Структурный полиморфизм металлсвязывающего домена природных вариантов бета-амилоида в растворе как фактор агрегации при развитии болезни Альцгеймера тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Истрате, Андрей Николаевич

• Истрате, Андрей Николаевич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Истрате, Андрей Николаевич

Оглавление

Список сокращений и условных обозначений

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1 Предшественник бета-амилоида (ПБА)

1.2 Бета-амилоид

1.3 Металлсвязывающий фрагмент бета амилоида человека и крысы

1.4 Нейротоксичность бета-амилоида

1.5 Амилоидные фибриллы

Промежуточные продукты процесса фибриллообразованш

Процесс агрегации АР

Условия агрегации in vitro и in vivo

1.6 Методы определения структуры белка

1.7 Определение структуры белка методом спектроскопии ЯМР

Пробоподготовка

Измерение спектров ЯМР

Отнесение сигналов

Получение структурных ограничений

Расчет и оптимизация структуры

II. Экспериментальная часть

2.1 Приготовление образцов

2.2 Измерение спектров ЯМР

2.3 Отнесение сигналов и получение ограничений

2.4 Расчет структур

Оптимизация протокола для программы GROMACS

Уточнение координат репрезентативной структуры методом ММ/КМ

Визуализация и оценка качества получаемых структур

III. Результаты и их обсуяедение

3.1 Отнесение сигналов

3.2 Ограничения на межъядерные расстояния и диэдральные углы

3.3.1 Оптимизация протокола для программы СЯОМАСБ

3.3.2 Расчет структур пептида Яа1 Ар(1-16) в свободном состоянии и в комплексе

с цинком

3.3.3 Расчет структур пептида А|3Н6к(1-16) в комплексе с цинком

3.3.5 Изучение взаимодействия Ар°7'50(1-16) с ионами Ъп1+

Выводы

Список литературы

Приложение

Благодарности

Список сокращений и условных обозначений

БА - болезнь Альцгеймера; Ар - бета-амилоидный пептид; ПБА - предшественник бета амилоида; Да, кДа - дальтон, килодальтон;

ИКТ - изотермическое калориметрическое титрование; м.д. - миллионные доли (ррш - parts per million); МД - молекулярная динамика; ММ - молекулярная масса; КМ - квантовая механика РЧ - радиочастотный;

ApD7ls0 - бета-амилоид содержащий изомеризованный остаток аспаргиновой кислоты в седьмом положении;

АрН6к - бета-амилоид содержащий замену гистидина на аргинин в шестом положении;

RatAp(l-16) - 1-16 фрагмент бета-амилоида крысы;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия;

ID, 2D, 3D, 4D - одно-, дву-, трех-, четырехмерный;

ррш - parts per million (м.д. - миллионные доли);

Трис - 2-Амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол гидрохлорид;

Трис Dn - 2-Амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол гидрохлорид, полностью меченый изотопом 2D;

Бис-трис D19 - 2-[Бис(гидроксиэтил)амино]-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол, полностью меченый изотопом 2D;

ССИ - сигнал свободной индукции;

Обозначения атомов полипептидной цепи

С — карбонильный атом углерода основной цепи;

N - амидный атом азота основной цепи;

HN - амидный протон основной цепи;

Са, р, у, 8, е- углеродные атомы;

На, р, у, 5, 8,

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурный полиморфизм металлсвязывающего домена природных вариантов бета-амилоида в растворе как фактор агрегации при развитии болезни Альцгеймера»

Введение

Болезнь Альцгеймера - это тяжелое нейродегенеративное заболевание головного мозга, приводящее к потере памяти и прогрессирующей деградации личности. Болезнь медленно прогрессирует, и в течение 5-15 лет приводит к поражению психомоторных функций и остановке дыхания. В группу риска входят люди старше 55-ти лет, независимо от их национальности и социально-экономического статуса [1, 2]. Этим заболеванием страдает более 37 миллионов человек по всему миру [3]. Болезнь Альцгеймера было впервые описано более ста лет назад, но широкое исследование причин, симптомов, факторов риска и методов лечения проводится только последние 30 лет. Хотя исследователи продвинулись далеко вперед в этом вопросе, причины возникновения данного заболевания, за исключением некоторых наследственных форм заболевания, остаются неизвестными.

Существуют несколько конкурирующих концепций молекулярного механизма Болезни Альцгеймера (БА), наиболее популярной из которых является т.н. «амилоидная гипотеза». Согласно этой гипотезе, накопление бета-амилоидного пептида (АР) в олигомерных и полимерных формах провоцирует синаптическую дисфункцию и клеточную смерть [4, 5]. АР - это короткий пептид, состоящий из 39-43 аминокислот, который образуется из более крупного трансмембранного белка-предшественника (ПБА), выполняющего трофическую и защитную функции [6]. Бета-амилоид является нормальным компонентом биологических жидкостей и присутствует примерно в равных концентрациях, как у больных, так и у здоровых людей. До недавнего времени Ар считался биологическим мусором, однако в недавних работах было показано, что этот пептид выполняет важные физиологические функции [7-10].

Согласно «амилоидной гипотезе» Р-амилоид, по невыясненным до конца причинам образует нейротоксические растворимые олигомеры, которые в дальнейшем агрегируют с образованием нерастворимых амилоидных бляшек в определенных участках головного мозга [11, 12]. Поданным многочисленных исследований агрегаты р-амилоида, включая олигомеры, губительно действуют на нервные клетки, нарушая их нормальное функционирование и вызывая симптомы БА [13]. В недавних работах было показано, что ионы переходных металлов, такие как цинк, медь или железо, способствуют процессу агрегации пептида [14]. Было также показано,' что усеченная форма бета-амилоида, ;

состоящая из аминокислотных остатков 17-42, не способна к агрегации irt vivo [15], а, следовательно, участок 1-16, называемый металлсвязывающим фрагментом бета-амилоида, играет ключевую роль в процессе образования амилоидных бляшек.

Бета-амилоид обнаружен у всех млекопитающих. В этой связи интересен тот факт, что у грызунов, в частности у мышей и крыс, не наблюдается образования амилоидных бляшек. Важно отметить, что первичная структура амилоидного пептида этих млекопитающих и человека различаются всего тремя аминокислотными остатками [16], расположенных именно в металл связывающем домене.

Хотя большинство случаев БА являются спорадическими, известно, что определенная часть случаев возникновения заболевания обусловлена мутациями в гене, кодирующим ПБА. Одной из таких мутаций является H677R, соответствующая замене H6R в Ар, обнаруженная в 2000 году, в английской семье. Было показано, что мутантная форма H6R Ар приводит к более быстрому фибриллообразованию [17]. Кроме того, было установлено, что олигомеры H6R Ар проявляют более высокую токсичность к нейронам в сравнении с олигомерами пептида дикого типа [18].

Следует также отметить еще один важный факт, характеризующий развитие болезни Альцгеймера. Спонтанная изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в седьмом положении АР неизбежно приводит к цинк-зависимой олигомеризации [19]. Поскольку вероятность образования изоаспартата из аспарагина выше вероятности изомеризации аспарагиновой кислоты [20], то другая патологическая мутация D7N (Tottori) [21], как предполагается, обусловлена повышением доли пептида, содержащего изоаспартат в положении 7.

Сравнение трехмерных структур металлсвязывающего фрагмента Ар человека со структурой аналогичного фрагмента пептида крысы, а также со структурами патогенных изоформ Ар человека (с заменой H6R и изоаспартатом в положении 7) может дать важную информацию для установления молекулярного механизма агрегирования бета-амилоида. Это также важно для разработки рациональных методов поиска лекарственных средств, эффективных для предотвращения развития и лечения болезни Альцгеймера.

Структура металлсвязывающего фрагмента бета-амилоида человека в

растворе, как ,в свободном состоянии, так ,, и в комплексе с цинком была

определена ранее [22]. Целью данной работы является определение трехмерных

6

структур металлсвязывающего фрагмента бета-амилоида крысы и аналогичных фрагментов бета-амилоида человека, содержащих изоаспартат в положении 7 и изоформу пептида НбЯ, также, как в свободном состоянии, так и в комплексе с ионами цинка.

Глава I. Обзор литературы 1.1 Предшественник бета-амилоида (ПБА)

Бета-амилоид (АР) является фрагментом белка ПБА, который экспресируется во многих тканях и органах человеческого организма, включая мозг [23, 24]. ПБА является мембранным белком первого типа состоящий из трех доменов: Ы-терминального домена, расположенного в межклеточном пространстве, трансмембранного домена и С-терминального домена, частично расположенного в цитоплазме (рис. 1) [25, 26]. Хотя функции ПБА не до конца исследованы, считается, что он участвует в гомеостазе ионов металлов, таких как медь, цинк, железо [27, 28]. Под действием специфических сериновых протеаз (а-, Р- и у-секретаз) ПБА разрезается на несколько фрагментов. В зависимости от участвующих ферментов, возможны два пути протеолиза ПБА - амилоидогенный и неамилоидогенный (рис. 1).

Extracellular

Membrane Intracellular

H,N4- sAPPa A ß(17-40/42) AICD

11 î a; >

H3N4- «APPß Aß(1-40/42) | AICD

✓

i-СОг

-C<V

ß . - ' a ^ Y

К I IUI

MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGANGLMVGGWIAT 1 5 10 15 20 25 30 35 40

Рисунок 1. Схема протеолиза предшественника бета-амилоида.

При неамилоидогенном пути ПБА разрезается а-секретазой по положению между Ьув687 и Ьеи688 освобождая растворимый Ы-терминальный фрагмент рПБАа. Оставшийся связанным с мембраной С-терминальный фрагмент далее

разрезается у-секретазой по положению Val711/Ile712 или Ala713/Thr714 образуя Ар( 17-40) или Ар (17-42) [29-32]. При амилоидогенном пути первоначальное разрезание ПБА осуществляется p-секретазой в положении Met671/Asp672 освобождая растворимый фрагмент рПБАр. Далее, оставшийся связанным с мембраной фрагмент разрезается у-секретазой образуя Ар(1-40) (-90%) и АР(1-42) (-10%) [23, 24, 33]. Пептид АР(1-42) считается основной патогенной формой Ар поскольку является более гидрофобным, проявляет повышенную склонность к агрегированию и является основной формой пептида, обнаруженной в амилоидных бляшках [34, 35]. Также следует отметить что мутации в гене кодирующем ПБА, ответственные за наследственную форму БА, как правило приводят к увеличению синтеза Ар(1-42) относительно Ар(1-40) [36]. Бета-амилоид встречается у всех млекопитающих, но аминокислотная последовательность у разных видов может различаться.

