Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А.17. Каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Куркова, Инна Николаевна

• Куркова, Инна Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Куркова, Инна Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА.

1.1. Каталитические антитела как часть иммунной системы.

1.2. Каталитические антитела как искусственные ферменты.

ПРОБЛЕМА АНТИДОТНОЙ ТЕРАПИИ ОТРАВЛЕНИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ ТОКСИНАМИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Одноцепочечное антитело А. 17 взаимодействует с фосфорорганическим пестицидом параоксон.

2. Создание эукариотической системы экспрессии полноразмерного антитела А. 17.

3. Сравнение функциональной активности одноцепочечного и полноразмерного антитела А. 17.

4. Структурный анализ антитела А.17:.

5. Сайт-направленный мутагенез антитела А.17.

Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов.

6. Взаимодействие антитела А.17 с пестицидом параоксон.

7. Детализация механизма катализа абзима А.17.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКТИВЫ И СОПУТСТВУЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ. реактивы и материалы. ферменты. ингибиторы протеаз. маркеры. антитела и конъюгаты. плазмиды. штаммы Е. coli.

ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ЛИНИИ

РАСТВОРЫ.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

АНТИБИОТИКИ.

МЕТОДЫ.

1. РАБОТА С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ.

АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

РЕСТРИКЦИЯ.

ЛИГИРОВАНИЕ.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.

ЭЛЕКТРОЭЛЮЦИЯ.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.

САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА А.17.

2. МЕТОДЫ РАБОТЫ С БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA СОИ.

ПОЛУЧЕНИЕ ЭЛЕКТРОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК.

ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК ЕСОПМЕТОРРМ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ.

ПЦР С КОЛОНИЙ.

НОЧНАЯ КУЛЬТУРА.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МУЗЕЙНОГО ШТАММА.

3. РАБОТА С БЕЛКАМИ.

ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.

ОКРАШИВАНИЕ ПААГ.

ИММУНОБЛОТГИНГ.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ*АНАЛИЗ (ИФА) ПО СХЕМЕ SANDWICH ELISA.

ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ (SGFV).

ОЧИСТКА ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ.

ПОЛУЧЕНИЕ FAB ФРАГМЕНТА АНТИТЕЛА.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ FAB*ФРАГМЕНТА АНТИТЕЛА А.17 И РЕНТГЕНОСГРУКТУРНЫЙАНАПИЗ.

ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОДИНАМИКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АБЗИМОВ/ФЕРМЕНТОВ С ФОСФОНАТОМ X МЕТОДОМ 'ГГС.

ТРИПТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ ДЛЯtМАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА.

МАСС-СПЕКТРОМЕГРИЯ MALDI.

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ELECTROSPRAY IONIZATION FOURIER TRANSFORM ION, CYCLOTRON RESONANCE MASS SPECTROMETRY ESI-FTICR-MS (TOP-DOWN).

ИЗМЕРЕНИЕ ЭСТЕРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

КАТАЛИЗ ГИДРОЛИЗА АМИДНОЙ СВЯЗИ.

МОДИФИКАЦИИ РЕКОМБИНАТНЫХ АНТИТЕЛ ФОСФОНАТОМ X.

ИЗУЧЕНИЕ КАТАЛИЗА ГИДРОЛИЗА ПАРАОКСОНА.

ПРЕДСТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИТЕЛО-СУБСТРАТ МЕТОДОМ ОСТАНОВЛЕННОГО ПОТОКА.

4. МЕТОДЫ РАБОТЫ С ЭУКАРИОТИЧЕСКИМИ КЛЕТКАМИ.

ПОДДЕРЖАНИЕ В КУЛЬТУРЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЛИНИИ СНО.

ПОДДЕРЖАНИЕ В КУЛЬТУРЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЛИНИИ ПЪО ВСИ.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МУЗЕЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК.

ВЫВЕДЕНИЕ ЛИНИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ИЗ ЗАМОРОЗКИ.

ТРАНСФЕЦИРОВАНИЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ЛИПОФЕКЦИИ.

ВЫВОДЫ.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А.17. Каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон»

Существование живых организмов - это сложный комплекс биохимических процессов, значительная часть которых представлена биокатализируемыми превращениями.

