растворы концентрировали при пониженном давлении на ротационном испарителе марки Heidolph «Laborota 4002 control» и «Laborota 4000-efficient» (Германия) при 40 - 45 °С.

Водные растворы лиофильно сушили на приборе марки «VirTis Sentery» (США).

3.2.2. Аналитические методы

Общее содерэ!сание гликуроновых кислот определяли по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии конц. НгЭСХ} [157] и калибровочному графику, построенному для Э-галактопиранозилуроновой кислоты, фотоколориметрирование проводили при 400 и 450 нм.

Содерэюание сульфатных групп определяли по методу Доджсона и калибровочному графику, построенному для сульфата калия, фотоколориметрирование проводили при 360 нм [82],

Количество метоксшьных групп определяли по ранее описанному методу [160] и калибровочному графику, построенному для метилового спирта, фотоколориметрирование проводили при 412 нм.

Полный кислотный гидролиз. К навеске (З-т-5 мг) исследуемого образца добавляли 1 мл 2 М ТФУ, содержащей в качестве внутреннего стандарта мио-инозит (1.0 мг/мл). Смесь нагревали в течение 5 ч при 100 °С в запаянной ампуле. Избыток кислоты удаляли многократным упариванием с метиловым спиртом. Моносахариды в гидролизате идентифицировали с помощью ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов.

Получение ацетатов полиолов. Использовали метод, описанный ранее [193]. Полученную в результате кислотного гидролиза смесь моносахаридов растворяли в 1 М растворе аммиака (1 мл), добавляли натрия боргидрид (5 мг), восстановление проводили в течение 12 ч при комнатной температуре. Избыток натрия боргидрида разрушали добавлением лед. уксусной кислоты до рН~5. Раствор упаривали, добавляя метиловый спирт до полного удаления воды. Полученную смесь полиолов растворяли в 0.2 мл сухого пиридина, добавляли 0.2 мл уксусного ангидрида, ацетилирование проводили течение 12 ч при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавляли 0.2 мл толуола и упаривали досуха до полного удаления избытка пиридина и уксусного ангидрида. Полученную смесь ацетатов полиолов растворяли в 1.0 мл сухого хлороформа, фильтровали через бумажный фильтр и анализировали ГЖХ.

Растворимость в воде. Образцы пектинов и их сульфатированных производных сушили в пистолете Фишера над Р2О5 при температуре 60 °С до постоянной массы. К навеске обезвоженного образца (50 мг) добавляли диет, воду (0.5 мл) и перемешивали при 25 °С в течение 24 ч. Затем полученную суспензию центрифугировали при 5000 g в течение 15 мин. Супернатант лиофилизовали и сушили в пистолете Фишера до постоянной массы. Осадок растворяли диет, воде, лиофилизовали и сушили в пистолете Фишера до постоянной массы. Значение растворимости выражали мг/мл, искомое значение вычисляли по формуле:

С (мг/мл) = m (с.н.) / V (раств.), где

С (мг/мл) - концентрация растворившегося полисахарида, m (с.н.) — масса супернатанта, V (раств.) - объем раствора.

Измерения вязкости. Реологические характеристики и текучесть водных растворов образцов определяли с помощью ротационного программируемого вискозиметра шпинделя «BROOKFIELD DV-III ULTRA» с SC4-18/13R, для адаптера малых образцов, при температуре 37.0 °С. Образец (60 мг) растворяли в 6 мл диет, воды нагретой до 37.0 °С, заливали в камеру вискозиметра и выдерживали в течение 2 ч при 37.0 °С. Измерения проводили в пределах скорости деформации с"1. Значение неныотоновского индекса (индекс поведения) -пи показатель коэффициента консистенции - Кс рассчитывали из степенного уравнения т = Кс-у". Каждый образец тестировали в трех повторностях при скоростях сдвига до 45 с"1.

3.2.3. Получение галактуронанов из пектина бадана толстолистного Bergenia crassifolia L (ВС)

2 М водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) по 50 мл добавляли к трем навескам пектина бадана толстолистного ВС (по 250 мг). Смеси термостатировали при 100 °С в течение 5 ч, 3 ч и 2 ч, затем центрифугировали в течение 20 мин. при 4 °С и 19000 g. Осадки растворяли в диет, воде, добавляя 2М раствор аммиака до рН~5, растворы диализовали и лиофилизовали. Получили галактуронаны: ВСН, ВСН-1 и ВСН-2 с выходом 77.5 мг, 87.5 мг и 100.0 мг соответственно, характеристика которых представлена в таблице 2.1.

3.2.4. Получение триэтиламмониевой соли пектиновых полисахаридов и галактуронана

Пектины и ВСН растворяли в диет, воде, диализовали против 1 % водного раствора гидрохлорида триэтиламина в течение 24 ч и затем против диет, воды в течение 24 ч. Растворы триэтиламмониевой соли пектинов и галактуронана лиофилизовали и обезвоживали в пистолете Фишера над PiOs при температуре 60 °С до постоянной массы.

3.2.5. Получение монометилсульфата пиридина

Для получения монометилсульфата пиридина [49], к охлажденному абсолютному метиловому спирту (88 мл) при непрерывном перемешивании медленно приливали конц. серную кислоту (48 мл), полученную смесь оставляли на 24 ч при 4 °С. Затем к реакционной смеси добавляли пиридин до рН~7 при температуре 10-И 5 °С и оставляли на 12 ч при 4 °С. Выпавший осадок отделили фильтрованием и промывали пиридином (5 раз по 20 мл). Полученные белые кристаллы монометилсульфата пиридина сушили в пистолете Фишера. Получили монометилсульфат пиридина с выходом 46.6 г.

3.2.6. Сульфатирование галактуронана ВСН

3.2.6.1. Метод I. Сульфатирование галактуронана ВСН монометилсульфатом пиридина

Сульфатирование монометилсульфатом пиридина проводили по ранее описанному методу [49]. Шесть навесок триэтиламмониевой соли ВСН (по 66.0 мг) помещали в конические колбы, доливали ДМФА (по 15 мл), смеси инкубировали при 60 °С в течение 0.5 ч. Затем в колбы добавляли монометилсульфат пиридина (в три по 458.0 мг, в три по 733.0 мг). Реакционные смеси, содержащие различное количество сульфатирующего реагента, инкубировали 0.5 ч, 1.5 ч и 3 ч при 80 °С при пониженном давлении. Затем реакционные смеси охлаждали до 10 °С, добавляя в них лед, нейтрализовали 0.5 М ЫаОН до рН ~ 6ч-7, диализовали против диет, воды и лиофилизовали. В результате получили шесть образцов сульфатированного ВСН с различной степенью замещения, характеристика которых представлена в таблице 2.2.

3.2.6.2. Метод И. Сульфатирование галактуронана ВСН пиридинсульфотриоксидом

Сульфатирование пиридинсульфотриоксидом проводили по ранее описанному методу [10]. Для получения пиридинсульфотриоксида к предварительно охлажденному пиридину (0.40 мл) медленно при постоянном перемешивании приливали конц. хлорсульфоновую кислоту (0.08 мл). Полученную смесь выдерживали при 4 °С в течение 24 ч, получили пиридинсульфотриоксид в виде белых кристаллов, которые растворяли в 1ч-2 мл ДМФА и использовали для сульфатирования галактуронана.

Четыре навески триэтиламмониевой соли ВСН (по 52.3 мг) помещали в конические колбы, доливали ДМФА (по 15 мл), смеси инкубировали при 60 °С в течение 0.5 ч. Затем к каждой смеси добавляли раствор пиридинсульфотриоксид. Сульфатирование проводили в течение 4 ч при разных температурах: 30 °С, 50 °С, 60 °С и 70 °С. Затем реакционные смеси охлаждали до 10 °С, добавляя в них лед, нейтрализовали 0.5 М 1МаОН до рН ~ 6-^7, диализовали против диет, воды и лиофилизовали. В результате получили четыре образца сульфатировапного галактуропана с различной степенью замещения, характеристика которых представлена в таблице 2.3.

3.2.6.3. Метод III. Сульфатирование галактуронана ВСН хлорсульфоновой кислотой

А) Сульфатирование галактуронана ВСН комплексом серный ангидрид-ДМФА. Сульфатирование комплексом серный апгидрид-ДМФА проводили по ранее описанному методу [59]. Для получения £Оз-ДМФА, на водяно-ледной бане (-15 °С) к ДМФА (1 мл) при непрерывном перемешивании медленно приливали хлорсульфоновую кислоту (0.2 мл). Полученную смесь выдерживали при температуре -25 °С в течение 24 ч. Образовавшиеся белые кристаллы ДМФА растворяли в 1-е-2 мл ДМФА и использовали для сульфатирования галактуронана.

