Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами и F-актином тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Пономарев, Михаил Александрович

• Пономарев, Михаил Александрович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пономарев, Михаил Александрович

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Структура и основные свойства миозина

1.1.1. Разнообразие миозинов и их общие черты

1.1.2. Фрагменты, получаемые при расщеплении миозина II протеолитическими ферментами

1.1.3. АТРазная активность миозина

1.2. Структура миозиновой головки

1.2.1. Первичная структура тяжелой цепи S1 из скелетных мышц

1.2.2. Третичная структура тяжелой цепи S1 из скелетных мышц

1.3. Цикл работы миозиновой головки. Гипотеза "Lever arm"

1.4. Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке в ходе АТРазной реакции

1.5. Взаимодействие миозина с актином

1.5.1. Структура и основные свойства актина

1.5.2. Кинетическая схема взаимодействия миозина и актина

1.5.3. Свойства поверхности взаимодействия миозиновой головки с актином

1.6. Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для изучения структурных перестроек миозиновой головки

1.6.1. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия как метод изучения структуры белков

1.6.2. Принципы регистрации данных и устройство прибора

1.6.3. Информация, получаемая из калориметрического эксперимента

1.6.4. Применение метода ДСК для изучения структуры S

1.6.5. Применение метода ДСК для изучения структурных перестроек, происходящих в S1 при взаимодействии с нуклеотидами

1.6.6. Применение метода ДСК для исследования изменений тепловой денатурации S1, вызываемых взаимодействием с актином

1.6.6.1. Тепловая денатурация актина

1.6.6.2. Тепловая денатурация комплексов миозиновой головки с актином 63 Экспериментальная часть

2. Материалы и методы

2.1. Выделение миозина из быстрых скелетных мышц кролика

2.2. Получение субфрагмента 1 миозина

2.3. Выделение актина из ацетонового порошка

2.4. Полимеризация актина и стабилизация Е-актина фаллоидином или фторидом бериллия

2.5. Определение АТРазной активности миозина и

2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле с ЗББ-Ыа

2.7. Определение концентрации белков методом Бредфорд

2.8. Модификация остатка Суз-707 в Б

2.9. Модификация остатка Суэ-697 в Б

2.10. Формирование стабильных тройных комплексов и рекомбинантных форм миозиновой головки из В^уозЬеИит сИ8со(йеит с АБР и аналогами Р1 (Уь ВеГх, А^-, 8сЕх)

2.11. Формирование комплексов Б1 и рекомбинантных форм миозиновой головки из ВШуозЬеИит сИ8со1(1еит с Р-актином в состоянии сильного связывания

2.12. Исследования методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК)

2.13. Исследования методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) 76 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Химические модификации БН-групп остатков Суз-697 и Суз-707 в молекуле Б

3.1.1. Специфические модификации 8Н1- и БШ-групп в 81. Исследования методом ДСК

3.1.2. Специфические модификации БШ-группы Б1 спиновыми метками. Исследования методом ЭПР

3.2. Калориметрические исследования фрагментов миозиновой головки из Вж1уо81еИит сИвсогйеит

3.2.1. Калориметрические исследования фрагментов М754, М765, М765-1Л, М765-2К и М864 в отсутствие нуклеотидов

3.2.2. Тепловая денатурация фрагментов миозиновой головки из Dгcíг/osíeZггí.m сИ8со{с1еит в комплексах с АБР и аналогами фосфата

3.2.3. Влияние связывания АБР на тепловую денатурацию фрагмента М765 из Огс£г/05£еКштг сИзсо{с1еит и скелетномышечного

3.3. Исследования методом ДСК доменной организации S1 в отсутствие и в присутствии ADP

3.4. Исследования методом ДСК комплексов миозиновой головки с F-актином

3.4.1. Взаимодействие с F-актином фрагмента М765 с изменениями в актин-связывающей петле

3.4.2. Влияние условий среды на взаимодействие S1 и М765 с F-актином

3.4.3. Взаимодействие S1 с G-актином

3.4.4. Взаимодействие с F-актином препаратов S1, специфически модифицированных по существенным SH-группам 132 Заключение 135 Выводы 136 Список литературы 138 Благодарности

