Структурно-функциональные закономерности катализа липоамиддегирогеназой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Щедрина, Валентина Анатольевна

• Щедрина, Валентина Анатольевна
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Щедрина, Валентина Анатольевна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА, РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ АКТИВНОСТЕЙ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ЛИПОАМИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ И ЕЁ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ.

1.1. Физико-химические свойства липоамиддегидрогеназ из различных источников.

1.2. Механизмы прямой и обратной липоамиддегидрогеназной реакций.

1.3. LADH - составной компонент митохондриальных дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот.

1.4. Структура дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот.

1.5. Заболевания, связанные с нарушением функционирования дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот.

1.6. Диафоразная реакция.

1.7. Регуляция олигомерного состава LADH в водных растворах.

ГЛАВА 2. ТОКСИЧНОЕ ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ЦИНКА НА ПРОЦЕССЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ В МИТОХОНДРИЯХ, И КАТАЛИЗ, ОСУЩЕСТВЛЯЕМЫЙ LADH.

2.1. Митохондриальная дисфункция и повышенная концентрация ионов Zr>2+ в дегенеративных заболеваниях ЦНС.

2.2. Влияние ионов цинка на липоамиддегидрогеназную, оксидазную и диафоразную активности LADH.

ГЛАВА 3. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ И ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА ФЕРМЕНТОВ В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ ПАВ/ВОДА/Органический растворитель.

3.1. Система обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях.

3.2. Ферменты в системах обращенных мицелл и регуляция их активности изменением степени гидратации ПАВ.

3.3. Регуляция каталитической активности и субъединичного состава олигомерных ферментов в системах обращенных мицелл.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Материалы.

4.2. Методы исследования.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 5. КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ДИАФОРАЗНОЙ РЕАКЦИИ И ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ЦИНКА НА КАТАЛИЗ.

5.1. Стационарная кинетика диафоразной реакции и предложение механизма данной реакции.

5.2. Стационарная кинетика диафоразной реакции в присутствии ионов гп2+, механизм и определение констант скорости.

5.3. Определение констант скорости диафоразной реакции в присутствии и в отсутствие ионов гп2+ методом остановленной струи и объяснение эффекта активации.,.

5.4. Отсутствие влияния ионов цинка на реакцию восстановления п-бензохинона, катализируемую 1АйН.

5.5. Различное влияние ионов цинка на реакцию восстановления одно - и двухэлектронных акцепторов электронов, катализируемую 1АРН.

ГЛАВА 6. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТЕЙ И ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА 1АРН В

СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ АОТ/ ВОДА/ОКТАН.

А 6.1. Зависимости коэффициента экстинкции ОСР1Р, фоновой реакции восстановления 0СР1Р с помощью МАРН и каталитической активности 1АОН в диафоразной реакции от рН.

6.2. Регуляция олигомерного состава и каталитической активности 1АРН в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан в диафоразной реакции при рН 7.5.

6.3. Регуляция олигомерного состава и каталитической активности 1АЭН в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан в обратной липоамиддегидрогеназной реакции при рН 7.5.

6.4. Седиментационный анализ 1АРН в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан при рН 7.5.

6.5. Модель тетрамера свиной 1АРН.

6.6. Сопоставление размеров димера и тетрамера, полученных экспериментально (рН 7.5), с размерами модельных форм 1АРН.

ГЛАВА 7. рН РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА 1АРН В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ АОТ/ВОДА/ОКТАН.

7.1. Седиментационный анализ ЦМЭН в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан при рН 5.8.

7.2. Влияние рН на активность ЦМЭН в диафоразной реакции и олигомерный состава фермента в системе обращенных мицелл АОТ/вода/октан.

V. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные закономерности катализа липоамиддегирогеназой»

Одним из направлений современной биохимии является исследование процессов, происходящих в клетках умирающих нейронов в ряде заболеваний центральной нервной системы (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и др.). Изучение дисфункции митохондрий (как органелл участвующих в синтезе АТФ, окислении Сахаров, жирных кислот и аминокислот) в нейродегенеративных заболеваниях занимает особое место в этом направлении. Липоамиддегидрогеназа (ЬАОН) является одним из трёх ферментов митохондриальных дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот аэробных организмов. Катализируемые митохондриальными комплексами реакции служат необходимыми звеньями синтеза АТФ и метаболизма разветвленных аминокислот, поэтому их значение для нормального функционирования клетки трудно переоценить. В случае нейродегенеративных заболеваний, в митохондриях нейронов происходит ряд патологических процессов: повышение концентрации свободного Zn2+ и концентрации радикальных кислород-содержащих частиц, понижение рН и др. Липоамиддегидрогеназа, как важных катализатор биохимических процессов митохондрии, является одной из мишеней для этих измененных условий матрикса митохондрий.

ЬАОН принадлежит к семейству РАО-зависимых тиоловых оксидоредуктаз. Кроме реакции, катализируемой в составе митохондриальных комплексов - обратимой реакции окисления восстановленного липоамида при сопряженном восстановлении фермент способен катализировать реакции восстановления хинонов, одноэлектронных акцепторов электронов и кислорода. В связи с этим интересным является вопрос о соотношении различных видов активностей ЬАБН в условиях, характерных для патологии. В 2002 году были обнаружены ингибирование ионами 2п2+ реакций восстановления/окисления липоамида/дигидролипоамида и активация ионами реакции восстановления кислорода. Вопрос о влиянии ионов Ът?* на механизм реакции восстановления хинонов (диафоразной реакции) вплоть до настоящего времени являлся неисследованным, как впрочем, и сам механизм восстановления хинонов. Поэтому одной из задач данной работы стало изучение механизма диафоразной реакции в присутствии и

Л I в отсутствии ионов Ъл . Для исследования был выбран наиболее известный фермент -липоамиддегидрогеназа из сердца свиньи.

