Структурные и функциональные детерминанты кальцийсвязывающих белков семейства «EF-руки» на примере парвальбуминов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Хорн Полина Александровна

• Хорн Полина Александровна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Хорн Полина Александровна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Научная новизна

Практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Вклад автора

Апробация диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Мотив «ЕF-руки»

1.2 Разнообразие доменов «ЕF-руки»

1.3 Строение белков семейства «ЕF-руки»

1.4 Сродство домена «ЕF-руки» к связыванию Са2+

1.5 Са2+-индуцированные изменения в белках семейства «ЕF-руки»

1.6 Строение и свойства парвальбуминов

1.6.1 Структура гена, локализация в хромосоме, изоформы

1.6.2 Первичная последовательность

1.6.3 Вторичная структура

1.6.4 Третичная структура

1.6.5 Физико-химические свойства

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.2.1 Наработка генетических конструкций Р-ПА

2.2.2 Получение рекомбинантного Р-ПА крысы и его мутантов

2.2.3 Получение рекомбинантного Р-ПА кижуча

2.2.4 Белковый гель-электрофорез

2.2.5 Определение концентрации исследуемых белков

2.2.6 Тест Эллмана

2.2.7 Восстановление SH-групп Р-парвальбумина

2.2.8 Масс-спектрометрия

2.2.9 Приготовление раствора калиевой соли ЭДТА/ЭГТА

2.2.10 Очистка белков от катионов металлов

2.2.11 Круговой дихроизм

2.2.12 Дифференциальная сканирующая калориметрия

2.2.13 Метод химического сшивания глутаровым альдегидом

2.2.14 Ограниченный протеолиз

2.2.15 Динамическое светорассеяние

2.2.16 Измерение флуоресценции

2.2.17 Равновесные константы связывания Са2+/М£2+ белком

2.2.18 Оценка сродства к Mg2+ методом равновесного диализа

2.2.19 Определение сродства к Са2+ методом Са2+-буферов

2.2.20 Оценка кинетических констант ассоциации/диссоциации Са2+/М§2+ белком

2.2.21 Спектрофотометрическое кислотно-основное титрование

2.2.22 Приготовление дисульфидного димера Р-ПА крысы

2.2.23 Определение редокс-потенциала Р-ПА крысы

2.2.24 Расчет идентичности аминокислотных последовательностей

2.2.25 Предсказание внутренней неупорядоченности белка

2.2.26 Анализ аминокислотного состава белка

2.2.27 Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Роль «черного» и «серого» кластеров спаренного домена «ЕF-руки» Р-ПА в поддержании структурных и функциональных свойств белка

3.2 Структурно-функциональная роль высококонсервативного цистеина инактивированной «ЕF-петли» Р-ПА

3.3 Распространенность внутренней неупорядоченности апо-формы среди

парвальбуминов, влияние этого явления на сродство белка к Са2+

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ПРИЛОЖЕНИЕ В

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

ПРИЛОЖЕНИЕ Д

ПРИЛОЖЕНИЕ Е

ПРИЛОЖЕНИЕ Ж

ПРИЛОЖЕНИЕ З

ПРИЛОЖЕНИЕ И

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурные и функциональные детерминанты кальцийсвязывающих белков семейства «EF-руки» на примере парвальбуминов»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Белки семейства «ЕF-руки», эволюционно древнего, самого многочисленного (свыше 180 генов в геноме человека) и хорошо изученного суперсемейства кальцийсвязывающих белков, участвуют в регуляции множества биологических процессов путем Ca2+/Mg2+-зависимой модуляции активности других белков. Белки этого семейства участвуют в дифференцировке и пролиферации клеток, апоптозе, мышечном сокращении, фоторецепции, нервной проводимости, секреции, и прочих жизненно важных процессах. Широкий спектр функциональных ролей белков семейства «ЕF-руки» обуславливает их участие в патогенезе сердечно-сосудистых, онкологических, нейродегенеративных, аутоиммунных, воспалительных и инфекционных заболеваний, что делает белки этого семейства ценным объектом для изучения как с точки зрения фундаментальной науки, так и для многочисленных медицинских и биотехнологических приложений.

Характерная особенность строения белков семейства «ЕF-руки» - наличие Ca2+-связывающего мотива, состоящего из 30 аминокислотных остатков, образующих две а-спирали, «Е» и <^», и консенсусной петли между ними, состоящей из 12 остатков, координирующей ион Са2+/И^+ атомами кислорода карбоксильных/карбонильных групп и молекул воды (запись PDОC00018 базы данных PRОSITЕ; Рисунки 1Г и 1Д). Впервые мотив «ЕF-руки» был обнаружен в структуре парвальбумина (ПА), небольшого (11-12 кДа) цитозольного белка позвоночных (Рисунок 1), экспрессируемого в мышцах, сердечной ткани, нефронах, специфических нейронах, в некоторых клетках эндокринных желез, сенсорных клетках слухового органа, и некоторых других клетках. В большинстве случаев два мотива «ЕF-руки» объединены в спаренный домен, что обеспечивает кооперативность процесса связывания Са2+. Недавнее исследование структурных особенностей спаренного домена «EF-руки» обнаружило неэквивалентность

входящих в состав домена единичных мотивов, а также позволило выявить два высококонсервативных кластера аминокислотных остатков, содержащих по три остатка, названных «черным» (Рисунок 1А) и «серым» (Рисунок 1Б) кластерами [1].

Рисунок 1. Наложенные трехмерные структуры апо-формы (зеленая, код PDB 2ЖК) и Са2+-формы (голубая, код PDB 1ИЯО) р-ПА крысы. А, аминокислотные остатки «черного» кластера домена «ЕF-руки»; Б, остатки «серого» кластера; В, высококонсервативный Cys18; Г, схематическое изображение мотива «ЕF-руки» (взято из [6]); Д, кальцийсвязывающая петля

«Черный» кластер менее вариабелен и преимущественно содержит ароматические аминокислотные остатки, в то время как «серый» кластер менее консервативен и содержит как гидрофобные, так и полярные остатки [1]. Оба кластера поддерживают структурные и функциональные свойства Са2+-связывающей петли DxDxDG и гидрофобного ядра домена «ЕF-рука». Было предложено, что остатки «черного» кластера обеспечивают структурную

целостность домена, в то время как остатки «серого» кластера обеспечивают «настройку» функциональных свойств домена «EF-руки». Тем не менее, структурное и функциональное значение «черного» и «серого» кластеров белков семейства «EF-руки» остается невыясненным.

Сродство белков семейства «ЕF-руки» к Са2+ варьируется в широких пределах, достигая величин константы диссоциации комплекса, Ка, около 0,1 нМ. Большинство белков семейства «ЕF-руки» является белками-сенсорами Са2+, изменяющими свою структуру в ответ на связывание Са2+, что сопровождается изменениями их взаимодействия с белками-партнерами и соответствующей модуляцией активности последних. Белки-буферы Са2+, в частности ПА, участвуют в поддержании концентрации и модуляции свободного Са2+ в клетке. Отметим, что деление Са2+-связывающих белков на «кальциевые сенсоры» и «кальциевые буферы» является условным. Так, для некоторых Р-ПА обнаружены свойства, характерные для кальциевых сенсоров. Более того, функциональная роль большинства белков семейства «ЕF-руки» не установлена.

Около трети мотивов «ЕF-руки» в ходе эволюции утратили способность связывать Са2+ [3]. Так, структура ПА включает в себя три мотива «ЕF-руки», два из которых, ЕF и CD, проявляют высокое (Ка ~ 0,1 - 1 нМ) сродство к кальцию, а один, АВ, неактивен. Тем не менее, он играет важную роль в поддержании структурной стабильности белка и его сродства к Са2+. Р-ПА содержит высококонсервативный остаток цистеина в неактивной АВ-петле (Рисунок 1В), отличающий р изоформу ПА от а изоформы белка. Наличие консервативного цистеина в неактивной ЕF-петле характерно для многих белков семейства нейрональных кальциевых сенсоров и сопряжено с их редокс-чувствительностью. Тем не менее, функциональная роль высококонсервативного остатка цистеина в структуре Р-ПА остается невыясненной.

Несмотря на выраженные различия представителей семейства «ЕF-руки» в способности связывать Са2+, координация иона металла в них осуществляется посредством атомов кислорода остатков Asp/Glu или карбонила основной цепи, а

также молекул воды. В отсутствие связанного иона Са2+ электростатическое отталкивание отрицательно заряженных атомов кислорода, участвующих в координации Са2+, дестабилизирует кальцийсвязывающий центр, что в отдельных случаях приводит к потере жесткой структуры белка. Единичные доказанные случаи такого поведения белков не позволяют судить о его распространённости. Термодинамические соображения указывают на то, что неупорядоченность апо-формы белка должна способствовать достижению максимального сродства белка к металлу. Неупорядоченность апо-формы наблюдается и в отдельных парвальбуминах, однако функциональная роль этого явления не ясна.

В целом, несмотря на обилие информации о структурных и функциональных свойствах белков семейства «ЕF-руки», многие фундаментальные аспекты их функционирования остаются невыясненными.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - изучить влияние отдельных структурных особенностей кальцийсвязывающих белков семейства «ЕF-руки» на их функционирование. В качестве объекта исследования выбран классический представитель семейства «ЕF-руки», парвальбумин, демонстрирующий все особенности, выбранные для изучения: «черный» и «серый» кластеры консервативных аминокислотных остатков спаренного домена «ЕF-руки», высококонсервативный остаток цистеина в инактивированной «ЕF-петле», внутренняя неупорядоченность апо-формы белка. В соответствии с выбранной целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный экспериментальный анализ роли «черного» и «серого» кластеров Р-ПА крысы в поддержании структурных и функциональных свойств белка, используя точечный мутагенез.

2. Изучить окислительно-восстановительные свойства высококонсервативного остатка Cys 18 инактивированной «ЕF-петли» Р-ПА крысы, а также

чувствительность структурно-функциональных свойств белка к малым структурным модификациям остатка Cys 18 на примере замены С18S.

3. Оценить распространенность внутренней неупорядоченности апо-формы среди парвальбуминов, а также проверить взаимосвязь этого явления с повышенным сродством белка к катионам кальция.