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ATP - аденозинтрифосфат ADP - аденозиндифосфат Pi - неорганический фосфат PPi - пирофосфат Vi - ортованадат

AMPPNP - аденозинимидотрифосфат ATPyS - аденозинтиотрифосфат EDTA - этилендиаминтетраацетат ПААГ -полиакриламидный гель SDS-Na - додецилсульфат натрия DTT - дитиотреитол TLCK - тозиллизинхлорметилкетон PMSF -фенилметилсульфонил фторид

IASL - 4-Ы-йодоацетамидо-2,2,6,6-тетраметилпиперединоксил

MSL - 4-К-малеимидо-2,2,6,6-тетраметилпиперединоксил

IANBD - 4-[Ы-[(йодацетокси)этил]-Ы-метиламино]-7-нитрбензо-2-оксо-1,3диазол

ЛЦ - легкие цепи миозина

ELC - существенная легкая цепь миозина

RLC - регуляторная легкая цепь миозина

LMM - легкий меромиозин

НММ - тяжелый меромиозин

S2 - субфрагмент 2 миозина

S1 - субфрагмент 1 миозина

MD - моторный домен миозиновой головки

MDE - моторный домен миозиновой головки с частью регуляторного домена и существенными легкими цепями

МН - головка миозина

MHF - фрагмент головки миозина

SIDc - фрагмент головки миозина из Dictyostellium discoideum

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами и F-актином»

В основе любых проявлений биологической подвижности у эукариот лежат циклические межбелковые взаимодействия. Такие взаимодействия осуществляются между двумя принципиально разными типами белков. Так называемые "молекулярные моторы" обеспечивают собственно функцию пространственного перемещения и цикличность их работы обусловлена реакцией гидролиза АТР. Направление перемещения определяется другим типом белков, формирующих в некотором роде "рельсы" для "молекулярных моторов". Основным свойством таких белков является способность к полимеризации с образованием филаментов разной длины, причем свойства поверхности филаментов различны, если рассматривать их вдоль с одного конца или с другого. По таким филаментам однонаправленно перемещаются "молекулярные моторы".

Одной из основных задач изучения процессов биологической подвижности является выяснение молекулярных механизмов взаимодействия белков вышеназванных типов. К типу "молекулярных моторов" относятся три класса белков: миозины, динеины и кинезины. Большинство представителей этих классов имеют сложную мультисубъединичную организацию, однако собственно моторную функцию всегда выполняют глобулярные части тяжелых субъединиц, называемые головками. Ко второму типу белков, формирующих "рельсы", относятся актины и тубулины. При этом функциональные системы биологической подвижности сформированы либо миозинами и актинами, либо динеинами, кинезинами и тубулинами. Наиболее распространенными объектами являются миозины и актины, присутствующие во всех эукариотических клетках, а также обеспечивающие все известные типы мышечного сокращения. Наиболее интенсивному исследованию подвергаются мышечные актомиозиновые системы, преимуществом которых является доступность в больших количествах. В связи с этим, наибольшее количество информации накоплено именно об их структуре и функциях. Что же касается тубулинов, формирующих микротрубочки, и взаимодействующих с ними динеинов и кинезинов (эти системы обеспечивают в основном процессы внутриклеточного транспорта), то изучение этих объектов развивается по аналогии с методами и способами, разработанными при исследованиях актомиозиновой системы. Принимая во 7 внимание вышесказанное, объектом для данной диссертационной работы была выбрана именно актомиозиновая система биологической подвижности.

Один из наиболее важных вопросов сводится к следующему - как происходит трансформация химической энергии гидролиза АТР в механическую энергию движения? Для ответа на него в первую очередь необходимо выяснить на уровне изменения химических связей - что происходит с белками, осуществляющими этот процесс. Какими путями исходно локальные изменения структуры миозиновой головки в области активного центра, сопутствующие гидролизу АТР, распространяются на всю молекулу, достигая актин-связывающих центров и, в конечном итоге, обеспечивая глобальные изменения конформации миозиновой головки, необходимые для процесса пространственного перемещения. Не менее важна и другая задача - выяснить, каким образом взаимодействия миозиновой головки с актином (по сравнению с размерами самого "мотора" эти взаимодействия тоже можно назвать локальными) модулируют АТР-зависимые структурные перестройки головки.