Для олигомерных ферментов, к которым относится ЬАОН, немаловажным является вопрос о соотношении между составом и каталитической активностью. Изменение в стехиометрии любого из трёх ферментов, входящих в состав митохондриальных дегидрогеназных комплексов, возможно, является одним из способов регуляции активности целых комплексов и играет важную роль в метаболизме клетки. Точный субъединичный состав кубических дегидрогеназных комплексов до сих пор остается не установленным. Вероятно, что эта неясность связана с непостоянством и изменением состава в ответ на потребности клетки в продуктах катализа комплексами. В этой связи точное знание каталитических свойств различных олигомерных форм ЬАЭН и условий их взаимопревращений представляет особый интерес. Возможность функционирования ЬАЭН в виде мономера была продемонстрирована только в денатурирующих условиях: при разрушении межсубъединичного контакта димерной молекулы с помощью химической модификации. Никаких других олигомерных форм фермента экспериментально не было обнаружено. Однако, предполагается, что в состав некоторых дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот липоамидцегидрогеназа входит в виде тетрамера. Поэтому второй задачей данной работы было изучение регуляции олигомерного состава и каталитической активности ЬАЭН в мягких, неденатурирующих условиях. Очень удобным инструментом для такого рода исследования является система обращенных мицелл АОТ/вода/н-октан. Кроме детекции различных олигомерных форм фермента, интересным представляется сравнение специфичности этих форм ЬАОН в двух типах реакций - диафоразной и липоамиддегидрогеназной, а также изучение влияния рН на процесс ассоциации - диссоциации и каталитическую активность ЬАЭН.

Третьей задачей работы являлось исследование влияния рН на каталитические и структурные свойства фермента. Это исследование представляется особенно перспективным, поскольку в условиях нарушения функционирования митохондрий наблюдается увеличение проницаемости их мембран и внутримитохондриальный рН (7.4) приближается к внутриклеточному рН (6.8), что, возможно, влияет на свойства ЬАОН и состав комплексов. Липоамидцегидрогеназа никогда ранее не изучалась в системе обращенных мицелл ПАВ/вода/органический растворитель, поэтому использование данного подхода для выявления возможных олигомерных состояний ЬАЭН и изучения их свойств является принципиально новым.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Щедрина, Валентина Анатольевна

V. выводы.

1. Методами стационарной и предстационарной кинетики определены константы скорости отдельных стадий диафоразной реакции, катализируемой липоамидцегидро-геназой, с модельным субстратом ЭСРГР. На основании проведенного анализа кинетических закономерностей диафоразных реакций в присутствии и в отсутствие ионов предложены схемы этих реакций. Доказано соответствие наблюдаемых кинетических закономерностей предложенным схемам и следующим из них уравнениям скорости реакций.

2. Показано, что каталитически значимой для восстановления ЭСР1Р в диафоразной реакции является ЕРЦ форма ЬАБН. Так, ЕНг форма ЬАБН почти в 20-30 раз менее активна по отношению к БСР1Р (к2 = (5.2±0.5)-103 М^с*1), чем ЕН4 форма ЬАБН (Л4 = (9±2)-104 М-'с1) и ЕН4 форма, модифицированная цинком (EH2Zn) (^оср1Р2п = (1.6±0.5)-105 М-'С1).

3. Методами стационарной кинетики проведено изучение влияния ионов цинка на восстановление одно- и двухэлектронных акцепторов электронов в диафоразной реакции.

V Установлено, что ионы цинка ускоряют восстановление только двухэлектронных акцепторов фСР1Р, дурохинон) и практически не влияют на скорость восстановления одноэлектронных акцепторов (п-бензохинон, убихинон С?0, феррицианид калия). Это указывает на возможность переключения ЬАБН в присутствии повышенных концентраций Ъп (патологические условия в клетке) на двухэлектронный путь восстановления субстратов, что, возможно, приводит к уменьшению концентрации семихинонов в митохондрии и, вероятно, является одним из защитных механизмов клетки на патологические условия.

4. Проведено изучение возможности регуляции олигомерного состава и каталитических свойств ЬАЭН с использованием системы обращенных мицелл. Кинетическими и седиментационными методами показано, что в системе обращенных мицелл АОТ в октане при физиологическом рН водной среды (рН 7.5) возможно существование и функционирование свиной ЬАБН в виде димера и тетрамера. Обнаружено, что соотношение активностей димерной и тетрамерной форм ЬАОН различается для различных типов реакций. Так, тетрамер ЬАОН имеет более высокую константу скорости восстановления липоамида, чем димер, а в случае восстановления ЭСР1Р, соотношение каталитических констант обратное.

5. Проведено моделирование трёхмерных структур тетрамера, димера и мономера свиной ЬАБН. Показано, что контакт между двумя димерами в модели тетрамера обусловлен, в основном, электростатическими взаимодействиями, что, по-видимому, объясняет трудность (или невозможность) образования тетрамера в водных растворах. Модель тетрамера предсказывает возможность взаимодействия ЬАОН с Е2 компонентом дегидрогеназных комплексов а-кетокарбоновых кислот.

6. В системе обращенных мицелл АОТ в октане показано образование каталитически активного в диафоразной реакции мономера. Установлено, что равновесие тетрамер-димер-мономер регулируется изменением рН водной фазы мицелл. Мономер наблюдается в области кислых рН (рН 5.8-6.8), характерных для патологических условий, а тетрамер — при физиологическом рН матрикса митохондрии (рН ~ 7.4).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Щедрина, Валентина Анатольевна, 2005 год

1. Reed, L.J. 1974. Multienzyme complexes. Acc. Chem. Res., v. 7, p. 701-729.

2. Matuda, S., Saheki, T. 1982. Intracellular distribution and biosynthesis of lipoamide dehydrogenase in rat liver. J. Biochem. (Tokyo), v. 91, p. 553-561.