Научная новизна

Все достигнутые результаты работы являются оригинальными. В работе была впервые экспериментально изучена чувствительность к аминокислотным заменам консервативных аминокислотных остатков в «черном» и «сером» кластере спаренного домена «ЕF-руки» на примере Р-ПА крысы, что позволило установить неэквивалентность кластеров в поддержании структурно-функциональных свойств белка. Впервые показана потенциальная возможность редокс-сенсорной роли высоконсервативного остатка Cys в неактивной кальцийсвязывающей петле Р-ПА. Предложены структурные критерии внутренней неупорядоченности апо-форм ПА, предсказывающие достаточно широкую распространённость этого явления среди парвальбуминов. Для Р-ПА показано, что внутренняя неупорядоченность апо-формы белка сопряжена с повышенным сродством белка к Са2+, что соответствует теоретическим ожиданиям. На примере классического представителя семейства белков «ЕF-руки» Р-ПА крысы исследовано несколько не-/малоизученных фундаментальных аспектов функционирования белков этого семейства.

Практическая значимость

Белки семейства «ЕF-руки» участвуют в развитии сердечных, воспалительных, эндокринных, аутоиммунных, нейродегенеративных и онкологических заболеваний. Знания о структурных и функциональных детерминантах этого биологически значимого семейства белков позволяют расширить наши фундаментальные представления о нем, а также использовать их для разработки подходов к терапии социально значимых заболеваний. В частности,

возможно расширение способов направленного изменения равновесных и кинетических параметров взаимодействия ПА с Са2+/И^+ в целях лечения сердечных заболеваний. Поскольку ПА является одним из основных пищевых аллергенов, понимание принципов структурной стабилизации ПА важно для разработки способов лечения аллергии на морепродукты. Роль ПА и ПА-содержащих клеток в патогенезе ряда заболеваний (шизофрения, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, аутизм, биполярное расстройство, клиническая депрессия, эпилепсия, бешенство, некоторые виды рака почек, потеря слуха, и пр.) остается невыясненной. Полученные в работе знания позволяют рассчитывать на разработку подходов к диагностике/терапии этих заболеваний, основанных на воздействии на ПА и/или ПА-содержащие клетки.

Положения, выносимые на защиту

1) Точечным мутагенезом показано, что проведенные аминокислотные замены остатков «черного» и «серого» кластеров спаренного домена «EF-руки» Р-ПА крысы приводят к выраженным изменениям структурно-функциональных свойств белка, причем влияние замен остатков «черного» кластера Р-ПА на величины ряда параметров белка в разы превышает таковое в случае замен остатков «серого» кластера белка.

2) Экспериментальная оценка величины окислительно-восстановительного потенциала высококонсервативного тиола Cys 18 неактивной «ЕF-петли» Р-ПА крысы указывает на возможность образования дисульфидного димера белка во внутриклеточных условиях, сопровождающихся повышением величины редокс-потенциала, и/или условиях внеклеточной среды. Полученные данные в совокупности с чувствительностью структурно-функциональных свойств белка к малым структурным модификациям остатка Cys 18 (замена C18S) свидетельствуют о редокс-сенсорной роли высококонсервативного тиола неактивной «ЕF-петли» Р-ПА.

3) Анализ базы данных Swiss-Prоt с использованием разработанных структурных критериев внутренней неупорядоченности апо-формы ПА показал распространенность этого явления на уровне 16-19%.

4) Внутренняя неупорядоченность апо-Р-ПА сопряжена с повышенным сродством белка к Са2+.

Вклад автора

Совокупность данных, приведенных в настоящей работе, была получена в результате 3-летнего научного исследования, проводимого в рамках очной аспирантуры соискателя. Работа выполнялась лично соискателем, в составе коллектива сотрудников Лаборатории новых методов в биологии Института биологического приборостроения РАН и коллег из НИИ РАН.

Биоинформатический анализ внутренней неупорядоченности и аминокислотного состава ПА проводился совместно с Пермяковым С.Е. и Уверским В.Н. Получение некоторых генно-инженерных конструкций проводилось совместно с Соколовым А.С. Экспрессия, выделение и очистка белков проводились совместно с Вологжанниковой А.А. Анализ полученных белковых препаратов методом масс-спектрометрии проводился совместно с Жаданом А.П., Исмаиловым Р.Г., Сувориной М.Ю. и Суриным А.К. Изучение физико-химических свойств ПА проводили методами сканирующей калориметрии, равновесной спектрофлуориметрии, спектрофотометрии и спектроскопии кругового дихроизма совместно с Вологжанниковой А.А.; методом атомно-адсорбционной спектроскопии - совместно с Шевелевой М.П.; методом динамического светорассеяния - совместно с Казаковым А.С.; методом остановленного потока со спектрофлуориметрической детекцией - совместно с Емельяненко В.И. Обработка и анализ полученных данных, подготовка статей к печати и тезисов конференций проводились либо лично соискателем, либо при его активном участии.

Апробация диссертации

Результаты диссертации были представлены на следующих конференциях: Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2016), Съезд биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015), The Bwphysical Sоciеty Virtual Annual Meeting (2021), Russian Interna^m! inference оп Сгуо-EM (RICCEM2021). Результаты диссертации опубликованы в 5 научных журналах, индексированных в базах данных S^pus и WоS.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Мотив «ЕF-руки»

В 1973 году Кеш^ег и ^скоШБ привели подробное описание структуры цитозольного белка - парвальбумина карпа - и впервые описали структурный мотив, принимающий участие в связывании кальция и встречающийся у многих кальцийсвязывающих белков [2]. Этот хорошо изученный мотив «спираль-петля-спираль» известен сейчас как мотив «EF-рука» [3, 4, 5]. Этот мотив состоит из 30 аминокислотных остатков, образующих две а-спирали: «Е» и «F» (название спиралей взято из описания Kгetsingeг кристаллической структуры парвальбумина) и петлю, которая их соединяет. Спирали почти всегда располагаются перпендикулярно друг другу, напоминая большой и указательный пальцы правой руки, в то время как закрытый средний палец приблизительно совпадает с петлевым участком, который участвует в координации катиона кальция (Рисунок

Атомы кислорода, связывающие ион кальция в мотиве «ББ-рука» образуют пентагональную бипирамиду, причем хелатирующие аминокислотные остатки обозначают либо в соответствии с их позициями в последовательности 12-ти членной петли (1, 3, 5, 7, 9 и 12), либо используя их геометрические координаты (х, У, 2, -X, -у и -2) (Рисунок 3).

2) [6].

Рисунок 2. Схематическое изображение мотива «ЕF-рука» (взято из [6]).

Каноническая петля

Парвальбумин (EF3) Кальмодулин (EF1) Кальбиндин (EF2) S100B (EF2)

Рисунок 3. Структура канонической «EF-петли». Желтой сферой обозначен катион кальция, голубой - молекула воды, красным отмечены атомы кислорода карбонильных/ карбоксильных групп, координирующие катион кальция (взято из [6]).

Пять из семи хелатирующих атомов кислорода принадлежат аминокислотным остаткам, находящихся в петле, причем 1(.), 3(y) и 5(z) -аминокислотные остатки, предоставляющие атомы кислорода боковых групп, чаще всего представлены остатками аспарагиновой кислоты (Рисунок 2). Аминокислотный остаток в позиции 7(-y) высоковариабелен и связывает кальций карбонильным кислородом основной цепи. Аминокислотный остаток в 9(-.) позиции координирует кальций не напрямую, а через молекулу воды, с которой он образует водородную связь. Оставшиеся два координирующих кислорода принадлежат бидентантной карбоксильной группе боковой цепи аминокислотного остатка в 12(-z) позиции. Структурно этот остаток принадлежит выходящей из петли а-спирали и отстоит на три аминокислотных остатка от ее C-конца, но обычно о нем говорят, как о двенадцатом остатке «EF-петли». От того, остаток какой аминокислоты находится в этой позиции, зависит сродство мотива «EF-руки» к катионам кальция и магния. Большинство мотивов «EF-руки» имеют в 12-й позиции остаток глутаминовой кислоты (E12), имеющей достаточно длинную для связывания иона кальция (Ca2+) боковую цепь. Однако приблизительно у 10%

мотивов «ЕF-руки» в этой позиции находится остаток аспарагиновой кислоты ф12). Боковая цепь остатка аспарагиновой кислоты короче, чем у глутаминовой и не способна связывать Са2+, выступая как монодентантный лиганд. В результате D12 снижает сродство мотива к катионам кальция и увеличивает сродство к катионам магния (Mg2+). На сродство к катионам металлов также влияет присутствие некоторых нехелатирующих аминокилотных остатков. Так, высоко консервативный остаток глицина в позиции 6 ^6) придает уникальную конформацию основной цепи за счет снятия напряжения в изгибе петли.

Помимо канонического мотива «ЕF-руки» известны также неканонические. Все семейство белков S100 и родственные им кальбиндины D9к содержат «псевдо» «ЕF-руку». В таком мотиве петля, за счет добавления двух остатков аминокислот, «выворачивается» таким образом, что все группы, хелатирующие Са2+, за исключением глутамата в позиции, координируют катион за счет карбонильных атомов кислорода основной цепи (Рисунок 4). Другие, более редко встречающиеся функциональные мотивы «ЕF-руки», включают в себя кальцийсвязывающие петли, состоящие из 11 остатков, как у кальпинов, и 13 остатков, как у внеклеточного белка остеонектина.

1 3 5 7 9 12

x у z -У ^ ^

Неканоническая петля

Кальбиндин D9k ^1) A A K E G D P N Q L S K E E

8100Б (ЕБ1) S G R E G D K H K L K K S E

Кальпаин (ЕБ1) A G - - D D - M Е V S A T E

ЛЬО-2 (ЕБ5) D T - D Q D - G W I Q V S Y

Остеонектин (EF2) D Q H P I D - G Y L S H T E

Рисунок 4. Структура неканонической «ЕF-петли» (взято из [6]).

1.2 Разнообразие доменов «ЕF-руки»

Мотивы «ЕF-рука» в большинстве белков встречаются в виде смежной пары, разделенной последовательностью из аминокислотных остатков разной

длины (Рисунок 5А). Считается, что такая структура появилась в процессе эволюции из-за дубликации гена, кодирующего одиночный мотив «ЕF-рука», и в результате дальнейшей эволюции этих «дублей» по отдельности.