Три навески триэтиламмониевой соли ВСН (по 66.0 мг) помещали в конические колбы, доливали ДМФА (по 15 мл), смеси инкубировали при 60 °С в течение 0.5 ч. Затем к ним добавляли раствор сульфатирующего реагента, содержащий 0.43, 1.00 и 1.30ммоль £0.3-ДМФА. Сульфатирование проводили при 25 °С в течении 4 ч. Затем реакционные смеси охлаждали до 10 °С, добавляя в них лед, нейтрализовали 0.5 М N3011 дорН~6-^7, диализовали против диет, воды и лиофилизовали. В результате получили три образца сульфатированного ВСН с различной степенью сульфатирования. Характеристика полученных сульфатированных образцов представлена в таблице 2.4.

Б) Сульфатирование галактуронана ВСН хлорсульфоновон кислотой в присутствии толуолсульфоновой кислоты. Сульфатирование хлорсульфоновой кислотой проводили по ранее описанному методу [71]. Пять навесок триэтиламмониевой соли ВСН (по 66.0 мг) помещали в конические колбы, добавляли ДМФА (по 15 мл) и я-толуолсульфокислоту (по 33 мг), смеси инкубировали при 60 °С в течение 0.5 ч. Затем к ним добавляли различное количество хлорсульфоновой кислоты (0.03 мл, 0.07 мл, в три колбы по 0.09 мл). Три колбы с реакционными смесями, содержащими 0.03 мл, 0.07 мл и 0.09 мл хлорсульфоновой кислоты, инкубировали при 25 °С в течение 1 ч. Две колбы с реакционными смесями, содержащими по 0.09 мл хлорсульфоновой кислоты, инкубировали при 40°С и 60°С в течение 1 ч. По истечении времени сульфатирования все реакционные смеси охлаждали до 10 °С, добавляя лед, нейтрализовали 0.5 М NaOH дорН~6-ь7, диализовали против диет, воды и лиофилизовали. В результате получили шесть образцов сульфатированного ВСН с различной степенью замещения, характеристика которых представлена в таблице 2.5.

3.2.7. Сульфатирование пектиновых полисахаридов

Триэтиламмониевую соль пектина (100 мг) помещали в конические колбы, доливали ДМФА (по 10 мл), смеси инкубировали при 60 °С в течение 0.5 ч. Затем к ним добавляли раствор сульфатирующего реагента, содержащий 1.00, 1.90 и 2.90 ммоль 50з-ДМФА. Реакцию проводили при 25 °С в течение 4 ч. Затем реакционные смеси охлаждали до10°С, добавляя в них лед, и нейтрализовали 0.5 М NaOH до рН ~ 6V7. Растворы диализовали против диет, воды и лиофилизовали.

В результате получили двадцать три образца сульфатированных производных пектинов: на основе пектина бадана - BCS1, BCS2 и BCS3; на основе пектина ряски - LMS1, LMS2 и LMS3, на основе пектина рдеста - PNS1, PNS2 и PNS3; на основе пектина борщевика - IISS1, HSS2 и HSS3; на основе пектина сабельника - CPS1, CPS2 и CPS3; на основе пектина пижмы - TVFS1 и TVFS2; на основе пектина яблок - MDS1, MDS2 и MDS3; на основе пектина слив - PDS1, PDS2 и PDS3. Характеристика полученных сульфатированных производных пектинов представлена в таблицах 2.7 - 2.13.

3.2.8. Фракционирование сульфатнрованных производных пектинов

Образцы (по 50 мг) сульфатнрованных производных BCS1, BCS3, LMS1, LMS3, PNS1, PNS3, HSS1, HSS3, CPS1, CPS3, MDS1, MDS3, PDS1 и PDS3 растворяли в диет, воде (по 50 мл). Полученные растворы последовательно пропускали через мембраны (полисульфон, Millipore, США) с размерами пор для молекул с Mw 300 и 100 кДа. Фракции концентрировали и лиофилизовали. Получили тридцать восемь полисахаридных фракций: с молекулярной массой более 300 кДа - BCS1-1, BCS3-1, LMS1-1, LMS3-1, PNS1-1, PNS3-1, I-ISS1-1, HSS3-1, CPS 1 -1, CPS3-1, MDS1-1, MDS3-1, PDS1-1 и PDS3-1; с молекулярной массой 100^300 кДа - BCS1-2, BCS3-2, LMS1-2, LMS3-2, PNS1-2, PNS3-2, HSS1-2, HSS3-2, CPS 1-2 и CPS3-2; с молекулярной массой менее 100 кДа - BCS1-3, BCS3-3, LMS1-3, LMS3-3, PNS1-3, PNS3-3, 1-ISS1-3, HSS3-3, CPS1-3, CPS3-3, MDS1-3, MDS3-3, PDS1-3 и PDS3-3. Характеристика полученных фракций в представлена в таблицах 2.7 - 2.13.

3.2.9. Определение физиологической активности

Острую токсичность определяли с помощью экспресс-метода Прозоровского при однократном внутрибрюшинном в ведении растворов сульфатнрованных производных пектинов лабораторным мышам [178].

Степень связывание ЛПНП сыворотки крови человека in vitro сульфатнрованных производных пектинов определяли турбидиметрическим методом, используя гепарин в качестве контроля [194]. Каждый образец анализировали в девяти повторности. К 0.025 М раствору СаСЬ (200 мкл) добавляли сыворотку крови человека (20 мкл), смесь перемешивали, определяли оптическое поглощение полученного раствора Л75о(1). Затем к раствору добавляли 0.5 % водный раствор полисахарида, полученную смесь перемешивали 4 мин., и определяли оптическое поглощение раствора А750 (2). Искомое значение определяли по формуле: Л750 =А750(1) -А750(2).

Определение адгезии.

Для оценки клеточной адгезии полисахариды (25 мкл, 300 мкг/мл) добавляли к суспензии перитонеальных лейкоцитов (100 мкл) инкубировали в 96-луночном плоскодонном планшете (Costar) в течение 15 мин. при 37 °С. Для стимуляции клеточной активности использовали форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) (1.625 мкМ). Неадгезированные клетки отмывали после инкубации, трижды промывая планшет с помощью фосфатно-буферного раствора (ФБР) от не прикрепившихся клеток. Количество адгезированных клеток определяли колориметрическим методом [180]. Клеточный монослой фиксировали на пластике 95 % этиловым спиртом по 100 мкл на лунку в течение 30 мин. После фиксации спирт удаляли и планшет высушивали. Клетки заливали краской Романовского-Гимза по 100 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре 30 мин. После окрашивания краску удаляли, а клеточный монослой отмывали трижды физиологическим раствором (pH 7.2V7.4) от не включившегося в клетки красителя. К окрашенным клеткам добавляли по 100 мкл милового спирта. После полного растворения красителя измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 650 нм с помощью спектрофотометра PowerWave 200 (BioTek Instruments, США).

Удельную антитромб иновую (alla) активность определяли по методике [195]. 1 Ед./мг антитромбина (Behring, США-Германия или Sigma, США), содержащегося в 250 мкл буфера 0.05 M трис-НС1, 0.0075 M Ыа2-ЭДТА, 0.175 M NaCl, pH ~ 7.4, инкубировали 3 мин. при 37 °С с образцами пектинов в конечной концентрации 0.01-ь240 мкг/мл. Затем добавляли 100 мкл (2 NIH Ед./мг) раствора бычьего тромбина (Behring, Sigma) в 2 мМ буфере трис-ЭДТА. Через 30 сек. добавляли 200 мкл раствора хромогенного субстрата для тромбина S-2238 (Behring или Sigma) в 2 мМ буфере трис-ЭДТА. Об активности исследуемого сульфатированного пектина судили по изменению оптической плотности раствора при 405 нм в течение 1 мин. Для оценки активности строили калибровочную зависимость, используя в качестве стандарта 5-ый Международный стандарт нефракционированного гепарина (НФГ).

Влияние на общий путь свертывания кропи определяли по тромбиновому времени (ТВ) [196]. К растворам сульфатированных производных пектинов (0.02-J-31.00 мкг/мл) добавляли плазму крови человека (НПО «Ренам») (0.1 мл), раствор тромбина (НПО «Ренам») (0.1 мл) и фиксировали время появления сгустка на фибринтаймере (Dade Behring, США-Германия).