К девяностым годам в мировой науке был накоплен огромный материал, позволивший на основании косвенных данных предложить несколько гипотез пространственной организации миозиновой головки [Vibert & Cohen, 1988; Botts et al., 1989; Winkelmann et al., 1991; Левицкий, 1991; Levitsky, 1994]. В 1993 году была представлена ее третичная структура, определенная методом рентгеноструктурного анализа [Rayment et al., 1993а]. Это событие позволило перейти от предположительных рассуждений о структуре миозиновой головки и ее комплексов с актином к более конкретным данным, оперирующим с параметрами отдельных ковалентных связей в полипептидной цепи. Однако результаты, получаемые методом рентгенографии, остаются спорными при использовании их для описания систем, работающих в физиологических условиях. Таким образом, молекулярная механика работы актомиозиновой системы остается еще до конца не ясной. Настоящая диссертационная работа посвящена дальнейшему выяснению молекулярных механизмов, обеспечивающих процессы биологической подвижности в актомиозиновых системах, и разработке новых подходов к решению возникающих при этом задач. 8

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Пономарев, Михаил Александрович

Выводы

1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) исследовано влияние модификации остатков Cys-707 и Cys-697 в изолированной миозиновой головке (субфрагмент 1 миозина, S1) на структурные перестройки S1, вызываемые образованием стабильных тройных комплексов с ADP и аналогами неорганического фосфата -ортованадатом (Vj) и фторидами бериллия (BeFx) или алюминия (A1F4). Показано, что специфическая модификация этих остатков препятствует структурным перестройкам, происходящим в молекуле S1 при образовании комплексов Sl-ADP-Vi и S1-ADP-A1F4, но почти не влияет на перестройки, вызываемые образованием комплекса Sl-ADP-BeFx.

2. При комплексном использовании методов ДСК и ЭПР получены прямые подтверждения высказывавшихся в литературе предположений о том, что комплекс Sl-ADP-BeFx отличается от всех других тройных комплексов: он моделирует промежуточное состояние М*-АТР АТРазной реакции миозина, тогда как комплексы Sl-ADP-Vi и S1-ADP-A1F4 имитируют состояние M**-ADP-Pi

3. Методом ДСК исследованы экспрессируемые в Dictyostelium discoideum фрагменты миозиновой головки, соответствующие глобулярной моторной части головки, и показано, что эти фрагменты сохраняют способность к структурным перестройкам при образовании тройных комплексов с ADP и аналогами фосфата. Сделан вывод, что такие перестройки происходят в глобулярной моторной части головки.

4. Методом ДСК с использованием процедуры "последовательного отжига" исследовано влияние ADP на доменную структуру S1. Показано, что связывание ADP вызывает структурные изменения лишь в моторном (но не в регуляторном) домене миозиновой головки и не влияет на взаимодействие между этими доменами.

5. Разработан новый подход к регистрации структурных перестроек, происходящих в миозиновой головке при взаимодействии с F-актином. В основе этого подхода лежит значительное увеличение термостабильности

137 изолированной головки миозина в результате ее взаимодействия с F-актином, отчетливо регистрируемое методом ДСК.

6. При исследованиях фрагментов головки миозина из Dictyostelium discoideum с изменениями заряда в области актин-связывающего участка показано, что такие изменения оказывают существенное влияние на способность головки подвергаться глобальной структурной перестройке при взаимодействии с F-актином.

7. Показано, что модификация SH2-rpynnbi остатка Cys-697 в S1 не оказывает существенного влияния на вызываемые F-актином изменения характера тепловой денатурации S1, тогда как модификация SH1-группы остатка Cys-707 существенно усиливает такие изменения. Высказано предположение о том, что наблюдаемые методом ДСК глобальные структурные перестройки головки миозина при связывании F-актина включают взаимодействие между участками головки, расположенными в пространстве далеко друг от друга.

