Структурно-функциональные взаимосвязи полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Табакмахер, Валентин Михайлович

• Табакмахер, Валентин Михайлович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Табакмахер, Валентин Михайлович

Оглавление

Список используемых сокращений и обозначений

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Яды животных как источник биологически активных соединений

2.2. Компонентный состав ядов животных: молекулярное разнообразие и механизмы формирования

2.3. Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки

2.3.1. Полипептиды со структурным мотивом цистеинового узла

2.3.2. Трехпетлевые токсины змей

2.3.3. Полипептиды с цистеин-стабилизированным а/р-мотивом

2.3.4. Перспективы использования полипептидов ядов животных

2.4. Полипептиды Кунитц-типа

2.4.1. Структура

2.4.2. Взаимодействие с сериновыми протеиназами

2.4.3. Структурные особенности и функциональное разнообразие

2.4.3.1. Доменные и мультидоменные ингибиторы Кунитц-типа

2.4.3.2. Полипептиды Кунитц-типа яда змей

2.4.3.3. Полипептиды Кунитц-типа яда пауков

2.4.3.4. Полипептиды Кунитц-типа яда скорпионов

2.4.3.5. Полипептиды Кунитц-типа яда конусов

2.4.3.6. Полипептиды Кунитц-типа земноводных

2.4.3.7. Полипептиды Кунитц-типа яда перепончатокрылых

2.4.3.8. Полипептиды Кунитц-типа яда актиний

2.5. Молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа актиний

2.5.1. Сериновые протеиназы

2.5.1.1. Классификация

2.5.1.2. Механизм катализа гидролитического расщепления пептидной связи

2.5.1.3. Функциональное разнообразие

2.5.2. Ионные каналы - молекулярные мишени полипептидов Кунитц-типа

2.5.2.1. Общая характеристика ионных каналов

2.5.2.2. Потенциалзависимые ионные каналы. Ку каналы

2.5.2.3. Рецептор ТЯРУ1

2.5.2.4. Структура и функциональные детерминанты ТИРУ!

2.5.2.5. Терапевтический потенциал агонистов и антагонистов TRPV1

3. Обсуждение результатов

3.1. Выделение ингибиторов Кунитц-типа из актинии Н. crispa

3.2. In silico исследование структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов комбинаторной библиотеки Н. crispa

3.2.1. Сравнительная характеристика структурных и функциональных особенностей

3.2.2. Компьютерное моделирование пространственных структур полипептидов Кунитц-типа актиний

3.2.3. Расчетные физико-химические характеристики IICGS-полипептидов

3.2.4. Анализ молекулярного электростатического потенциала

3.2.5. Установление структурно-функциональных взаимосвязей

3.2.5.1. Структурные модели комплексов с а-химотрипсином

3.2.5.2. Структурные модели комплексов с трипсином

3.2.5.3. Структурные модели комплексов с эластазой нейтрофилов человека

3.2.5.4. Структурные модели комплексов с рецептором TRPV1

3.3. Получение рекомбинантных полипептидов семейства Кунитца Н. crispa. Исследование физико-химических характеристик и биологической активности

3.3.1. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе кДНК

3.3.2. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе синтетических генов

3.3.3. Определение констант ингибирования трипсина рекомбинантными полипептидами

3.3.4. Исследование кинетики взаимодействия рекомбинантных полипептидов с сериновыми протеиназами методом поверхностного плазмонного резонанса

3.3.5. Исследование анальгетической активности рекомбинантных полипептидов

4. Экспериментальная часть

4.1. Материалы и реактивы

4.2. Биологический материал, бактериальные штаммы и животные

4.3. Приборы и оборудование

4.4. Методы исследования

4.4.1. Выделение природных ингибиторов Кунитц-типа

4.4.2. Методы компьютерного моделирования и биоинформационного анализа

4.4.3. Методы получения рекомбинантных полипептидов и определения их физико-химических характеристик и биологической активности

4.4.4. Методы тестирования анальгетической активности

5. Заключение

6. Выводы

7. Список литературы

Список используемых сокращении и обозначений а.о. - аминокислотный остаток;

БГТТИ (BPTI, апротинин) - бычий панкреатический ингибитор трипсина;

База данных EST (англ. expressed sequence tags database) - совокупность коротких

нуклеотидных последовательностей, которые получены в результате секвенирования кДНК;

ДМ ФА — диметилформамид;

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИПТГ - изопропил-Р-О-тиогалактозид;

ккал/моль - килокалорий на моль;

Кристаллическая структура — структура химического соединения, установленная с помощью рентгеноструктурного анализа;

МЭП - молекулярный электростатический потенциал; об/мин - оборотов в минуту;

ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ПААГ - полиакриламидный гель;

