Структурный полиморфизм теломерных ДНК и их комплексообразование с белком PGEk - переносчиком нуклеиновых кислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат физико-математических наук Бессчётнова, Ирина Александровна

• Бессчётнова, Ирина Александровна
• кандидат физико-математических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Бессчётнова, Ирина Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цели и задачи работы.

1.3 Научная новизна и практическая значимость.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

2.1 Последовательности ДНК богатые гуанином.

2.2 Теломеры и теломераза.

2.3 Способы подавления активности теломеразы.

2.4 Способы доставки нуклеиновых кислот в клетки и возможность использования белков переносчиков.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Образцы и их подготовка.

3.2 Образование межмолекулярных и внутримолекулярных структур.

3.3 Измерение спектров поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма.

3.4. Анализ экспериментальных данных.

3.5. Молекулярное моделирование.

3.6. Эксперименты на СФМ (Сканирующем Силовом Микроскопе).

4. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ И СТРУКТУРНЫЕ

ОСОБЕННОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ДВОЙНЫХ И ЧЕТВЕРНЫХ СПИРАЛЕЙ ТЕЛОМЕРНЫХ ДНК ИЗ Б^мТ^ И Б(ТТАССС)4 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ. ВЛИЯНИЕ НА ВТОРИЧНУЮ СТРУКТУРУ ЛИГАНДОВ ИНТЕРКАЛЯТОРОВ.

4.1. Использование флуоресцентных и кинетических параметров ЕтВя для определения количества молекул олигонуклеотидов входящих в состав образуемых структур.

4.2. Изучение адсорбции ЕтВя на теломерных олигонуклеотидах для выявления их структурных особенностей.

4.3. Влияние ЕтВя на термическую денатурацию олигонуклеотидов.

5. СВЯЗЫВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА РвЕК С ТЕЛОМЕРНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ РАЗЛИЧНОЙ КОНФОРМАЦИИ С ОБРАЗОВАНИЕМ АДРЕСОВАННЫХ ТРАНСПОРТНЫХ КОМПЛЕКСОВ.

5.1. Изучение вторичной структуры олигонуклеотидов: о(ттаооо)4, 80(ттассо)4, б(ттаооо)з, о(от),2 и о(ась.

5.2. Изучение связывания и динамики молекул РвЕк в комплексе с олигонуклеотидами разной структуры.

5.3. Изучение комплексов РвЕкгДНК с помощью собственной УФ-флуоресценции белка.

6. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ РвЕКгДНК.

6.1. Влияние молекул РвЕк на вторичную структуру о(ТТАССО)4 и 80(ТТАООО)4.

7. ИЗУЧЕНИЕ КОМПАКТИЗАЦИИ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ПОД ВЛИЯНИЕМ СВЯЗЫВАНИЯ С РвЕК ПРИ ПОМОЩИ СКАНИРУЮЩЕГО СИЛОВОГО МИКРОСКОПА.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурный полиморфизм теломерных ДНК и их комплексообразование с белком PGEk - переносчиком нуклеиновых кислот»

1.1 Актуальность проблемы.

В последние годы проявляется повышенный интерес к теломерам - ДНК-белковым комплексам на концах линейных хромосом. Теломеры обеспечивают окончание репликации хромосомной ДНК и защищают концы хромосом от слипания и деградации (Blackburn, 1991). Богатая гуанинами нить теломерной ДНК человека содержит d(TTAGGG)n повторяющиеся последовательности и заканчивается одноце-почечным 3'- выступом. Одноцепочечный 3'-конец включается в теломер-теломерные взаимодействия с образованием Т-петель и четырёхцепочечных G-квадруплексов - структур, препятствующих работе теломеразы -фермента, участвующего в регуляции длины теломер (Griffith, 1999). После каждого клеточного деления теломеры укорачиваются и при достижении теломерой критически малого размера клетки перестают делиться. Раковые клетки имеют неограниченную способность к делению, их теломераза как правило активна, и после каждого клеточного деления она восстанавливает длину теломер (Kim, 1994). Богатая гуанинами теломерная нить ДНК способна образовывать G-квадруплексы (рис. I). В опытах in vitro было показано, что лиганды-интеркаляторы, стабилизируя G-квадруплексы, усиливают их ингибирующее действие по отношению к теломеразе (Haider et al., 2003). Недавно были получены доказательства существования G-квадруплексов теломерной ДНК в ядре клетки (Paeschke, 2005). Кроме того, показано участие некоторых видов G-квадруплексов в контроле экспрессии генов (Siddiqui-Jain, 2002).