1.2 Бета-амилоид

До недавнего времени физиологическая роль бета-амилоида была неизвестна и он считался биологическим «мусором». Однако в недавних работах [7-9] было показано, что Ар участвует в системе врожденного иммунитета, обладая сильной антимикробной активностью, подобно другим схожим по структуре пептидам LL-7 и лактоферину. От антител (лежащих в основе приобретённого, или специфического, иммунитета) их выгодно отличает то, что они могут действовать в нервной ткани и в ткани мозга, куда антитела не попадают. Это защищает человека от таких заболеваний, как менингит и нейрокандидоз. Помимо этого, было показано, что концентрация Ар связанна с синаптической активностью. В частности фармакологические препараты, увеличивающие нейронную активность, стимулируют производство Ар, в то время как препараты, снижающие нейронную активность, уменьшают уровень Ар [10]. С физиологической важностью Ар также согласуется тот факт, что ингибирование секреции этого пептида приводит к смерти нейронной клетки. Обработка нейронных клеток ингибиторами а- и у-секретаз снижает их выживаемость, в то время как добавление АР(1-40) предотвращает токсичность этих секретаз. Эти факты однозначно указывают на роль Ар в поддержании нейронных клеток в жизнеспособном состоянии. Следует заметить, что аналогичная обработка других типов клеток, не имеющих отношения к нейронам, не влияет на их выживаемость [37].

В нормальных условиях, уровень всех пептидов определяется балансом между их анаболизмом и катаболизмом. Бета-амилоид не является исключением, и расщепляется различными пептидазами (в частности, инсулин-расщепляющим ферментом, неприлизином и др.) [38]. Ряд исследований, проведенных на трансгенных мышах и пациентах страдающих болезнью Альцгеймера, показали, что уровень А(3-деградирующих ферментов уменьшается с прогрессированием заболевания [39].

Трехмерную структуру А(3 в растворе методами ЯМР не удается получить ввиду его высокой конформационной подвижности и плохой растворимости пептида в воде. В то же время, оказалось невозможным получить кристаллы Ар, что в свою очередь необходимо для определения структуры пептида методом рентгеновской кристаллографии. Была, однако определена структура фибриллярных образований бета-амилоида, полученных in vitro, которые структурно подобны агрегатам амилоидных бляшек, образующихся в человеческом мозгу при болезни Альцгеймера [40]. Трехмерная структура фибрилл Ар была определена методом ЯМР твердого тела. Пептид Ар состоит из двух фрагментов: гидрофильного 1-16 и гидрофобного 17-42. Гидрофобные участки молекул пептида, для которых удалось получить структурные данные, соединены между собой водородными связями в форме бета листов (рис.2), образуя гидрофобное ядро. Предполагается, что гидрофильные фрагменты 1-16 направлены наружу, не участвуя в стабилизации структуры фибриллы.

Рисунок 2. Строение гидрофобного ядра фибриллярных образований бета-амилоида.

Вместе с тем, усеченная форма 17-42 АР теряет способность к образованию фибрилл, что указывает на важную роль фрагмента 1-16 в процессах формирования бляшек in vivo.

1.3 Металлсвязывающий фрагмент бета амилоида человека и

крысы

Как уже отмечалось выше, процесс образования амилоидных агрегатов связан с хелатированием фрагмента 1-16 бета-амилоида ионами переходных металлов. Этот процесс предваряет, а, возможно, и обуславливает, последующую олигомеризацию пептида и дальнейшее образование гидрофобного фибриллярного ядра [34, 41-45]. Это, в частности, подтверждается и повышенным содержанием ионов переходных металлов в амилоидных отложениях. Так, концентрация ионов цинка в амилоидных бляшках составляет ~ 1 мМ, меди ~ 400|хМ, а трехвалентного железа ~1 мМ [46, 47], в то время как внутриклеточеая

1 Я

концентрация указанных свободных металлов в мозгу не превышает 10" М [48]. Однако концентрация ионов металлов в синаптической щели значительно выше и составляет 15-250(л,М для ионов меди [49] и ЮО-ЗООцМ для ионов цинка [50]. Была измерена константа диссоциации для комплекса АР(1-16) с цинком, она составляет 100 рМ [51]. Последующие исследования показали, что в качестве лигандов, хелатирующих ионы переходных металлов, выступают аминокислотные остатки гистидина (Шэб, Шв^, Шбм) [52-54]. Исследование комплекса Ар(1-16) с ионами цинка, проведенное с помощью масс-спектроскопии с ионизацией методом электрораспыления в газовой фазе, позволило предположить, что четвертым лигандом является аминокислотный остаток аргинина в пятом положении [55]. Позже методом ЯМР была определена структура Ар(1-16) человека и его комплекса с цинком (рис. 3) в растворе [22]. В этой работе было установлено, что четвертым лигандом, хелатирующим ион цинка, является аминокислотный остаток глутамата в одиннадцатом положении, что опровергает ранее полученные данные (рис. 4).

ч

Рисунок 3. Структура фрагмента 1-16 бета-амилоида человека в свободном состоянии (А, В) и в комплексе с цинком (С, О).

Рисунок 4. Координация иона цинка в комплексе с фрагментом 1-16 бета-амилоида человека.

Авторы объясняют указанные противоречия различиями в кислотно-основных свойствах аминокислот в газовой фазе и в растворе [22]. Следует заметить, что в отсутствии ионов цинка участок 1 -6 является неупорядоченным, а участок 7-15 достаточно хорошо структурирован. После связывания с ионами

12

цинка 1-6 участок структурируется благодаря координации гистидина в шестом положении, структура основной цепи минидомена 7-15 практически не изменяется, а боковые цепи остатков 01и11, ШзП и Шв14 переориентируются. В работе [56], методом изотермического калориметрического титрования (ИКТ) было показано, что фрагмент 6-14 бета-амилоида является минимальным металлсвязывающим участком полипептида. В той же работе с помощью метода ИКТ и КМ/ММ расчетов была выявлена способность фрагмента 11-14 А(5 (ЕУНН) образовывать димеры, в которых две молекулы ЕУНН соединены посредствам иона цинка.

Еще одним важным свойством фрагмента 1-16 бета-амилоида является его способность к изомеризации и рацемизации по остатку аспаргиновой кислоты в седьмом положении. Это химическое превращение происходит через циклический сукцинимидный интермедиат (рис. 5) [57, 58].

-Авп-Хаа-

О

-¡воАэр-Хаа (70-85%)

О т -Авр-Хаа-(15-30%)

Рисунок 5. Пути самопроизвольной изомеризации аспаргина и аспаргиновой кислоты [57, 58].

В амилоидных бляшках было обнаружено аномально высокое содержание изомеризованных и рацемизованных пептидов, доля ApD7lS0 от общего количества Ар выделенного из мозга пациентов страдающих БА составила 55% [59]. Поэтому было высказано предположение, что такие изменения в строении бета-амилоида способствуют ускорению его агрегирования. В пользу этой гипотезы свидетельствует и тот факт, что исследования процессов агрегирования полипептидов в условиях in vitro показали рост содержания Р-листов при использовании модифицированных пептидов [19, 60]. Кроме того, исследование, проведенное на трансгенных мышах, было показало, что многократное внутривенное введение ApD7lS0 приводит к значительному увеличению чиста амилоидных бляшек [61]. Следует отметить что вероятность образования изоаспартата из аспарагина выше вероятности изомеризации аспарагиновой кислоты [20], что может являться причиной патогенности мутантной формы бета-амилоида, содержащей замену аспаргиновой кислоты в седьмом положении на аспаргин (Totori) [21]. С другой стороны, имеются данные, указывающие на то, что рацемизация и изомеризация аспартата может происходить уже после образования фибриллярных структур [62].

Хотя большинство случаев БА являются спорадическими, известно, что определенная часть случаев заболевания (менее 1%) [13], возникает в результате мутаций в трех генах (т.н. наследственная форма БА). Эти гены кодируют ПБА [63], пресенилин 1 и пресенилин 2 [64, 65]. Мутации в ПБА ответственные за наследственную форму болезни Альцгеймера, как правило приводят к нарушению синтеза Ар [66]. В 2000 году, в английской семье была обнаружена мутация H677R гена кодирующего ПБА, соответствующая мутации H6R в Ар. Эта мутация не влияет на синтез АР [18]. Изначально ее считали не патогенной, однако в недавних работах было показано что H6R мутантная форма Ар способна к более быстрому фибриллообразованию [17]. Кроме того, было установлено, что олигомеры H6R АР проявляют более высокую токсичность к нейронам чем олигомеры пептида дикого типа [18].

Необходимо отметить тот факт, что процессы, аналогичные тем, что вызывают возникновение и развитие болезни Альцгеймера у человека, отсутствуют у грызунов, и, в частности, у крыс [16]. Таким образом представляет значительный интерес изучение структурных особенностей бета-амилоида этих млекопитающих. Аминокислотная последовательность бета-амилоида крыс отличается от аналогичной последовательности бета-амилоида человека всего

14

тремя заменами (рис. 6) >01у5, Туг 10—^РЪеЮ и №з13—>Аг§13,

расположенными именно в металлсвязывающем домене (Рис. 6) [67, 68].

АВ(1-16)

А6(17-42)

I--)1

АВ(1-42) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA

V

A6(l-16) D АЕ F RH D S G Y Е V iLH Q К

- Human

■

Рисунок 6. Аминокислотная последовательность бета-амилоида человека, его металлсвязывающего фрагмент и аналогичного крысиного фрагмента.