Влияние на внешний путь свертывания крови оценивали по протромбиновому времени (ПВ) [197]. К растворам сульфатированных производных пектинов и нефракционированного гепарина (0.001-f0.630 мкг/мл) добавляли раствор плазмы крови человека (НПО «Ренам») (0.1 мл) и инкубировали в течение 1 мин. при 37 °С. Затем к полученному раствору добавляли раствор Са-тромбопластина (НПО «Ренам») (0.2 мл) и фиксировали время появления сгустка на фибринтаймере (Dade Behring).

Определение анти-фактор Ха активности (аХа) проводили по методике [84]. К 250 мкл 0.05 М буфера Трис-ЭДТА, 0.0075 М Ыа2-ЭДТА и 0.175 М NaCl, рН~8.4, содержащего 1 Ед./мл антитромбина (Behring; Trinity Biotech, Ирландия) и пектинов в конечной концентрации 0.014-1000 мкг/мл добавляли 250 мкл смеси 8 Ед./мл фактора Ха (Behring, Trinity Biotech) с 0.02 мг/мл декстрансульфата (Behring, Trinity Biotech) в буфере трис-ЭДТА инкубировали 3 мин. при 37 °С. Затем определяли остаточную активность фактора Ха, добавляя 50 мкл хромогенного субстрата-S 2222 (Behring, Trinity Biotech). Активность определяли по изменению оптической плотности раствора при длине волны 405 нм. Для калибровочной кривой использовали 5-ый Международный стандарт НФГ.

Определение ашпшпромбиновой (alla) активности с использованием теста активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) осуществляли по методу [198]. К растворам сульфатированных производных пектинов (0.0001-Н000 мкг/мл) добавляли плазму крови человека (НПО «Ренам») (0.1 мл) и раствор эллаговой кислоты (Trinity Biotech, НПО «Ренам») с фосфолипидами (0.1мл). Полученную смесь и инкубировали при 37 °С в течение 3 мин и затем добавляли 0.025 M раствор СаСЬ (0.1мл). Время появления сгустка фиксировали на фибринтаймере (Dade Behring). Для расчета alla активности использовали калибровочные кривые 5-го Международного стандарта НФГ.

Определение аХа активности по ингибированию фибрипогенсвертывающей активности фактора Ха [199]. К растворам сульфатированных производных пектинов (0.01ч-10000 мкг/мл) добавляли плазму крови человека (НПО «Ренам») (0.1 мл), инкубировали 1 мин. при 37 °С, добавляли смесь фосфолипидов с фактором Ха (Trinity Biotech, НПО «Ренам») (0.05 мл) и инкубировали 3 мин. при 37 °С. К полученному раствору добавляли 0.035 M раствор СаСЬ (0.05 мл). Время свертывания плазмы крови фиксировали на коагулометре. Для расчета аХа активности использовали калибровочные кривые 1-го Международного стандарта низкомолекулярного гепарина или 5-го Международного стандарта НФГ.

3.2.10. Статистический анализ

При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднеквадратичное отклонение. Достоверность оценивали по ¿-критерию Стыодента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Витязев, Фёдор Васильевич, 2013 год

Список литературы

1. Попов С.В. Иммуномодулирующее действие пектиновых полисахаридов. Автореф. дисс. ... д-ра. биолог. Сыктывкар, 2010. -40 с.

2. Toida Т., Chaidedgumjorn A., Linhardt R.J. Structure and Bioactivity of Sulfated Polysaccharides // Trends Glycosci. Glycotech. 2003. Vol. 15 (81). P. 29-46.

3. Пектиновые вещества растений европейского Севера России / Ю.С. Оводов, В.В. Головченко, Е.А. Гюнтер, С.В. Попов - Екатеринбург: УрО РАН, 2009.- 112 с.

4. Hirsh J., O'Donnell М., Weitz J.I. New anticoagulants // Blood. 2005. Vol. 105. P. 453-463.

5. Coombe D.R., Kett W.C. Heparan sulfate-protein interactions: therapeutic potential through structure-function insights // Cell. Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 410-424.

6. Hirsh J., Raschke R. Heparin and low-molecular-weight heparin: the Seventh ACCP Conference on Antithrombotic and Thrombolytic Therapy // Chest. 2004. Vol. 126. P. 188S-203S.

7. Díaz-Nido J., Wandosell F., Avila J. Glycosaminoglycans and beta-amyloid, prion and tau peptides in neurodegenerative diseases // Peptides. 2002. Vol. 23. P. 1323-1332.

8. Wang Z.M., Li L., Zheng B.S., Normakhamatov N., GuoS.Y. Preparation and anticoagulation activity of sodium cellulose sulfate // Int. J. Biol. Macromol. 2007. Vol.41 (2). P. 376-382.

9. Huynh R., Chaubet F., Jozefonvicz J. Anticoagulant properties of dextranmethylcarboxylate benzylamide sulfate (DMCBSu); a new generation of bioactive functionalized dextran // Carbohydr. Res. 2001. Vol. 332. P. 75-83.

10. Mahner C., Lechner M. D., Nordmeier E. Synthesis and characterization of dextran and pullulan sulphate // Carbohydr. Res. 2001. Vol. 331. P. 203-208.

11. Химия углеводов / H.K. Кочетков, А.Ф. Бочков, Б.А.Дмитриев, А.И. Усов, О.С. Чижов, В.Н. Шибаев - М.: Химия, 1967. - 672 с.

12. Оводов Ю.С. Избранные главы биоорганической химии. Сыктывкар: Сыктывкарский ун-т, 1998. - 222 с.

13. Suzuki A., Toyoda Н., Toida Т., Imanari Т. Preparation and inhibitory activity on hyaluronidase of fully O-sulfated hyaluro-oligosaccharides // Glycobiol. 2001. Vol. 11 (1). P. 57-64.

14. Beeson J.G., Chai W., Rogerson S.J., Lawson A.M., Brown G.V. Inhibition of binding of malaria-infected erythrocytes by a tetradecasaccharide fraction from chondroitin sulfate A // Infect. Immun. 1998. Vol. 66 (7). P. 3397-3402.

15. Linhardt R.J. Hileman R.E. Dermatan sulfate as a potential therapeutic agent // Gen Pharmac. 1995. Vol. 26. P. 443-451.

16. Lever R., Page C.P. Novel drug opportunities for heparin // Nat. Rev. Drug Discovery. 2002. Vol. 1. P. 140-148.

17. Casu B. Structure and biological activity of heparin //Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1985. Vol. 43. P. 51-134.

18. Крылов В.Б., Устюжанина H.E., Нифантьев Н.Э. Синтез низкомолекулярных углеводных миметиков гепарина // Биоорган, химия. 2011. Т. 37, № 6. С. 745-779.

19. Casu В., Oreste P., Torri G., Zoppetti G., Choay J., Lormeau J.C., Petitou M., Sinay P. The structure of heparin oligosaccharide fragments with high anti-(factor Xa) activity containing the minimal antithrombin // Biochem. J. 1981. Vol. 197. P. 599-609.

20. Van Boeckel C.A.A., Petitou M. The unique antithrombin III binding domain of heparin: A lead to new synthetic antithrombotics // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993. Vol. 32(1). P. 1671-1690.

21. Lindahl U., Backstrom G., Thunberg L. The Antithrombin-binding Sequence in Heparin // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 9826-9830.

22. Villanueva G.B. Predictions of the Secondary Structuroef Antithrombin III and the Location of the Heparin-binding Site // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 2531-2536.

23. Greinacher A., Alban S., Omer-Adam M.A., Weitschies W., Warkentin Т.Е. Heparin-induced thrombocytopenia: a stoichiometry-based model to explain the differing immunogenicities of unfractionated heparin, low-molecular-weight heparin, and fondaparinux in different clinical settings // Thromb. Res. 2008. Vol. 122. P. 211-220.

24. Horlick L., Duff G.L. Heparin in experimental cholesterol atherosclerosis in the rabbit. I. The effect of heparin on the serum lipids, and development of atherosclerosis // AMA Arch Pathol. 1954. Vol. 57. P. 417-424.

25. Essien E.M., Kinlough-Rathbone R., Moore S., Fraser Mustard J. Proceedings: The role of heparin on the inhibition of platelet adhesion to damaged arterial endothelial surface // Thromb. Diath Haemorrh. 1975. Vol. 34. P. 600-608.