Рисунок 5. Спаренный домен «ЕF-руки». Одиночные мотивы показаны разными цветами: красным цветом обозначен участок, соединящий мотивы. А, N концевой домен кальмодулина (1ЕXR). Б, С-концевой домен рековерина (ЮМЯ). В, К-концевой домен EhCaBP1 (2NXQ), в котором спаренный домен образован за счет межмолекулярного взаимодействия трех белковых молекул (зято из [6]).

Так, в хорошо изученном эукариотическом регуляторном кальцийсвязывающем белке, кальмодулине, первый и второй мотивы «ЕF-рука» имеют последовательности, гомологичные - на 36%. Мотивы EF1 и EF2 соединены в этих белках последовательностью из 5-6 остатков, формирующих неупорядоченную структуру, в то время как у других белков этот участок может быть упорядоченным. К примеру, в зрительном белке рековерине соединительная последовательность остатков между мотивами EF3 и EF4 гораздо длиннее и

образует два спиральных участка (Рисунок 5Б). Межмолекулярные домены «EF-рука» также встречаются. Кристаллическая структура белка EhCaBPl из простейшего паразита Entamoeba histolytica помогла обнаружить образование гомотримера, в котором мотив EF1 одной молекулы белка формирует пару с мотивом EF2 другой молекулы (Рисунок 5В). Схожие межмолекулярные взаимодействия найдены и для пятого мотива «EF-рука» в белках семейства «пента-ЕF-рука». Тот факт, что функциональные «EF-руки» часто образуют пары с мотивами «EF-руки», неспособными связывать Ca2+, подчеркивает важность спаренной структуры домена для его функционирования.

Так, молекула рековерина (Рисунок 5Б) содержит четыре мотива «EF-рука», однако EF1 и EF4, находясь в паре с функциональными EF2 и EF3, сами по себе не способны связывать Ca2+. При этом эти нефункциональные «EF-руки» служат для обеспечения общей конформационной стабильности белка и помогают создать интерфейс для связывания с мишенью. На примере кальций и интегринсвязывающего белка 1 (CIB1) можно сказать, что нефункциональные мотивы могут образовывать пары вместе так же, как и их функциональные аналоги. Значение образования парных доменов доказывает и отсутствие примеров белков с одиночным мотивом «EF-рука». Несмотря на то, что такие белки были теоретически предсказаны, опираясь на первичную аминокислотную последовательность (например, белок STIM1 [7]), более детальный структурный анализ выявил «скрытые» мотивы «EF-рука», образующие пару с мотивом белка.

Ориентация одиночных мотивов внутри парного домена позволяет кальцийсвязывающим петлям формировать короткую ß-складку за счет образования водородных связей между атомами основной цепи антипараллельным образом. Эта ориентация также способствует кооперативному характеру связывания атомов кальция внутри домена. Связывание катионов одиночным мотивом увеличивает сродство другого одиночного мотива внутри спаренного домена к этому иону металла [5]. Считается, что связывание Ca2+ одной из петель домена сказывается на ориентации некоторых кальцийсвязывающих остатков в

другой петле. Это происходит благодаря водородным связям и диполь- дипольным взаимодействиям между двумя катионсвязывающими петлями, в частности, за счет образования Р-складки, соединяющей аминокислотные остатки 7 и 8 обеих «ЕF-петель». В кооперативный характер связывания Са2+ спаренным доменом вносит вклад также гидрофобная область между спиралями двух одиночных мотивов «ЕF-рук», ввиду чего спаренный домен «ЕF-руки» имеет большее сродство к Са2+, нежели изолированные его части.

1.3 Строение белков семейства «ЕF-руки»

С момента первого описания мотива «ББ-рука» было обнаружено множество различных подсемейств белков «ЕF-рука» [8]. База данных белков (PDB) на сегодняшний день насчитывает более 280 кристалографических и 130 ЯМР структур, содержащих один или несколько спаренных доменов, состоящих из одиночных «ЕF-рука» подобных мотивов, и принадлежащих суперсемейству белков «ЕF-руки» [9]. Все белки семейства «ЕF-руки», структура которых определена на сегодняшний день, содержат от двух до шести единичных мотивов «ЕF-рука».

Кальбиндин D9K - белок семейста «ЕF-руки» - обладает наименьшим размером, содержит только два мотива (псевдо EF1 и канонический EF2) и является мономерным.

Семейство белков 8100 - самое крупное подсемейство белков «ЕF-руки», содержащих пару псевдо «ЕF-рука» - каноническая «EF-рука», образуя схожую с кальбиндином D9K структуру парного домена. В отличие от кальбиндина Э9к, все белки S100 существуют в виде стабильных гомо- или гетородимеров, тем самым формируя компактную глобулу, содержащую четыре одиночных мотива «ЕF-руки» [10, 11].

Представители семейства парвальбуминов в своей структуре имеют три одиночных мотива «ББ-руки», два из которых (EF2 и EF3) являются функциональными и образуют спаренный домен, оставшийся неспаренный мотив

EF1 не связывает Ca2+ - он взаимодействует с парным доменом за счет гидрофобных сил, стабилизируя конформацию белка [12, 13].

Самую многочисленную группу белков семейства «EF-рука» составляют белки, содержащие четыре одиночных мотива. В нее входят такие хорошо известные белки, как кальмодулин (CaM), сократительный белок мышц тропонин C (TnC), легкая цепь миозина, белок матрикса центриолей центрин, все члены семейства белков нейрональных кальцевых сенсоров (такие как рековерин, фреквенин, НКС1) [14]. Эти белки состоят из двух глобулярных доменов (на N- и C-концах), соединенных аминокислотной последовательностью разной длины, каждый домен представлен парой одиночных мотивов «EF-рука». По форме молекул эти белки можно разделить на те, что напоминают гантели и те, которые представляют собой компактный эллипсоид. N- и C-концевые парные домены в гантелеобразных молекулах белка независимо кальцийзависимым образом взаимодействуют с белками-мишенямии (например, CaM, TnC). А у эллипсоидных белков семейства НКС два спаренных домена «EF-руки» тесно взаимодействуют друг с другом, что приводит к кооперативному связыванию кальция и связыванию белков-мишеней, в которое вовлечены оба домена.

Такие белки как кальпаин, сорцин, гранкальцин имеют пять мотивов «EF-рука» и относятся к белкам «пента-EF-руки». Как и парвальбумины, они имеют неспаренный мотив. С помощью него белки этого подсемейства образуют межмолекулярный спаренный домен «EF-руки», формируя таким образом димеры. Несмотря на то, что большинство белков имеют нефункциональный мотив EF5, у некоторых из них при образовании димера появляется способность связывать Ca2+ неканонической «EF-петлей». Это обусловлено, по-видимому, «липкой» природой неспаренного мотива «EF-руки», впервые отмеченной у синтетических пептидов, содержащих единичный мотив «спираль-петля-спираль», за счет которого спонтанно образуются гомодимеры [15].

Белки семейства «EF-руки» с шестью мотивами - это белки-нейропротекторы. Среди них кальбиндин D28k и гомологичные ему кальретинин,

ретикулокальбиндин и секретагогин. Кальбиндин D28k содержит три домена, состоящих из спаренных единичных мотивов «ЕF-руки», которые вместе создают объемную «У-образную» структуру. Только четыре из шести мотивов «ЕF-руки» (EF1, EF3, EF4 и EF5) способны связывать Са2+. Интересно, что, имея схожие вторичные структуры, кристаллические структуры Са2+-загруженного кальбиндина D28k и секретагогина в апо-форме отличаются взаимным расположением кальцийсвязывающих доменов. Так, мотив ЕF1 секретагогина в апо-форме развернут почти на 1800 относительно остальной структуры белка. Но является ли такое конформационное изменение кальцийзависимым и характерно ли оно для всех белков этого подсемейства, еще предстоит выяснить.

1.4 Сродство домена «ЕF-рука» к Ca2+

Несмотря на достаточно большое сходство в первичных последовательностях кальций связывающих петель, белки семейства «EF-руки» проявляют различное сродство к Са2+ в диапазоне от наномолярных до миллимолярных значений. Более того, сродство белка к кальцию не может быть определено исключительно по аминокислотной последовательности связывающих его петель. На сродство к кальцию влияет коперативность связывания кальция спаренными мотивами «EF-руки», а также свободная энергия конформационных изменений, вызванных связыванием кальция [3]. Кроме того, поскольку электростатические силы являются дальнодействующими, отрицательно заряженные боковые группы аминокислотных остатков, находящиеся вблизи кальцийсвязывающей петли, увеличивают сродство мотива «EF-руки» к кальцию. Величины констант диссоциации кальция белков коррелируют с концентрациями кальция среды, в которой они функционируют. Так, например, белки молекул стромального взаимодействия ^Т1М) контролируют колебания концентрации ионов Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме и проявляют наименьшее из исследованных сродство к этому иону (несколько сотен мкМ). Это дает возможность STIM белкам выполнять роль кальциевых сенсоров на фоне очень

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Хорн Полина Александровна, 2021 год

С18Б апо - - - -

Мв2+ 55,9 16,4 -0,09 1,25

Са2+ 85,6 31,8 -0,41 0,87

Снижение термостабильности Р-ПА, вызванное заменой C18S, сопровождается ослаблением сродства белка к Mg2+/Ca2+, согласно данным методов буферов Са2+ с флуоресцентной детекцией и равновесного диализа Mg2+ с детекцией методом ААС (Рисунок 22А, Приложение Е, Ж). В соответствии с пониженным сродством C18S к Са2+ (на 1,5 порядка величины одной из «ЕF-рук») изучение кинетики диссоциации Са2+ методом остановленного потока с флуоресцентной детекцией демонстрирует ускоренную в сравнении с WT на 38% диссоциацию Са2+ из мутанта C18S (Рисунок 21Б, Приложение Ж).