Поскольку иных различий между последовательностью грызунов и человека не существует, представляется весьма вероятным, что замены в металлсвязывающем домене определяют изменения физико-химических свойств пептида, достаточные для предотвращения агрегирования бета-амилоида.

Данных по структуре цинк-связывающего фрагмента бета амилоида крыс на сегодняшний день недостаточно для понимания природы его устойчивости к агрегированию. Известна структура более крупного фрагмента (1-28), полученного методом ЯМР в растворе ДМСО [69]. Как сообщают авторы, данный фрагмент состоит из двух участков: хорошо структурированного участка 10-28, представляющего собой альфа спираль, и неструктурированного фрагмента 1-10 (рис. 7). Таким образом, структуру металлсвязывающего домена бета-амилоида крысы в работе [69] определить не удалось. Кроме того, раствор пептида в ДМСО представляется моделью, слишком далекой от физиологических условий.

Рисунок 7. Структура 1-28 фрагмента бета-амилоида крысы.

В этой работе также исследовали взаимодействие 1-28 участка бета АР с цинком, после добавления которого, 1-10 участок тоже структурируется. Исходя из характера изменения химических сдвигов сигналов пептида при добавлении к нему ионов цинка, авторы сделали вывод, что в координации цинка принимают участие аминокислотные остатки His6, Argl3 и His 14.

1.4 Нейротоксичность бета-амилоида

С тех пор как было установлено, что Ар является основным компонентом амилоидных бляшек [70], появляющихся в процессе развития болезни Альцгеймера, «амилоидной теории» принадлежит ключевая роль. Согласно этой теории накопление Ар и последующая агрегация пептида провоцирует синаптическую дисфункцию и клеточную смерть. Считается что накопление АР, который запускает патогенный каскад событий при БА, возникает в результате нарушения равновесия между синтезом и расщеплением пептида. Эту гипотезу поддерживают многочисленные генетические, молекулярные, биохимические и нейропатологические исследования [5].

Поскольку нерастворимые фибриллярные агрегаты являются нейротоксичными, как in vivo, так и in vitro, было сделано предположение, что фибриллы являются основной причиной нейро дегенерации при Б А [71]. Однако, несмотря на то, что, действительно, было обнаружено, что нейроны с нарушенными функциями контактируют с амилоидными бляшками [72], количество бляшек и уровень нерастворимого Ар плохо коррелируют с локальной распространенностью нейронной смерти и потерей синапсов, или с когнитивными

16

дисфункциями [73]. С другой стороны, оказалось, что количество растворимых олигомеров АР строго коррелирует с прогрессированием болезни, как у модельных животных, так и у пациентов, страдающих Б А [12].

Известно, что нейроны человеческого мозга в областях подверженных БА (гиппокамп, энториальная кора) специфически накапливают АР(1-42). Более того, детектируемость внутринейронного Ар(1-42) иммунными методами на стадиях, предшествующих образованию амилоидных бляшек, указывает на то, что внутриклеточное накопление АР(1-42) является более ранним событием нейронной дисфункции, по сравнению с фибрилогенезом [74]. В недавнем клиническом исследовании были определенны разные пулы АР в мозгу больных Б А [75]. Было установлено, что уровень АР(1-42) во всех проанализированных компартментах превышал контроль, однако количество внутреклкточного и связанного с мембраной АР(1-42) лучше коррелирует с симптомами БА чем количество других видов Ар.

В ряде работ было показано, что Ар накапливается в синапсах [76, 77], что приводит к прогрессирующей синаптической токсичности [78] и расстройству нейронной сети [79].

Глутаматные (АМРА, ЫМБА) и ацетилхолиновые (а7-, а4-пАСЬ) рецепторы являются ключевыми рецепторами, осуществляющими синапс и нейротрансмиссию в областях мозга и реализующими функцию памяти (гипокамп и неокортекс). Была показана комплексная взаимосвязь между функционированием этих систем и количеством АР при развитии БА [80]. В частности, была выявлена взаимосвязь между экспрессией а7- и а4-субьединиц пАСЬ рецептора и уровнем внутриклеточного накопления Ар [81]. Кроме того, было показано, что Ар связывается с а7-пАСЬ рецептором в синаптических мембранных препаратах гипокампа. Это в свою очередь приводит к ингибированию высвобождения ацетилхолина и свободному проникновению ионов кальция через клеточную мембрану, что приводит к смерти нейрона [82]. Аналогичные данные были получены и для глутаматэргических систем.

Помимо влияния АР на специфические синаптические ионные каналы, следует рассмотреть его роль в постсинаптическом уплотнении. Так в работе [83] было показано, что АР снижает глутаматэргическую передачу сигнала и ЫМБА рецептор зависимую долговременную потенциацию. Обработка срезов гипокампа

I

Ар вызывает приток ионов кальция, что приводит к активации кальциневрина, который в свою очередь активирует стриатум преобладающую фосфатазу

17

(Striatal-Enriched Phosphatase). Фосфатаза дефосфорилирует субьединицу NR2B NMDA рецептора, что вызывает эндоцитоз рецептора.

Митохондрии играют чрезвычайно важную роль в метаболизме клеток мозга. Как было показано на клетках трансгенных мышей и тканях мозга, обработанных Ар, нарушение функций митохондрий ассоциированы со многими нейро дегенеративными заболеваниями включая Б А [84]. Эксперименты на трансгенных мышах показали, что накопление Ар вызывает уменьшение потребления кислорода митохондриями и снижение активности ферментов, связанных с респираторными комплексами III и IV [85].

1.5 Амилоидные фибриллы

Промежуточные продукты процесса фибриллообразования

Амилоидные фибриллы являются конечным продуктом сложного каскада процессов фибриллогенеза, проходящего через серию промежуточных продуктов. Этими промежуточными продуктами могут быть бета-амилоидные димеры, олигомеры, глобуломеры и протофибриллы [12,24, 86, 87].

Определение промежуточных продуктов фибриллообразования является сложной задачей [88]. Были приложены огромные усилия для ее выполнения. Некоторые работы были посвящены выделению агрегатов из тканей и физиологических жидкостей, таких как спинномозговая жидкость, с помощью эксклюзионной хроматографии и ультрацентрифугирования [89-91]. Другие работы посвящены кинетическим и структурным исследованиям in vitro с использованием синтетических или рекомбинантных пептидов [92].

Мономер

Бета-амилоид проявляет амфифильные свойства, поскольку N-концевой участок (1-16) является гидрофильным а С-концевой (17-42) гидрофобным. Это следствие того, что в белке ПБА участок 1-28 Ар находится в гидрофильном внеклеточном пространстве, а участок 29-42 - в гидрофобном трансмембранном окружении [93]. Структура мономера в значительной степени определяется размером пептида и характером растворителя, в котором исследовали Ар. Так, в водно-спиртовом растворе или мицеллярных растворах, Ар принимает а-спиральную конформацию [94, 95]. В водном растворе форма АР(1-40) находится

, I

в неупорядоченном состоянии, в то время как форма АР(1-42) быстро принимает1

1

Р-листовую конформацию [96, 97].

Димеры

Стабильные димеры А(3(1 -40) и Ар(1-42) были обнаружены в экспериментах in vitro [98, 99], а также при изучении гомогенизированных тканей мозга [100] и в культурах клеток [101]. Считается, что димеры, обнаруженные in vivo, имеют внутриклеточное происхождение [102].

Небольшие олигомеры

Олигомеры с низкой молекулярной массой (3-50 молекул Ар) являются наиболее изученной группой интермедиатов процесса агрегации Ар. Они были обнаружены в экспериментах in vitro, в культуре клеток спинномозговой жидкости и гомогенизированных тканей мозга, секретирующих Ар, [88, 103-105]. Небольшие олигомеры Ар представляют значительный интерес, поскольку они проявляют гораздо большую цитотоксичность по сравнению с нерастворимыми фибриллами АР [73, 89, 106]. Из олигомеров, относящихся к этому классу, можно отметить олигомер с массой 60 кДа, обнаруженный in vivo в мышах, человеческом мозгу, а также и in vitro [107], 48-ми мерный Ар, обнаруженный только in vitro [108], и додекамер АР с массой 56 кДа, выделенный из мышиного мозга [90].

Кольцевые пороподобные олигомеры

Кольцевые олигомеры АР были обнаружены в экспериментах in vitro и клеточных культурах [109]. С ними связанна, так называемая, гипотеза каналов, согласно которой кольцевые олигомеры АР образуют патогенные малоспецифические, нерегулируемые поры, нарушающие функции мембраны. Обнаруженные кольцевые формы Ар формируют поры, способные проводить катионы кальция, натрия и калия. Такие поры обладают различными размерами, канальной специфичностью и регуляторными способностями [110].

Протофибриллы

Амилоидные протофибриллы являются полипептидными агрегатами с кросс-Р-листовой структурой [111]. Кросс-Р-листовая структура — это межмолекулярный пептидный ансамбль, в котором плоскость Р-листа и водородные связи, которые соединяют р-цепи, ориентированы параллельно

основной оси фибриллы. Плоскости Р-цепей, соответственно, ориентированы

11

перпендикулярно основной оси фибриллы (рис. 8 а,б). Присутствие кросс-Р-

листовой структуры во всех амилоидных фибриллах первоначально было установлено с помощью рентгеновской дифракции [112]. На наличие Р-листовой структуры также указывает способность фибрилл связывать конго красный и тиофлавин Т [113, 114]. Более поздние кристаллографические исследования выявили наличие, так называемых, стерических зипперов (застежек), состоящих из двух протофибрилл с интеркалированными боковыми цепями (рис. 8 в).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Истрате, Андрей Николаевич, 2014 год

Список литературы

1. Berchtold, N.C. and Cotman, C.W. Evolution in the conceptualization of dementia and Alzheimer's disease: Greco-Roman period to the 1960s. Neurobiol Aging. 19(3): p. 173-89. (1998).

2. Brookmeyer, R., Gray, S., and Kawas, C. Projections of Alzheimer's disease in the United States and the public health impact of delaying disease onset. Am J Public Health. 88(9): p. 1337-42. (1998).