В последние три* десятилетия в связи с обнаружением каталитической активности молекул РНК (рибозимов) и антител (абзимов) основополагающие представления о биокатализе существенно изменились. В основе концепции индукции каталитического' ответа антител (абзимов) лежат классические работы Полинга и Дженкса [1, 2]. В ответ на введение в организм природных или синтетических антигенов иммунная система способна вырабатывать антитела, связывающиеся со своими антигенами с высокой аффинностью и исключительной специфичностью. Взаимодействие антигена и связывающего участка антитела осуществляется за счет большого числа нековалентных взаимодействий - водородных связей, гидрофобных и электростатических взаимодействий, точно так же, как при образовании фермент-субстратного комплекса [3]. Полинг постулировал, что фундаментальным отличием антител от ферментов является то, что антитела с высокой специфичностью связывают стабильную форму антигена,- а ферменты проявляют максимальную аффинность к высокоэнергетическому переходному состоянию катализируемой ими реакции [2]. Таким образом, можно было предположить, что иммуноглобулины, способные связывать переходное состояние реакции, могут проявлять каталитическую активность.

Идея Полинга получила блестящее практическое подтверждение в работах Лернера и Шультца [4, 5]. К настоящему моменту известно значительное число абзимов, катализирующих более 30 химических реакций. В начале 90-х годов пионерские работы Паула [6] и Габибова [7] впервые показали спонтанное образование этих биокатализаторов при аутоиммунных патологиях.

На сегодняшний день показано существование природных абзимов при целом ряде аутоиммунных патологий, доказана принципиальная возможность возникновения каталитических антител практически к любому аутоантигену [8]. Обнаружение способности молекул иммуноглобулинов катализировать образование активных форм кислорода, обусловленное специфическим фолдингом этих белковых молекул, существенным образом расширило представление о функции антител в иммунной системе [9]. Разработка методов получения искусственных абзимов с заданной субстратной специфичностью, в том числе способных осуществлять биокаталитические превращения, для которых нет соответствующих природных аналогов, имеет важное фундаментальное и прикладное значение. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке открывает широкие перспективы использования абзимов в качестве лекарственных средств. Так исследования кокаин-гидролизующих абзимов были доведены до стадии in vivo. Значительный прогресс, достигнутый в этом направлении исследований, привел к формированию отдельного области знания в энзимологии -абзимологии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Куркова, Инна Николаевна

выводы.

1. На основе последовательностей вариабельных доменов одноцепочечного антитела А. 17 создано и проэкспрессировано в клетках линии'СНО-К1 полноразмерное антитело. Показано, что полученное полноразмерное антитело способно^ ковалентно связываться с /7-нитрофенил# 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (X) и гидролизовать пестицид параоксон.

2. Произведен структурный* анализ Fab фрагмента каталитического антитела А. 17 и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната X. Основываясь на структурных данных, был осуществлен мутагенез ряда аминокислотных остатков антитела* с целью выявления* их роли в каталитической активности абзима. Показано, что замены аминокислотных остатков, участвующих в стабилизации* CDR-H3, влияют на. скорость реакции фосфонилирования* антитела фосфонатом Х и слабо сказываются на-стадии связывания субстрата.

3. По совокупности данных структурного анализа, изучения термодинамики и быстрой кинетики показано, что взаимодействие А. 17 с фосфонатом X осуществляется по механизму индуцированного.соответствия.

4. Установлено, что гидролиз пестицида параоксон антителом* А.17 проходит через стадию образования фосфотирозинового ковалетного интермедиата с аминокислотным остатком Y-L37. Показано, что стадия дефосфорилирования* является скорость-лимитирующей.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Куркова, Инна Николаевна, 2011 год

1. Jenks, W.P., Catalysis in Chemistry and Enzymoiogy. New York: McGrawj . Hill., 1969.1 2. Pauling, L., Chem Eng News, 1946: 36: p. 1375-77. '

2. Tramontano, A., K.D. Janda, and R.A. Lerner, Catalytic antibodies. Science,

3. J 1986. 234(4783): p. 1566-70.

4. Paul, S., et a I;, Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by humanautoantibody. Science, 1989. 244(4909): p. 1158-62.

5. Shuster, A.M.', et al., DNA hydrolyzing autoantibodies. Science, 1992.256(5057): p. 665-7. .

6. Belogurov, A., Jr., et al., Catalytic antibodies: balancing between Dr. Jekyll1.and Mr. Hyde. Bioessays, 2009. 31(11): p. 1161-1171.