Поскольку G-квадруплексы способны взаимодействовать с ферментами, участвующими в регуляции клеточного деления и генной экспрессии, представляется важным исследование образования мультиспиральных структур из й-богатых ДНК, а также изучение их стабилизации низкомолекулярными лигандами, в том числе интеркаляторами. Важнейшей задачей является также поиск эффективного способа доставки внутрь раковых клеток олигонуклеотидных в-квадруплексов, которые могли бы оказаться ингибиторами теломеразы. Существенно, чтобы такие переносчики нуклеиновых кислот (НК) не нарушали функционально значимую структуру в-квадруплекса. Для доставки НК в клетки-мишени разрабатываются специальные методы. Наиболее перспективным решением задачи доставки является конструирование высоко аффинных к клеткам-мишеням векторов с использованием природных белков человека или максимально близких к ним естественных гомологов (8Ыга1зЫ, 2005). Отвечающий этим требованиям новый рекомбинантный белковый вектор РвЕк был сконструирован Позмоговой и др. (патент РФ№ 2248983, 2004) для переноса олигонуклеотидов и плазмидной ДНК в активно пролиферирующие клетки. Молекулы РОЕк способны связывать НК, селективно проникать в опухолевые клетки по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза, избирательны по отношению к ядру клетки. Комплексы РвЕк с фосфодиэфирным с!(ТТАОСС)4 и фосфоротиоатным зс!(ТТАССО)4 олигонуклеотидами вызывали гибель целого ряда раковых клеток, несущих ЕОР-рецепторы (Позмогова, 2004).

Представляет несомненный интерес выявление структурных аспектов формирования комплексов РвЕк с олигонуклеотидами и их связи с биологической активностью. Для изучения структурной организации РОЕкгДНК комплексов в настоящей работе были использованы высокочувствительные флуоресцентные методы в сочетании с методами кругового дихроизма и УФ-плавления. Они позволили выявить мультиспиральные структуры ДНК в составе белкового комплекса и изучить динамику их функционирования. Комбинированный подход расширяет возможности в получении новой информации и делает её более надёжной. Совокупность спектральных методов позволяет проводить исследования в условиях максимально приближенных к физиологическим.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Бессчётнова, Ирина Александровна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Определены энергетические параметры и стехиометрия связывания рекомбинантного белкового вектора РвЕк -переносчика НК в клетки-мишени с биологически важными фрагментами теломерной ДНК - ингибиторами теломеразы: в-квадруплексами с1(ТТАООО)4 и фосфоротиоатными нитями зс1(ТТАООО)4, а также шпилечными <1(ТТАСОС)з и однонитевыми <1(ОТ}12 и с!(АС)12 структурами. Установлено высокое сродство РвЕк к фрагментам ДНК разной вторичной структуры и нуклеотидного состава (Кдж10" М).

2. Установлено, что молекулы РвЕк имеют повышенное о сродство к в-квадруплексу с1(ТТАОСО)4 (Кд= (2-5)'10" М) и связываются с высокой кооперативностью.

3. Экспериментально определены времена вращательной релаксации свободных молекул ДНК и их комплексов с РвЕк. Показано, что ДНК-связывающий домен N1.8 имеет высокую подвижность относительно домена ЕвР белка РвЕк.

4. Определена структурная организация биологически активных комплексов РСЕк:с1(ТТАООО)4, содержащих 5 молекул РвЕк, и РОЕк:зс1(ТТАССС)4, содержащих 2 молекулы РвЕк. Установлено, что структура в-квадруплекса <1(ТТАСОО)4 и денатурированной нити 8<1(ТТАССО)4 сохраняются в активных комплексах. Наблюдаемая высокая подвижность РвЕк в активных комплексах с ДНК играет важную роль во взаимодействии с ЕОРЯ-рецепторами пролифирирующих клеток.

5. Установлено влияние интеркалятора Е1Вг на образование РСЕк:ДНК комплексов. Адсорбция Е1Вг на фрагментах теломерной ДЬЖ снижает сродство молекул РвЕк к ДНК и уменьшает число мест связывания.

6. Изучено влияние интеркалятора Е1Вг на термостабильность СГ-квадруплекса [с1(СТ)5]4, в-квадруплекса ё(ТТАССС)4 и Ьр-вТ шпильки ёС(ТС)4С-Ь-сЮ(ТС)4С. Термостабильность Е1Вг:ДНК комплексов не менялась. Установлено уникальное свойство вТ-квадруплекса и Ьр-вТ шпильки - способность к значительному растяжению их спиралей под действием интеркалятора Е1Вг.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Бессчётнова, Ирина Александровна, 2006 год

1. Список работ, опубликованных по теме диссертации. Статьи в рецензируемых журналах:

2. Anantha, N. V.; Azam, M.; Sheardy, R. D. (1998) Biochemistry, 37, 2709-2714.

3. Arthanari, H.; Basu, S.; Kawano, T. L.; Bolton, P. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 3724-3728.

4. Balagurumoorthy P, Brahmachari SK, Mohanty D, Bansal M,

5. Sasisekharan V. (1992). "Hairpin and parallel quartet structures fortelomeric sequences." Nucleic Acids Res.;20(15):4061-7.