Поисковая функция (scoring function) - математический метод (или набор методов),

используемый для прогнозирования прочности нековалентного взаимодействия (сродства)

между двумя молекулами в результате молекулярного докинга;

ПЦР — полимеразная цепная реакция;

СПН — сериновые протеиназы нейтрофилов;

Трис — тригидроксиметиламинометан;

ТФУ - трифторуксусная кислота;

Фолд (англ. fold - клубок) - пространственная укладка белковой молекулы;

н.п. — пары нуклеотидов;

ЦНС - центральная нервная система;

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

ЯМР-структура - структура химического соединения, установленная с помощью методов ЯМР-спектроскопии;

ÀASA - изменение площади поверхности молекулы, доступной растворителю (в результате образования комплекса); АТР - аденозинтрифосфат;

BAPNA - и-нитроанилид jV-бензоил-Д L-аргинина;

BSA - бычий сывороточный альбумин;

CSa/p - цистеин-стабилизированный а/р-мотив;

DTXs - дендротоксины из яда черной мамбы;

ЕС (Ensime Classification) - современная международная система классификации ферментов;

ЕС50 - концентрация лиганда, вызывающая эффект, равный половине максимально

возможного для данного лиганда после истечения определенного промежутка времени;

HNE (Human Neutrophil Eastase) - эластаза нейтрофилов человека;

IC50 - концентрация полумаксимального ингибирования;

ICK (Inhibitor Cystine Knot) - структурный мотив «цистеинового узла»;

K¿ - константа диссоциации;

K¡ - константа ингибирования;

Kv - потенциалзависимый калиевый канал;

dNTPs - дезоксинуклеозидтрифосфаты;

MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) — времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией; Мг — молекулярная масса;

PDB (Protein Data Bank) - база данных пространственных структур полипептидов;

PDB ГО - уникальный шифр доступа пространственной структуры каждого белка в базе

данных PDB;

PIP2 - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат;

RMSD (Root-Mean-Square Deviation) - среднеквадратичное отклонение; SDS - додецилсульфат натрия;

SLPI - секреторный ингибитор протеазы лейкоцитов;

SPR (Surface Plasmon Resonance) - поверхностный плазмонный резонанс;

TFT (Three-Finger Toxins, 3FTX) - трехпетлевые токсины змей;

TRPV1 (Transient Receptor Potential cation channel, subfamily V, member 1) - ваниллоидный рецептор/канал (управляет неселективным ионным каналом, является полимодальным детектором многих болевых стимулов); Тгх - тиоредоксин;

UniProt — универсальный протеиновый ресурс, белковая база данных;

UniProt AN (UniProt Accession Number) — уникальный шифр доступа каждого конкретного белка в базе данных UniProt.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные взаимосвязи полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa»

1. Введение

Полипептиды структурного семейства Кунитца — широко распространенная группа соединений, выделенных из ядов животных самого разнообразного систематического положения. Исследовательский интерес к соединениям данной группы, обнаруженным в актиниях, обусловлен проявляемой ими биологической активностью: анальгетической, антигистаминной, а также способностью ингибировать протеолитические ферменты, модулировать ионотропные рецепторы и блокировать потенциалзависимые ионные каналы. Так, для некоторых представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa показана способность модулировать болевой ваниллоидный рецептор TRPV1, ингибировать сериновые протеиназы, оказывать антигистаминное действие. Такое разнообразие функциональной активности указывает на возможный терапевтический потенциал данных полипептидов при лечении болевых и воспалительных состояний и патологий, связанных с нарушением регуляции системы протеолиза. Однако молекулярные механизмы биологического действия, проявляемого этими соединениями, в настоящее время требуют выяснения.

Данная работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, посвященных изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Целью исследования является установление структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов Кунитц-типа актинии II. crispa. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать нативные полипептиды Кунитц-типа из актинии II. crispa.

2. Провести биоинформационный анализ представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa с целью выявления молекул, перспективных для получения их рекомбинантных форм.

3. С помощью расчетных методов идентифицировать структурные детерминанты полипептидов, ответственные за взаимодействие с биологическими мишенями.

4. Создать генетические экспрессионные конструкции и получить отобранные полипептиды в рекомбинантной форме.

5. Определить физико-химические характеристики рекомбинантных полипептидов, установить их функциональную и биологическую активность.