3. Wimo, A., Winblad, В., and Jonsson, L. The worldwide societal costs of dementia: Estimates for 2009. Alzheimers Dement. 6(2): p. 98-103. (2010).

4. Hardy, J. and Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends Pharmacol Sci. 12(10): p. 383-8. (1991).

5. Hardy, J. and Selkoe, D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297(5580): p. 353-6. (2002).

6. Turner, P.R., O'Connor, K., Tate, W.P., and Abraham, W.C. Roles of amyloid precursor protein and its fragments in regulating neural activity, plasticity and memory. Prog Neurobiol 70(1): p. 1-32. (2003).

7. Appelt, D.M., Roupas, M.R., Way, D.S., Bell, M.G., Albert, E.V., Hammond, C.J., and Balin, B.J. Inhibition of apoptosis in neuronal cells infected with Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae. BMC Neurosci. 9: p. 13. (2008).

8. Soscia, S.J., Kirby, J.E., Washicosky, K.J., Tucker, S.M., Ingelsson, M., Hyman, В., Burton, M.A., Goldstein, L.E., Duong, S., Tanzi, R.E., and Moir, R.D. The Alzheimer's disease-associated amyloid beta-protein is an antimicrobial peptide. PLoS One. 5(3): p. e9505. (2010).

9. Balin, B.J., Little, C.S., Hammond, C.J., Appelt, D.M., Whittum-Hudson, J.A., Gerard, H.C., and Hudson, A.P. Chlamydophila pneumoniae and the etiology of late-onset Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 13(4): p. 371-80. (2008).

10. Kamenetz, F., Tomita, Т., Hsieh, H., Seabrook, G., Borchelt, D., Iwatsubo, Т., Sisodia, S., and Malinow, R. APP processing and synaptic function. Neuron. 37(6): p. 925-37. (2003).

11. Gandy, S., Simon, A.J., Steele, J.W., Lublin, A.L., Lah, J.J., Walker, L.C., Levey, A.I., Krafft, G.A., Levy, E., Checler, F., Glabe, C., Bilker, W.B., Abel, Т., Schmeidler, J., and Ehrlich, M.E. Days to criterion as an indicator of toxicity

associated with human Alzheimer amyloid-beta oligomers. Ann Neurol. 68(2): p. 220-30. (2010).

12. Haass, C. and Selkoe, D.J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(2): p. 101-12. (2007).

13. Holtzman, D.M., Morris, J.C., and Goate, A.M. Alzheimer's disease: the challenge of the second century. Sci Transl Med. 3(77): p. 77srl. (2011).

14. Bush, A.I., Pettingell, W.H., Jr., de Paradis, M., Tanzi, R.E., and Wasco, W. The amyloid beta-protein precursor and its mammalian homologues. Evidence for a zinc-modulated heparin-binding superfamily. J Biol Chem. 269(43): p. 26618-21.(1994).

15. Gowing, E., Roher, A.E., Woods, A.S., Cotter, R.J., Chaney, M., Little, S.P., and Ball, M.J. Chemical characterization of A beta 17-42 peptide, a component of diffuse amyloid deposits of Alzheimer disease. J Biol Chem. 269(15): p. 1098790. (1994).

16. Shivers, B.D., Hilbich, C., Multhaup, G., Salbaum, M., Beyreuther, K., and Seeburg, P.H. Alzheimer's disease amyloidogenic glycoprotein: expression pattern in rat brain suggests a role in cell contact. EMBO J. 7(5): p. 1365-70. (1988).

17. Hori, Y., Hashimoto, T., Wakutani, Y., Urakami, K., Nakashima, K., Condron, M.M., Tsubuki, S., Saido, T.C., Teplow, D.B., and Iwatsubo, T. The Tottori (D7N) and English (H6R) familial Alzheimer disease mutations accelerate Abeta fibril formation without increasing protofibril formation. J Biol Chem. 282(7): p. 4916-23. (2007).

18. Ono, K., Condron, M.M., and Teplow, D.B. Effects of the English (H6R) and Tottori (D7N) familial Alzheimer disease mutations on amyloid beta-protein assembly and toxicity. J Biol Chem. 285(30): p. 23186-97. (2010).

19. Kuo, Y.M., Webster, S., Emmerling, M.R., De Lima, N., and Roher, A.E. Irreversible dimerization/tetramerization and post-translational modifications inhibit proteolytic degradation of A beta peptides of Alzheimer's disease. Biochim Biophys Acta. 1406(3): p. 291-8. (1998).

20. Reissner, K.J. and Aswad, D.W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals? Cell Mol Life Sci. 60(7): p. 1281-95. (2003).

21. Wakutani, Y., Watanabe, K., Adachi, Y., Wada-Isoe, K., Urakami, K., Ninomiya, H., Saido, T.C., Hashimoto, T., Iwatsubo, T., and Nakashima, K. Novel amyloid precursor protein gene missense mutation (D678N) in probable familial Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 75(7): p. 1039-42. (2004).

22. Zirah, S., Kozin, S.A., Mazur, A.K., Blond, A., Cheminant, M., Segalas-Milazzo, I., Debey, P., and Rebuffat, S. Structural changes of region 1-16 of the Alzheimer disease amyloid beta-peptide upon zinc binding and in vitro aging. J. Biol. Chem. 281(4): p. 2151-61. (2006).

23. Hamley, I.W. The amyloid beta peptide: a chemist's perspective. Role in Alzheimer's and fibrillization. Chem Rev. 112(10): p. 5147-92. (2012).

24. Jakob-Roetne, R. and Jacobsen, H. Alzheimer's disease: from pathology to therapeutic approaches. Angew Chem Int Ed Engl. 48(17): p. 3030-59. (2009).

25. Savelieff, M.G., Lee, S., Liu, Y., and Lim, M.H. Untangling Amyloid-beta, Tau, and Metals in Alzheimer's Disease. ACS Chem Biol. 8(5): p. 856-65. (2013).

26. Halim, A., Brinkmalm, G., Ruetschi, U., Westman-Brinkmalm, A., Portelius, E., Zetterberg, H., Blennow, K., Larson, G., and Nilsson, J. Site-specific characterization of threonine, serine, and tyrosine glycosylations of amyloid precursor protein/amyloid beta-peptides in human cerebrospinal fluid. Proc Natl AcadSci USA. 108(29): p. 11848-53. (2011).

27. Bonda, D.J., Lee, H.G., Blair, J.A., Zhu, X., Perry, G., and Smith, M.A. Role of metal dyshomeostasis in Alzheimer's disease. Metallomics. 3(3): p. 267-70. (2011).

28. Eskici, G. and Axelsen, P.H. Copper and oxidative stress in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Biochemistry. 51(32): p. 6289-311. (2012).

29. Rauk, A. The chemistry of Alzheimer's disease. Chem Soc Rev. 38(9): p. 2698715. (2009).

30. DeToma, A.S., Salamekh, S., Ramamoorthy, A., and Lim, M.H. Misfolded proteins in Alzheimer's disease and type II diabetes. Chem Soc Rev. 41(2): p. 608-21.(2012).

31. Kepp, K.P. Bioinorganic chemistry of Alzheimer's disease. Chem Rev. 112(10): p. 5193-239. (2012).

32. Allinson, T.M., Parkin, E.T., Turner, A.J., and Hooper, N.M. ADAMs family members as amyloid precursor protein alpha-secretases. J Neurosci Res. 74(3): p. 342-52. (2003).

33. Vassar, R. and Citron, M. Abeta-generating enzymes: recent advances in beta-and gamma-secretase research. Neuron. 27(3): p. 419-22. (2000).

34. Jarrett, J.T., Berger, E.P., and Lansbury, P.T., Jr. The carboxy terminus of the beta amyloid protein is critical for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease. Biochemistry. 32(18): p. 4693-7. (1993).

35. Younkin, S.G. The role of A beta 42 in Alzheimer's disease. J Physiol Paris. 92(3-4): p. 289-92. (1998).

36. Hardy, J. The Alzheimer family of diseases: many etiologies, one pathogenesis? Proc Natl Acad Sci USA. 94(6): p. 2095-7. (1997).

37. Plant, L.D., Boyle, J.P., Smith, I.F., Peers, C., and Pearson, H.A. The production of amyloid beta peptide is a critical requirement for the viability of central neurons. JNeurosci. 23(13): p. 5531-5. (2003).

38. Carson, J.A. and Turner, A.J. Beta-amyloid catabolism: roles for neprilysin (NEP) and other metallopeptidases? JNeurochem. 81(1): p. 1-8. (2002).

39. Reddy, P.H., Manczak, M., Mao, P., Calkins, M.J., Reddy, A.P., and Shirendeb, U. Amyloid-beta and mitochondria in aging and Alzheimer's disease: implications for synaptic damage and cognitive decline. J Alzheimer s Dis. 20 Suppl 2: p. S499-512. (2010).

40. Luhrs, T., Ritter, C., Adrian, M., Riek-Loher, D., Bohrmann, B., Dobeli, H., Schubert, D., and Riek, R. 3D structure of Alzheimer's amyloid-beta(l-42) fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102(48): p. 17342-7. (2005).

41. Pithadia, A.S. and Lim, M.H. Metal-associated amyloid-beta species in Alzheimer's disease. Curr Opin Chem Biol. 16(1-2): p. 67-73. (2012).

42. Soto, C., Castaño, E.M., Frangione, B., and Inestrosa, N.C. The alpha-helical to beta-strand transition in the amino-terminal fragment of the amyloid beta-peptide modulates amyloid formation. J Biol Chem. 270(7): p. 3063-7. (1995).

43. Tougu, V., Tiiman, A., and Palumaa, P. Interactions of Zn(ii) and Cu(ii) ions with Alzheimer's amyloid-beta peptide. Metal ion binding, contribution to fibrillization and toxicity. Metallomics. 3(3): p. 250-261. (2011).

44. Breydo, L. and Uversky, V.N. Role of metal ions in aggregation of intrinsically disordered proteins in neurodegenerative diseases. Metallomics. 3(11): p. 1163-80.(2011).