6. Bates P.J., Kahlon,J.B., Thomas,S.D., Trent,J.O. and Miller,D.M. (1999)

7. Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides correlates withprotein binding." J. Biol. Chem., 274, 26369-26377.

8. Beschetnova, I. A., D. N. Kaluzhny, et al. (2003). "Ethidium probing of theparallel double- and four-stranded structures formed by the telomeric DNAsequences dG(GT)4G and d(GT)5." J Biomol Struct Dyn 20(6): 789-99.

9. Besschetnova, Galina E. Pozmogova, Anna K. Shchyolkina, Olga F.

10. Borisova. (2005) "The Effect of the Secondary and Tertiary Structure ofd(TTAGGG)n Telomeric Oligonucleotides on their Binding with a Novel

11. Recombinant Protein PGEk Deliver of DNA in Cells." Journal of

12. Biomolecular Structure and Dynamics, V. 22, P. 859-860.

13. Blackburn E.H. (1991). "Structure and function of telomeres." Nature, 350,569.573.

14. Borisova, O. F., A. K. Shchyolkina, et al. (1993). "Relative stability of AT and GC pairs in parallel DNA duplex formed by a natural sequence." FEBS Lett 322(3): 304-6.

15. Borisova, Shchyolkina A. K., et al. (1992). "Evidence for the tetraplex structure of the d(GT)n repetitive sequences in solution." FEBS Lett 306 (2,3): 140-142.

16. Borisova, Shchyolkina A. K., et al. (2001). "Interaction of EtBr and parallel-stranded DNA formed by 3 '-d(GTGTGTGTGG)-p0(CH2CH20)3p-d(GGTGTGTGTG)-3' oligonucleotide ", J Biomol Struct Dyn: 931-932.

17. Bryan TM, Englezou A, Gupta J, Bacchetti S, Reddel RR. (1995) "Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity." EMBO J.; 14(17): 4240-8.

18. Burke P, Schooler K, Wiley HS. (2001) "Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking." Mol Biol Cell.; 12(6): 1897-910.

19. Cesare AJ, Griffith JD. (2004) "Telomeric DNA in ALT cells is characterized by free telomeric circles and heterogeneous t-loops." Mol Cell Biol.; 24(22):9948-57.

20. Cristiano R. J. (1998) "Targeted, non-viral gene delivery for cancer gene therapy." Frontiers in Biosci. N 3. P. 1161-1170.

21. Cristiano R. J., Roth J. A. (1996) "Epidermal growth factor mediated DNA delivery into lung cancer cells via the epidermal growth factor receptor." Cancer Gene Ther. V. 3. N 1. P. 4-10.

22. Elena Conti, Marc Uy, Lore Leighton, Gu" nter Blobel, and John Kuriyan (1998) "Crystallographic Analysis of the Recognition of a Nuclear Localization Signal by the Nuclear Import Factor Karyopherin a"; Cell, Vol. 94, 193-204.

23. Haider SM, Parkinson GN, Neidle S. (2003) "Structure of a Gquadruplex-ligand complex."; J Mol Biol.; 326(1): 117-25.

24. Han, F. X.; Wheelhouse, R. T.; Hurley, L. H. J. (1999)Am. Chem. Soc.,121,3561-3570.

25. Keniry M.A. (2001) "Quadruplex structures in nucleic acids." Biopolymers, 56, 123-146.

26. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L.C., Coviello G.H., Wright W.E., Weinrich S.L., Shay J.W. (1994). "Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer." Science. 266, 2011—2015.

27. Kiseleva E., Goldberg M. W., Cronshaw J., Allen T. D. (2000) "The nuclear pore complex: structure, function and dynamics." Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression. N 10. P. 101-112.

28. Krafft C, Benevides JM, Thomas GJ Jr. (2002) "Secondary structure polymorphism in Oxytricha nova telomeric DNA." Nucleic Acids Res.; 30(18):3981-91.

29. Krauskopf A, Blackburn EH. (1996) "Control of telomere growth by interactions of RAP 1 with the most distal telomeric repeats." Nature; 383(6598):354-7.

30. H, Cao Y, Berndt MC, Funder JW, Liu JP. (1999) "Molecular interactions between telomerase and the tumor suppressor protein p53 in vitro." Oncogene; 18(48): 6785-94.

31. Manoharan M. (2002) "Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action." Antisense Nucleic Acid Drug Dev. V. 12. P. 103128.

32. Naijie Jing, Weijun Xiong, Yongli Guan, Luke Pallansch, and Shimei Wang (2002) "Potassium-Dependent Folding: A Key to Intracellular Delivery of G-Quartet Oligonucleotides as HIV Inhibitors", Biochemistry, 41,5397-5403.