7. Wentworth, P., Jr., et al., Evidence for antibody-catalyzed ozone formationin bacterial killing.and inflammation. Science, 2002.-298(5601): p; 2195-9.

8. Janeway, C., Immunobiology : the immune system in health and. disease.5th ed. 2001, New York: Churchill Livingstone; Garland, xviii, 732 p.

9. Planque, S., et al., Ontogeny of proteolytic immunity: IgM serine proteases.

10. J BiohChem, 2004. 279(14): p. 14024-32. ■

11. Tawfik, D.S., et al., Unexpectedly high occurrence of catalytic antibodies in• MRL/lpr and SJL mice immunized with a transition-state analog: is there alinkage to autoimmunity? Proc Natl Acad Sci USA; 1995. 92(6): p. 2145-9:,

12. Lacroix-Desmazes, S., et al., High levels of catalytic antibodies correlate withfavorable outcome in sepsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(1-1): p.f 4109-13. ’

13. Gao, Q.S., et al., Molecular cloning of a proteolytic antibody light chain. J

14. Biol Chem, 1994. 269(51): p. 32389-93.

15. Sun, M., et al., Proteolytic activity of an antibody light chain. J Immunol,t 1994. 153(11): p. 5121-6.s*

16. Thiagarajan, P., et al., Monoclonal antibody light chain with prothrombinasej activity. Biochemistry, 2000. 39(21): p. 6459-65.

17. Thiagarajan, P. and S. Paul, Prothrombin cleaving antibody light chains.

18. J Chem Immunol, 2000. 77: p. 115-29.

19. Nardi, M., et al., Complement-independent, peroxide-induced antibody lysis of platelets in HIV-l-related immune thrombocytopenia. Cell, 2001. 106(5): p. 551-61.

20. Paul, S.,.et al., Characterization of thyroglobulin-directed and poiyreactive catalytic antibodies in autoimmune, disease. J Immunol, 1997. 159(3): p. 1530-6.

21. Lacroix-Desmazes, S., et al., The prevalence of proteolytic antibodies against ' factor VIII in hemophilia A. N Engl J Med, 2002. 346(9): p. 662-7.

22. Ponomarenko, N.A., et al., Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models. J Immunol Methods, 2002. 269(1-2): p. 197-211.

23. Ponomarenko, N.A., et al., On the catalytic'activity of autoantibodies in multiple sclerosis. Dokl Biochem Biophys, 2004. 395: p. 120-3.

24. Gololobov, G.V., et al:, DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl Biochem Biotechnol, 1994. 47(2-3):.p. 305-14; discussion 314-5.

25. Baranovskii, A.G., et al., Catalytic heterogeneity of polyclonal DNA-hydrolyzing antibodies from the sera of patients with multiple sclerosis. Immunol Lett, 2001.-76(3): p. 163-7.

26. Breusov, A.A., et al., Comparison of the Level of DNA-Hydrolyzing Polyclonal IgG Antibodies in Sera of Patients with Hashimoto's Thyroiditis and Nontoxic NodaiGoiter. Russ J Immunol, 2001. 6(1): p. 17-28.

27. Nieva, J. and P. Wentworth, Jr., The antibody-catalyzed water oxidation pathway-a new chemical arm to immune defense? Trends Biochem Sci,2004. 29(5): p. 274-8.

28. Zhu, X., et al., Probing the antibody-catalyzed water-oxidation pathway at atomic resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(8): p. 2247-52.

29. Khersonsky, O. and D.S. Tawfik, Enzyme promiscuity: a mechanistic and evolutionary perspective. Annu Rev Biochem. 79: p. 471-505.

30. Fiehn, O., D.K. Barupal, and T. Kind, Extending biochemical databases by metaboiomicsurveys. J Biol Chem. 286(27): p. 23637-43.

31. Khersonsky, O., C. Roodveldt, and D.S. Tawfik, Enzyme promiscuity: evolutionary and mechanistic aspects. Curr Opin Chem Biol, 2006. 10(5): p. 498-508.

32. Tawfik, D.S., Biochemistry. Loop grafting and the origins of enzyme species. Science, 2006. 311(5760): p. 475-6.

33. Breslow R., O.L.E., An 'Artificial Enzyme' Combining a Metai Catalytic Group and a Hydrophobic Binding Cavity. J. Am. Chem. Soc., 1970. 92(4): p. 10751077.