Заключение

Приведенные данные наглядно демонстрируют, на наш взгляд, те новые возможности, которые предоставляет использование метода ДСК для структурно-функциональных исследований головки миозина и для выяснения особенностей ее работы в качестве "молекулярного мотора". Применение этого метода позволяет не только проводить подробные исследования доменной организации миозиновой головки, но и выявлять (а впоследствии более детально изучать) глобальные структурные перестройки, происходящие в головке миозина в процессе ее функционирования, т. е. в ходе АТРазной реакции и при взаимодействии с актином. Таким образом, применение метода ДСК в сочетании с другими методами предоставляет новые (и зачастую уникальные) возможности для разработки новых подходов к изучению молекулярного механизма процессов биологической подвижности, основанных на взаимодействии миозина с актином.

136

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пономарев, Михаил Александрович, 2000 год

1. Левицкий Д. И., Хайтлина С. Ю., Гусев Н. Б. Белки актомиозиновой системы подвижности. (1995) В кн.: "Белки и пептиды" (ред. Иванов В. Т., Липкин В. М.) М.: Наука, том 1, Глава "Двигательные белки", с. 249-293.

2. Любарев А. Е., Курганов Б. И. Моделирование процесса необратимой тепловой денатурации белка при переменной температуре. I. Модель,включающая две последовательно протекающие необратимые стадии. (1998) Биохимия, 63, 516-523.

3. Поглазов Б. Ф., Билуши В., Баев А. А. О сульфгидрильных группах миозиновой аденозинтрифосфатазы. (1958) Биохимия, 23, 269-284. Поглазов Б. Ф., Левицкий Д. И. Миозин и биологическая подвижность. (1982) Изд-во "Наука", М., 160 С.

4. Хворов Н. В., Левицкий Д. И., Букатина А. Е., Шныров В. Л., Поглазов Б.Ф. Калориметрические доказательства двух конформационных состояний комплекса субфрагмента-1 миозина с нуклеотидами. (1990) Доклады АН СССР, 315, 745-748.

5. Шныров В. Л., Левицкий Д. И., Веденкина Н. С., Николаева О. П., Хворов Н. В., Пермяков Е. А., Поглазов Б. Ф. Доменная структура субфрагмента 1 миозина. (1989) Доклады АН СССР, 304, 1497-1499.

6. Ajtai K. and Burghardt T. P. Fluorescent modification and orientation of myosin sulfhydryl 2 in skeletal muscle fibers. (1989) Biochemistry, 28, 2204-2210.

7. Ajtai K., Poto L., Burghardt T. P. Specificity and orientation of (iodoacetamido)proxyl spin-labeled myosin subfragment 1 decorating muscle fibers: localization of protein-bound spin labels using SDS-PAGE. (1990) Biochemistry, 29, 7733-7741.

8. Barnett V. A., Thomas D. D. Resolution of conformational states of spinlabeled myosin during steady-state ATP hydrolysis. (1987) Biochemistry, 26, 314-323.

9. Bertazzon A. and Tsong T. Y. High-resolution differential scanning calorimetric study of myosin, functional domains, and supramolecular structures (1989) Biochemistry, 28, 9784-9790.

10. Bertazzon A. Tian G. H., Lamblin A., Tsong T. Y. Enthalpic and entropic contributions to actin stability: calorimetry, circular dichroism, and fluorescence study and effects of calcium. (1990) Biochemistry, 29, 291298.

11. Bobkova, E. A., Bobkov, A. A., Levitsky, D. I., Reisler, E. Effects of SHI and SH2 modifications on myosin: similarities and differences. (1999) Biophys. J., 76, 1001-1007.

12. Botts J. , Thomason J. F. and Morales M. F. On the origin and transmission of force in actomyosin subfragment 1. (1989) PNAS USA, 86, 2204-2208.

13. Bradford M. M. A rapid and sencitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. (1976) Anal. Biochem., 72, 248-254.

14. Brandts J. F. and Lin L.-N. Study of strong to ultralight protein interactions using differential scanning calorimetry. (1990) Biochemistry, 29, 6927-6940.