45. Maynard, C.J., Bush, A.I., Masters, C.L., Cappai, R., and Li, Q.X. Metals and amyloid-beta in Alzheimer's disease. IntJExp Pathol. 86(3): p. 147-59. (2005).

100

46. Lovell, M.A., Robertson, J.D., Teesdale, W.J., Campbell, J.L., and Markesbery, W.R. Copper, iron and zinc in Alzheimer's disease senile plaques. J. Neurol. Sci. 158(1): p. 47-52. (1998).

47. Smith, M.A., Harris, P.L., Sayre, L.M., and Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proc Natl Acad Sci USA. 94(18): p. 9866-8. (1997).

48. Rae, T.D., Schmidt, P.J., Pufahl, R.A., Culotta, V.C., and O'Halloran, T.V. Undetectable intracellular free copper: the requirement of a copper chaperone for superoxide dismutase. Science. 284(5415): p. 805-8. (1999).

49. Gaier, E.D., Eipper, B.A., and Mains, R.E. Copper signaling in the mammalian nervous system: synaptic effects. JNeurosci Res. 91(1): p. 2-19. (2013).

50. Craddock, T.J., Tuszynski, J.A., Chopra, D., Casey, N., Goldstein, L.E., Hameroff, S.R., and Tanzi, R.E. The zinc dyshomeostasis hypothesis of Alzheimer's disease. PLoSOne. 7(3): p. e33552. (2012).

51. Mekmouche, Y., Coppel, Y., Hochgrafe, K., Guilloreau, L., Talmard, C., Mazarguil, H., and Faller, P. Characterization of the Znll binding to the peptide amyloid-betal-16 linked to Alzheimer's disease. Chembiochem. 6(9): p. 1663-71.(2005).

52. Liu, S.T., Howlett, G., and Barrow, C.J. Histidine-13 is a crucial residue in the zinc ion-induced aggregation of the A beta peptide of Alzheimer's disease. Biochemistry. 38(29): p. 9373-8. (1999).

53. Miura, T., Suzuki, K., Kohata, N., and Takeuchi, H. Metal Binding Modes of Alzheimer's Amyloid P-Peptide in Insoluble Aggregates and Soluble Complexes!. Biochemistry. 39(23): p. 7024-7031. (2000).

54. Yang, D.S., McLaurin, J., Qin, K., Westaway, D., and Fraser, P.E. Examining the zinc binding site of the amyloid-beta peptide. Eur J Biochem. 267(22): p. 6692-8. (2000).

55. Zirah, S., Rebuffat, S., Kozin, S.A., Debey, P., Fournier, F., Lesage, D., and Tabet, J.-C. Zinc binding properties of the amyloid fragment Ap(l-16) studied by electrospray-ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 228(2-3): p. 999-1016. (2003).

56. Tsvetkov, P.O., Kulikova, A.A., Golovin, A.V., Tkachev, Y.V., Archakov, A.I., Kozin, S.A., and Makarov, A.A. Minimal Zn(2+) binding site of amyloid-beta. Biophys. J. 99(10): p. L84-6. (2010).

57. Geiger, T. and Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262(2): p. 785-94. (1987).

58. Stephenson, R.C. and Clarke, S. Succinimide formation from aspartyl and asparaginyl peptides as a model for the spontaneous degradation of proteins. J Biol Chem. 264(11): p. 6164-70. (1989).

59. Roher, A.E., Lowenson, J.D., Clarke, S., Wolkow, C., Wang, R., Cotter, R.J., Reardon, I.M., Zurcher-Neely, H.A., Heinrikson, R.L., Ball, M.J., and et al. Structural alterations in the peptide backbone of beta-amyloid core protein may account for its deposition and stability in Alzheimer's disease. J Biol Chem. 268(5): p. 3072-83. (1993).

60. Fabian, H., Szendrei, G.I., Mantsch, H.H., Greenberg, B.D., and Otvos, L., Jr. Synthetic post-translationally modified human A beta peptide exhibits a markedly increased tendency to form beta-pleated sheets in vitro. Eur J Biochem. 221(3): p. 959-64. (1994).

61. Kozin, S.A., Cheglakov, I.B., Ovsepyan, A.A., Telegin, G.B., Tsvetkov, P.O., Lisitsa, A.V., and Makarov, A.A. Peripherally Applied Synthetic Peptide isoAsp7-Abeta(l-42) Triggers Cerebral beta-Amyloidosis. Neurotox Res. (2013).

62. Fonseca, M.I., Head, E., Velazquez, P., Cotman, C.W., and Tenner, A.J. The presence of isoaspartic acid in beta-amyloid plaques indicates plaque age. Exp Neurol. 157(2): p. 277-88. (1999).

63. Chartier-Harlin, M.C., Crawford, F., Houlden, H., Warren, A., Hughes, D., Fidani, L., Goate, A., Rossor, M., Roques, P., Hardy, J., and et al. Early-onset Alzheimer's disease caused by mutations at codon 717 of the beta-amyloid precursor protein gene. Nature. 353(6347): p. 844-6. (1991).

64. Levy-Lahad, E., Wasco, W., Poorkaj, P., Romano, D.M., Oshima, J., Pettingell, W.H., Yu, C.E., Jondro, P.D., Schmidt, S.D., Wang, K., and et al. Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer's disease locus. Science. 269(5226): p. 973-7. (1995).

65. Levy-Lahad, E., Wijsman, E.M., Nemens, E., Anderson, L., Goddard, K.A., Weber, J.L., Bird, T.D., and Schellenberg, G.D. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science. 269(5226): p. 970-3. (1995).

66. Janssen, J.C., Beck, J.A., Campbell, T.A., Dickinson, A., Fox, N.C., Harvey, R.J., Houlden, H., Rossor, M.N., and Collinge, J. Early onset familial

Alzheimer's disease: Mutation frequency in 31 families. Neurology. 60(2): p. 235-9. (2003).

67. Bush, A.I., Pettingell, W.H., Multhaup, G., d Paradis, M., Vonsattel, J.P., Gusella, J.F., Beyreuther, K., Masters, C.L., and Tanzi, R.E. Rapid induction of Alzheimer A beta amyloid formation by zinc. Science. 265(5177): p. 1464-7. (1994).

68. Johnstone, E.M., Chaney, M.O., Norris, F.H., Pascual, R., and Little, S.P. Conservation of the sequence of the Alzheimer's disease amyloid peptide in dog, polar bear and five other mammals by cross-species polymerase chain reaction analysis. Brain Res Mol Brain Res. 10(4): p. 299-305. (1991).

69. Huang, J., Yao, Y., Lin, J., Ye, Y.H., Sun, W.Y., and Tang Dagger, W.X. The solution structure of rat Abeta-(l-28) and its interaction with zinc ion: insights into the scarcity of amyloid deposition in aged rat brain. J Biol Inorg Chem. 9(5): p. 627-35. (2004).

70. Glenner, G.G. and Wong, C.W. Alzheimer's disease and Down's syndrome: sharing of a unique cerebrovascular amyloid fibril protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 122(3): p. 1131-5. (1984).

71. Hardy, J.A. and Higgins, G.A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256(5054): p. 184-5. (1992).

72. Wang, J., Dickson, D.W., Trojanowski, J.Q., and Lee, V.M. The levels of soluble versus insoluble brain Abeta distinguish Alzheimer's disease from normal and pathologic aging. Exp Neurol. 158(2): p. 328-37. (1999).

73. McLean, C.A., Cherny, R.A., Fraser, F.W., Fuller, S.J., Smith, M.J., Beyreuther, K., Bush, A.I., and Masters, C.L. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Ann Neurol. 46(6): p. 860-6. (1999).

74. Gouras, G.K., Tsai, J., Naslund, J., Vincent, B., Edgar, M., Checler, F., Greenfield, J.P., Haroutunian, V., Buxbaum, J.D., Xu, H., Greengard, P., and Relkin, N.R. Intraneuronal Abeta42 accumulation in human brain. Am J Pathol. 156(1): p. 15-20. (2000).

75. Steinerman, J.R., Irizarry, M., Scarmeas, N., Raju, S., Brandt, J., Albert, M., Blacker, D., Hyman, B., and Stern, Y. Distinct pools of beta-amyloid in Alzheimer disease-affected brain: a clinicopathologic study. Arch Neurol. 65(7):

, p. 906-12. (2008).

76. Lacor, P.N., Buniel, M.C., Chang, L., Fernandez, S.J., Gong, Y., Viola, K.L., Lambert, M.P., Velasco, P.T., Bigio, E.H., Finch, C.E., Krafft, G.A., and Klein, W.L. Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers. J Neurosci. 24(45): p. 10191-200. (2004).

77. Capetillo-Zarate, E., Gracia, L., Tampellini, D., and Gouras, G.K. Intraneuronal Abeta accumulation, amyloid plaques, and synapse pathology in Alzheimer's disease. Neurodegener Dis. 10(1-4): p. 56-9. (2012).

78. Mucke, L., Masliah, E., Yu, G.Q., Mallory, M., Rockenstein, E.M., Tatsuno, G., Hu, K., Kholodenko, D., Johnson-Wood, K., and McConlogue, L. High-level neuronal expression of abeta 1-42 in wild-type human amyloid protein precursor transgenic mice: synaptotoxicity without plaque formation. J Neurosci. 20(11): p. 4050-8. (2000).

79. Palop, J.J., Chin, J., Roberson, E.D., Wang, J., Thwin, M.T., Bien-Ly, N., Yoo, J., Ho, K.O., Yu, G.Q., Kreitzer, A., Finkbeiner, S., Noebels, J.L., and Mucke, L. Aberrant excitatory neuronal activity and compensatory remodeling of inhibitory hippocampal circuits in mouse models of Alzheimer's disease. Neuron. 55(5): p. 697-711. (2007).

80. Geerts, H. and Grossberg, G.T. Pharmacology of acetylcholinesterase inhibitors and N-methyl-D-aspartate receptors for combination therapy in the treatment of Alzheimer's disease. J Clin Pharmacol. 46(7 Suppl 1): p. 8S-16S. (2006).