Рисунок 22. А, величины свободной энергии связывания Mg2+/Ca2+ различными формами Р-ПА при 20°С, оцененные методами буферов Са2+ с флуоресцентной детекцией и равновесного диализа Mg2+ с детекцией методом ААС. Оценка констант связывания металлов проведена в рамках схемы последовательного заполнения центров связывания (АОМе = - КГ 1п (^г-х[Н2О]), 1=1..2). Б, кинетика диссоциации Са2+ из Р-ПА (5-23 мкМ; [Са2+]:[Р-ПА]=2:1) при 20°С при добавлении 1 мМ ЭГТА, по данным метода остановленного потока с флуоресцентной детекцией (10 мМ HЕPЕS-KОH, рН 8,2, Хвозбуждения=275 нм). Пунктиром обозначены теоретические кривые, рассчитанные согласно схеме последовательного заполнения центров связывания Са2+.

Суммируя, введение гомологичной замены C18S в Р-ПА крысы сопровождается существенными изменениями на всех уровнях структурно-функциональной организации белка, что свидетельствует о чувствительности Р-ПА к малым структурным модификациям высококонсервативного остатка Cys18 инактивированной «ЕF-петли». Тем самым, окисление тиольной группы остатка Cys18 Р-ПА крысы способно влиять на свойства белка.

Для оценки реакционоспособности Cys18 в Р-ПА крысы, методом спектрофотометрического кислотно-основного титрования (см. Раздел 2.2.21) определяли значение pKa цистеина по изменению поглощения на длине волны 240 нм, характерной для поглощения депротонированной тиольной группы [70] (Рисунок 23).

Рисунок 23. Зависимость молярного коэффициента поглощения различных ß-ПА (23мкМ) при 240 нм от pH при 20°C после вычитания вклада депротонированных остатков Туг. Апо- (светлые символы) и Са2+-загруженные (сплошные символы) формы восстановленного ß-ПА WT обозначены кругами, ß-ПА C18S - треугольниками (30 мМ MES, 30 мМ HEPES, 30 мМ H3BO3, 30 мМ глицин, 100 мМ KCl, 1,5 мМ ЭДТА (апо^-ПА) или 1 мМ CaCb (Ca2+-загруженный ß-ПА)).

В качестве контрольного образца использовали Р-ПА С18Б, не содержащий цистеин. Полученные зависимости молярного коэффициента поглощения Р-ПА Т в апо/ Са2+ форме при 240 нм от рН не выявили перехода между протонированной/депротонированной формой СуБ18 в Р-ПА в диапазоне значений рН от 6,5 до 9,5 (Рисунок 23). Аналогичный результат был получен для Р-ПА С18Б. Наблюдаемое при рН>9,5 увеличение поглощения на 240 нм свидетельствует либо о депротонировании СуБ18, либо о щелочной денатурации белка.

Отметим, что усредненное значение рКа цистеина в свернутом белке отличается от рКа свободного цистеина (рКа-8,5) и равно 6,8±2,7 [71]. Экспериментальные данные указывают на то, что при физиологических значениях рН и независимо от загрузки белка Са2+ СуБ18 Р-ПА крысы находится либо в депротонированной форме (рКа<6,5), либо в протонированной (рКа>9,5). Это отличается от приведенных в литературе значений, в том числе от величины рКа высоконсервативного СуБ39 неактивной «ЕБ-петли» бычего рековерина (рКа= 7,6) [55], для которого ранее была показана его редокс-сенсорная роль.

Высокая внутриклеточная концентрация Р-ПА (2-3 мМ [71]) предполагает участие белка в реакциях тиол-дисульфидного обмена, таких, как, например, взаимодействие с основным редокс буфером клетки, глутатионом (ОБН). Для определения редокс-потенциала Cys 18 Р-ПА крысы устанавливали тиол-дисульфидное равновесие апо/Са2+-загруженного белка в присутствии окислительно-восстановительной пары глутатиона с последующей оценкой доли дисульфидного димера белка денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях (Рисунок 24). Величины окислительно-восстановительного потенциала SH-группы Cys 18, Ен, составили: -168,4±0,9 мВ для апо-состояния и -176,5±1,9 мВ для Са2+-загруженного белка. Полученные величины близки к таковым, измеренным для эритроцитов больных диабетом (-179 мВ) [72], для апоптотических гибридомных клеток мыши и апоптотических лейкемических клеток человека НЬ-60 (-170 мВ и -167 мВ

соответственно), а также для дифференцированных раковых клеток КГ29 (-160 мВ) (для обзора см. [73]).

Рисунок 24. Тиол-дисульфидное равновесие ano/Ca2+-формы ß-ПА (1,5 мкМ) в присутствии окислительно-восстановительной пары глутатиона при 35°С (50 мМ HEPES-KOH, 100 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА/CaCb, pH 7,4) с последующей оценкой доли дисульфидного димера белка денатурирующим электрофорезом в ПААГ в невосстанавливающих условиях.

Так, внутриклеточные условия, сопровождающиеся повышенным окислительно-восстановительным потенциалом, вероятно, будут способствовать накоплению дисульфидного димера Р-ПА. Кроме того, во внеклеточной среде Р-ПА [20, 74-75] будет подвергаться более окислительным условиям (от -140 мВ до -131 мВ), которые увеличиваются с возрастом (от -93 мВ до -84 мВ) и при потологических состояниях (диабет, возрастная дегенерация желтого пятна - до -65 мВ [76], ранний атеросклероз [77], при курении [78]). Предположительно, дисульфидный димер Р-ПА, накопленный в более окислительных условиях, будет обладать измененной функциональной активностью, на что указывает эффективная активация димером белка двух кальмодулин-зависимых ферментов

[79]. А поскольку ß-ПА за счет кальций-индуцируемого ингибирования глутатионредуктазы способен участвовать в регулировании уровня окисленного и восстановленного глутиона [80], дисульфидная димеризация ß-ПА, вероятно, будет оказывать влияние на внутриклеточный окислительно-воостановительный потенциал.

Совокупность полученных нами данных свидетельствует о том, что эволюционная потеря сродства к Ca2+ AB-петли ß-ПА сопровождалась приобретением белком редокс-чувствительности за счет появления в ее составе тиольной группы, склонной к дисульфидной димеризации в условиях повышенного редокс-потенциала. Аналогичная ситуация имеет место для рековерина, белка семейства «EF-руки», в котором неактивная «EF-петля» содержит консервативный остаток цистеина с величиной редокс-потенциала -152 мв / -128 мВ для Са2+/апо-форм белка, соответственно [59].

3.3 Распространенность внутренней неупорядоченности апо-формы среди парвальбуминов, влияние этого явления на сродство белка к Ca2+

В целях поиска ПА с развернутой апо-формой, в штамме Е. coli BL21(DE3)-RIL экспрессировали, наработали и очистили до гомогенности ß-ПА кижуча, одного из наиболее хладолюбивых видов рыб. Чистоту белкового препарата подтвердили данными электрофореза в нативных и денатурирующих условиях; данные электрораспылительной масс-спектрометрии подтвердили отсутствие N-концевого Mеt у 75% белка. Концентрацию белка определяли с использованием молярного коэффициента поглощения при 280 нм, определенного по поглощению при 205 нм (см. Раздел 2.2.5). Поскольку ß-ПА кижуча содержит 4 остатка цистеина, то препарат хранили в присутствии 2-ME, а перед проведением физико-химических измерений, подвергали процедуре восстановления, описанной в Разделе 2.2.7. С помощью теста Эллмана мы показали, что SH-группы белка после этой процедуры были восстановлены на 80%.

Спектры флуоресценции бис-АНС в присутствии Р-ПА кижуча продемонстрировали экспонирование гидрофобных аминокислотных остатков белка при удалении Са2+ (Рисунок 25), что связано со снижением компактности белковой молекулы, согласно данным методов ДСР и сшивок глутаровым альдегидом (Таблица 6).

Рисунок 25. Спектры флуоресценции бис-АНС (1 мкМ) в присутствии Р-ПА кижуча (10 мкМ) при 20°С, в зависимости от загруженности белка Са2+ (10 мМ HЕPЕS-KОH, рН 8,2, 2мМ ЭДТА/ 1 мМ СаС12). Длина волны возбуждения бис-АНС 385 нм.

Таблица 6. Олигомеризация Р-ПА кижуча (1,5-2 мг/мл) по данным метода сшивок глутаровым альдегидом (0,02%, 20°С), а также гидродинамические свойства белка по данным ДСР (25°С). Ян, средний гидродинамический радиус

Состоян Содержа Содерж Содержа Ян ± SD, нм

ие ние ание ние Эксперимен Предсказания для

белка мономер димера, мультим тальные мономера белка

а, % % ера, % данные свернутый белок развернутый белок

апо 55 33 12 2,78±0,04 1,77±0,02 3,16±0,06

Са2+ 41 28 31 1,95±0,03

Дестабилизации апо-Р-ПА кижуча проявляется в 2,6-кратном снижении относительно Са2+-загруженного состояния белка содержания а-спиралей (Рисунок 26А). Отсутствие жесткой третичной структуры в апо-ПА следует из отсутствия пика теплопоглощения на термограммах ДСК, а также уровня удельной теплоемкости белка, близкому к таковому, предсказанному для полностью развернутого ПА (Рисунок 26Б).

° Температура, °С

Рисунок 26. А, содержание элементов вторичной структуры в образцах Р-ПА кижуча (10-16 мкМ) при 20°С по данным КД (10 мМ Н3ВО3-КОН рН 8,8). Б, температурные зависимости удельной теплоемкости Р-ПА кижуча (1,5-1,7 мг/мл) в зависимости от содержания Са2+, по данным ДСК (рН 9,0-9,2).

Совокупность полученных структурных данных свидетельствует о том, что апо-Р-ПА кижуча - белок с внутренней неупорядоченностью.

Величина общей свободной энергии связывания Са2+ Р-ПА кижуча, оцененная с помощью метода спектрофлуориметрического титрования белка Са2+/ЭДТА (А ОСа = -114 кДж/моль), ниже таковой для Р-ПА, для которых ранее была подтверждена свернутость апо-формы (АОСа = -112^-99 кДж/моль) (Рисунок 27, Приложение З). Повышенное сродство к Са2+ наблюдается для прочих Р-ПА с развернутой апо-формой. Недостаток информации по стабильности апо-а-ПА не позволяет судить о влиянии неупорядоченности апо-а-ПА на его сродство к Са2+.

В целом, отсутствие жесткой третичной структуры в апо-Р-ПА указывает на повышенное сродство белка к Са2+.