3. Danson, M.J., Conroy, K., McQuattie, A., Stevenson, K.J. 1987. Dihydrolipoamide dehydrogenase from Trypanosoma brucei. Characterization and cellular location. Biochem. J., v. 243, N.3, p. 661-665.

4. Smith, L.D., Bungard, S.J., Danson, M.J., Hough, D.W. 1987. Dihydrolipoamide dehydrogenase from the thermo acidophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum. Biochem. Soc. Trans., v. 15, p. 1097-1102.

5. Hong, Y.S., Jacobia, S.J., Packer, L., Patel, M.S. 1999. The inhibitory effects of lipoic compounds on mammalian pyruvate dehydrogenase complex and its catalytic components. Free Radic. Biol. Med., v. 26, N. 5-6, p. 685-94.

6. Mattevi, A., Schierbeek, A.J., Hoi, W.G. 1991. Refined crystal structure of lipoamide dehydrogenase from Azotobacter vinelandii at 2.2 A resolution. A comparison with the structure of glutathione reductase. J. Mol. Biol., v. 220, N. 4, p. 975-994.

7. Mattevi, A., Oblomova, G., Sokatch, J.R., Betzel, W.J., Hoi, W.G. 1992. The refined crystal structure of Pseudomonas putida lipoamide dehydrogenase complexed with NAD at 2.45 A resolution. Proteins, v. 13, N. 4, p. 336-351.

8. Sierra, I., Pernot, L., Prange, T., Saludjian, P., Schiltz, M., Fourme, R., Padron, G. 1997. Molecular structure of the lipoamide dehydrogenase domain of a surface antigen from Neisseria meningitides. J. Mol. Biol., v. 269, p. 129-141.

9. Toyoda, T., Suzuki, K., Sekiguchi, T., Reed, L J. and Takenaka, A. 1998. Crystal structure of eucaryotic E3, lipoamide dehydrogenase from yeast. J. Biochem., v. 123, N. 4, p. 668-674.

10. Thieme, R., Pai, E.F., Schirmer, R.H., Schulz, G.E. 1981. Three-dimensional structure of glutathione reductase at 2 A resolution. J. Mol. Biol., v. 152, N. 4, p. 763-782.

11. Guex, N., Peitsch, M.C. 1997. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, v. 18, N. 15, p. 2714-2723.

12. Pai, E.F., Karplus, P.A., Schulz, G.E. 1988. Crystallographic analysis of the binding of NADPH, NADPH fragments, and NADPH analogues to glutathione reductase. Biochemistry, v. 27, N. 12, p. 4465-4474.

13. Massey, V., Gibson, Q.H., Veeger, C. 1960. Intermediates in the catalityc action oflipoyl dehydrogenase (Diaphorase). Biochem. J., v. 77, p. 341-351.

14. Williams, C.H., Jr. 1965. Studies on lipoyl dehydrogenase from Escherichia coli. J. Biol. Chem., v. 240, N. 12, p. 4793-4800.

15. Argyrou, A., Blanchard, J.S. and Palfey, B.A. 2002. The lipoamide dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis permits the direct observation of flavin intermediates in catalysis. Biochemistry, v. 41, N. 49, p. 14580-14590.

16. Matthews, R.G., Ballou, D.P., Williams, C.H., Jr. 1979. Reactions of pig heart lipoamide dehydrogenase with pyridine nucleotides. Evidence for an effector role for bound oxidized pyridine nucleotide. J. Biol. Chem., v. 254, N. 12, p. 4974-4812.

17. Veeger, C., Massey, V. 1962. The reaction mechanism of lipoamide dehydrogenase. II. Modification by trace metalls. Biochim. Biophys. Acta, v. 64, p. 83-100.

18. Wilkinson, K.D., Williams, C.H., Jr. 1979. Evidence for multiple electronic forms of two-electron-reduced lipoamide dehydrogenase from Escherichia coli. J. Biol. Chem., v. 254, N. 3, p.852-862.

19. Matthews, R.G., Williams, C.H., Jr. 1974. Identification of the thiol residues involved in modification of pig heart lipoamide dehydrogenase by cupric ion and by iodoacetamide. Biochim. Biophys. Acta, v. 370, p. 39-48.

20. Thrope, C., Williams, C.H., Jr. 1976. Differential reactivity of the two active site cysteine residues generated on reduction of pig heart lipoamide dehydrogenase. J. Biol. Chem., v. 251, N. 12, p. 3553-3557.

21. Massey, V., Veeger, C. 1961. Studies on the reaction mechanism oflipoyl dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta, v. 48, p. 33-47.

22. Wilkinson, K., Williams, C.H., Jr. 1981. NADH Inhibition and NAD activation of Escherichia coli lipoamode dehydrogenase catalyzing the NADH-lipoamide reaction. J. Biol. Chem., v. 256, N. 5, p. 2307-2314.

23. Argyrou, A., Sun, G., Palfey, B.A., Blanchard, J.S. 2003. Catalysis of diaphorase reactions by Mycobacterium tuberculosis lipoamide dehydrogenase occurs at the EH4 level. Biochemistry, v. 42, N. 7, p. 2218-2228.

24. Matthews, R.G., Williams, C.H., Jr. 1976. Measurement of the oxidation-reduction potentials for two-electron and four-electron reduction of lipoamide dehydrogenase from pig heart. J. Biol. Chem., v. 251, N. 13, p. 3956-3969.

25. Reed, L.J., Hackert, M.L. 1990. Structure-function relationships in dihydrolipoamide acyltransferases. J. Biol. Chem., v. 265, N. 16, p. 8971-8974.

26. Koike, M., Reed, L.J., Carroll, W.R. 1960. a-Keto acid dehydrogenase complexes. I. Purification and properties of pyruvate and a-ketoglutarate dehydrogenation complexes of Escherichia coli. J. Biol. Chem., v. 235, p. 1924-1930.