81. Wevers, A., Monteggia, L., Nowacki, S., Bloch, W., Schutz, U., Lindstrom, J., Pereira, E.F., Eisenberg, H., Giacobini, E., de Vos, R.A., Steur, E.N., Maelicke, A., Albuquerque, E.X., and Schroder, H. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subunits in the cerebral cortex in Alzheimer's disease: histotopographical correlation with amyloid plaques and hyperphosphorylated-tau protein. Eur J Neurosci. 11(7): p. 2551-65. (1999).

82. Wang, H.Y., Lee, D.H., D'Andrea, M.R., Peterson, P.A., Shank, R.P., and Reitz, A.B. beta-Amyloid(l-42) binds to alpha7 nicotinic acetylcholine receptor with high affinity. Implications for Alzheimer's disease pathology. J Biol Chem. 275(8): p. 5626-32. (2000).

83. Snyder, E.M., Nong, Y., Almeida, C.G., Paul, S., Moran, T., Choi, E.Y., Nairn, A.C., Salter, M.W., Lombroso, P.J., Gouras, G.K., and Greengard, P. Regulation of NMD A receptor trafficking by amyloid-beta. Nat Neurosci. 8(8): p. 1051-8. (2005).

84. Reddy, P.H. and Beal, M.F. Amyloid beta, mitochondrial dysfunction and synaptic damage: implications for cognitive decline in aging and Alzheimer's disease. Trends Mol Med. 14(2): p. 45-53. (2008).

85. Caspersen, C., Wang, N., Yao, J., Sosunov, A., Chen, X., Lustbader, J.W., Xu, H.W., Stern, D., McKhann, G., and Yan, S.D. Mitochondrial Abeta: a potential focal point for neuronal metabolic dysfunction in Alzheimer's disease. FASEB J. 19(14): p. 2040-1.(2005).

86. Broersen, K., Rousseau, F., and Schymkowitz, J. The culprit behind amyloid beta peptide related neurotoxicity in Alzheimer's disease: oligomer size or conformation? Alzheimers Res Ther. 2(4): p. 12. (2010).

87. Lashuel, H.A. and Lansbury, P.T., Jr. Are amyloid diseases caused by protein aggregates that mimic bacterial pore-forming toxins? Q Rev Biophys. 39(2): p. 167-201. (2006).

88. Bitan, G., Kirkitadze, M.D., Lomakin, A., Vollers, S.S., Benedek, G.B., and Teplow, D.B. Amyloid beta -protein (Abeta) assembly: Abeta 40 and Abeta 42 oligomerize through distinct pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 100(1): p. 330-5. (2003).

89. Cleary, J.P., Walsh, D.M., Hofmeister, J.J., Shankar, G.M., Kuskowski, M.A., Selkoe, D.J., and Ashe, K.H. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat Neurosci. 8(1): p. 79-84. (2005).

90. Lesne, S., Koh, M.T., Kotilinek, L., Kayed, R., Glabe, C.G., Yang, A., Gallagher, M., and Ashe, K.H. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440(7082): p. 352-7. (2006).

91. Lue, L.F., Kuo, Y.M., Roher, A.E., Brachova, L., Shen, Y., Sue, L., Beach, T., Kurth, J.H., Rydel, R.E., and Rogers, J. Soluble amyloid beta peptide concentration as a predictor of synaptic change in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 155(3): p. 853-62. (1999).

92. Walsh, D.M., Hartley, D.M., Condron, M.M., Selkoe, D.J., and Teplow, D.B. In vitro studies of amyloid beta-protein fibril assembly and toxicity provide clues to the aetiology of Flemish variant (Ala692~>Gly) Alzheimer's disease. BiochemJ. 355(Pt 3): p. 869-77. (2001).

93. Selkoe, D.J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nat Cell Biol. 6(11): p. 1054-61. (2004).

94. Coles, M., Bicknell, W., Watson, A.A., Fairlie, D.P., and Craik, D.J. Solution

structure of amyloid beta-peptide(l-40) in a water-micelle environment. Is the

105

I I

membrane-spanning domain where we think it is? Biochemistry. 37(31): p. 11064-77.(1998).

95. Crescenzi, O., Tomaselli, S., Guerrini, R., Salvadori, S., D'Ursi, A.M., Temussi, P.A., and Picone, D. Solution structure of the Alzheimer amyloid beta-peptide (1-42) in an apolar microenvironment. Similarity with a virus fusion domain. Eur J Biochem. 269(22): p. 5642-8. (2002).

96. Zhang, S., Iwata, K., Lachenmann, M.J., Peng, J.W., Li, S., Stimson, E.R., Lu, Y., Felix, A.M., Maggio, J.E., and Lee, J.P. The Alzheimer's peptide a beta adopts a collapsed coil structure in water. J Struct Biol. 130(2-3): p. 130-41. (2000).

97. Barrow, C.J. and Zagorski, M.G. Solution structures of beta peptide and its constituent fragments: relation to amyloid deposition. Science. 253(5016): p. 179-82. (1991).

98. Garzon-Rodriguez, W., Sepulveda-Becerra, M., Milton, S., and Glabe, C.G. Soluble amyloid Abeta-(l-40) exists as a stable dimer at low concentrations. J Biol Chem. 272(34): p. 21037-44. (1997).

99. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C.L., and Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease beta A4 peptides. J Mol Biol. 228(2): p. 460-73. (1992).

100. Roher, A.E., Chaney, M.O., Kuo, Y.M., Webster, S.D., Stine, W.B., Haverkamp, L.J., Woods, A.S., Cotter, R.J., Tuohy, J.M., Krafft, G.A., Bonnell, B.S., and Emmerling, M.R. Morphology and toxicity of Abeta-(l-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. J Biol Chem. 271(34): p. 20631-5. (1996).

101. Podlisny, M.B., Ostaszewski, B.L., Squazzo, S.L., Koo, E.H., Rydell, R.E., Teplow, D.B., and Selkoe, D.J. Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. J Biol Chem. 270(16): p. 9564-70.(1995).

102. Walsh, D.M., Tseng, B.P., Rydel, R.E., Podlisny, M.B., and Selkoe, D.J. The oligomerization of amyloid beta-protein begins intracellularly in cells derived from human brain. Biochemistry. 39(35): p. 10831-9. (2000).

103. Walsh, D.M., Klyubin, I., Fadeeva, J.V., Cullen, W.K., Anwyl, R., Wolfe, M.S., Rowan, M.J., and Selkoe, D.J. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation1 in vivo. Nature. 416(6880): p. 535-9. (2002).

104. Walsh, D.M., Klyubin, I., Fadeeva, J.V., Rowan, M.J., and Selkoe, D.J. Amyloid-beta oligomers: their production, toxicity and therapeutic inhibition. Biochem Soc Trans. 30(4): p. 552-7. (2002).

105. Kuo, Y.M., Emmerling, M.R., Vigo-Pelfrey, C., Kasunic, T.C., Kirkpatrick, J.B., Murdoch, G.H., Ball, M.J., and Roher, A.E. Water-soluble Abeta (N-40, N-42) oligomers in normal and Alzheimer disease brains. J Biol Chem. 271(8): p. 4077-81.(1996).

106. Dahlgren, K.N., Manelli, A.M., Stine, W.B., Jr., Baker, L.K., Krafft, G.A., and LaDu, M.J. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277(35): p. 32046-53. (2002).

107. Barghorn, S., Nimmrich, V., Striebinger, A., Krantz, C., Keller, P., Janson, B., Bahr, M., Schmidt, M., Bitner, R.S., Harlan, J., Barlow, E., Ebert, U., and Hillen, H. Globular amyloid beta-peptide oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease. J Neurochem. 95(3): p. 83447. (2005).

108. LeVine, H., 3rd Alzheimer's beta-peptide oligomer formation at physiologic concentrations. Anal Biochem. 335(1): p. 81-90. (2004).

109. Kagan, B.L., Hirakura, Y., Azimov, R., Azimova, R., and Lin, M.C. The channel hypothesis of Alzheimer's disease: current status. Peptides. 23(7): p. 1311-5. (2002).

110. Quist, A., Doudevski, I., Lin, H., Azimova, R., Ng, D., Frangione, B., Kagan, B., Ghiso, J., and Lai, R. Amyloid ion channels: a common structural link for protein-misfolding disease. Proc Natl Acad Sci USA. 102(30): p. 10427-32. (2005).

111. Fandrich, M. On the structural definition of amyloid fibrils and other polypeptide aggregates. Cell Mol Life Sci. 64(16): p. 2066-78. (2007).

112. Sunde, M., Serpell, L.C., Bartlam, M., Fraser, P.E., Pepys, M.B., and Blake, C.C. Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction. J Mol Biol. 273(3): p. 729-39. (1997).

113. Walsh, D.M., Lomakin, A., Benedek, G.B., Condron, M.M., and Teplow, D.B. Amyloid beta-protein fibrillogenesis. Detection of a protofibrillar intermediate. J Biol Chem. 272(35): p. 22364-72. (1997).

114. Williams, A.D., Sega, M., Chen, M., Kheterpal, I., Geva, M., Berthelier, V., Kaleta, D.T., Cook, K.D., and Wetzel, R. Structural properties of Abeta

protofibrils stabilized by a small molecule. Proc Natl Acad Sci USA. 102(20): p. 7115-20. (2005).

115. Nelson, R., Sawaya, M.R., Balbirnie, M., Madsen, A.O., Riekel, C., Grothe, R., and Eisenberg, D. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435(7043): p. 773-8. (2005).

116. Sawaya, M.R., Sambashivan, S., Nelson, R., Ivanova, M.I., Sievers, S.A., Apostol, M.I., Thompson, M.J., Balbirnie, M., Wiltzius, J.J., McFarlane, H.T., Madsen, A.O., Riekel, C., and Eisenberg, D. Atomic structures of amyloid cross-beta spines reveal varied steric zippers. Nature. 447(7143): p. 453-7. (2007).

117. Harper, J.D. and Lansbury, P.T., Jr. Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins. Annu Rev Biochem. 66: p. 385-407.(1997).