р-ПА, Крыса Р-ПАЗ, Курица р-ПА, Курица

__р-ПА, Карп

_ сх-ПА, Крыса

р-ПА, Балтийская треска р-ПА, Обыкновенная щука р-ПА, Кижуч

_ сс-ПА, Обыкновенная щука

я 1 1 ' 1 I ' 1 1 1 I 1 1 1 1 I 1 1 1 1 I 1 1 1 ' I 1 1 1 1 I 1 1

90 100 110 120 130 140 150

-Дв^., кДж/моль

Рисунок 27. Диаграмма величин общей свободной энергии связывания Са2+ ПА, различающимися стабильностью апо-формы, согласно экспериментальным и литературным данным (АОСа = - RT X 1п (^^[ШО]), 1=1..2).

Для установления структурных причин пониженной стабильности отдельных апо-ПА мы предсказали склонность к неупорядоченности для двух групп ПА, отличающихся стабильностью апо-формы (Рисунок 27), с использованием алгоритма PОNDR® VSL2P (Рисунок 28). Анализируемые группы ПА отличаются повышенной склонностью к неупорядоченности ^концевого участка белка с 1-го по 35-й аминокислотный остаток у ПА с развёрнутой апо-формой. На основе этого признака неупорядоченности апо-формы ПА при краевом значении <VSL2P>1-з5, равном 0,609, предсказано, что 16% из 69 последовательностей ПА базы данных Swiss-Prоt относятся к категории белков с развернутой апо-формой.

Рисунок 28. Распределение средних баллов PОNDR® VSL2P по выровненным последовательностям ПА с развернутой (серые линии) и свернутой (черные линии) апо-формой. Приведенные кривые соответствуют максимальной и минимальной оценкам средних баллов VSL2P с учетом стандартных отклонений. Буквами обозначены участки белка, соответствующие спиралям и Са2+-связывающим петлям.

Анализ аминокислотного состава N-концевого участка 1-35 анализируемых групп ПА показал, что неупорядоченные в апо-форме ПА содержат повышенное количество остатков Lys и не содержат остатков Gln, в сравнении с ПА со свернутой апо-формой (Приложение И). Использование этого критерия неупорядоченности апо-формы ПА (количество Lys не менее 4) предсказывает развернутость апо-формы белка в 19% ПА базы данных Swiss-Prat Таким образом, в зависимости от используемого критерия неупорядоченности апо-формы ПА это явление предсказано для 16-19% ПА.

На примере классического представителя белков семейства «EF-руки», парвальбумине, спектром физико-химических методов изучена структурная и функциональная значимость малоизученных структурных особенностей кальцийсвязывающих белков этого семейства, включая «черный» и «серый» кластеры консервативных аминокислотных остатков спаренного домена «EF-руки», консервативный остаток цистеина в инактивированной «EF-петле», внутреннюю неупорядоченность апо-формы белка.

Несмотря на сложную картину влияния замен отдельных аминокислотных остатков «черных» и «серых» кластеров Р-ПА крысы на структурно-функциональные свойства белка, для ряда свойств белка замены остатков «черного» кластера Р-ПА сопровождаются более выраженными эффектами, нежели замены на Ala остатков «серого» кластера, что указывают на большую значимость остатков «черного» кластера Р-ПА для поддержания свойств белка.

Полученные данные по свойствам высококонсервативного остатка Cys 18 Р-ПА крысы свидетельствуют о том, что эволюционная потеря сродства AB-петли к Ca2+ сопровождалась приобретением Р-ПА редокс-чувствительности, что наблюдается и в других представителях семейства белков «EF-руки».

На основе разработанных структурных критериев внутренней неупорядоченности апо-формы ПА предсказана неупорядоченность апо-форм для 16-19% ПА базы данных Swiss-Prat Неупорядоченность апо-Р-ПА связана с повышенным сродством белка к Ca2+.

Полученные в работе данные дополняют существующие представления о функционировании белков семейства «EF-руки», открывают новые возможности для манипулирования их структурными свойствами в целях терапии сердечных, аллергических, нейродегенеративных, психических, аутоиммунных, онкологических и прочих заболеваний, опосредованных ПА и/или ПА-содержащими клетками.

1) Методом точечного мутагенеза показано, что проведенные замены аминокислотных остатков «черного» и «серого» кластеров спаренного домена «ЕF-руки» Р-ПА крысы вызывают изменения таких параметров белка, как гидродинамический радиус апо-белка, термостабильность Са2+/М£2+-загруженных форм белка и общая свободная энергия связывания ионов Са2+, причем эффекты, вызываемые заменами в «черном» кластере, в 2,5-4,5 раза превышают таковые в случае замен в «сером» кластере белка.

2) Обнаружено, что окислительно-восстановительный потенциал высококонсервативного тиола Cys 18 неактивной «ЕF-петли» Р-ПА крысы составляет -168/-176 мв, и эта величина близка к физиологически значимому уровню.

3) Гомологичная замена C18S вызывает дестабилизацию вторичной и третичной структур апо- и Mg2+-загруженных форм Р-ПА крысы и снижение сродства к Са2+ одной из «ЕF-рук» белка на 1,5 порядка величины.

4) Полученные результаты указывают на редокс-сенсорную роль высококонсервативного тиола неактивной «ЕF-петли» Р-ПА.

5) Повышенная склонность к неупорядоченности ^концевого участка парвальбумина с 1-го по 35-й остаток выровненной аминокислотной последовательности, а также отдельные особенности аминокислотного состава этого участка белка указывают на развёрнутость его апо-формы.

6) Теоретическая оценка распространённости парвальбуминов с неупорядоченной апо-формой в базе данных Swiss-Prоt v.2014_05 составляет 16-19%.

7) Показано, что внутренняя неупорядоченность апо-формы белка сопряжена с повышенным сродством Р-ПА к Са2+.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Cp - удельная теплоемкость белка;

Eh - окислительно-восстановительный потенциал;

ESI-MS - метод масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией;

Gdn-HCl - гуанидин гидрохлорид;

GSH - восстановленная форма глутатиона;

GSSG - дисульфидный димер глутатиона;

HEPES - #-2-гидроксиэтилпиперазин-#-2-этансульфоновая кислота;

IDPs - белки с внутренней неупорядоченностью;

Imax - максимальная интенсивность флуоресценции;

MES - 2-(#-морфолино) этансульфоновая кислота;

MOPS - 3-(#-морфолино) пропансульфоновая кислота;

NaPi- натрий-фосфатный буфер;

NCS - нейрональные кальциевые сенсоры;

Rh - гидродинамический радиус.

SDS - додецилсульфат натрия;

T - абсолютная температура, K;

WT -белок дикого типа;

AH0 - энтальпия денатурации белка;

Amax - длина волны, соответствующая максимуму спектра флуоресценции;

- молярная эллиптичность; 2-МЕ - 2-меркаптоэтанол;

бис-АНС - 4,4'-бис (1-анилиннафталин 8-сульфонат);

дПА - димер парвальбумина;

ДСР - динамическое светорассеяние;

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия;

ДТНБ - 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота);

ДТТ - дитиотреитол;

ИПТГ - изопропил-Р^-1-тиогалактопиранозид;

КД - круговой дихроизм;

ПА - парвальбумин;

ПААГ - полиакриламидный гель;

Трис - трис-гидроксиметил-аминометан;

ТХУ - трихлоруксусная кислота;

ФМСФ - фенилметансульфонилфторид;

ЭГТА - этиленгликольтетрауксусная кислота;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс.

Хочу выразить огромную благодарность своему научному руководителю Пермякову С.Е., а также Пермякову Е.А. и всем членам лаборатории новых методов в биологии ИБП РАН за помощь в подготовке этой работы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, индексированных в базах данных S^pus и WоS:

1. Permyakov, S. Е. Comprehensive analysis of the roles of 'black' and 'gray'

clusters in structure and function of rat P-parvalbumin / S. Е. Permyakov, A.

A. Vologzhannikova, P. A. Khorn, M. P. Shevelyova, A. S. Kazakov, V. I.

Emelyanenko, A. I. Denesyuk, K. A. Denessiouk, V. N. Uversky, Е. A.

Permyakov // Cell Calcium. - 2018. - N 75. - P. 64-78.

2. Vologzhannikova, A. A. The Highly Conservative Cysteine of Oncomodulin as a Feasible Redox Sensor / A. A. Vologzhannikova, P. A. Khorn, M. P. Shevelyova, A. S. Kazakov, V. I. Emelyanenko, E. A. Permyakov, S. E. Permyakov // Biomolecules. -2021. - N 11. - P. 66.

3. Vologzhannikova, A. A. In search for globally disordered apo-parvalbumins: Case of parvalbumin P-1 from coho salmon / A. A. Vologzhannikova, P. A. Khorn, A. S. Kazakov, R. G.I smailov, A. S. Sokolov, V. N. Uversky, E. A.Permyakov, S. E. Permyakov // Cell Calcium. - 2017. - N. 67. - P. 53-64.

4. Kazakov, A. S. Interleukin-11 binds specific EF-hand proteins via their conserved structural motifs / A. S. Kazakov, A. S. Sokolov, A. A. Vologzhannikova, M. E. Permyakova, P. A. Khorn, R. G. Ismailov, K. A. Denessiouk, A. I. Denesyuk, V. A. Rastrygina, V. E. Baksheeva, E. Yu. Zernii, D. V. Zinchenko, V. V. Glazatov, V. N. Uversky, T. A. Mirzabekov, E. A. Permyakov, S. E. Permyakov // Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. - 2017. - N 1 (35). - P. 78-91.

5. Vologzhannikova, A. A. Effects of his-tags on physical properties of parvalbumins / A. A. Vologzhannikova, P. A. Khorn, A. S. Kazakov, E. A. Permyakov, V. N. Uversky, S.E. Permyakov // Cell Calcium. - 2019. - N 77. - P. 1-7.

Тезисы конференций по теме диссертации:

1. Вологжанникова, А. А. Структурная стабильность апо-парвальбуминов

на примере Р-парвальбумина кижуча (Oncorhynchus kisutch) / А. А.

Вологжанникова, П. А. Хорн, А. С. Казаков, А. С. Соколов, Е. А. Пермяков, С.Е. Пермяков // V Съезд биофизиков России: сборник тезисов / Южный федеральный университет. - Ростов-на-Дону, 2015. - том 1. - C. 75.