15. Brouillette C. G., Muccio D. D. and Finney T. K. (1987) Biochemistry, 26, 74431-7438.

16. Burke M., Rajasekharan K. N., Maruta S. and Ikebe M. A second consensus sequence of ATP-requiring proteins resides in the 21-kDa C-terminal segment of myosin subfragment-1. (1990) FEBS Lett., 262, 185188.

17. Cope M., Whisstock J., Rayment I. and Kendrick-Jones J. Conservation within the myosin motor domain: implications for structure and function. (1996) Structure, 4, 969-987.

18. Cremo C. R., Grammer J. C. and Yount R. G. Direct chemical evidence that serine 180 in the glycine-rich loop of myosin binds to ATP. (1989) J. Biol. Chem., 264, 6608-6611.

19. DasGupta G. and Reisler E. Antibody aganist the amino terminus of alpha-actin inhibits actomyosin interactions in the presence of ATP. (1989) J. Mol. Biol, 207, 833-836.

20. Dominguez R., Freyzon Y., Trybus K. M. and Cohen C. Crystal structure of a vertebrate smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain: visualization of the pre-power stroke state. (1998) Cell, 94, 559-571.

21. Engelgardt V. A. and Ljubimova M. N. Myosin andadenosinetriphosphatase (1939) Nature, 144, 668-669.

22. Finkelstein A. A. Can protein unfolding simulate protein folding? (1997) Protein Engineering, 10, 843-845.

23. Fisher A. J., Smith C. A., Thoden J. B., Smith R., Sutoh K., Holden H. M. and Rayment I. X-ray structure of the myosin motor domain of Dictyostellium discoideum complexed with MgADPBeFx and MgADP AIF4-. (1995a) Biochemistry, 34, 8960-8972.

24. Fisher A. J., Smith C. A., Thoden J. B., Smith R., Sutoh K., Holden H. M. and Rayment I. Structural studies of myosin;nucleotide complexes: A revised model for the molecular basis of muscle contraction. (1995b) Biophys. J., 68, 19s-28s.

25. Geeves M. A., and Conibear P. B. Th role of the three-state docking of myosin SI with actin in force generation. (1995) Biophys. J., 68, 194s-199s.

26. Goodno C. C. Inhibition of myosin ATPase by vanadate ion. (1979) PNAS USA, 76, 2620-2624.

27. Gopal D. and Burke M. Formation of stable inhibitory comlexes of myosin subfragment-1 using fluoroscandium anions. (1995) J. Biol. Chem., 270, 19282-19286.

28. Gulick A. M., Bauer C. B., Thoden J. B. and Raiment I. X-ray structures of the MgADP, MgADPyS, and MgAMPPNP complexes of the Dictyostellium discoideum myosin motor domain. (1997) Biochemistry, 36, 11619-11628.

29. Holmes K. C. Muscle proteins their actions and interactions. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol, 6, 781-789.

30. Holmes K. C. The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. (1997) Curr. Biol, 7, R112-R118.

31. Holmes K. C. Muscle contraction. In the limits of reductionism in biology. (1998) Novartis Foundation Symposium 213 (Chichester: Wiley), 76-92.

32. Houdusse A., Kalabokis V. N., Himmel D., Szent-Gyorgyi A. G. and Cohen C. Atomic structure of scallop myosin subfragment SI complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head. (1999) Cell, 97, 459-470.

33. Hozumi T. and Muhlard A. Reactive lysyl of myosin subfragment-1: location on the 27K fragment and labeling properties. (1981) Biochemistry, 20, 2945-2950.

34. Huston E., E., Grammer J., C. and Yount R. G. Flexibility of the myosin heavy chain: direct evidence that the region containing SHX and SH2 can move 10 A under influence of nukleotide binding. (1988) Biochemistry, 27, 8945-8952.

35. Jonson K. A. and Taylor E. W. Intermediate states of subfragment-1 ATPase: réévaluation of the mechanism. (1978) Biochemistry, 17, 34323442.

36. Kurganov B. I., Lyubarev A. E., Sanchez-Ruiz J. M., Shnyrov V. L. Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins. Criteriaof validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation. (1997) Biophys. Chem., 69, 125-135.