118. Walsh, D.M., Hartley, D.M., Kusumoto, Y., Fezoui, Y., Condron, M.M., Lomakin, A., Benedek, G.B., Selkoe, D.J., and Teplow, D.B. Amyloid betaprotein fibrillogenesis. Structure and biological activity of protofibrillar intermediates. J Biol Chem. 274(36): p. 25945-52. (1999).

119. Arimon, M., Diez-Perez, I., Kogan, M.J., Durany, N., Giralt, E., Sanz, F., and Fernandez-Busquets, X. Fine structure study of Abetal-42 fibrillogenesis with atomic force microscopy. FASEB J. 19(10): p. 1344-6. (2005).

120. Rochet, J.C. and Lansbury, P.T., Jr. Amyloid fibrillogenesis: themes and variations. Curr Opin Struct Biol. 10(1): p. 60-8. (2000).

121. Ross, C.A. and Poirier, M.A. Opinion: What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nat Rev Mol Cell Biol. 6(11): p. 891-8. (2005).

122. Kirschner, D.A., Inouye, H., Duffy, L.K., Sinclair, A., Lind, M., and Selkoe, D.J. Synthetic peptide homologous to beta protein from Alzheimer disease forms amyloid-like fibrils in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 84(19): p. 6953-7. (1987).

123. Sachse, C., Xu, C., Wieligmann, K., Diekmann, S., Grigorieff, N., and Fandrich, M. Quaternary structure of a mature amyloid fibril from Alzheimer's Abeta(l-40) peptide. J Mol Biol. 362(2): p. 347-54. (2006).

124. Schmidt, M., Sachse, C., Richter, W., Xu, C., Fandrich, M., and Grigorieff, N. Comparison of Alzheimer Abeta(l-40) and Abeta(l-42) amyloid fibrils reveals similar protofilament structures. Proc Natl Acad Sci U SA. 106(47): p. 19813-8. (2009).

125. Goldsbury, C.S., Wirtz, S., Muller, S.A., Sunderji, S., Wicki, P., Aebi, U., and Frey, P. Studies on the in vitro assembly of a beta 1-40: implications for the search for a beta fibril formation inhibitors. J Struct Biol. 130(2-3): p. 217-31. (2000).

126. Meinhardt, J., Sachse, C., Hortschansky, P., Grigorieff, N., and Fandrich, M. Abeta(l-40) fibril polymorphism implies diverse interaction patterns in amyloid fibrils. JMolBiol. 386(3): p. 869-77. (2009).

127. Fandrich, M., Schmidt, M., and Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's beta-amyloid structures. Trends Biochem Sci. 36(6): p. 338-45. (2011).

128. Paravastu, A.K., Leapman, R.D., Yau, W.M., and Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci USA. 105(47): p. 18349-54. (2008).

129. Zhang, R., Hu, X., Khant, H., Ludtke, S.J., Chiu, W., Schmid, M.F., Frieden, C., and Lee, J.M. Interprotofilament interactions between Alzheimer's Abetal-42 peptides in amyloid fibrils revealed by cryoEM. Proc Natl Acad Sci USA. 106(12): p. 4653-8. (2009).

130. Fandrich, M., Meinhardt, J., and Grigorieff, N. Structural polymorphism of Alzheimer Abeta and other amyloid fibrils. Prion. 3(2): p. 89-93. (2009).

131. Kodali, R., Williams, A.D., Chemuru, S., and Wetzel, R. Abeta(l-40) forms five distinct amyloid structures whose beta-sheet contents and fibril stabilities are correlated. JMolBiol. 401(3): p. 503-17. (2010).

132. Klement, K., Wieligmann, K., Meinhardt, J., Hortschansky, P., Richter, W., and Fandrich, M. Effect of different salt ions on the propensity of aggregation and on the structure of Alzheimer's abeta(l-40) amyloid fibrils. J Mol Biol. 373(5): p. 1321-33. (2007).

133. Petkova, A.T., Leapman, R.D., Guo, Z., Yau, W.M., Mattson, M.P., and Tycko, R. Self-propagating, molecular-level polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Science. 307(5707): p. 262-5. (2005).

134. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D.M., and Linse, S. Amyloid beta-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chem Neurosci. 1(1): p. 13-8. (2010).

135. Zagorski, M.G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., and Hong, A.

¡Methodological and chemical factors affecting amyloid ' beta peptide

amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309: p. 189-204. (1999).

109

136. Caughey, B. and Lansbury, P.T. Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders. Annu Rev Neurosci. 26: p. 267-98. (2003).

137. Lomakin, A., Chung, D.S., Benedek, G.B., Kirschner, D.A., and Teplow, D.B. On the nucleation and growth of amyloid beta-protein fibrils: detection of nuclei and quantitation of rate constants. Proc Natl Acad Sci USA. 93(3): p. 1125-9. (1996).

138. O^uallain, B., Williams, A.D., Westermark, P., and Wetzel, R. Seeding specificity in amyloid growth induced by heterologous fibrils. J Biol Chem. 279(17): p. 17490-9. (2004).

139. Sengupta, P., Garai, K., Sahoo, B., Shi, Y., Callaway, D.J., and Maiti, S. The amyloid beta peptide (Abeta(l-40)) is thermodynamically soluble at physiological concentrations. Biochemistry. 42(35): p. 10506-13. (2003).

140. Jarrett, J.T. and Lansbury, P.T., Jr. Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell. 73(6): p. 1055-8. (1993).

141. Lazo, N.D., Grant, M.A., Condron, M.C., Rigby, A.C., and Teplow, D.B. On the nucleation of amyloid beta-protein monomer folding. Protein Sci. 14(6): p. 1581-96.(2005).

142. Kirkitadze, M.D., Condron, M.M., and Teplow, D.B. Identification and characterization of key kinetic intermediates in amyloid beta-protein fibrillogenesis. JMolBiol. 312(5): p. 1103-19. (2001).

143. Ban, T., Hoshino, M., Takahashi, S., Hamada, D., Hasegawa, K., Naiki, H., and Goto, Y. Direct observation of Abeta amyloid fibril growth and inhibition. J Mol Biol. 344(3): p. 757-67. (2004).

144. Carulla, N.. Caddy, G.L., Hall, D.R., Zurdo, J., Gairi, M., Feliz, M., Giralt, E., Robinson, C.Y., and Dobson, C.M. Molecular recycling within amyloid fibrils. Nature. 436(7050): p. 554-8. (2005).

145. OTSTuallain, B., Shivaprasad, S., Kheterpal, I., and Wetzel, R. Thermodynamics of A beta(l-40) amyloid fibril elongation. Biochemistry. 44(38): p. 12709-18. (2005).

146. Huang, X., Atwood, C.S., Moir, R.D., Hartshorn, M.A., Vonsattel, J.P., Tanzi, R.E., and Bush, A.I. Zinc-induced Alzheimer's Abetal-40 aggregation is mediated by conformational factors. J Biol Chem. 272(42): p. 26464-70. (1997).

147. Lee, J.Y., Cole, T.B., Palmiter, R.D., Suh, S.W., and Koh, J.Y. Contribution by synaptic zinc to the gender-disparate plaque formation in human Swedish mutant APP transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 99(11): p. 7705-10. (2002).

148. Shen, C.L. and Murphy, R.M. Solvent effects on self-assembly of beta-amyloid peptide. BiophysJ. 69(2): p. 640-51. (1995).

149. Yamamoto, N., Igbabvoa, U., Shimada, Y., Ohno-Iwashita, Y., Kobayashi, M., Wood, W.G., Fujita, S.C., and Yanagisawa, K. Accelerated Abeta aggregation in the presence of GMl-ganglioside-accumulated synaptosomes of aged apoE4-knock-in mouse brain. FEBS Lett. 569(1-3): p. 135-9. (2004).

150. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C.L., and Beyreuther, K. Aggregation and secondary structure of synthetic amyloid beta A4 peptides of Alzheimer's disease. JMolBiol. 218(1): p. 149-63. (1991).

151. Barrow, C.J., Yasuda, A., Kenny, P.T., and Zagorski, M.G. Solution conformations and aggregational properties of synthetic amyloid beta-peptides of Alzheimer's disease. Analysis of circular dichroism spectra. J Mol Biol. 225(4): p. 1075-93. (1992).

152. Fraser, P.E., Nguyen, J.T., Surewicz, W.K., and Kirschner, D.A. pH-dependent structural transitions of Alzheimer amyloid peptides. Biophys J. 60(5): p. 1190-201.(1991).

153. Wood, S.J., Maleeff, B., Hart, T., and Wetzel, R. Physical, morphological and functional differences between ph 5.8 and 7.4 aggregates of the Alzheimer's amyloid peptide Abeta. JMolBiol. 256(5): p. 870-7. (1996).

154. Howlett, D.R., Jennings, K.H., Lee, D.C., Clark, M.S., Brown, F., Wetzel, R., Wood, S.J., Camilleri, P., and Roberts, G.W. Aggregation state and neurotoxic properties of Alzheimer beta-amyloid peptide. Neurodegeneration. 4(1): p. 2332. (1995).

155. Shapira, R., Austin, G.E., and Mirra, S.S. Neuritic plaque amyloid in Alzheimer's disease is highly racemized. JNeurochem. 50(1): p. 69-74. (1988).

156. Tomiyama, T., Asano, S., Furiya, Y., Shirasawa, T., Endo, N., and Mori, H. Racemization of Asp23 residue affects the aggregation properties of Alzheimer amyloid beta protein analogues. J Biol Chem. 269(14): p. 10205-8. (1994).

157. Szendrei, G.I., Prammer, K.V., Vasko, M., Lee, V.M., and Otvos, L., Jr. The effects of aspartic acid-bond isomerization on in vitro properties of the amyloid beta-peptide as modeled with N-terminal decapeptide fragments. Int J Pept

Protein Res. 47(4): p. 289-96. (1996).

Ill

158. Schoneich, C. Methionine oxidation by reactive oxygen species: reaction mechanisms and relevance to Alzheimer's disease. Biochim Biophys Acta. 1703(2): p. 111-9. (2005).