2. Вологжанникова, А. А. Изучение закономерностей строения парвальбуминов, обусловливающих структурную стабильность их апо-форм / А. А. Вологжанникова, П. А. Хорн, А. С. Казаков, А. С. Соколов, Е. А. Пермяков, С.Е. Пермяков // 20-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: сборник тезисов / КТ «Буки-Веди». -Магнитогорск, 2016. - С. 162.

3. Maslov, I. Singlе-molеculе fluorеscеncе-basеd mеasurеmеnts of conformational dynamics of calcium-binding protеin rеcovеrin / I. Maslov, P. Khorn, A. Bogorodskiy, A. Volgozhannikova, I. Zykov, A. Bеlousov, S. Pеrmyakov, Е. 7етп, J. №ndrix, T. Gеnsch, V. Borsh^vskiy // Biophysical Journal. - 2021. - N 120(3). -183a

4. Ве1ошоу A., Maslov I., Khorn P., Mishin A, Baranov M., Gеnsch Th., Borshchеvskiy V. Solvatochromic f1uorеscеnt dyеs tеstеd for spеctroscopic mеasurеmеnts of protеin conformational dynamics // IJBM. - 2021. - N 11(Suppl_1). -P. 15.

1. Dеnеssiouk, K. Two Structural Motifs within Canonical EF-Hand Calcium-Binding Domains ^nf F^ Diffеrеnt Qassеs of Calcium Buffеrs and Sеnsors / K. Dеnеssiouk, S. Pеrmyakov, A. Dеnеsyuk, E. Pеrmyakov, M. S. Johnson // PLoS ONE.

- 2014. - N 9 (10).

2. К^^е^ R. H., Carp musc1е calcium-binding protеin. II. Structure dеtеrmination and gеnеra1 dеscription / R. H. Krеtsingеr, C. E. Nockolds // J Biol Chеm. - 1973. -N 248. - P. 3313-3326.

3. Gifford, J. L. Structures and mеta1-ion-binding propеrtiеs of Ше Ca2+-binding hе1ix-1oop-hе1ix EF-hand motifs / J. L. Gifford, M.P. Walsh, H. J. Vogе1 // Bio^m J, 2007.

- N 405. - P.199-221.

4. Moncriеf, N. D. Evolution of EF-hand ca1cium-modu1atеd protеins. I. Rе1ationships basеd on amino acid sеquеncеs / N. D. Moncriеf, R. H. Krеtsingеr,

M. Goodman // J Mol Evol. - 1990. - N 30. - P. 522-562.

5. Grabarek, Z. Structural basis for d^raty of Ше EF-hand calcium-binding protеins / Z. Grabarek // J Mol Biol. - 2006. - N 359. - P. 509-525.

6. Ishida, H. EF-Hand Protеins / H. Ishida, H. J. Vogе1 // Encyc1opеdia of Mеta11oprotеins / R. H. Krеtsingеr, V. N. Ше^Ьу, E. A. Pеrmyakov ^ds). - №w York, NY : Spr^r, 2013.

7. Stathopulos, P. B. Structural and mеchanistic insights into STIM1-mеdiatеd initiation of storе-opеratеd calcium еntry / P. B. Stathopulos, L. Zhеng, G. Y. Li,

M. J. Pkvin, M. Ikura // Cе11. - 2008. - N 135. - P. 110-122.

8. Kawasaki, H. Classification and еvo1ution of EF-hand protеins / H. Kawasaki, S. Nakayama, R. H. ^ts^r // Biomеta1s. - 1998. - N 11. - P. 277-295.

9. Bluhm, W. F. Quality assurance for the query and distribution systems of the RCSB Protein Data Bank / W. F. Bluhm, B. Beran, C. Bi, D. Dimitropoulos, A. Prlic, et al. // Database (Oxford). - 2011. - bar 003.

10. Santamaria-Kisiel, L. Calcium-dependent and -independent interactions of the S100 protein family / L. Santamaria-Kisiel, A. C. Rintala-Dempsey, G. S. Shaw // Biochem J. - 2006. - N 96. - P. 201-214.

11. Permyakov, S. E. Intrinsic disorder in S100 proteins / S. E. Permyakov,

R. G. Ismailov, B. Xue, A. I. Denesyuk, et al. // Mol Biosyst. - 2011. - N 7 (7). -P. 2164-2180.

12. Henzl, Michael T. Parvalbumin //Michael T. Henzl // Encyclopedia of Metalloproteins / R. H. Kretsinger, V. N. Uversky, E. A. Permyakov (eds). - New York, NY : Springer, 2013.

13. Permyakov, E. A. Parvalbumin as a Pleomorphic Protein / E. A. Permyakov, V. N. Uversky, S. E. Permyakov // Curr Protein Pept Sci. - 2017. - N 8 (18). -P. 780-794.

14. Burgoyne, R. D. Neuronal Ca2+-sensor proteins: multitalented regulators of neuronal function / R. D. Burgoyne, D. W. O'Callaghan, B. Hasdemir, L. P. Haynes, A. V. Tepikin // Trends Neurosci. - 2004. - N 27. - P. 203-209.

15. Shaw, G. S. Calcium-induced peptide association to form an intact protein domain: 1 H NMR structural evidence / G. S. Shaw, R. S. Hodges, B. D. Sykes // Science. -1990. - N 249. - P. 280-283.

16. Шрмягав, E. А. Мeтoд сoбствeннoй люминис^нции бeлка / E. А. Шрмягав. -М.: Наука, 2003. - 188 с.

17. Шрмягав, E. А. Мeталлсвязываюш,иe бeлки: структура, CBo^TBa, функции / E. А. Шрмягав. - М.: Научный мир, 2012. - 542 с.

18. Ishida, H. Protein-peptide interaction studies demonstrate the versatility of calmodulin target protein binding / H. Ishida, H. J. Vogel // Protein Pept Lett. - 2006. -N 13. - P. 455-465.

19. Bhattacharya, S. Target selectivity in EF-hand calcium binding proteins /

S. Bhattacharya, C. G. Bunick, W. J. Chazin // Biochim Biophys Acta. - 2004. -N 1742. - P. 69-79.

20. Schwaller, B. The continuing disappearance of «pure» Ca2+ buffers / B. Schwaller // Cell Mol Life Sci. - 2009. - N 66. - P. 275-300.

21. Babini, E. Principal component analysis of the conformational freedom within the EF-hand superfamily / E. Babini, I. Bertini, F. Capozzi, C. Luchinat C, et al. //

J Proteome Res. - 2005. - N 4. - P. 1961-1971.

22. Berchtold, M. W. Parvalbumin : guidebook to the calcium-binding proteins // M. W. Berchtold / M.R. Celio, T. Pauls, B. Schwaller (eds). - New York : Oxford University Press, 1996.

23. Kretsinger, R. H. Structure and evolution of calcium modulated proteins / R. H. Kretsinger // CRC Crit Rev Biochem. - 1980. - N 8. - P. 119-174.

24. Kawasaki, H. Structural and functional diversity of EF-hand proteins: Evolutionary perspectives / H. Kawasaki, H., R. H. Kretsinger // Protein Science. - 2017. - N 26. - P. 1898-1920.

25. Schuermann, J. P. Structure of avian thymic hormone, a high-affinity avian beta parvalbumin, in the Ca2+-free and Ca2+-bound states / J. P. Schuermann, A. Tan, J. J. Tanner, M. T. Henzl // J Mol Biol. - 2010. - N 397. - P. 991-1002.

26. Permyakov, E. A. Calcium binding proteins / E. A. Permyakov, R. H. Kretsinger. -Hoboken : Wiley, 2011. - P. 221-235.

27. Habchi, J. Introducing protein intrinsic disorder / J. Habchi, P. Tompa, S. Longhi, V.N. Uversky // Chem. Rev. - 2014. - N 114. - P. 6561-6588.

28. Henzl, M. T. Leucine-85 is an important determinant of divalent ion affinity in rat P-parvalbumin (oncomodulin) / M. T. Henzl, M. E. Davis, A. Tan // Biochemistry. -2008. - N 47. - P. 13635-13646.

29. Вoлoгжанникoва, А. А. Рoль AB дoмeна в функциoнирoвании парвальбумина: дис. канд. бшл. наук: 03.01.02. / Алиса Андрeeвна Вoлoгжанникoва. -Дoлгoпрудный: МФТИ, 2020. - 184 с.

30. Green, Michael R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / Michael R. Green, Joseph Sambrook. - NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.

31. Laible, M. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids / M. Laible, K. Boonrod // J. of Visualized Experiments. - 2009.

32. McWilliam, H. Analysis Tool Web Services from the EMBL-EBI /

H. McWilliam, et al. // Nucleic Acids Res. - 2013. - N 41. - P. W597-600. - Web Server issue.

33. Scopes, R. K., Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm / R. K. Scopes // Anal. Biochem. - 1974. - N 1 (59). - P. 277-282.

34. Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups / G. L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. -1959. - N 1 (82). - P. 70-77.

35. Yazawa, M. Calmodulins from muscles of marine invertebrates, scallop and sea anemone / M. Yazawa, M. Sakuma, K. Yagi // J Biochem. - 1980. - N 5 (87). - P. 1313-1320.

36. Blum, H. E. Comparative properties of vertebrate parvalbumins / H.E. Blum, et al. // J. Biol. Chem. - 1977. - N 9 (252). - P. 2834-2838.

37. Pеrmyakov, E. A. Effеcts of Zn (II) on ga1actosy1transfеrasе activity / E. A. Pеrmyakov, I. L. Rеyzеr, L. J. Bеr1inеr // J. Protеin Chеm. - 1993. - N 5 (12). -P. 633-638.

38. Kawahara, K. Viscosity and dеnsity of aq^ous solutions of urea and guanidim hydrocЫoridе / K. Kawahara, C. Tanford // J. Biol ^m. - 1966. - N 13 (241). - P. 3228-3232.

39. Srееrama, N. Estimation of protеin sеcondary structurе from circular dichroism spеctra: inclusion of dеnaturеd protеins with nativе protеins in Ше analysis / N. Srееrama, S. Y. Vеnyaminov, R. W. Woody // Anal. Вю^ет. - 2000. - N 2 (287). -P. 243-251.