33. Neidle S, Harrison RJ, Reszka AP, Read MA. (2000) "Structure-activity relationships among guanine-quadruplex telomerase inhibitors." Pharmacol Ther.; 85(3): 133-9.

34. Nickiin S. A., White S. J., Watkins S. J., Hawkins R. E., Baker A. (2000) "Selective Targeting of Gene Transfer to Vascular Endothelial Cells by Use of Peptides Isolated by Phage Display." Circulation. N 102. P. 231237.

35. Plank C., Tang M. X., Wolfe A. R., Szoka F. C. Jr. (1999) "Branched cationic peptides for gene delivery: role of type and number of cationic residues in formation and in vitro activity of DNA polyplexes." Hum. Gene Ther. V. 10. N 2. P. 319-332.

36. Price CM. (1999)" Telomeres and telomerase: broad effects on cell growth." Curr Opin Genet Dev.; 9(2):218-24.

37. Schaffitzel C., Berger I., Postberg J., Hanes J., Zipps H.J., Pruckthan A. (2001). "In vivo generated antibodies specific for telomeric guanine -quadruplex DNA react with Stylonychia lemnae macronuclei." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 8572—8577.

38. Sean Michael Kerwin (2000) "G-Quadruplex DNA as a Target for Drug Design" Current Pharmaceutical Design, 6, 441-471.

39. Sen, D.; Gilbert, W. Curr. Opin. Struct. Biol. (1991) Biophys. Biomol. 1, 435-438.

40. Shore D. (1996) "The means to bind the ends." Nat Struct Biol.; 3(6):491-3.

41. Shore D. (1997) "Telomeres. Different means to common ends." Nature; 385(6618):676-7.

42. Siddiqui-Jain A., Grand C.L., Bearss D.J., Harley L.H. (2002). "Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with asmall molecule to repress cMyc transcription." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 11593—11598.

43. Simeoni, F., Morris, M.C., Heitz, F., Divita, G. (2003) "Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells"; Nucleic Acids Res. 31, N 11,2717-2724.

44. Simon R.W.L. Chan and E. H. Blackburn (2003) "Telomeres and telomerase" The Royal Society; 109-121.

45. Simonsson T. (2001). "G-quadruplex DNA structure -variations on a theme." Biol. Chem. 382, 621—628.

46. Stansel, R. M., T. de Lange, et al. (2001). "T-loop assembly in vitro involves binding of TRF2 near the 3' telomeric overhang." Embo J 20(19): 5532-40.

47. Stec, W. J., Zon, G., Egan, W., and Stec, B. (1984) "Automated solidphase synthesis, separation, and stereochemistry of phosphorothioate analogues of oligodeoxyribonucleotides." J. Am. Chem. Soc. 106, 60776079.

48. Stein C.A. (1996) "Exploiting the potential of antisense: beyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides" Chemistry & Biology, Volume 3, Number 8, pp. 693-693(1)

49. Альберте Б., Брей Б., Льюис Дж. и др.(1994) "Молекулярная биология клетки." Мир. Т. 1-3.

50. Богданов А.А. (1998) Обзор. "Теломеры и теломераза"; БИОЛОГИЯ; Соросовский Образовательный журнал N12; 12-18. Богданов А.А."Теломера, теломераза, рак и старение." (1997) Биохимия; Т. 62, №11.

51. Борисова, А.К. Щёлкина, O.K. Мамаева, Ю.П. Лысов, А.А. Чёрный, А.А. Горин, Э.Н. Тимофеев, В.Л. Флорентьев (1992) "Структураповторяющихся последовательностей d(GT)n с параллельными и антипараллельными цепями", Молекулярная биология, том 26, 452462.

52. Борисова, J1.J1. Киселёв, А.Н. Суровая, J1.A. Тумерман, Л.Ю. Фролова (1964) "О макромолекулярной структуре транспортных рибонуклеиновых кислот в растворе", Биофизика, том 195, N 5, 11541157.

53. Дмитриев П.В., А.В.Петров, О.А.Донцова (2003) Обзор "Телосомный комплекс дрожжей Saccharomyces cerevisiae: компоненты и функции" БИОХИМИЯ, Том 68, выпуск 7, с. 877-895.

54. Позмогова Г. Е., Кнорре Д. Г. (1998) "Белковые и пептидные конструкции для доставки в клетку олигонуклеотидов и ДНК." Вопр. Мед. Химии. Т. 44. N 4. Р. 331-337.

55. Позмогова Г.Е. (2003) "РвЕк новый рекомбинантный белковый вектор для генотерапии." Тезисы докл. Московский международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. С.61.

56. Позмогова Г.Е. (2003) Обзор. "Супрамолекулярные конструкции для направленного транспорта нуклеиновых кислот." Центр "Биоинженерия" РАН.