37. Manstein D. J., Ruppel K. M. and Spudich J. A. Expression and characterization of a functional myosin head fragment in Dictyostelium discoideum. (1989) Science, 246, 656-658.

38. Mendelson R. and Morris E. P. The structure of the acto-myosin subfragment 1 complex: results of searches using data from electron microscopy and x-ray cristallography. (1997) PNAS USA, 94, 8533-8538.

39. Milligan R., Whittaker M., Safer D. Molecular structure of F-actin and locations of surface binding sites. (1990) Nature, 348, 217-221.

40. Milligan R. A. Protein-protein interactions in the rigor actomyosin complex. (1996) PNAS USA, 93, 21-26.

41. Mornet D., Pantel P., Audemard E., Derancourt J. and Kassab R. Molecular movements promoted by metal nucleotides in the heavy-chain regions of myosin heads from sceletal muscle. (1985) J. Molec. Biol., 183, 479-489.

42. Mornet D., Bertrand R., Pantel P., Audemard E. and Kassab R. Structure of the actin-myosin interface. (1981) Nature, 292, 301-306.

43. Muhlard A. and Takashi R. Ionization of reactive lysyl residue of myosin subfragment-1. (1981) Biochemistry, 20, 6749-6754.

44. Murphy C. T. and Spudich J. A. The sequence of the myosin 50-20 K loop affects myosin's affinity for actin throughout the actin-myosin ATPase cycle and its maximum ATPase activity. (1999) Biochemistry, 38, 3785-3792.

45. Nikolaeva O. P., Bobkov A. A., Orlov V. N., Levitsky D.I. Thermal stability of myosin subfragment 1 dramatically decreases upon tryptic cleavage in the N-terminal region of myosin heavy chain. (1997) J. Muscle Res. and Cell Motility., 18, 258.

46. Nikolaeva O. P., Dedova I. V., Khvorova I. S., Levitsky D. I. Interaction of F-actin with phosphate analogues studied by differential scanning calorimetry. (1994) FEBS Lett., 351, 15-18.

47. Nikolaeva N. O., Orlov V. N., Dedova I. V., Drachev V. A. and Levitsky D. I. Interaction of myosin subfragment 1 with F-actin studied by differential scanning calorimetry. (1996) Biochem. Mol. Biol. Int., 40, 653661.

48. Okamoto Y. and Yount R. G. Identification of an active site peptide of skeletal myosin after photoaffinity labeling with N-(4-azido-2-nitrophenyl)-2-aminoethyl diphosphate. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 1575-1579.

49. Panusz T. H., Graczyk G., Wilmanska D. and Skarzinsky J. Analysis of ortophosphate-pyrophosphate mixtures resulting from weak pyrophosphatase activity (1970) Anal. Biochem., 35, 494-504.

50. Patterson B., Ruppel K. M., Wu Y. and Spudich J. A. Cold-sensitive mutants G680V and G691C of Dictyostelium myosin II conferdramatically different biochemicle defects. (1997) J. Biol. Chem., 272, 27612-27617.

51. Phan B., Faller L. D. and Reisler E. Kinetics and equilibrium analysis of the interactions of actomyosin subfragment-1 ADP with berillium fluoride. (1993) Biochemistry, 32, 7712-7719.

52. Phan B. and Reisler E. Inhibition of myosin ATPase by berillium fluoride. (1992) Biochemistry, 31, 4787-4793.

53. Privalov P. L. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. (1982) Adv. Protein Chem., 35, 1-104.

54. Privalov P. L. and Potekhin S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. (1986) Methods Enzymol, 131, 4-51.

55. Rayment I., Holden H. M., Wittaker M., Yohn C. B., Lorenz M., Holmes K. C., Milligan R. A. Structure of the actin-myosin complex and its implication for muscle contrction. (1993b) Science, 261, 58-65.

56. Rayment I. and Holden H. The three-dimentional structure of a molecular motor. (1994) TIBS, 19, 129-134.

57. Rayment I., Ripniewsky W. R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D. R., Benning M., M., Winkelmann D. A., Wesenberg G. and Holmes H. M. Three-dimentional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. (1993a) Science, 261, 50-58.