40. Бакунц, А. Г. Влияние связывания катионов металлов на кооперативность тепловых переходов в парвальбумине: дис. канд. биол. наук: 03.01.02. / Ануш Гамлетовна Бакунц. - Пущино: ИТЭБ РАН, 2009. - 130 с.

41. Privalov, P. L. Scanning microca1orimеtry in studying tеmpеraturе-inducеd changеs in protеins / P. L. Privalov, S. A. Potеkhin // Mеthods Enzymol. - 1986. - N 131. - P. 4-51.

42. Hackе1, M. Partial molar vo1umеs of protеins: amino acid sidе-chain contributions dеrivеd from thе partial molar vo1umеs of somе tripеptidеs ovеr thе tеmpеraturе rangе 10-90 dеgrееs C / M. Hackе1, H. J. Hinz, G. R. №dwig // Biophys Chеm. - 1999 (a). -N 1 (82). - P. 35-50.

43. Hackе1, M. A mw sеt of pеptidе-basеd group hеat capaci^s for usе in protеin stability calculations / M. Hackе1, H. J. Hinz, G. R. №dwig // J Mol Biol. - 1999 (b). -N 1 (291). - P. 197-213.

44. Buskin, E. A. Log-normal dеscription of fluorеscеncе spеctra of organic fluorophores / E. A. Buskin, V. I. Emе1yanеnko // Photo^m. Photobiol. -1996. -N 64. - P. 316-320.

45. Alberty, R. A. Standard apparent reduction potentials for biochemical half reactions as a function of pH and ionic strength / R. A. Alberty // Arch Biochem Biophys. - 2001. - N 389. - P. 94-109.

46. Permyakov, E. A. Luminescent Spectroscopy of Proteins / E. A. Permyakov. - Boca Raton ; Ann Arbor ; London ; Tokyo : CRC Press. - 1993.

47. Permyakov, S. E. Metal-controlled interdomain cooperativity in parvalbumins / S. E. Permyakov, et al. // Cell Calcium. - 2009 (a). - N 3 (46). - P. 163-75.

48. Schwarzenbach, G. Die komplexometrische titration / G. Schwarzenbach, H. Flaschka. - Stuttgart: Ferdinand Enke Verlag, 1965.

49. Marquardt, D. W. An algorithm for least-squares estimation of nonlinear parameters / D. W. Marquardt // J. Soc. Indust. Appl. Math. - 1963. - N 2 (11). - P. 431-441.

50. Banker, M. J. Development and validation of a 96-well equilibrium dialysis apparatus for measuring plasma protein binding / M. J. Banker, T. H. Clark, J. A. Williams // J. Pharm Sci. - 2003. - N 5 (92). - P. 967-974.

51. Waters, N. J. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding / N. J. Waters, et al. // J. Pharm Sci. - 2008. - N 10 (97). - P. 4586-4595.

52. Pupyshev, A. A. Atomic absorption spectral analysis / Pupyshev, A. A. - M.: Technosphera, 2009. - in Russian.

53. Forsythe, G. E. Computer methods for mathematical computations / G. E. Forsythe, M. A. Malcolm, and C. B. M. - [USA] : Prentice-Hall, 1977.

54. Smith P. D. A stopped-flow investigation of calcium ion binding by ethylene glycol bis(p-aminoethyl ether)-N,N-tetraacetic acid / P. D. Smith, et al. // Anal. Biochem. -1984. - N 143. - P. 188-195.

55. Hyman, E. S. A study of the rate of chelation of magnesium by CDTA and EDTA in the ATP (Na+ + K+)-ATPase system / Hyman, E. S. // Biochim Biophys Acta. - 1980. -N 2 (600). - P. 553-570.

56. Permyakov, S. E. Recoverin as a redox-sensitive protein / S. E. Permyakov, et al. // J Proteome Res. - 2007 (a). - N 5 (6). - P. 1855-1863.

57. Creed, D. The Photophysics and Photochemistry of the near-Uv Absorbing Amino-Acids .2. Tyrosine and Its Simple Derivatives / D. Creed // Photochem Photobiol. -1984. - N 39. - P. 563-575.

58. Clayshulte, T. M. Reactivity of cysteine 18 in oncomodulin / T. M. Clayshulte, D. F. Taylor, M. T. Henzl // J Biol Chem. - 1990. - N 3 (265). - P. 1800-1805.

59. Zernii, E.Y. Light-induced disulfide dimerization of recoverin under exvivo and in vivo Conditions. Free Radic / E.Y. Zernii, et al. // Biol. Med. - 2015. - N 83. - P. 283295.

60. Rey, N. A. Equilibrium characterization of the As(III)-cysteine and the As(III)-glutathione systems in aqueous solution / N. A. Rey, O. W. Howarth, E. C. Pereira-Maia // J Inorg Biochem. - 2004. - N 98. - P. 1151-1159.

61. Schafer, F. Q. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple / F. Q. Schafer, G. R. Buettner // Free Radical Bio Med. - 2001. - N 30. - P. 1191-1212.

62. Sievers, F. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega / F. Sievers, et al. // Mol Syst Biol. - 2011. - N 7. - P. 539.

63. Uversky, V. N. Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions? / V. N. Uversky, J. R. Gillespie, and A. L. Fink // Proteins. -2000 (a). - N 3 (41). - P. 415-427.

64. Oldfield, C. J. Comparing and combining predictors of mostly disordered proteins / C. J. Oldfield, et al. // Biochemistry. - 2005 (a). - N 6 (44). - P. 1989-2000.

65. Peng, K. Length-dependent prediction of protein intrinsic disorder / K. Peng, et al. // BMC Bioinformatics. - 2006. - N 7. - P. 208.

66. Xue, B. CDF it all: consensus prediction of intrinsically disordered proteins based on various cumulative distribution functions / B. Xue, et al. // FEBS letters. - 2009. - N 9 (583). - P. 1469-1474.

67. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput / R. C. Edgar // Nucleic Acids Res. - 2004. - N 5 (32). - P. 1792-1797.

68. Permyakov, S. E. Sequence microheterogeneity of parvalbumin pi 5.0 of pike: a mass spectrometric study / S. E. Permyakov, et al. // Biochim Biophys Acta. - 2009 (b). - N 1 (1794). - P. 129-136.

69. Uversky, V. N. What does it mean to be natively unfolded? / V. N. Uversky // Eur. J. Biochem. - 2002. N 1 (269). - P. 2-12.

70. Noda, L.H. Properties of thiolesters: kinetics of hydrolysis in dilute aqueous media / L.H. Noda, S.A. Kuby, H.A. Lardy // J.Am.Chem.Soc. - 1953. - N 75. - P. 913-917.

71. Grimsley, G.R. A summary of the measured pK values of the ionizable groups in folded proteins / G.R. Grimsley, J.M. Scholtz, C.N. Pace // Protein Sci. - 2009. -

N 18. - P. 247-251.

72. Hackney, C.M. The concentrations of calcium buffering proteins in mammalian cochlear hair cells / C.M. Hackney, S. Mahendrasingam, A. Penn, R. J. Fettiplace // Neurosci. - 2005. - N 25. - P. 7867-7875.

73. Schafer, F.Q. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple / F.Q. Schafer, G.R. Buettner // Free Radic. Biol. Med. - 2001. - N 30. - P. 1191-1212.

74. Kurimoto, T. Neutrophils express oncomodulin and promote optic nerve regeneration / T. Kurimoto, Y.Q. Yin, G. Habboub, H.Y. Gilbert, Y.Q. Li, S. Nakao, A. Hafezi-Moghadam, L.I.Benowitz // J. Neurosci. - 2013. - N 33. - P. 14816-14824.

75. Yin, Y. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells / Y. Yin, M.T. Henzl, B. Lorber, T. Nakazawa, T.T. Thomas, F. Jiang, R. Langer, L.I. Benowitz // Nat. Neurosci. - 2006. - N 9. - P. 843-852.

76. Samiec, P.S. Glutathione in human plasma: decline in association with aging, age-related macular degeneration, and diabetes / P.S. Samiec, C. Drews-Botsch, E.W. Flagg, J.C. Kurtz, P. Sternberg, R.L. Reed, D.P. Jones // Free Radic. Biol. Med. - 1998. - N 24. - P. 699-704.

77. Ashfaq, S. The relationship between plasma levels of oxidized and reduced thiols and early atherosclerosis in healthy adults / S. Ashfaq, J.L. Abramson, D.P .Jones, S.D. Rhodes, W.S. Weintraub, W.C. Hooper, V. Vaccarino, D.G. Harrison, A.A. Quyyumi // J. Am. Coll. Cardiol. - 2006. - N 47. - P. 1005-1011.

78. Moriarty, S.E. Oxidation of glutathione and cysteine in human plasma associated with smoking / S.E. Moriarty, J.H. Shah, M. Lynn, S. Jiang, K. Openo, D.P. Jones, P. Sternberg // Free Radic. Biol. Med. - 2003. - N 35. - P. 1582-1588.

79. Mutus, B. Disulfide-linked dimer of oncomodulin: comparison to calmodulin / Bulent Mutus, Elizabeth J. Palmer, J. P. MacManus // Biochemistry. - 1988. - N 15 (27). - P. 5615-5622.

80. Palmer, E. J. Inhibition of glutathione reductase by oncomodulin / E. J. Palmer,

J. P. MacManus, B. Mutus // Arch Biochem Biophys. - 1990. - N 277(1). - P. 149-54.

Таблица 7. Данные метода масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением различных форм Р-ПА крысы (см. Раздел 2.2.8). Мутантные формы Р-ПА с аминокислотными заменами в «черном» и «сером» кластерах выделены жирным и обычным шрифтом, соответственно.