26. Synytsya A., Kim W.-J., Kim S.-M., Pohl R., Synytsya A., Kvasnicka F., Copikova J., Park Y. Structure and antitumour activity of fucoidan isolated from sporophyll of Korean brown seaweed Undaria pinnatifida // Carbohydr. Polym. 2010. Vol. 81. P. 41-48.

27. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Ermakova S.P., Vishchuk O.S., Nazarenko E.L., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Anticancer activity in vitro of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens and its low-molecular fragments, structurally characterized by tandem mass-spectrometry // Carbohydr. Res. 2012. Vol. 87. P. 186-194.

28. Кусайкин М.И., Буряцева Ю.В., Светашева Т.Г., Сова В.В., Звагинцева Т.Н. Распространение О-гликозилгидрилаз в морских беспозвоночных. Ферменты морского моллюска Littorina kurila, катализирующие транформацию фукоидан. // Биохимия. 2003. Т. 68, № 3. С. 384-392.

29. Swarte V.V., Joziasse D.H., Mebius R.E., Eijnden D.H., Kraal G. L-selectin-mediated lymphocyte aggregation: role of carbohydrates, activation and effects on cellular interactions // Cell Adhes Commun. 1998. Vol. 6 (4). P. 311-322.

30. Крылов В.Б. Синтез сполна сульфатированных олигосахаридов, родственных природным полисахаридам фукоиданам. Автореф. дисс. ... канд. хим. Москва, 2010. -26 с.

31. Усов А.И., Билан М.И. Фукоиданы - сульфатированные полисахариды бурых водорослей // Успехи химии. 2009. Т. 78, № 8. С. 846-862.

32. Haug A., Larsen В. Phenolic compounds in brown algae I. The presence of reducing compounds in Ascophyllum Nodosum (L.) Le Jol // Acta Chem. Scand. 1958. Vol. 12(4). P. 650-657.

33. Percival E., McDowell R.H. Food Storace polysaccharides of the Phaeophyceae and Crysophyceae // Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides / Ed. Percival E., McDowell R.H. - New York: Academic Press., 1967.-P. 53-71.

34. Оводов Ю.С., Хоменко В.А. Общая характеристика полисахаридов бурых водорослей//Химия природ, соедин. 1969. С. 73-76.

35. Усов А. Полисахариды красных морских водорослей // Прогресс химии углеводов / Под ред. И.В. Торгов - М.: Наука, 1985. - С. 77-96.

36. Knutsen S.H., Myslabodski D.E., Larsen В., Usov A.I. A modified system of nomenclature for red algal galactans // Bot. Mar. 1994. Vol. 37 (2). P. 163-169.

37. Usov A.I. Sulfated polysaccharides of the red seaweeds // Fd Hydrocoll. 1992. Vol. 6(1). P. 9-23.

38. Usov A.I. Structural analysis of red seaweed galactans of agar and carrageenan groups // Fd Hydrocoll. 1998. Vol. 12 (3). P. 301-308.

39. Усов А.И. Проблемы и достижения в структурном анализе сульфатированных полисахаридов красных водорослей // Химия раст. сырья. 2001. №2. С. 7-20.

40. Selby Н.Н., Whistler R.L. Agar // Industrial gums: Polysaccharides and their derivatives. 1993. P. 87-103.

41. Therkelsen G.H. Carrageenan // Industrial gums: Polysaccharides and their derivatives. 1993. P. 145-180.

42. Rees D.A. Structure, conformation, and mechanism in the formation of polysaccharide gels and networks // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1969. Vol. 24. P. 267-332.

43. Ермак И.М. Хотимченко Ю.С. Физико-химические свойства, применение и биологическая активность каррагинана - полисахарида красных водорослей //Биология Моря. 1997. Т. 23, № 3. С. 129-142.

44. Toskas G., ITund R-D., Laourine E., Cherif С., Smyrniotopoulos V., Roussis V. Nanofibers based on polysaccharides from the green seaweed Ulva Rigida II Carbohydr. Polym. 2011. Vol. 84. P. 1093-1102.

45. Paulert R., Talamini V., Cassolato J.E.F., Duarte M.E.R., Noseda M.D., Smania Jr.A., Stadnik M.J. Effects of sulfated polysaccharide and alcoholic extracts from green seaweed Ulva fasciata on anthracnose severity and growth of common bean (Phaseolus vulgaris L.) // Journal of Plant Diseases and Protection. 2009. Vol. 116(6). P. 263-270.

46. Groth Т., Wagenknecht W. Anticoagulant potential of regioselective derivatized cellulose //Biomaterials. 2001. Vol. 22. P. 2719-2729.

47. Mihai D., Mocanu G., Carpov A. Chemical reactions on polysaccharides: I. Pullulan sulfation // Eur. Polym. J. 2001. Vol. 37 (3). P. 541-546.

48. Alban S., Franz G. Characterization of the Anticoagulant Actions of a Semisynthetic Curdlan Sulfate // Thromb. Res. 2000. Vol. 99. P. 377-388.

49. Takano R., Nagai Т., Wu X., Xu X., Tien H.N., Kamei К, Hara S. Sulfation of polysaccharides using monomethyl sulfate // J. Carbohydr. Chem. 2000. Vol. 19 (9). P. 1185-1190.

50. Dace R., McBride R., Brooks K., Gander J., Buszko M., Doctor K.M. Comparison of the anticoagulantaction of sulfated and phosphorylated polysaccharides//Thromb. Res. 1997. Vol. 87 (1). P. 113-121.

51. Geresh S., Mamontov A., Weinstein J. Sulfation of extra-cellular polysaccharides of red microalgae: Preparation, charac-terization and properties // J. Biochem. Biophis. Methods. 2002. Vol. 50 (1). P. 179-187.

52. Yoon S.J., Pyun Y.R., Hwang J.K., Mourao P.A. A sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity // Carbohydr. Res. 2007. Vol. 342. P. 2326-2330.

53. Alban S., Kraus J., Franz G.G. Synthesis of laminarin sulfates with anticoagulant activity // Arzneimittel forschung. 1992. Vol. 42 (8). P. 1005-1008.

54. Zhao X., Yu G., Guan II., Yue N., Zang Z., Li H. Preparation of low-molecular-weight polyguluronate sulfate and its anticoagulant and anti-in Xammatory activities // Carbohydr. Polym. 2007. Vol. 69 (3). P. 272-279.

55. Lin C.Z., Guan H.S., Li H.H., Yu G.L., Gu C.H., Li G.Q. The influence of molecular mass of sulfated propylene glycol ester of low-molecular-weight alginate on anticoagulant activities // Eur. Polym. J. 2007. Vol. 43 (7). P. 3009-3015.

56. Fan L., Jiang L., Xu Y., Zhou Y., Shen Y., Xie W., Long Z., Zhou J. Synthesis and anticoagulant activity of sodium alginate sulfates // Carbohydr. Polym. 2011. Vol. 83. P. 1797-1803.

57. Jayakumar R., Nwe N., Tokura S., Tamura H. Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials // Int. J. Biol. Macromol. 2007. Vol. 40 (1). P. 175-181.

58. Zou Y., Khor E. Preparation of sulfated-chitins under homogeneous conditions // Carbohydr. Polym. 2009. Vol. 77 (3). P. 516-525.

59. Huang R., Du Y., Yang J., Fan L. Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate // Carbohydr. Res. 2003. Vol. 338. P. 483-489.

60. Vongchan P., Sajomsang W., Subyen D., Kongtawelert P. Anticoagulant activity of a sulfated chitosan // Carbohydr. Res. 2002. Vol. 337. P. 1233-1236.

61. Martinichen-Herrero J.C., Carbonero E.R., Sassaki G.L., Gorin P.A., Iacomini M. Anticoagulant and antithrombotic activities of a chemically sulfated galactoglucomannan obtained from the lichen Cladonia ibitipocae // Int. J. Biol. Macromol. 2005. Vol. 35. P. 97-102.

62. Zhang Y., Xie B., Gan X. Advance in the applications of konjac glucomannan and its derivatives // Carbohydr. Polym. 2005. Vol. 60 (1). P. 27-31.

63. Pines L., Gorin P.A., Reicher F., Sierakowski M.R. An active heparinoid obtained by sulphation of a galactomannan extracted from the endosperm of Senna macranthera seeds //Carbohydr. Polym. 2001. Vol. 46 (2). P. 165-169.

64. Ono L., Wollinger W., Rocco I.M., Gorin P.A., Sierakowski M.R. In vitro and in vivo antiviral properties of sulfated galactomannans against yellow fever virus (BeHl 11 strain) and dengue 1 virus (Hawaii strain) // Antiviral Res. 2003. Vol. 60 (3). P. 201-208.