34. Gouverneur, V.E., et al., Control of the exo and endo pathways of the Die/sAlder reaction by antibody catalysis. Science, 1993. 262(5131): p. 204-8.

35. Ulrich, H.D., E.M. Driggers, and P.G. Schultz, Antibody catalysis of pericyciic reactions. Acta Chem Scand, 1996. 50(4): p. 328-32.

36. Socolich, M., et al., Evolutionary information for specifying a protein fold. Nature, 2005. 437(7058): p. 512-8.

37. Russ, W.P. and R. Ranganathan, Knowledge-based potential functions in protein design. Curr Opin Struct Biol, 2002. 12(4): p. 447-52.

38. Minshull, J., et al., Predicting enzyme function from protein sequence. Curr Opin Chem Biol; 2005. 9(2): p. 202-9.

39. Russ, W.P., et al., Natural-like function in artificial WW domains. Nature,2005. 437(7058): p. 579-83.

40. Hilvert, D., Critical analysis of antibody catalysis. Annu Rev Biochem, 2000. 69: p. 751-93.

41. Stewart, ID. and SJ. Benkovic, Transition-state stabilization as a measure of the efficiency of antibody catalysis. Nature, 1995. 375(6530):-p. 388-91.

42. Raso, V. and B.D. Stollar, The antibody-enzyme analogy. Comparison of enzymes and antibodies specific for phosphopyridoxyltyrosine. Biochemistry, 1975. 14(3): p. 591-9.44: Kohen, F., et al., Antibody-enhanced hydrolysis of steroid esters. Biochim

43. Biophys Acta, 1980. 629(2): p. 328-37.

44. Kohen, F., et al., Monoclonal immunoglobulin G augments hydrolysis of an ester of the homologous hapten: an esterase-like activity of the antibody-containing site? FEBS Lett, 1980.-111(2): p. 427-31.

45. Shokat, K.M. and P.G. Schultz, Catalytic antibodies. Annu Rev Immunol, 1990. 8: p. 335-63.

46. Schultz, P.G., The interplay between chemistry and biology in the design of enzymatic catalysts. Science, 1988. 240(4851): p. 426-33.

47. Napper, A.D., et al., A stereospecific cydization catalyzed by an antibody. Science, 1987. 237(4818): p. 1041-3.

48. Hilvert, D., et al., Catalysis of concerted reactions by antibodies: the Ciaisenrearrangement. Proc Natl Acad Sci USA, 1988: 85(14): p. 4953-5. *

49. Jackson D. Y., J.H.W., Sugasawara R., Reich S. H., Bartlett P. A., Schultz P.G., An Antibody-catalyzed Ciaisen Rearrangement. J. Am: Chem. Soc., 1988. 110: p. 4941-42.

50. Bencovic S. J., N.A.D., Lerner R. A., Catalysis of a Stereospecific Bimolecular Amide Synthesis by an Antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1988. 85(5355-8).

51. Braisted A. C., S.P.G., An Antibody-catalyzed Bimolecular Diefs-Alder Reaction. J. Am. Chem. Soc., 1990. 112: p. 7430-1.

52. Hilvert D., H.K.W., Nared K. D., Auditor M. T. M., Antibody Catalysis of a Diels-AlderReaction. J. Am. Chem. Soc., 1989. Ill: p. 9261-9262.

53. Mundorff, E.C., et al., Conformational effects in biological catalysis: an antibody-catalyzed oxy-cope rearrangement Biochemistry, 2000. 39(4): p. 627-32.

54. Reshetnyak, A.M., et al., Routes to covalent catalysis by reactive selection for nascent protein nucleophiles. J Am Chem Soc, 2007. 129(51): p. 16175-82.

55. Tawfik, D.S., et al., Efficient and selective p-nitrophenyl-ester-hydrolyzing antibodies elicited by a p-nitrobenzyl phosphonate hapten. Eur J Biochem, 1997. 244(2): p. 619-26.

56. Suzuki, H., et al., A catalytic antibody that accelerates the hydrolysis of carbonate esters. Prediction of the binding-site structure of the substrate. J Protein Chem, 1998. 17(3): p. 273-8.

57. Janda, K.D., et al., Induction of an antibody that catalyzes the hydrolysis of an amide bond. Science, 1988. 241(4870): p. 1188-91.