Р-ПА Теоретическа я масса, Да Экспериментальна я масса, Да Массы дополнительны х веществ, Да Отношение интенсивносте й пиков, %

WT 12056 12057 - 60

12188 131 (Met) 30

12097 40 (Ca, O, Na) 10

F48A 11981 11982 - 66

12113 131 (Met) 23

12022 40 (Ca, O, Na) 11

A100 V 12085 12085 - 48

12216 131 (Met) 52

F103A 11981 11980 - 53

12112 131 (Met) 36

12149 168 (Met, Ca, O) 3

12020 39 (Ca, O, Na) 4

12055 64 (Ca, O, Na) 3

G61A 12071 12070 - 36

12202 131 (Met) 64

L64A 12015 12014 - 50

12145 131 (Met) 50

M87A 11997 11996 - 50

12127 131 (Met) 50

C18S 12041 12041 - 81

12172 131 (Met) 19

Таблица 8. Молярный коэффициент поглощения различных форм Р-ПА крысы при 280 нм, определенный по поглощению при 205 нм (см. Раздел 2.2.5), а также содержание восстановленных БИ-групп различных форм Р-ПА крысы (1 остаток цистеина), определенное с помощью теста Эллмана (см. Раздел 2.2.6). Мутантные формы Р-ПА с аминокислотными заменами в «черном» и «сером» кластерах выделены жирным и обычным шрифтом, соответственно.

Р-ПА 828о(апо-форма), М-1 см-1 828о(Мв2+/Са2 + загруженная форма), М-1 см-1 ОВ412пт (ТШ 2), о.е.п. Концентраци я БИ-групп, цМ Содержание БИ-групп в белке

жт 2409 2721 0.1580±0.0005 11.54±0.04 0.660±0.002

Р48Л 2316 2829/2207 0.1916±0.0012 13.98±0.09 0.751±0.005

Л100У 2556 2341/2067 0.0912±0.0009 6.66±0.06 0.381±0.004

Р103Л 2511 2523/1987 0.2469±0.0006 18.02±0.05 0.858±0.002

061Л 2265 2387/2693 0.1962±0.0007 14.32±0.05 0.667±0.002

Ь64Л 2367 2276/2304 0.1998±0.0008 14.58±0.06 0.749±0.003

М87Л 2261 2782/2464 0.2590±0.0005 18.91±0.04 0.743±0.002

С18Б 2202 2575 - - -

о 202 ч

ч ю-со 3.

< 0.

Са2*-ПА -WT F48A

-'/7~ \ \ ---A100V

----F103A

,/ п \\

\

\

у/

\ Д

210 220 230

Длина волны.нм

Рисунок 29. Спектры КД в дальней УФ-области Р-ПА крысы дикого типа и его мутантных форм (6,0-7,2 мкМ) при 15°С в зависимости от содержания Са2+/М£2+ (10 мМ Н3ВО3-КОН, рН 8,8 / 10 мМ Трис-НС1, рН 7,3). Мутантные формы Р-ПА с аминокислотными заменами в «черном» (А, В, Д) и «сером» (Б, Г, Е) кластерах выделены жирным и обычным шрифтом, соответственно.

Таблица 9. Термодинамические параметры тепловой денатурации Р-ПА дикого типа и его мутантных форм по данным метода ДСК в соответствии с кооперативной схемой перехода между двумя состояниями. Т0, температура середины теплового перехода; АИ0, энтальпия денатурации белка при Т0; АСР, разность теплоемкостей денатурированной и нативной форм ПА; п, количество белковых молекул, участвующих в тепловом переходе.

Форма белка Р-ПА То, °с АНо, Дж/г АСр, Дж/гК п

ОТ 30,7 11,3 0,59 0,83

Б48Л <30 - - -

«черный» кластер Л100У 33,1 12,9 0,36 0,85

апо Б103Л 31,3 12,3 0,43 0,72

Об1Л 35,5 13,0 0,37 0,86

«серый» кластер Ь64Л 34,5 12,7 0,13 0,90

М87Л 28,4 7,5 0,28 1,08

ОТ 60,9 27,2 0,26 0,83

Б48Л 50,0 18,3 0,27 1,05

«черный» кластер Л100У 66,5 18,8 0,23 1,58

Мв2+ Б103Л 44,5 12,1 0,24 1,18

Об1Л 68,3 17,4 0,04 1,56

«серый» кластер Ь64Л 60,8 17,1 0,14 1,45

М87Л 57,8 13,1 0,13 1,67

ОТ 89,3 52,9 -0,31 0,77

Са2+ Б48Л 77,9 31,9 0,002 1,15

«черный» кластер Л100У 91,9 30,2 -0,65 1,27

Б103Л 74,5 22,8 -0,02 1,26

Форма белка Р-ПА То, °С АЯо, Дж/г АСР, Дж/гК п

061Л 92,2 34,0 -0,69 1,10

«серый» кластер Ь64Л 84,8 27,9 -0,10 1,49

М87А 85,3 22,0 -0,27 1,80

Таблица 10. Величины равновесных констант связывания Mg2+/Ca2+ Р-ПА крысы дикого типа и его мутантных форм при 15°С, оцененные методами буферов М^2+/Са2+ с флуоресцентной детекцией и равновесного диализа с детекцией методом ААС. Оценка констант связывания М§2+/Са2+ проведена в рамках схемы последовательного заполнения центров связывания М§2+/Са2+. Мутантные формы Р-ПА по остаткам «черного» и «серого» кластеров выделены жирным и обычным шрифтом, соответственно.

Р-ПА Мв2+ Са2+

М§ 2+-буферы с флуоресцентной детекцией Равновесный диализ с детекцией ААС Са2+-буферы с флуоресцентной детекцией

^^1

WT 4,7±0,2 4,4±0,4 4,8±0,1 4,1±0,1 9,7±1,2 8,3±0,1

Р48Л - - 3,9±0,2 3,4±0,1 6,0±1,1 4,9±0,3

Л100У 4,7±0,1 3,3±0,2 - - 8,5±0,3 8,3±0,2

Р103Л - - 3,8±0,1 3,7±0,1 5,2±0,4 5,5±0,9

061Л 5,0±0,1 2,9±0,2 - - 9,5±0,3 9,0±0,0

Ь64Л 4,3±0,1 2,7±0,3 - - 9,9±0,2 8,0±0,1

М87А - - 3,8±0,2 3,3±0,2 8,2±0,2 6,9±0,4

1,0

м

Ф (О

=■" 5

о со

2. з

О

к

с; го

в" I

_п го

I- ш

Я О

О со

¡1 ¡1

0,7

0,6

•а А

/ •Л °Ь •ч X ** %

я та 9 а, Л ♦ ® • 1 Р 1 ч - * ► • -е-*» С183 * » Т// ' • • • •

0 1 И/Т

ю <р 6 1

[Са ]/[р-ПА]

4 5 6 7 [ЭДТА]/[р-ПА]

10 11

Рисунок 30. A, спектрофлуориметрическое титрование Ca2+/ЭДТА различных Р-ПА (5-23 мкМ) при 20 °С (10 мМ HEPES-KOH, pH 8,2, Хвозбуждения=275 нм). Б, определение сродства различных Р-ПА (50-200 мкМ) к Mg2+ методом равновесного диализа с детекцией ААС при 20 °С (30 мМ HEPES-KOH, 1 мМ ЭГТА, pH 7,4, 2750 мкM Mg(NO3)2). [bMg2+] - концентрация связанного Mg2+. Пунктиром обозначены теоретические кривые, рассчитанные согласно схеме последовательного заполнения центров связывания металлов.

Таблица 11. Величины равновесных констант связывания Mg2+/Ca2+ Р-ПА крысы дикого типа и С18Б при 20°С, оцененные методами спектрофлуориметрического титрования и равновесного диализа с детекцией методом ААС. Оценка констант связывания М^2+/Са2+ проведена в рамках схемы последовательного заполнения центров связывания М§2+/Са2+.

Р-ПА Мв2+ Са2+

Равновесный диализ с детекцией ААС Спектрофлуориметрическое титрование Са2+/ЭДТА

^Ка1 1о§Ка2 ^Ка1 1о§Ка2

ЖТ 5,15±0,03 4,16±0,09 9,1±0,3 7,5±0,3

С18Б 4,71±0,04 4,00±0,19 7,6±0,2 7,9±0,2

Таблица 12. Значения равновесных констант связывания Са2+ различными Р-ПА, К1 и К2, и констант скорости диссоциации комплекса Са2+ и различных Р-ПА, кф (1=1,2), при 20°С согласно данным методов методами спектрофлуориметрического титрования Са2+/ЭДТА и остановленного потока с флуоресцентной детекцией, соответственно. Оценка констант связывания Са2+ проведена в рамках схемы последовательного связывания. Константы скорости ассоциации металлов, к0т (1=1,2) были получены из этих оценок.

Р-ПА К1, М-1 К2, М-1 Кии М-1с-1 кои2, М-1с-1 коГА ± ББ, с-1 ко^2 ± ББ, с-1

ЖТ (1,3±0,9)х109 (4±2)х107 (3±2)х109 (5±4)х108 2,6±0,3 1,9±0,4

С18Б (4±2)х107 (8±4)х107 (1,5±0,8)х108* -* 3,6±0,4

*диссоциация комплекса проходила в пределах «мертвого» времени прибора, 6 мс

Рисунок 31. Спектрофлуориметрическое определение сродства Р-ПА кижуча к Са2+ при 20°С согласно методам титрования Са2+/ЭДТА (А) и буферов кальция (Б). А, зависимость интенсивности флуоресценции (^возбуждения=258 нм) Р-ПА кижуча (14 мкМ) от общей концентрации Са2+/ЭДТА (10 мМ ИЕРЕЗ-КОИ, рН 8,2, 0,2 мМ ДТТ) Пунктиром обозначены теоретические кривые, рассчитанные согласно схеме последовательного заполнения центров связывания металлов. Б, изменение интенсивности флуоресценции ((А,возбуждения=385 нм) бис-АНС (1 мкМ) в присутствии Р-ПА кижуча (10 мкМ) и добавлении СаС12 (10 мМ HEPESKOH, рИ 8,2, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА-КОН, 27 мкМ-0,99 мМ СаС12. Пунктиром обозначены теоретические кривые, рассчитанные согласно кооперативного связывания металла.

Таблица 13. Особенности аминокислотного состава двух групп ПА, различающихся стабильностью их апо-форм.

1-35 участок выровненных последовательностей Полная последовательность

Количество остатков Количество остатков

Аминокислотный остаток Апо-форма не свернута Апо-форма свернута Аминокислотный остаток Апо-форма не свернута Апо-форма свернута

Lys 4,8±1,3 2,4±1,0 Tre 3,0±1,2 5,0±0,6

Gln 0 1,6±1,4 Ala 19,0±0,7 12±4

Ser 4,8±1,9 11±3