65. Mestechkina N.M., Shcherbukhin V.D., Bannikova G.E., Varlamov V.P., Drozd N.N., Tolstenkov A.S., Makarov V.A., Tikhonov V.E. Anticoagulant Activity of Low-molecular-weight Sulfated Derivatives of Galactomannan From Cyamopsis tetragonoloba (L.) Seeds // Appl. Biochim. Microbiol. 2008. Vol. 44 (1). P. 98-103.

66. Егоров А.В. Изучение структуры замещенных (3-маннанов семян бобовых и синтез их биологически активных сульфатированных производных. Автореф. дисс. ... канд. биолог. Москва, 2004. - 25 с.

67. Yang J., Du Y., Wen Y., Li Т., Ни L. Sulfation of Chinese lacquer polysaccharides in different solvents // Carbohydr. Polym. 2003. Vol. 52(4). P. 397-403.

68. Mestechkina N.M., Egorov A.V., Shcherbukhin V.D. Synthesis of Galactomannan Sulfates //Appl. Biochem. Microbiol. 2006. Vol. 42 (3). P. 368-373.

69. Петропавловский Г.А. Гидрофильные частично замещенные эфиры целлюлозы и их модификация путем химического сшивания. - Л.: Наука, 1988.- 128 с.

70. Роговин З.А.. Химия целлюлозы. - М.: Химия, 1972. - 520 с.

71. Vogt S., Pleinze Т., Rottig К., Klemm D. Preparation of carbomethylcellulose sulfate of high degree of substitution // Carbohydr. Res. 1995. Vol. 266. P. 315-320.

72. Chaidedgumjorn A., Toyoda H., Woo E.R., Lee K.B., Kim Y.S., Toida Т., Imanaria T. Effect of (1-3)- and (l-4)-linkages of ully sulfated polysaccharides on their anticoagulant activity // Carbohydr. Res. 2002. Vol. 337 (10). P. 925-933.

73. Burgermeister J., Paper D.H., Vogl II., Linhardt R.J., Franz G. LaPSvSl, a (l-3)-ß-galactan sulfate and its effect on angiogenesis in vivo and in vitro II Carbohydr. Res. 2002. V. 337 (16). P. 1459-1466.

74. Vikhoreva G., Bannikova G., Stolbushkina P., Panov A., Drozd N., Makarov V., Varlamov V., Gal'braikh L. Preparation and anticoagulant activity of a low-molecular-weight sulfated chitosan // Carbohydr. Polym. 2005. Vol. 62 (4). P. 327-332.

75. Bao X., Duan J., Fang X., Fang J. Chemical modifications of the (l-3)-a-D-glucan from spores of Ganoderma lucidum and investigation of their physicochemical properties and immunological activity // Carbohydr. Res. 2001. Vol. 336(1). P. 127-140.

76. Anderson N.S., Dolan T.C.S., Penman A., Rees D.A., Mueller G.P., Standoff D.J., Stanley N.F. Carrageenans. Part IV. Variations in the structure and gel properties of к-carrageenan, and the characterization of sulphate esters by infrared spectroscopy // J. Chem. Soc. 1968. P. 602-606.

77. Rochas C., Lahaye M., Yaphe W. Sulfate content of carrageenan and agar determined by infrared spectroscopy // Bot. Mar. 1986. Vol. 29 (4). P. 335-340.

78. Местечкина H.M., Щербухин В.Д., Шашков A.C. Структурные особенности полусинтетических сульфатов галактоманнанов // Известия Академии наук. Серия химическая. 2008. № 8. С. 1745-1749.

79. Johnson С. М., Nishita FI. Microestimation of sulhur in plant materials, soils, and irrigation waters // Anal. Chem. 1952. Vol. 24. P. 736-742.

80. Tabatabai M.A. Methods of Measurement of Sulphur in Soils, Plant Materials and Waters: SCOPE 48 Sulphur Cycling on the Continents - Wetlands, Terrestrial Ecosystems, and Associated Water Bodies: URL: http://www.scopenvironment.org/downloadpubs/scope48/index.html (1992)

81. Chesnin L., Yien C.H. Turbidimetric determination of available sulfates // Soil. Sei. Soc. Am. Proc. 1950. Vol. 15. P. 149-151.

82. Dodgson K.S., Price R.G. A Note on the Determination of the Ester Sulhate Content of Sulphated Polysaccharides // Biochem. J. 1962. Vol. 84. P. 106-110.

83. Tabatabai M.A., Dick W.A. Simultaneous determination oh nitrate, chloride, sulfate, and phosphate in natural waters by ion chromatography // J. Environ. Equal. 1983. N 12. P. 209-213.

84. Walenga J., Bara L., Samama M. Amidolytic antifactor Xa assays in the laboratory evaluation of heparin and low molecular weight fractions // Sem. Thromb. Haemost. 1985. Vol. 11. P. 100-107.

85. Pereira M.G., Benevides N.M.B., Melo M.R.S., Valente A.P., Melo F.R., Moura P.A.S. Structure and anticoagulant activity of a sulfated galactan from the redalga, Gelidium crinale. Is there a specific structural requirement for the anticoagulant action? // Carbohydr. Res. 2005. Vol. 340. P. 2015-2023.

86. Maaroufi R.M., Giordano P., Triadou P., Tapon-Bre-taudiere J., Dautzenberg M.D., Fischer A.M. Effect of oversulfated dermatan sulfate derivatives on platelet aggregation // Thromb. Res. 2007. Vol. 120 (4). P. 615-621.

87. Melo F.R., Pereira M.S., Foguel D., Mourao P.A. Antithrombin-mediated Anticoagulant Activity of Sulfated Polysaccharides // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279 (20). P. 20824-20835.

88. Pomin V.I-L, Pereira M.S., Valente A.P., Tollefsen D.M., Pavao M.S.G., Mourao P.A.S. Selective cleavage and anticoagulant activity of a sulfated fucan: stereospecific removal of a 2-sulfate ester from the polysaccharide by mild acid hydrolysis, preparation of oligosaccharides, and heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity // Glycobiol. 2005. Vol. 15 (4). P. 369-381.

89. Zhang H.-J., Mao W.J., Fang F., Li H.Y., Sun H.H., Chen Y, Qi Х.Ы. Chemical characteristics and anticoagulant activities of a sulfated polysaccharide and its fragments from Monostroma latissimum II Carbohydr. Polum. 2008. Vol. 71 (3). P. 428-434.

90. Местечкина H.M., Щербухин В.Д., Банникова Г.Е., Варламов В.П., Дрозд Н.Н., Толстенков А.С., Макаров В.А., Тихонов В.Е. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатнрованных производных галактоманнана семян Cyamopsis tetragonoloba (L) Taub II Прикл. биохим. микробиол. 2008. Т. 44. С. 111-116.

91. Barbucci R., Lamponi S., Magnani A., Renier D. The influence of molecular weight on the biological activity of heparin like sulphated hyaluronic acids // Biomaterials. 1998. Vol. 19. P. 801-809.

92. Martinichen-Herrero J.C., Carbonero E.R., Gorin P.A.J., Iacomini M. Anticoagulant and antithrombotic activity of a sulfate obtained from a glucan component of the lichen Parmotrema mantiqueirense Hale // Carbohydr. Polym. 2005. Vol. 60(1). P. 7-13.

93. Nishino T., Nagumo T. Anticoagulant and antithrombin activities of oversulfated fucans // Carbohydr. Res. 1992. Vol. 229 (2). P. 355-362.

94. Lee K.B., Bae J.H., Kim J.S., Yoo Y.C., Kim B.S., Kwak S.T. Anticoagulant activity of sulfoalkyl derivatives of curdlan // Arch. Pharm. Res. 2001. Vol. 24 (2). P. 109-113.

95. Qiu X., Amarasekara A., Doctor V. Effect of oversulfation on the chemical and biological properties of fucoidan // Carbohydr. Polym. 2006. Vol. 63 (2). P. 224-228.

96. Franz G., Alban S. Structure activity relationship of antithrombotic polysaccharide derivatives // Int. J. Biol. Macromol. 1995. Vol. 17 (6). P. 311-314.

97. Chevolot L., Foucault A., Chaubet F., Kervarec N., Sinquin C., Fisher A.M., Boisson-Vidal C. Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity // Carbohydr. Res. 1999. Vol. 319. P. 154-165.