58. Miyashita, H., et al., Prodrug activation via catalytic antibodies. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(11): p. 5337-40.

59. Landry, D.W., et al., Antibody-catalyzed degradation of cocaine. Science, 1993. 259(5103): p. 1899-901.

60. Landry, D.W., Immunotherapy for cocaine addiction. Sci Am, 1997. 276(2): p. 42-5.

61. Mets, B., et al., A catalytic antibody against cocaine prevents cocaine's reinforcing and toxic effects in rats. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(17): p. 10176-81.

62. McKenzie, K.M., et al., Identification and characterization of single chain anti-cocaine catalytic antibodies. J Mol Biol, 2007. 365(3): p. 722-31.

63. Benkovic, S.J., et al., The enzymic nature of antibody catalysis: development of multistep kinetic processing. Science, 1990. 250(4984): p. 1135-9.

64. Janda, K.D., C.G. Shevlin, and R.A. Lerner, Antibody catalysis of a disfavored chemical transformation. Science, 1993. 259(5094): p. 490-3.

65. Gruber, K., et al., Structural basis for antibody catalysis of a disfavored ring closure reaction. Biochemistry, 1999. 38(22): p. 7062-74.

66. Shabat, D., et al., Antibody catalysis of a reaction otherwise strongly disfavoured in water. Nature, 1995. 374(6518): p. 143-6.

67. Baca, M., et al., Phage display of a catalytic antibody to optimize affinity for transition-state analog binding. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(19): p. 10063-8.

68. Takahashi, N., et al., In vitro abzyme evolution to optimize antibody recognition for catalysis. Nat Biotechnol, 2001. 19(6): p. 563-7.

69. Lerner, R.A. and C.F. Barbas, 3rd, Using the process of reactive immunization to induce catalytic antibodies with complex mechanisms: aldolases. Acta Chem Scand, 1996. 50(8): p. 672-8.

70. Wirsching, P., et al., Reactive immunization. Science, 1995. 270(5243): p. 1775-82.

71. Barbas, C.F., 3rd, et al., Immune versus natural selection: antibody aldolases with enzymic rates but broader scope. Science, 1997. 278(5346): p. 2085-92.

72. Sinha, S.C., C.F. Barbas, 3rd, and R.A. Lerner, The antibody catalysis route to the total synthesis of epothilones. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(25): p. 14603-8.

73. Shabat, D., et al., Multiple event activation of a generic prodrug: trigger by antibody.catalysis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(12): p. 6925-30.

74. Shamis, M., H.N. Lode, and D. Shabat, Bioactivation of self-immoiativedendritic prodrugs by catalytic antibody 38C2. J Am Chem Soc, 2004; 126(6): p. 1726-31. .

75. Sinha, S.C., et al:, Prodrugs of dynemicin analogs for selective chemotherapymediated by an aldolase catalytic Ab. Proc Natl; Acad Sci U S A, 2004. 101(9): p. 3095-9. . .

76. Shabat, D., et al., In vivo activity in a catalytic antibody-prodrug system: Antibody catalyzed:etoposide prodrug activation for selective chemotherapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(13): p. 7528-33.

77. Poignard; P., et a W,gpl20:: Biologic.aspects of structural features. An n u Rev1.munol, 2001. 19: p. 253-74. ;

78. Burton, D.R., A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. Proc Natl

79. Acad:Sci U S.A; 1997. 94(19): p. 10018-23; .

80. Burton, D.R. and P.W. Parren, Vaccines and the induction of functionalantibodies: time to look beyond the molecules of'natural infection? Nat Med, 2000. 6(2): p. 123-5. '

81. Pollard; S.R.,.et al., CD4-binding regions of human immunodeficiency virusenvelope glycoprotein gp!20 defined by proteolytic digestion. Proc Natl Acad Sci USA, 1991.88(24): p. 11320-4. . . .

82. Moore, J.P. and D.D. Ho; Antibodies to discontinuous or conformationaHysensitive epitopes on the gpl20 glycoprotein of human immunodeficiency.

83. Smith, G.P. and V.A. Petrenko, Phage Display. Chem Rev, 1997: .97(2): p.391.410: . ' :

84. Winter, G., et al., Making antibodies:by phage display technology. Annu Rev1.munol, 1994. 12: p. 433-55., .

85. Smith, G.P., Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.Sz\ex\ce, ,1985. 228(4705): p. 1315-7.91.