27. Patel, M.S., Korotchkina, L.G. 2003. The biochemistry of the pyruvate dehydrogenase complex. Biochemistry and Molecular Biology Education, v. 31, N. 1, p. 5-15.

28. Mattevi, A., Oblomova, G., Schulze, E., Kalk, K.H., Westphal A.H., de Kok, A., Hoi, W.G. 1992. Atomic structure of the cubic core of the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex. Science, v. 255, N. 5051, p. 1544-1550.

29. Patel, M.S., Roche, T.E. 1990. Molecular biology and biochemistry of pyruvate dehydrogenase complexes. FASEB J., v. 4, N. 14, p. 3224-3233.

30. Yang, D., Song, J., Wagenknecht, T., Roche, T.E. 1997. Assembly and full functionality of recombinantly expressed dihydrolipoyl acetyltransferase component of the human pyruvate dehydrogenase complex. J. Biol. Chem., v. 272, N. 10, p. 6361-6369.

31. Perham, R.N. 1991. Domains, motifs, and linkers in 2-oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes: a paradigm in the design of a multifunctional protein. Biochemistry, v.30, N. 35, p. 8501-8512.

32. Perham, R.N. 2000. Swinging arms and swinging domains in multifunctional enzymes: catalytic machines for multistep reactions. Annu. Rev. Biochem., v. 69, p.961-1004.

33. Reed, L.J., Pettit, F.H., Eley, M.H., Hamilton, L., Collins, J.H., Oliver, R.M. 1975. Reconstitution of the Escherichia coli pyruvate dehydrogenase complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 72, N. 8, p. 3068-3072.

34. Reed, L.J. 2001. A trail of research from lipoic acid to a-keto acid dehydrogenase complexes. J. Biol. Chem., v. 276, N. 42, p. 38329-38336.

35. Zhou, Z.H., McCarthy, D.B., O'Connor, C.M., Reed, L.J., Stoops, J.K. 2001. The remarkable structural and functional organization of the eukaryotic pyruvate dehydrogenase complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 98, N. 26, p. 14802-14807.

36. Patel, M.S., Harris, R.A. 1995. Mammalian a-ketoacid dehydrogenase complexes: gene regulation and genetic defects. FASEB J., v. 9, N. 12, p. 1164-1178.

37. Chuang, D.T., Shih, V.E. 1995. Disorders of branced chain amino acid and keto acid metabolism. Metabolic and molecular bases of inherited disease. 7th edition. McGraw-Hill, New York, USA, p.1239-1277.

38. Scherer, S.W., Otulakowski, G., Robinson, B.H., Tsui, L.-C. 1991. Localization of the human dihydrolipoamide dehydrogenase gene (DLD) to 7q31-7q32. Cytogenet. Cell Genet., v. 56, p. 176-177.

39. Liu, T.-C., Kim, H., Arizmendi, C., Kitano, A., Patel, M.S. 1993. Identification of two missense mutations in a dihydrolipoamide dehydrogenase-deficient patient. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 90, N. 11, p. 5186-5190.

40. Shaag, A., Saada, A., Berger, I., Mandel, H., Joseph, A., Feigenbaum, A., Elpeleg, O.N. 1999. Molecular basis of lipoamide dehydrogenase deficiency in Ashkenazi Jews. Am. J. Med. Genet., v. 82, p. 177-182.

41. Shany, E., Saada, A., Landau, D., Shaag, A., Hershkovitz, E., Elpeleg, O.N. 1999. Lipoamide dehydrogenase deficiency due to a novel mutation in the interface domain. Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 262, N. 1, p. 163-166.

42. Hong, Y.S., Kerr, D.S., Craigen, W.J., Tan, J., Pan, Y., Lusk, M., Patel, M.S. 1996. Identification of two mutations in a compound heterozygous child with dihydrolipoamide dehydrogenase deficiency. Hum. Molec. Genet., v. 5, N. 12, p. 1925-1930.

43. Chesis, P.L., Levin, D.E., Smith, M.T., Ernster, L., Ames, B.N. 1984. Mutagenicity of quinines: pathways of metabolic activation and detoxification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 81, N. 6, p. 1696-1700.

44. Connor, J.R., Menzies, S.L. 1995. Cellular management of iron in the brain. J. Neurol. Sci., v. 134, Suppl, p. 33-44.

45. Liochev, S. I., Fridovich, I. 1994. The role of (Of) in the production of OHin vitro and in vivo. Free Radic. Biol. Med., v. 16, N. 1, p. 29-33.

46. Liochev, S. I., Fridovich, I. 1999. Superoxide and iron: partners in crime. IUBMB Life, v. 48, N. 2, p. 157-161.

47. Ernster, L. 1993. Lipid peroxidation in biological membranes: mechanism and implications. Active Oxygens, Lipid Peroxides, and Antioxidants, CRC Press, NY, USA.

48. Beattie, D.S. 2002. Reactive oxygen species (ROS). In the textbook of Biochemistry with clinical corretions. 5th edition. (Devin, T.M., ed.). John Wiley and Sons, Inc., New York, USA, p. 590-592.

49. Gate, L., Paul, J., Ba, G.N., Tew, K.D., Tapiero, H. 1999. Oxidative stress induced in pathologies: the role of antioxidants. Biomed. Pharmacother., v. 53, N. 4, p. 169-180.

50. Lind, C., Cadenas, E., Hochstein, P., Ernster, L. 1990. DT-diaphorase: purification, properties andfunction. Meth. Enzymol., v. 186, p. 287-301.

51. Ernster, L., Danielson, L., Ljunggren, M. 1962. DT-diaphorase. I. Purification from the soluble fraction of rat liver cytoplasm, and properties. Biochim. Biophys. Acta, v. 58, p. 171188.