159. Kendrew, J.C., Dickerson, R.E., Strandberg, B.E., Hart, R.G., Davies, D.R., Phillips, D.C., and Shore, V.C. Structure of myoglobin: A three-dimensional Fourier synthesis at 2 A. resolution. Nature. 185(4711): p. 422-7. (1960).

160. Perutz, M.F., Rossmann, M.G., Cullis, A.F., Muirhead, H., Will, G., and North, A.C. Structure of haemoglobin: a three-dimensional Fourier synthesis at 5.5-A. resolution, obtained by X-ray analysis. Nature. 185(4711): p. 416-22. (1960).

161. Williamson, M.P., Havel, T.F., and Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182(2): p. 295-315. (1985).

162. Havel, T.F. and Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182(2): p. 281-94. (1985).

163. Castellani, F., van Rossum, B., Diehl, A., Schubert, M., Rehbein, K., and Oschkinat, H. Structure of a protein determined by solid-state magic-anglespinning NMR spectroscopy. Nature. 420(6911): p. 98-102. (2002).

164. Clore, G.M. and Gronenborn, A.M. New methods of structure refinement for macromolecular structure determination by NMR. Proc Natl Acad Sci USA. 95(11): p. 5891-8.(1998).

165. Evans, J.N.S. Biomolecular NMR Spectroscopy. Oxford: Oxford University Press. (1995).

166. Jacobsen, N.E. NMR spectroscopy explained. New-York: Wiley-Interscience. (2007).

167. Hornak, J.P. The Basics of NMR, on-line guide. (1997-2003). http://www.cis.rit.edu/people/facultv/hornak/.

168. Wuthrich, K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. New York: Wiley-Interscience. (1986).

169. Wagner, G. NMR investigations of protein structure. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 22(2): p. 101-139. (1990).

170. Cornilescu, G., Delaglio, F., and Bax, A. Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology. J Biomol NMR. 13(3): p. 289-302. (1999).

171. Karplus, M. Vicinal Proton Coupling in Nuclear Magnetic Resonance. Journal of the American Chemical Society. 85(18): p. 2870-2871. (1963).

172. Pardi, A., Billeter, M., and Wuthrich, K. Calibration of the angular dependence of the amide proton-C alpha proton coupling constants, 3JHN alpha, in a globular protein. Use of 3JHN alpha for identification of helical secondary structure. JMolBiol. 180(3): p. 741-51. (1984).

173. Vuister, G.W. and Bax, A. Quantitative J correlation: a new approach for measuring homonuclear three-bond J(HNH.alpha.) coupling constants in 15N-enriched proteins. Journal of the American Chemical Society. 115(17): p. 77727777. (1993).

174. Polshakov, V.I., Frenkiel, T.A., Birdsall, B., Soteriou, A., and Feeney, J. Determination of stereospecific assignments, torsion-angle constraints, and rotamer populations in proteins using the program AngleSearch. J. Magn. Reson. B. 108(1): p. 31-43. (1995).

175. Brunger, A.T. X-PLOR: a system for X-ray Crystallography and NMR. New Haven: Yale University Press. (1992).

176. Brunger, A.T., Adams, P.D., Clore, G.M., DeLano, W.L., Gros, P., Grosse-Kunstleve, R.W., Jiang, J.S., Kuszewski, J., Nilges, M., Pannu, N.S., Read, R.J., Rice, L.M., Simonson, T., and Warren, G.L. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54(Pt 5): p. 905-21. (1998).

177. Guntert, P. Automated NMR structure calculation with CYANA. Methods Mol. Biol. 278: p. 353-78. (2004).

178. Van Der Spoel, D., Lindahl, E., Hess, B., Groenhof, G., Mark, A.E., and Berendsen, H.J. GROMACS: fast, flexible, and free. J. Comput. Chem. 26(16): p. 1701-18. (2005).

179. Bardiaux, B., Malliavin, T.E., Nilges, M., and Mazur, A.K. Comparison of different torsion angle approaches for NMR structure determination. J. Biomol. NMR. 34(3): p. 153-66. (2006).

180. Leach, A.R. Molecular Modelling. Principles and applications. Harlow: Pearson Education Ltd. (1996).

181. Schirra, J. Structure Determination of Proteins with NMR Spectroscopy. http://www.crvst.bbk.ac.uk/PPS2/proiects/schirra/html/theory.htm.

182. DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. DeLano Scientific LLC, Palo Alto, CA, USA. (2008).

183. Humphrey, W., Dalke, A., and Schulten, K. VMD: visual molecular dynamics. J Mol Graph. 14(1): p. 33-8, 27-8. (1996).

184. Koradi, R., Billeter, M., and Wuthrich, K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J Mol Graph. 14(1): p. 51-5, 29-32. (1996).

185. Sayle, R.A. and Milner-White, E.J. RASMOL: biomolecular graphics for all. Trends Biochem Sci. 20(9): p. 374. (1995).

186. Senn, H.M. and Thiel, W. QM/MM methods for biomolecular systems. Angew Chem Int Ed Engl. 48(7): p. 1198-229. (2009).

187. Humbel, S., Sieber, S., and Morokuma, K. The IMOMO method: Integration of different levels of molecular orbital approximations for geometry optimization of large systems: Test for n-butane conformation and SN2 reaction: RC1+C1-. The Journal of Chemical Physics. 105(5): p. 1959-1967. (1996).

188. Gil, V.M.S. and Oliveira, N.C. On the use of the method of continuous variations. Journal of Chemical Education. 67(6): p. 473. (1990).

189. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G.W., Zhu, G., Pfeifer, J., and Bax, A. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6(3): p. 277-93. (1995).

190. Goddard. T.D. and Kneller. D.G. http://www.cel. ucsf.edu/home/sparkv.

191. Polshakov, V.I. NMRest: package for work with NMR derived constraints. (1995-1998).

192. Rieping, W., Habeck, M., Bardiaux, B., Bernard, A., Malliavin, T.E., and Nilges, M. ARIA2: automated NOE assignment and data integration in NMR structure calculation. Bioinformatics. 23(3): p. 381-2. (2007).

193. Cornell, W.D., Cieplak, P., Bayly, C.I., Gould, I.R., Merz, K.M., Ferguson, D.M., Spellmeyer, D.C., Fox, T., Caldwell, J.W., and Kollman, P.A. A Second Generation Force Field for the Simulation of Proteins, Nucleic Acids, and Organic Molecules. Journal of the American Chemical Society. 117(19): p. 5179-5197.(1995).

194. Duan, Y., Wu, C., Chowdhury, S., Lee, M.C., Xiong, G., Zhang, W., Yang, R., Cieplak, P., Luo, R., Lee, T., Caldwell, J., Wang, J., and Kollman, P. A pointcharge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations. J Comput Chem. 24(16): p. 1999-2012.(2003).

195. Воеводин, В.В., Жуматий, С.А., Соболев, С.И., Антонов, А.С., Брызгалов, П.А., Никитенко, Д.А., Стефанов, К.С., and Воеводин, В.В. Практика суперкомпьютера "Ломоносов". Открытые системы. - Москва: Издательский дом "Открытые системы". (2012).

196. Hess, В. and van der Vegt, N.F. Hydration thermodynamic properties of amino acid analogues: a systematic comparison of biomolecular force fields and water models. J. Phys. Chem. B. 110(35): p. 17616-26. (2006).

197. Oh, D., Shin, S.Y., Kang, J.H., Hahm, K.S., Kim, K.L., and Kim, Y. NMR structural characterization of cecropin A(l-8) - magainin 2(1-12) and cecropin A (1-8) - melittin (1-12) hybrid peptides. J. Pept. Res. 53(5): p. 578-89. (1999).

198. CPMD, Copyright IBM Corp 1990-2008, http://www.cpmd.org/.

199. Parr, R.G., Gadre, S.R., and Bartolotti, L.J. Local density functional theory of atoms and molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 76(6): p. 2522-6. (1979).

200. Langreth, D.C. and Mehl, M.J. Beyond the local-density approximation in calculations of ground-state electronic properties. Physical Review B. 28(4): p. 1809-1834.(1983).

201. Laasonen, K., Pasquarello, A., Car, R., Lee, C., and Vanderbilt, D. Car-Parrinello molecular dynamics with Vanderbilt ultrasoft pseudopotentials. Phys Rev В Condens Matter. 47(16): p. 10142-10153. (1993).

202. Laskowski, R.A., Rullmannn, J.A., MacArthur, M.W., Kaptein, R., and Thornton, J.M. AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR. J. Biomol. NMR. 8(4): p. 477-86. (1996).

203. Gaggelli, E., Janicka-Klos, A., Jankowska, E., Kozlowski, H., Migliorini, C., Molteni, E., Valensin, D., Valensin, G., and Wieczerzak, E. NMR studies of the Zn2+ interactions with rat and human beta-amyloid (1-28) peptides in water-micelle environment. J Phys Chem B. 112(1): p. 100-9. (2008).

204. Miller, Y., Ma, В., and Nussinov, R. Zinc ions promote Alzheimer Abeta aggregation via population shift of polymorphic states. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107(21): p. 9490-5. (2010).

205. Miller, Y., Ma, В., and Nussinov, R. Polymorphism in Alzheimer Abeta amyloid organization reflects conformational selection in a rugged energy landscape. Chem Rev. 110(8): p. 4820-38. (2010).

' i i1 1

206. Minicozzi, V., Stellato, F., Comai, M., Serra, M.D., Potrich, C., Meyer-Klaucke, W., and Morante, S. Identifying the minimal copper- and zinc-binding site sequence in amyloid-beta peptides. J Biol Chem. 283(16): p. 10784-92. (2008).

207. Kozin, S.A., Mezentsev, Y.V., Kulikova, A.A., Indeykina, M.I., Golovin, A.V., Ivanov, A.S., Tsvetkov, P.O., and Makarov, A.A. Zinc-induced dimerization of the amyloid-beta metal-binding domain 1-16 is mediated by residues 11-14. Mol. Biosyst. 7(4): p. 1053-5. (2011).

208. Кольман, Я. and Рем, К.-Г. Наглядная Биохимия. Москва: Мир. (2000).