58. Reedy M. K., Myosin-actin motors: the partnership goes atomic. (1993) Structure, 1, 1-5.

59. Reisler E., Sulfhydryl modification and labeling of myosin (1982) Methods Enzymol, 85, 84-93.

60. Reisler E., Burke M., Himmelfarb S. and Harrington W. F. Spatial proximity of the two essential sulfhydryl groups of myosin. (1974) Biochemistry, 13, 3837-3840.

61. Ritchie M. D. Geeves M. A., Woodward S. K. A. and Manstein D. J. Kinetic characterization of a cytoplasmic myosin motor domain expressed in Dictyostelium discoideum. (1993) PNAS USA, 90, 8619-8623.148

62. Roopnarine O. and Thomas D. D. Orientation of intermediate nucleotide states of indan dione spin-labeled myosin heads in muscle fibers. (1996) Biophys. J., 70, 2795-2806.

63. Root D. and Reisler E. Cooperativity of thiol-modified myosin filaments. ATPase and motolity assays of myosin function. (1992) Biophys. J., 63, 730-740.

64. Ruiz-Arribas A., Santamaria R. I., Zhadan G. G., Villar E. and Shnyrov V. L. Differential scanning calorimetric study of the thermal stability of xylanase from Streptomyces halstedii JM8. (1994) Biochemistry, 33, 13787-13791.

65. Sanchez-Ruiz J. M., Lopez-Lacomba J. L., Cortijo M. and Mateo P. L. Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin. (1988) Biochemistry, 27, 1648-1652.

66. Sanchez-Ruiz J. M. Differential scanning calorimetry of proteins. (1992a) Subcell. Biochem., 24, 133-176.

67. Sanchez-Ruiz J. M. Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry. (1992b) Biophys. J., 61, 921-935.

68. Saraste M., Sibbald P. and Wittinghofer A. The P-loop a common motif in ATP and GTP-binding proteins. (1990) TIBS, 15, 430-434.

69. Sellers J., K., Goodson H., V. and Wang F. A miosyn family reunion. (1996) J. Muscle Res. Cell Motil., 17, 7-22.

70. Shnyrov V. L. and Mateo P. L. Thermal transitions in purple membrane from Halobacterium halobium. (1993) FEBS Lett., 324, 237-240.

71. Shnyrov V. L., Sanchez-Ruiz J. M., Boiko B. N., Zhadan G. G., Permyakov E. A. Application of scanning microcalorimetry in biophysics and biochemistry. (1997a) Thermochimica Acta 302, 165-180.

72. Sriver J. W. and Kamath U. Differential scanning calorimetry of the unfolding of myosin subfragment 1, subfragment 2, and heavy meromyosin. (1990) Biochemistry, 29, 2556-2564.

73. Smyth C. A. and Rayment I. X-ray structure of the Magnesium(II)-pyrophosphate complex of the truncated head of Dictyostelliumdiscoideum myosin to 2.7 A resolution. (1995) Biochemistry, 34, 89738981.

74. Smyth C. A. and Rayment I. X-ray structure of the Magnesium(II)'ADP Vanadate complex of the Dictyostellium discoideum myosin motr domain to 1.9 A Resolution. (1996) Biochemistry, 35, 54045417.

75. Spudich J. A. How molecular motors work. (1994) Nature, 372, 515-518.

76. Spudich J. A. and Watt S The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. (1971) J. Biol. Chem., 246, 4866-4871.

77. Sugimoto Y., Tokunaga M., Takezawa Y., Ikebe M. and Wakabayashi K. Conformational changes of the myosin heads during hydrolysis of ATP as analyzed by x-ray solution scattering. (1995) Biophys. J., 68, 29s-34s.

78. Sutoh K. Identification of the myosin-binding sites on the actin sequens1982) Biochemistry, 21, 3654-3661.

79. Sutoh K. A short hydrophobic segment next to tryptophan-130 in myosin heavy chain is close to the ribose ring of ADP bound in the adenosinetriphosphatase site. (1987) Biochemistry, 26, 7648-7654.