52. Gutierrez, P.L. 2000. The role of NAD(P)H oxidoreductase (DT-Diaphorase) in the bioactivation of quinine-containing antitumor agents: a review. Free Radic. Biol. Med., v. 29, N. 3-4, p. 263-275.

53. Vienozinskis, J., Butkus, A., Cenas, N., Kulys, J. 1990. The mechanism of the quione reductase reaction of pig heart lipoamide dehydrogenase. Biochem. J., v. 269, p. 101-105.

54. Cenas, N., Rakauskiene, G.A., Kulys, J. 1989. One- and two-electron reduction of quinines by glutathione reductase. Biochim. Biophys. Acta, v. 973, p. 399-404.

55. Xia, L., Bjornstedt, M., Nordman, T., Eriksson, L.C., Olsson, J.M. 2001. Reduction of ubiquinone by lipoamide dehydrogenase. An antioxidant regenerating pathway. Eur. J. Biochem., v. 268, p. 1486-90.

56. Ernster, L., Dallner, G. 1995. Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function. Biophys. Acta, v. 1271, N. 1, p. 195-204.

57. Casola, L., Brumby, P.E., Massey, V. 1966. The reversible conversion of lipoyl dehydrogenase to an artifactual enzyme by oxidation of sulfhydryl groups. J. Biol. Chem., v. 241, N. 21, p. 4977-4984.

58. Gutierrez Correa, J., Stoppani, A.O.M. 1993. Inactivation of lipoamide dehydrogenase by cobalt (II) and iron (II) fenton systems: effect of metal chelators, thiol compounds and adenine nucleotides. Free Rad. Res. Comn., v. 19, p. 303-314.

59. Olsson, J.M., Xia, L., Eriksson, L.S., Bjornstedt, M. 1999. Ubiquinone is reduced by lipoamide dehydrogenase and this reaction is potently stimulated by zinc. FEBS Letters, v. 448, p. 190-192.

60. Stein, A. M., Stein, J. H. 1971. Isolation of the cadmium derivative oflipoyl dehydrogenase. J. Biol. Chem., v. 246, N. 3, p. 670-676.

61. Nakamura, M., Yamazaki, I. 1972. One-electron transfer reaction in biochemical systems. IV. Changes in electron transfer mechanism of lipoamide dehydrogenase by modification of sulfhydryl groups. Biochim. Biophys. Acta, v. 267, p. 249-257.

62. Casola, L., Massey, V. 1966. Differential effects of mercurial on the lipoyl reductase and diaphorase activities oflipoyl dehydrogenase. J. Biol. Chem., v. 241 N. 21, p. 4985-4993.

63. Searls, R.L., Peters, J.M., Sanadi, D.R. 1961. a Ketoglutaric dehydrogenase. X. On the mechanism of dihydrolipoyl dehydrogenase reaction. J. Biol. Chem., v. 236, N. 8, p. 2317-2322.

64. Hopkins, N. and Williams, C. H., Jr. 1995. Characterization of lipoamide dehydrogenase from Escherichia coli lacking the redox active disulfide: C44S and C49S. Biochemistry, v. 34, N. 37, p. 11757-11765.

65. Tsai, C.S. 1980. Kinetic studies of multifunctional reactions catalysed by lipoamide dehydrogenase. Int. J.Biochem., v. 11, p. 407-413.

66. Tsai, C.S., Templeton, D.M., Wand, A.J. 1981. Multifunctionality of lipoamide dehydrogenase: activities of chemically trapped monomeric and dimeric enzymes. Arch. Biochem. Biophys., v. 206, N. 1, p. 77-86.

67. Visser, J., Veeger, C. 1968. Relations between conformations and activities of lipoamide dehydrogenase. III. Protein association dissociation and the influence on catalytic properties. Biochim. Biophys. Acta, v. 159, N. 2, p. 265-275.

68. Koh, J.Y., Suh, S.W., Gwag, B.J., He, Y.Y., Hsu, C.Y., Choi, D.W. 1996. The role of zinc in selective neuronal death after transient global cerebral ischemia. Science, v. 272, p. 1013-1016.

69. Deibel, MA., Ehmann, WD., Markesbery, WR. 1996. Copper, iron, and zinc imbalances in severely degenerated brain regions in Alzheimer's disease: possible relation to oxidative stress. J. Neurol.Sci., v. 143, N. 1-2, p. 137-142.

70. Cornett, C.R., Markesbery, W.R., Ehmann, W.D. 1998. Imbalances of trace elements related to oxidative damage in Alzheimer's disease brain. Neurotoxicology, v. 19, N. 3, p. 339-345.

71. Frederickson, C.J., Hernadez, M.D., McGinty, J.F. 1989. Translocation of zinc may contribute to seizure-induced death of neurons. Brain Res., v 480, N. 1 -2, p. 317-321.

72. Manev, H., Kharlamov, E., Uz, T., Mason, R.P., Cagnoli, C.M. 1997. Characterization of zinc-induced neuronal death in primary cultures of rat cerebral granule cells. Exp. Neurol., v.146, p. 171-178.

73. Koh, J.Y. 2001. Zinc and disease of the brain. Mol Neurobiol., v. 24, N. 1-3, p. 99-106.

74. Choi, D.W., Koh, J.Y. 1998. Zinc and brain injury. Annu. Rev. Neurosci., v. 21, p. 347375.

75. Koh, J.Y., Choi, D.W. 1994. Zinc toxicity on cultured cortical neurons: involvement of N-methyl-D-aspartate receptors. Neuroscience, v. 60, N. 4, p. 1049-1057.

76. Weiss, J.H., Hartley, D.M., Koh, J.Y., Choi, D.W. 1993. AMP A receptor activation potentiates zinc neurotoxicity. Neuron, v. 10, N. 1, p. 43-49.

77. Atar, D., Backx, P.H., Appel, M.M., Gao, W.D., Marban, E. 1995. Excitation-transcription coupling mediated by zinc influx through voltage-dependent calcium channels. J. Biol. Chem.,v. 270, N. 6, p. 2473-2477.