98. Pereira M.S., Meló F.R., Mourao P.A.S. Is there a correlation between structure and anticoagulant action of sulfated galactans and sulfated fucans? //Glycobiol. 2002. Vol. 12. P. 573-580.

99. Mulloy B., Mourao P.A.S., Gray E.J. Structure/function studies of anticoagulant sulphated polysaccharides using NMR // J. of Biotechnology 2000. Vol. 77(1). P. 123-135.

100. Vicente C.R., Zancan H., Peixoto L.L., Alves-Sa R., Araujo F.S., Mourao P.A., Pavao M.S. Unbalanced effects of dermatan sulfates with different sulfation patterns on coagulation, thrombosis and bleeding // Tromb. Haemost. 2001. Vol. 86 (5). P. 1215-1220.

101. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. С. 483-501.

102. Popov S.V., Popova G.Yu., Koval О.A., Paderin N.M., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Preventive anti-inflammatory effect of potamogetonan, pectin of common pondweed Potamogeton natans L. // Phytotherapy Res. 2007. Vol. 21. P. 609-614.

103. Popov S.V., Popova G.Yu., Nikolaeva S.Yu., Golovchenko V.V., Ovodova R.G. Immunostimulaing activity of pectic polysaccharide from Bergenia crasifilia L. // Phytother. Res. 2005. Vol. 19. P. 1052-1056.

104. Оводова Р.Г., Головченко B.B., Шашков A.C., Попов С.В., Оводов Ю.С. Структурное исследование и физиологическая активность лемнана, пектина из Lemna minor L // Биоорган, химия. 2000. Т. 26, № 10. С. 743-751.

105. Ovodov Yu.S. Structural chemistry of plant glycuronoglycans // Pure Appl. Chem. 1975. Vol. 42. P. 351-365.

106. Coenen G.J., Bakx E.J., Verhoef R.P., Schols H.A., Voragen A.G.J. Identification of the connecting linkage between homo- or xylogalacturonan and rhamnogalacturonan type I // Carbohydr. Polym. 2007. Vol. 70. P. 224-235.

107. Caffall K.H., Mohnen D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides // Carbohydr. Res. 2009. Vol. 344. P. 1879-1900.

108. Оводов Ю.С. Современные представления о пектиновых веществах // Биоорган, химия. 2009. Т. 35, № 3. С. 293-310.

109. Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Шашков А.С., Оводов Ю.С. Выделение и предварительное исследование строения полисахаридов из смолевки обыкновенной Silene vulgaris II Биоорган, химия. 2000. Т. 26, № 2. С. 686-692.

110. Aspinall G.O., Fanous Н.К. Structural investigations on non-starchy polysaccharides of apples // Carbohydr. Polym. 1984. Vol. 4. P. 193-214.

111. McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. Structure of plant cell walls: X. Rhamnogalacturonan-I, a structurally complex pectic polysaccharide in the walls of suspension-cultured sycamore cells //Plant Physiol. 1980. Vol. 66. P. 1128-1134.

112. Powell D.A., Morris E.P., Gidley M.J. Conformations and interactions of pectins. II. Influences of residue sequence on chain association in calcium pectate gels//J. Mol. Biol. 1982. Vol. 155. P. 517-531.

113. Thibault J.F., Renard C.M.G.C., Axelos M.A.V., Roger P., Crepeau M.J. Studies of the length of homogalacturonic regions in pectins by acid hydrolysis // Carbohydr. Res. 1993. Vol. 238. P. 271-286.

114. O'Neill M.A., Albersheim P., Darvill A.G. The pectic polysaccharides of primary cell walls // Methods in plant biochemistry. Carbohydrates / Ed. P.M. Dey- London: Acad. Press., 1990. Vol. 2. P. 415-444.

115. Kiyohara H., Yamada IT. Characterisation of methyl-ester distributions in galacturonan regions of complement activating pectins from the roots of Angelica acutiloba ICitagawa // Carbohydr. Polym. 1994. Vol. 25. P. 117-122.

116. Grasdalen H., Вакоу O.E., Larsen B. Determination of the degree of esterification and the distribution of methylated and free carboxyl groups in pectins by 1H-NMR spectroscopy // Carbohydr. Res. 1988. Vol. 184. P. 183-191.

117. Ishii T. O-acetylated oligosaccharides from pectins of potato tuber cell walls // Plant Physiol. 1997. Vol. 113. P. 1265-1272.

118. Золотарева A.M., Чиркина Т.Ф., Цыбикова Д.Ц., Бабуева Ц.М. Исследование функциональных свойств облепихового пектина // Химия раст. сырья. 1998. № 1.С. 29-32.

119. Донченко J1.B. Технология пектина и пектинопродуктов. - М.: ДеЛи, 2000.-256 с.

120. Voragen A.G.J., Coenen G.J., Verhoef R.P., Schols IT.A. Pectin, a versatile polysaccharide present in plant cell walls // Struct. Chem. 2009. Vol. 20. P. 263-275.

121. An J., O'Neill M.A., Darvill A.G., Albersheim P. Isolation and structural characterization of P-D-glucosyluronic acid and 4-O-methyl p-D-glucosyluronic acid-containing oligosaccharides from the cell-wall pectic polysaccharide, rhamnogalacturonan I // Carbohydr. Res. 1994. Vol. 252. P. 235-243.

122. Bushneva O.A., Ovodova R.G., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. Structural studies on hairy regions of pectic polysaccharide from campion Silene vulgaris (iOberna behen L.) // Carbohydr. Polym. 2002. Vol. 49. P. 471-478.

123. Polle A.Ya., Ovodova R.G., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. Some structural features of pectic polysaccharide from tansy, Tanacetum vulgare L. // Carbohydr. Polym. 2002. Vol. 49. P. 337-344.

124. Lau J.M., McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. Structure of the backbone of rhamnogalacturonan I, a pectic polysaccharide in the primary cell walls of plants // Carbohydr. Res. 1985. Vol. 137. P. 111-125.

125. Cui W., Eskin M.N.A., Biliaderis C.G., Marat K. NMR characterization of a 4-O-methyl-P-D-glucuronic acid-containing rhamnogalacturonan from yellow mustard (Sinapis alba L.) mucilage // Carbohydr. Res. 1996. Vol. 292. P. 173-183.

126. O'Neill M.A., Ishii T., Albersheim P., Darvill A.G. Rhamnogalacturonan II: structure and function of a borate cross-linked cell wall pectic polysaccharide // Annu. Rev. Plant. Biol. 2004. Vol. 55. P. 109-139.

127. Matsunaga T., Ishi T., Matsumoto S., Higuchi M., Darvill A., Albersheim P., O'Neill M.A. Occurrence of the primary cell wall polysaccharide rhamnogalacturonan II in Pteridophytes, lyophytes, and bryophytes. Implications for the evolution of vascular plants // Plant Physiol. 2004. Vol. 134. P. 339-351

128. Vidal S., Doco T., Williams P, Pellerin P, York W.S., O'Neill M.A., GlushkaJ., Darvill A.G., Albersheim P. Structural characterization of the pectic polysaccharide rhamnogalacturonan II: Evidence for the backbone location of the aceric acid containing oligoglycosyl side-chain // Carbohydr. Res. 2000. Vol. 326. P. 277-294.

129. Spellman M.W., McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P., Henrick K. Isolation and characterization of 3-C-carboxy-5-deoxy-L-xylose, a naturally occurring, branched-chain, acidic monosaccharide // Carbohydr. Res. 1983. Vol. 122. P. 115-129.

130. York W.S., Darvill A.G., McNeil M., Albersheim P. 3-deoxy-D-wa/7/?o-2-octulosonic acid (KDO) is a component of rhamnogalacturonan II, a pectic

polysaccharide in the primary cell walls of plants // Carbohydr. Res. 1985. Vol. 138. P. 109-126.

131. Strasser G.R., Amado R. Pectic substances from red beet {Beta vulgaris L. var. conditiva). Part II. Structural characterization of rhamnogalacturonan II // Carbohydr. Polym. 2002. Vol. 48. P. 263-269.

132. Schols H.A., Bakx E.J., Schipper D., Voragen A.G.J. A xylogalacturonan subunit present in the modified hairy regions of apple pectin // Carbohydr. Res. 1995. Vol. 279. P. 265-279.

133. Oosterveld A., Beldman G., Schols H.A., Voragen A.G.J. Arabinose and ferulic acid rich pectic polysaccharides extracted from sugar beet pulp // Carbohydr. Res. 1996. Vol. 288. P. 143-153.