80. Suzuki Y., Yasunaga T., Ohkura R., Wakabayashi T. and Sutoh K. Swing of the lever arm of a myosin motor of the at the isomerization and phosphate-release steps. (1998) Nature, 396, 380-383.

81. Tong S. W. and Elzinga M. The sequence of the NH2-terminal 204-residue fragment of the heavy chain of rabbit skeletal muscle myosin.1983) J. Biol. Chem., 258, 13100-13110.

82. Tong S. W. and Elzinga M. Amino acid sequence of rabbit skeletal muscle myosin. 50 kDa fragment of the heavy chain. (1990) J. Biol. Chem., 265, 4893-4901.

83. Trayer I. P., Trayer H. R., Levin B. A. Evidence that the N-terminal region of A1-light chain of myosin interacts directly with C-terminal region of actin. (1987) Eur. J. Biochem., 164, 259-266.

84. Uyeda T., Abramson P. and Spudich J., A. The neck region of the myosin motor acts as a lever arm to generate movement. (1996) PNAS USA, 93, 4459-4464.

85. Uyeda T. Q. P., Ruppel K. M. and Spudich J. A. Enzymatic activities correlate with chimaerie substitutions at the actin-binding face of myosin. (1994) Nature, 368, 567-569.150

86. Vibert P. and Cohen C. Domains, motions and regulation in the myosin head. (1988) J. Muscle Res. Cell Motil, 9, 296-305

87. Weeds A. G. and Pope B. Studies on the chymotriptic digestion of myosin. Effect of divalent cations on the proteolytic susceptibility. (1977) J. Mol. Biol, 111, 129-157.

88. Weeds A. G. and Taylor R. S. Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin. (1975) Nature, 257, 54-56.

89. Wells C., Bagshaw C. R. The characterization of vanadate-trapped nucleotide complexes with spin-labeled myosin. (1984) J. Muscle Res. and Cell Motil, 5, 97-112.

90. Wells J. A. and Yount R. G. Reaction of a 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) with myosin subfragment one: evidence for formation of a single protein disulfide with trapping of metal nucleotide at the active site. (1980) Biochemistry, 19, 1711-1717.

91. Werber M. M., Peyser M., Muhlard A. Characterization of stable beryllium fluorid, aluminium fluoride, and vanadate containing myosin subfragment 1 nucleotide complexes. (1992) Biochemistry, 31, 71907197.

92. Werber M. M., Szent-Gyorgy A. G. and Fasman G. Fluorescence studies on heavy meromyosin-substrate interactions. (1972) Biochemistry, 11, 2872-2883.

93. Whittaker M., Wilson-Kubalek E. M., Smith J. E., Faust L., Milligan R. A. and Sweeney H. L. A 35-A movement of smooth muscle myosin on ADP release. (1995) Nature, 378, 748-751.

94. Winkelmann D. A., Baker T. S. and Rayment I. Three-dimentional structure of myosin subfragment-1 from electron microscopy of sectioned crystals. (1991) J. Cell Biol, 114, 487-501.

95. Xie X., Harrison D. H., Schlichting I., Sweet R. M., Kalabokis V. N., Szent-Gyorgi A. G. and Cohen C. Structure of regulatore domain of scallop myosin at 2.8A resolution. (1994) Nature, 368, 306-312.

96. Yamamoto K. Shift of binding site at the interface between actin and myosin. (1990) Biochemistry, 29, 844-848.

97. Yamamoto K. and Sekine T. Interaction of alkali light chain 1 with actin: effect of ionic strength on the cross-linking of alkali chain 1 with actin. (1983) J. Biochem. (Tokyo), 94, 2075-2078.1521. Благодарности

98. Я глубоко признателен своему научному руководителю доктору биологических наук Дмитрию Ивановичу Левицкому за постоянную поддержку на протяжении всего времени моей работы и черезвычайно неоценимое внимание.

99. Я благодарен моим родным и близким за постоянную моральную и техническую поддержку, и особенно жене и дочери, без которых вряд ли когда-нибудь появился бы (и т. д.) настоящий текст.