78. Sensi, S.L., Yin, H.Z., Carriedo, S.G., Rao, S.S., Weiss, J.H. 1999. Preferential Zn2+ influx through Ca2+-permeable AMPA/kainate channels triggers prolonged mitochondrial superoxide production. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 96, p. 2414-2419.

79. Jordan, J., Cena, V., Prehn, J.H. 2003. Mitochondrial control of neuron death and its role in neurodegenerative disorders. J. Physiol. Biochem., v. 59, N. 2, p. 129-141.

80. Davis, M., Whitely, T., Turnbull, D.M., Mendelow, A.D. 1997. Selective impairments of mitochondrial respiratory chain activity during aging and ischemic brain damage. Acta Neurochir., Suppl., v. 70, p. 56-58.

81. Sims, N.R., Pulsinelli, W.A. 1987. Altered mitochondrial respiration in selectively vulnerable brain subregions following transient forebrain ischemia in the rat. J. Neurochem., v. 49, N. 5, p. 1367-1374.

82. Zaidan, E., Sims, N.R. 1997. Reduced activity of the pyruvate dehydrogenase complex but not cytochrome c oxidase is associated with neuronal loss in the striatum following short-term forebrain ischemia. Brain Res., v. 772, N. 1-2, p. 23-28.

83. Gibson, G.E., Sheu, K.F., Blass, J.P. 1998. Abnormalities of mitochondrial enzymes in Alzheimer disease. J. Neural. Transm. v. 105, N. 8-9, p. 855-870.

84. Gibson, G.E., Kingsbury, A.E., Xu, H., Lindsay, J.G., Daniel, S., Foster, O.J., Lees, A.J., Blass, J.P. 2003. Deficits in a tricarboxylic acid cycle enzyme in brains from patients with Parkinson's disease. Neurochem. Int., v. 43, N. 2, p. 129-135.

85. Mastrogiacomo, F., Kish, S.J. 1994. Cerebellar alpha-ketoglutarate dehydrogenase activity is reduced in spinocerebellar ataxia type 1. Ann. Neurol., v. 35, N. 5, p. 624-626.

86. Mastrogiacomo, F., Bergeron, C., Kish, S.J. 1993. Brain alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex activity in Alzheimer's disease. J. Neurochem., v. 61, N. 6, p. 20072014.

87. Blass, J.P., Kark, R.A., Menon, N.K. 1976. Low activities of the pyruvate and oxoglutarate dehydrogenase complexes in five patients with Friedreich's ataxia. N. Engl. J. Med., v. 295, N. 2, p. 62-67.

88. Mizuno, Y., Matuda, S., Yoshino, H., Mori, H., Hattori, N., Ikebe, S. 1994. An immunohistochemical study on alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex in Parkinson's disease. Ann. Neurol., v. 35, N. 2, p. 204-210.

89. Zaidan, E., Sims, N.R. 1993. Selective reductions in the activity of the pyruvate dehydrogenase complex in mitochondria isolated from brain subregions following forebrain ischemia in rats. J. Cereb. Blood Flow Metab., v. 13, N. 1, p. 98-104.

90. Skulachev, V.P., Chistyakov, V.V., Jasaitis, AA., Smirnova, E.G. 1967. Inhibition of the respiratory chain by zinc ions. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 26, N. 1, p. 1-6.

91. Hunter, F.E., Ford, L. 1955. Inactivation of oxidative and phosphorylative systems in mitochondria by preincubation with phosphate and other ions. J. Biol. Chem., v. 216, N. 1, p. 357-369.

92. Lorusso, M., Cocco, T., Sardanelli, A.M., Minuto, M., Bonomi, F., Papa, S. 1991. Interaction ofZn2+ with the bovine-heart mitochondrial bcl complex. Eur. J. Biochem., v. 197, N. 2,p.555-561.

93. Link, T.A., von Jagow, G. 1995. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bcl complex by blocking a protonatable group. J. Biol. Chem., v. 270, N. 42, p. 25001-25006.

94. Kleineke, J.W., Brand, I. A. 1997. Rapid changes in intracellular Zn2+ in rat hepatocytes. J. Pharmacol. Toxicol. Methods., v. 38, N. 4, p. 181-187.

95. Bando, Y., Aki, K. 1990. Mechanisms of generation of oxygen radicals and reductive mobilization of ferritin iron by lipoamide dehydrogenase. J. Biochem., v. 109, p. 450-454.

96. Frank, S.G., Zografi, G.J. 1969. Solubilization of water by dialkyl sodiumsulfosuccinates in hydrocarbon solutions. J. Colloid and Interface Sci., v.29, p. 27-35.

97. Eicke, H.-F., Christen, H. 1978. Is water critical to the formation of micelles in apolar media. Helv. Chim. Acta, v. 61, p. 2258-2263.

98. Ekwall, P., Mandell, L., Fontell, K. 1970. Some observation on binary and ternary Aerosol OTsystems. J. Colloid and Interface Sci., v.33, p. 215-235.

99. Eicke, H.-F. 1980. Surfactants in nonpolar solvents: Agregation and micellization. Top. Curr. Chem., v.87, p. 85-145.

100. Eicke, H.-F., Kubick, R. 1980. The optical matching phenomenon in water/oil-microemulsion. Phys. Chem., v. 84, p. 36-41.

101. Левашов, A.B. 1987. Катализ ферментами в системах обращенных мицелл. Дис. докт. хим. наук. М., МГУ.

102. Eicke, H.F., Rehak, J. 1976. On the formation of water in oil microemulsions. Helv. Chim. Acta., 59, p. 2883-2891.

103. Zinsli, P.E. 1979. Inhomogeneous interior of Aerosol ОТ microemulsion, probed by fluorescence and polarization decay. J. Phys. Chem., v.33, p. 3223-3231.