134. Wu H., Dwyer K.M., Fan Z., Shircore A., Fan J., Dwyer J.H. Dietary fiber and progression of atherosclerosis: the Los Angeles atherosclerosis study // Am. J. Clin. Nutr. 2003. Vol. 78. P. 1085-1091

135. Cipriani T.R., Mellinger C.G., Bertolini M.L.C., Baggio C.H., Freitas C.S., Marques M.C.A., Gorin P.A.J., Sassaki G.L., Iacomini M. Gastroprotective effect of a type I arabinogalactan from soybean meal // Food Chem. 2009. Vol. 115. P. 687-690.

136. Hamauzu Y., Irie M., Kondo M., Fujita T. Antiulcerative properties of crude polyphenols and juice of apple, and Chinese quince extracts // Food Chem. 2008. Vol. 108. P. 488-495.

137. Khotimchenko M.Yu., Kolenchenko E.A., Khotimchenko Yu.S. Zinc-binding activity of different pectin compounds in aqueous solutions // J. Coll. Interface Sci. 2008. Vol. 323. P.216-222.

138. Khotimchenko M.Yu., Kolenchenko E.A., Khotimchenko Yu.S., Khozhaenko E.V., Kovalev V.V. Cerium binding activity of different pectin compounds in aqueous solutions // Coll. Surf. B: Biointerfaces. 2010. Vol. 77. P. 104-110.

139. Han S.B., Lee C.W., Kang M.R., Yoon Y.D., Kang J.S., Lee K.H., Yoon W.K., Lee K., Park S.K., Kim H.M. Pectic polysaccharide isolated from Angelica gigas

Nakai inhibits melanoma cell metastasis and growth by directly preventing cell adhesion and activating host immune functions // Cancer Lett. 2006. Vol. 243. P. 264-273.

140. Licht T.R., Hansen M., Bergstrom A., Poulsen M., Krath B.N., Markowski J., Dragsted L.O., Wilcks A. Effects of apples and specific apple components on the cecal enviroment of conventional rats: role of apple pectin // BMC Microbiol. 2010. Vol. 10. P. 13-24.

141. Хотимченко Ю.С., Одинцова M.B., Ковалев B.B. Полисорбовит. - Томск: Изд-воНТЛ, 2001.- 132 с.

142. Tsai А.С., Elias J., Kelley J.J., Lin R.S., Robson J.R. Influence of certain fibers on serum and tissue cholesterol levels in rats // J. Nutr. 1976. Vol. 106. P. 118-123.

143. Kelley J.J., Tsai A.C. Effect of pectin, gum arabic and agar on cholesterol absorption, synthesis, and turnover in rats // J. Nutr. 1978. Vol. 108. P. 630-639.

144. Leveille G.A., Sauberlich H.E. Mechanism of the cholesterol-depressing effect of pectin in the cholesterol-fed rat // J. Nutr. 1966. Vol. 88. P. 209-214.

145. Rolandelli R.IT., Koruda M.J., Settle R.G., Leskiw M.J., Stein T.P., Rombeau J.L. The effect of pectin on hepatic lipogenesis in the enterally-fed rat // J. Nutr. 1989. Vol. 119. P. 89-93.

146. Kritchevsky D., Story J.A. Fiber, hypocholesteremia, and atherosclerosis // Lipids. 1978. Vol. 13. P. 366-369.

147. Choi Y., Cho S.H., Kim H.J., Lee H.J. Effects of soluble fibers on lipid metabolism and activities of intestinal disaccharidases in rats // J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 1998. Vol. 44. P. 591-600.

148. Местечкина H.M., Щербухин В.Д. Сульфаты полисахаридов и их антикоагулянтная активность // Прикл. биохим. микробиол. 2010. Т. 46, № 3. С. 291-298.

149. Becker C.F., Guimaraes J.A., Mourao P.A.S., Verli H. Conformation of sulfated galactan and sulfated iucan in aqueous solutions: implications to their anticoagulant activities // J. Mol. Graph. Model. 2007. Vol. 26 (1). P. 391-399.

150. Nader H.B., Lopes C.C., Rocha H.A.O., Santos E.A., Dietrich C.P. Heparins and heparinoids: occurrence, structure, and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic effect activities // Curr Pharm Des. 2004. Vol. 10. P. 951-966.

151. Golovchenko V.V., Ovodova R.G., Shashkov A.S., Ovodov Y.S. Structural studies of the pectic polysaccharide from duckweed Lemna minor L. // Phytochemistry. 2002. Vol. 60. P. 89-97.

152. Головченко B.B., Бушнева О.А., Оводова Р.Г., Шашков А.С., Чижов А.О., Оводов Ю.С. Структурное исследование бергенана, пектина из бадана толстолистного Bergenia crassifolia II Биоорган, химия. 2007. Т. 33. С. 54-63.

153. Полле А.Я., Оводова Р.Г., Шашков А.С., Оводов Ю.С. Выделение и общая характеристика полисахаридов пижмы обыкновенной // Биоорган, химия. 2001. Т. 27, № 1.С. 52-56.

154. Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Шашков А.С., Чижов А.О., Оводов Ю.С. Структурное изучение пектина сабельника болотного Comarum painstre L // Биохимия. 2005. Т. 70, № 8. С. 1051-1062.

155. Пат. 2176515 Российская Федерация. Способ получения из растительного сырья суммы полисахаридов / Полле А.Я., Оводова Р.Г., Оводов Ю.С. заявитель и патентообладатель Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН.-№200121307/14; заявл. 08.08.2000; 10.12.2001.

156. Hirst E.L., Jones J.K.N. The chemistry of pectic materials //Adv. Carbohydr. Chem. 1946. Vol. 2. P.235-247.

157. Usov A.I., Bilan M.I., Klochkova N.G. Polysaccharides of algae. 48. Polysaccharide composition of several calcareous red algae: isolation of alginate from Corallina pilulitara // Bot. Marina. 1995. Vol. 38. P. 43-51.

158. Odonmazig P., Badga D., Ebringerova A., Alfoldi J. Structures of pectic polysaccharides isolated from the Siberian apricot Armeniaca siberica L. // Carbohydr. Res. 1992. Vol. 226. P. 353-358.

159. Catoire L., Goldberg R., Pierron M., Morvan C., Herve du Penhoat C. An efficient procedure for studying pectin structure which combines limited depolymerization and 13C NMR// Eur. Biophys. J. 1998. Vol. 27. P. 127-136.

160. Wood P.J., Siddiqui I.R. Determination of methanol and its application to measurement of pectin ester content and pectin methyl esterase activity // Analyt. Biochem. 1971. Vol. 39. P. 418-428.

161. Местечкина H.M., Егоров A.B., Щербухин В.Д. Синтез сульфатов галактоманнанов //Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42, № 3. С. 368-373.

162. Vogl Н., Paper D.H., Franz G. Preparation of a sulfated linear (l-4)-(3-D-galactan with variable degrees of sulfation // Carbohydr. Polym. 2000. Vol. 41. P. 185-190.

163. Sun Z., He Yu., Liang Z., Zhou W., Niu T. Sulfation of (l-3)-(3-D-glucan from the fruiting bodies of Russula virescens and antitumor activities of the modifiers // Carbohydrate Polymers. 2009. Vol. 77. P. 628-633.

164. Wang Y., Zhang L., Li Y., Hou X., Zeng F. Correlation of structure to antitumor activities of five derivatives of a b-glucan from Poria cocos sclerotium // Carbohydr. Res. 2004. Vol. 339. P. 2567-2574.

165. Смит А. Прикладная ИК-спектроскопия. M.: Изд-во Мир, 1982. - 328 с.

166. Zuniga Е.А., Matsuhiro В., Mejias E. Preparation of a low-molecular weight fraction by free radical depolymerization of the sulfated galactan from Schizymenia binderi (Gigartinales, Rhodophyta) and its anticoagulant activity // Carbohydr. Polym. 2006. Vol. 66. P. 208-215.

167. Zhang Y., Lu X., Zhang Y., Qin L., Zhang J. Sulfated modification and immunomodulatory activity of water-soluble polysaccharides derived from fresh Chinese persimmon fruit // Biological Macromolecules. 2010. Vol. 46 (1). P. 67-71.

168. Zhang Y., Lu X., Fu Z., Wang Z., Zhang J. Sulphated modification of a polysaccharide obtained from fresh persimmon (Diospyros kaki L.) fruit and antioxidant activities of the sulphated derivatives // Food Chem. 2011. Vol. 127 (3). P. 1084-1090.