104. Zulauf, M., Eicke, H.-F. 1979. Inverted micelles and microemulsions in the ternary system H20/aerosol OT/isooctane as studied by photon correlation spectroscopy. J. Phys. Chem., v. 83, p. 480-486.

105. Martinek, K., Klyachko, N.L., Kabanov, A.V., Khmelnitsky, Yu.L., Levashov, A.V. 1989. Micellar enzymology: its relation to membranology. Biochim. Biophys. Acta., v. 981, N. 2, p. 161-72.

106. Nicot, С., Waks, М. 1996. Proteins as invited guests of reverse micelles: conformational effects, significance, applications. Biotechnol. Genet. Eng. Rev., v. 13, p. 267-314.

107. Клячко, Н.Л., Пшежецкий, A.B., Кабанов, A.B., Вакула, С.В., Мартинек, К. 1990. Катализ ферментами в агрегатах ПАВ: оптимальная конструкция матрицы ПАВ. Биол. Мембраны, т.7, стр. 467-472.

108. Левашов, А.В., Пантин, В.И., Мартинек, К., Березин, И.В. 1980. Кинетическая теория реакций, катализируемых ферментами, солюбилизированными в органических растворителях с помощью поверхностно-активных веществ. Докл. АН СССР, т. 252, стр.133-136.

109. Bru, R., Sanchez-Ferrer, A., Garcia-Carmona, F. 1995. Kinetics models in reverse micelles. Biochem. J., v. 310, p. 721-739.

110. Aguilar, L.F., Abuin, E., Lissi, E. 2001. A procedure for the joint evaluation of substrate partitioning and kinetic parameters for reactions catalysed by enzymes in reverse micellar solutions. Arch. Biochem. Biophys., v. 338, p. 231-236.

111. Huang, T.-M., Huang, H.-C., Chang, T.-C., Chang, G.-G. 1998. Solvent kinetic isotope effects of human placental alkaline phosphatase in reverse in reverse micelles. Biochem. J., v. 330, p. 267-275.

112. Kamyshny, A., Trofimova, D., Magdassi, S., Levashov, A.V. 2001. Native and modified glucose oxidase in reversed micelles. Colloids Surf. B: Biointerfaces, v. 23, p.45-49.

113. Левашов A.B. 1987. Катализ ферментами в микрогетерогенных системах агрегатов ПАВ. Биотехнология (Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР), т. 4, стр. 112-158.

114. Пшежецкий, А.В. 1987. Ферменты в агрегатах поверхностно-активных веществ: регуляция каталитической активности структурной матрицы. Дис. канд. хим. наук. М., МГУ.

115. Adams, M.J., Haas, D.J., Geffery, В.A., McPherson, A., Jr., Mermall, H.L., Rossman, M.G., Schevitz, R.W., Wonacott, A.J. 1969. Low resolution study of crystalline L-lactate dehydrogenase. J. Mol. Biol., v. 41, N. 2, p. 159-188.

116. Lamzin, V.S., Dauter, Z., Popov, V.O., Harutyunyan, E.H. and Wilson, K.S. 1994. High resolution structure ofholo and apo formate dehydrogenase. J. Mol. Biol., v. 236, p. 759-785.

117. Клячко, Н.Л., Вакула, C.B., Гладышев, B.H., Тишков, В.И., Левашов, А.В. 1997. Формиатдегидрогеназа в системе обращенных мицелл: регуляция каталитической активности и олигомерного состава фермента. Биохимия, т. 62, N. 12, стр. 1683-1687.

118. Chebotareva, N.A., Kurganov, B.I., Burlakova, А.А. 1999. Sedimentation velocity analysis of oligomeric enzymes in hydrated reversed micelles of surfactants in organic solvents. Progr. Colloid. Polym. Sci., v. 113, p. 129-134.

119. Pshezhetsky, A.V., Levashov, A.V., Wiederschain, G.Ya. 1992. Regulation of GM1galactoside supramolecular structure and catalytic activity in vitro. Biochim. Biophys. Acta, v. 1122, N. 2, p. 154-160.

120. Трофимова, Д.Н., Левашов, A.B. 2002. Гидрофобная формиатдегидрогеназа из Pseudomonas sp. 101 в системе обращенных мицелл аэрозоля ОТ в октане. Биоорг. химия, т. 28, N. 5, стр. 434-439.

121. Доссон, P., Эллиот, Д., Эллиот, У., Джонс, К. 1991. Справочник биохимика. М., Мир, стр. 104.

122. Levashov, A.V., Khmelnitsky, Yu. L., Klyachko, N.L., Chernyak, V.Ya., Martinek, K.1982. Sedimentation analysis of protein-Aerosol OT-Water-Octane system. J. Colloid Interface Sci., v. 88, p. 444-457.

123. Schwede, Т., Корр. J., Guex, N., and Peitsch, M.C. 2003. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Research, v. 31, p. 3381-3385.

124. Wilkinson, K. D., Williams, С. H., Jr. 1981. NADH inhibition and NAD activation of Escherichia coli lipoamide dehydrogenase catalyzing the NADH lipoamide reaction. J. Biol. Chem., v. 256, N. 5, p. 2307 - 2314.

125. Rendon, J.L., Mendoza-Hernandez, G. 1989. Dimer-tetramer equilibrium of glutathione reductase from cyanobacterium Spirulina maxima. Arch. Biochem. Biophys., v. 268, N. 1, p. 255-263.

126. Левашов, А.В., Пантин, В.И., Мартинек, К. 1979. Кислотно-основной индикатор 2,4-динитрофенол в обращенных мицеллах поверхностно-активного вещества (АОТ) в октане. Коллоидный журнал, т. 41, стр. 453-459.

127. Menger, F.M., Saito, G. 1978. Adsorption, displacement and ionization in water pools. J. Amer. Chem. Soc., v. 100, p. 4376-4379.

128. Клячко Н.Л. 1983. Кинетические закономерности действия ферментов, солюбилизированных обращенными мицеллами поверхностно-активных веществ в органических растворителях. Дис. канд. хим. наук. М., МГУ.

129. Raddatz, G. and Bisswanger, Н. 1997. A tetrameric model of the dihydrolipoamide dehydrogenase component of the pyruvate dehydrogenase complex: construction and evaluation by molecular modeling techniques. J. Mol. Model., v. 3, p. 423-433.

130. Фрайфелдер, Д. 1980. Физическая биохимия. М., Мир, стр. 275-306.

131. Кантор, Ч., Шиммел, П. 1984. Биофизическая химия. М., Мир, т. 2, стр. 223-237.

132. Вегшап, Н.М., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., Bourne, P.E. 2000. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, v. 28, p. 235-242.

133. Toyoda, Т., Kobayashi, R., Sekiguchi, Т., Koike, K., Koike, M., Takenaka, A. 1998. Crystallization and preliminary X-ray analysis of pig E3, lipoamide dehydrogenase. Acta Crystallogr., Sect.D, v. 54, p. 982-989.

134. Shaanan, B. 1983. Structure of human oxyhaemoglobin at 2.1 A resolution. J. Mol. Biol., v. 171, N. 1, p. 31-59.

135. Fermi, G., Perutz, M. F., Shaanan, В., Fourme, R. 1984. The crystal structure of human deoxyhaemoglobin at 1.74 A resolution. J. Mol. Biol., v. 175, N. 2, p. 159-174.

136. Liang, Y., Hua, Z., Liang, X., Xu, Q., Lu, G. 2001. The Crystal Structure of Bar-Headed Goose Hemoglobin in Deoxy Form: The Allosteric Mechanism of a Hemoglobin Species with High Oxygen Affinity. J. Mol. Biol., v. 313, N. 1, p. 123-137.

137. Zhang, J., Madden, T.L. 1997. Power BLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. Genome Res., v. 7, p. 649-656.

138. Jentoft, J.E., Shoham, M., Hurst, D., Patel, M.S. 1992. A structural model for human dihydrolipoamide dehydrogenase. Proteins: Structure, Function, and Genetics, v. 14, p. 88-101.

139. Sayle, R. A., Milner-White, E. J. 1995. RasMol: Biomolecular graphics for all. Trends in Biochemical Sciences (TIBS), v. 20, N. 9, p. 374-376.

140. Eisenberg, M., Gresalfi, Т., Riccio, Т., McLaughlin, S. 1979. Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids. Biochemistry, v. 18, N. 23, p. 5213-5223.

141. Teissie, J., Prats, M., Soucaille, P., Tocanne, J.F. 1985. Evidence for condaction of protons along the interface between water and a lipid monolayer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 82, p. 3217-3221.

142. Ландау, JI.Д., Лившиц, Е.М. Теоретическая физика. Электродинамика непрерывной среды, М., Наука, т. 8, стр. 60.

143. Devin, Т.М. 2002. Micelles and liposomes. In the textbook of Biochemistry with clinical corretions. 5th edition. (Devin, T.M., ed.). John Wiley and Sons, Inc., New York, USA, p. 502504.

144. Luzzati, V. 1997. Biological significance of lipid polymorphism: the cubic phases. Curr. Opin. Struct. Biol., v. 7, N. 5, p. 661-668.

145. Perkins, W.R., Dause, R.B., Parente, R.A., Minchey, K.C., Neuman, K.C., Gruner, S.M., Taraschi, T.F., Janoff, A.S. 1996. Role of lipid polymorphism in pulmonary surfactant. Science, v. 273, p. 330-332.

146. Ortiz, A., Kilian, J. A., Verkleij, A. J., Wilschut, J. 1999. Membrane fusion and the lamellar-to-inverted-hexagonal phase transition in cardiolipin vesicle systems induced by divalent cations. Biophys. J., v. 77, N. 4, p. 2003-2014.

147. Zazueta, C., Ramirez, J., Garcia, N., Baeza, 1.2003. Cardiolipin regulates the activity of the reconstituted mitochondrial calcium uniporter by modifying the structure of the liposome bilayer. J. Membrane Biol., v. 191, N. 2, p. 113-122.

148. Van der Does, C., Swaving, J., Van Klompenburg, W., Driessen, A.J.M. 2000. Non-bilayer lipids stimulate the activity of the reconstituted bacterial protein translocase. J. Biol. Chem., v. 275, p. 2472-2478.

149. Or, E., Navon, A., Rapoport, T. 2002. Dissociation of the dimeric SecA ATPase during protein translocation across the bacterial membrane. EMBO J., v. 21, N. 17, p. 4470-4479.1. БЛАГОДАРНОСТИ.

150. Благодарю проф., д.х.н. Клячко Наталью Львовну за предоставленную свободу мысли и жизни, и вместе с тем, за неослабевающий запас энтузиазма в постижении научных загадок. За понимание, доброту, оптимизм и волю к победе. За руководство!

151. Благодарю проф., д.х.н. Левашова Андрея Вадимовича за советы в трудных ситуациях моей научной жизни, за здоровую критику, за предоставленную вовремя и к месту литературу, и даже за кофе, степлеры и т.д., а, главное, за умело скрытую доброту.

152. Благодарю Калмыкова Петра Васильевича, сотрудника института Белозерского, за выполнение всех седиментационных экспериметов.

153. Благодарю Гариева И.А. за помощь в оформлении работы и предоставленный им компьютер.

154. Благодарю свою сестру, Щедрину Светлану Анатольевну, за веру в мои силы и стимулирование завершения данной работы. Благодарю её друга, Смирнова Юрия Лаврентьевича, за предоставление БЕСПЛАТНОЙ московской квартиры на финальном этапе этой работы. Спасибо.