169. Zhang K., Peschel D., Klinger Т., Gebauer K., Groth Т., Fischer S. Synthesis of carboxyl cellulose sulfate with various contents of regioselectively introduced sulfate and carboxyl groups // Carbohydr. Polym. 2010. Vol. 82. P. 92-99.

170. Kaputskii F.N., Torgashov V.I., Yurkshtovich T.L., Golub N.V., Ostrovskaya I.L., Alinovskaya V.A. Sulfation of Polysaccharides with Sodium Pyrosulfate in Dimethyl Sulfoxide // Russian Journal of Applied Chem. 2007 Vol. 80(10). P. 1745-1749.

171. Hartman F.W., Schelling V., Harkins H.N., Brush B. Pectin solution as a blood substitute // Ann. Surg. 1941. Vol. 114 (2). P. 212-224.

172. McClure R.D., Warren K.W., Fallis L.S. Intravenous Pectin Solution in the Prophylaxis and Treatment of Shock// Can Med Assoc J. 1944. Vol. 51. P. 206-210.

173. Ильина И.А. Научные основы технологии модифицированных пектинов. Краснодар.: Изд-во СКЗНИИиВ, 2001. - 312 с.

174. Jung H.Y., Bae I.Y., Lee S., Jung H.G. Effect of the degree of sulfation on the physicochemical and biological properties of Pleurotus eryngii polysaccharides // Fd Iiydrocoll. 2011. Vol. 25. P. 1291-1295.

175. Koumoto K., Umeda M., Numata M., Matsumoto Т., Sakurai K., Kunitake Т., Shinkai S. Low Mw sulfated curdlan with improved water solubility forms macromolecular complexes with polycytidylic acid // Carbohydr. Res. 2004. Vol. 339. P. 161-167.

176. Lin Y., Zhang L., Chen L., Jin Y., Zeng F., Jin J., Wan В., Cheung P.C. Molecular mass and antitumor activities of sulfated derivatives of alpha-glucan from Poria cocos mycelia // Int J Biol Macromol. Vol. 34 (5). P. 289-294.

177. Зостерин / IO.IT. Лоенко, A.A. Артюков, Э.П. Козловская, В.А. Мирошниченко, Г.Б. Еляков - Владивосток: Дальнаука, 1997. -211 с.

178. Прозоровский В., Прозоровская М., Демченко В. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакол. токсил. 1978. № 4. С. 497-502.

179. Кондашевская М.В. Современные представления о роли гепарина в гемостазе и регуляции ферментативной и гормональной активности // Вестник РАМН. 2010. № 7. С. 35-43.

180. Пипегин Б.В., Бутаков А.А., Щельцына Т.Л. Комплекс методов оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток для выяснения

повышенной чувствительности к инфекционным агентам // Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М.: ВНИРО, 1995. Гл. 6. С. 106-162.

181. Попов С.В., Оводова Р.Г., Попова Г.Ю., Никитина И.Р., Оводов Ю.С. Ингибирующее действие пектиновых галактуронанов на адгезию нейтрофилов //Биоорган, химия. 2007. Т. 33, № 1. С. 187-192.

182. Vergara-Jimenez М., Conde К., Erickson S.K., Fernandez M.L. Hypolipidemic mechanisms of pectin and psyllium in guinea pigs fed high fat-sucrose diets: alterations on hepatic cholesterol metabolism // J. Lipid Res. 1998. Vol. 39. P. 1455-1465.

183. Злобин A.A., Оводова P.Г., Попов С.В. Общая химическая характеристика водорастворимых полисахаридов плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa II Химия раст. сырья. 2003. № 2. С. 39-44.

184. Marounek М., Volek Z., Synytsya A., Copikova J. Effect of pectin and amidated pectin on cholesterol homeostasis and cecal metabolism in rats fed a high-cholesterol diet // Physiol Res. 2007. Vol. 56. P. 433-442.

185. Хотимченко M.IO. Гиполипидемическая активность низкоэтерифициро-ванных пектинов при этаноловом поражении печени в эксперименте // Биология моря. 2009. Т. 35, № 4. С. 302-305.

186. Рыженков В.Е., Соловьева М.А., Ремезова О.В., Окуневич И.В. Гиполипидемическое действие сульфатированных полисахаридов // Вопросы мединской химии. 1996. Т. 42. С. 115-119.

187. Yamaguchi F., Shimizu N., Hatanaka С. Preparation and physiological effect of low-molecular-weight pectin // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. Vol. 58. P. 679-682.

188. Yamaguchi F., Uchida S., Watabe S., Kojima H., Shimizu N., Hatanaka C. Relationship between molecular weights of pectin and hypocholesterolemic effects in rats//Biosci. Biotech. Biochem. 1995. Vol. 59. P. 2130-2131.

189. Pengzhan Y., Ning L., Xiguang L., Gefei Z., Quanbin Z., Pengcheng L. Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulphated polysaccharides from Ulvapertusa (Chlorophyta) // Pharmacol. Res. 2003. Vol. 48 (6). P. 543-549.

190. Alban S., Franz G. Anticoagulant activity of P-l,3-glucan sulfates in dependence on their molecular weight // Pure Appl. Chem. 1994. Vol. 66. P. 2403-2406.

191. Pereira M.S., Vilela-Silva A.C.E.S., Valente A.P., Mourao P.A.S. A 2-sulfated, 3-linked a-L-galactan is an anticoagulant polysaccharide // Carbohydr. Res. 2002. Vol. 337. P. 2231-2238.

192. Mao W., Li H., Li Y. Zhang H., Qi X., Sun IT., Chen Y., Guo S. Chemical characteristic and anticoagulant activity of the sulfated polysaccharide isolated from Monostroma latissimum (Chlorophyta) // Int J Biol Macromol. 2009. Vol. 44. P. 70-74.

193. York W.S., Darvill A.G., McNeil M.A., Stevenson T.T., Albersheim P. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components // Meth. Enzymol. 1985. Vol. 118. P. 3-40.

194. Климов A.H., Ловягина Т.Н., Баньковская Э.Б. Турбидиметрический метод определения p-липопротеидов и хиломикронов в сыворотке крови и тканях // Лаб. дело. 1966. Т. 5. С. 276-279.

195. Teien A.N., Lie М. Evaluation of an amidolytic heparin assay method: increased sensitivity by adding purified antithrombin III // Thromb. Res. 1977. Vol. 10. P. 399-410.

196. Teien A.N., Lie M. Heparin assay in plasma: a comparison of five clotting methods // Thromb. Res. 1975.Vol. 7. P. 777-788.

197. Pletcher C., Cunningham M., Nelsestuen G. Kinetic analysis of various heparin fractions and heparin substitutes in the thrombin inhibition reaction // Biochim. Biophys. Acta. 1985. Vol. 838. P. 106-113.

198. Coyne E. Heparin past, present and future // Chemistry and biology of heparin / Eds. R.L. Lindblad, W.V. Brown, K.G. Mann, H.R. Roberts - New-York: Elsevier/North-IToIland, 1981.-P. 9-17.

199. Yin E.T., Wessler S., Butler J.V. Plasma heparin: a unique, practical, submicrogram-sensitive assay //J. Lab. Clin. Med. 1973. Vol. 81. P. 298-310.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю к.х.н., доценту Головченко В.В. и академику Оводову Ю.С. за ценные советы и консультации, к.х.н., доценту Патовой O.A., к.х.н., ст.н.с. Оводовой Р.Г., д.б.н., доценту Попову C.B. и всем сотрудникам Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии. Особую признательность автор выражает сотрудникам Института органической химии им. Н.Д. Зелинского: д.х.н., профессору Шашкову A.C. за исследование образцов методом ЯМР-спектроскопии и помощь в интерпретации полученных спектров, к.х.н. Билан М.И. за подготовку образцов для анализа методом спектроскопии ЯМР. Автор благодарит научного сотрудника Института химии Коми научного центра УрО РАН Ипатову Е.У. за исследование образцов методом ИК-спектроскопии, сотрудника Гематологического научного центра РАМН ГНЦ РАМН д.м.н. Дрозд H.H. за помощь в исследовании антикоагулянтной активности образцов.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом НИР Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра УрО РАН на 2009-2012 гг. и поддержана грантами РФФИ № 09-04-00017-а, № 11-04-12110-офи м-2011; Программой ведущих научных школ № НШ-2383.2008.4; Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»; Интеграционным проектом фундаментальных научных исследований УрО и СО РАН.