2. Литературный обзор

2.1. Яды животных как источник биологически активных соединений

Среди огромного многообразия продуцентов биологически активных полипептидов особое место принадлежит ядовитым организмам. Известны тысячи ядовитых животных самого разнообразного систематического положения, включая кишечнополостных (актинии, медузы, кораллы), иглокожих (морские ежи), моллюсков (брюхоногие и головоногие), членистоногих (пауки, скорпионы, многоножки, насекомые), рыб, амфибий, рептилий (змеи, ящерицы) и даже млекопитающих (утконос, землеройковые, толстый лори) [1]. Согласно современным представлениям, их яды являются биологическими секретами специализированных органов [2]. Они содержат соединения, которые нарушают нормальные физиологические и биохимические процессы в организме жертвы и выполняют алломональную и/или пищеварительную функцию для животного-продуцента. Чаще всего яд используется животными для охоты или защиты от естественных врагов. Однако иногда ядовитый секрет играет роль инструмента сохранения и укрепления системы внутривидовых иерархических взаимоотношений [2].

Поскольку в процессе эволюционного развития филогенетически отдаленных видов их яд меняется независимо и служит для выполнения разных задач, компонентный состав яда, система его доставки и физиологические мишени чрезвычайно разнообразны у различных организмов [2]. Известно, что компоненты ядов животных оказывают различное физиологическое действие на организм жертвы: гемотоксическое (затрагивающее сердечнососудистую систему), нейротоксическое (воздействующее на нервную систему и мозг) и цитотоксическое (разрушающее клетки локально), а также вызывают патологические состояния, связанные с дыхательной, мышечной, мочевыделительной и желудочно-кишечной системами [3-5].

В результате интоксикации биологическими ядами у жертвы могут наблюдаться самые разнообразные симптомы, как локальные (местная боль, отек, волдыри, сыпь, некроз тканей), так и системные (головная боль, нарушение зрения, лихорадка, тошнота, рвота, диарея, увеличение лимфатических узлов, головокружение, мышечная слабость, потеря координации или паралич). Зачастую отравления сопровождаются дисфункцией кровеносной системы: нарушениями гемостаза, тромбозом и коагуляцией крови, внезапными кровотечениями, и нередко воздействие ядов приводит к коллапсу и смерти жертвы [1].

Все эти симптомы имеют различную биохимическую основу. Молекулярными мишенями компонентов ядов являются мембранные рецепторы и ионные каналы, а также цитоплазматические мембраны. Нарушение их функции нейротоксинами ядов может приводить к выбросу нейромедиаторов и запуску каскадов физиологических реакций,

приводящих к сердечной и дыхательной блокаде, потере чувствительности, параличу и т.д. Ферменты, такие как фосфолипазы А2 и протеиназы, а также мембраноактивные пептиды/полипептиды, входящие в состав ядовитого секрета, могут вызывать формирование пор, лизис цитоплазматической мембраны, нарушение функционирования различных клеточных компонентов, высвобождение молекул, участвующих в иммунном ответе (цитокинов), что приводит к развитию отеков и воспалительного процесса. Ингибиторы протеиназ могут препятствовать разрушению других полипептидных компонентов яда за счет блокирования протеолитических систем жертвы [б]. Так или иначе, действие ядов животных направлено на дестабилизацию нормальных биохимических и физиологических процессов.

2.2. Компонентный состав ядов животных: молекулярное разнообразие и механизмы формирования

Яды животных являются богатым источником уникальных биологически активных соединений с разнообразной структурой, функциональной активностью и специфичностью действия на молекулярные мишени в организме жертвы. Накопленные к настоящему времени структурные, генетические и филогенетические данные свидетельствуют о том, что в ходе эволюции природа «редактирует» [7] компонентный состав ядов животных таким образом, чтобы среди всего возможного разнообразия молекул в ядовитом секрете присутствовали наиболее эффективные с точки зрения биологической активности.

На данный момент известно два пути «формирования» состава яда. При реализации одного из них в состав яда «отбирается» лишь ограниченное число молекул, обладающих, как правило, широким спектром действия [7]. Так, например, основными компонентами яда медоносной пчелы являются фосфолипаза Аг и пептид мелиттин, обеспечивающие его высокую неспецифическую цитолитическую активность [8, 9], которая необходима для выполнения защитной функции.

Реализация другого пути привела к тому, что в ядах образовались чрезвычайно сложные многокомпонентные смеси, состоящие из солей, низкомолекулярных соединений (полиамины, аминокислоты, нуклеотиды, углеводы), а также белков различных структурных групп (от коротких пептидов до многодоменных глобулярных ферментов) и др. [10]. При этом соединения лишь одной или нескольюгх структурных групп количественно превалируют в таких ядах. Основными компонентами ядовитого секрета являются чаще всего соединения белковой природы [7].

В ходе эволюции для развития токсической функции в роли «шаблона» (при формировании компонентного состава яда) выступают различные молекулярные фолды [1].

Так, например, в змеином яде встречаются в основном полипептиды с тремя фол дам и (фосфолипазы Аг, трехпетлевьтх токсинов и Кунитца), в то время как в яде скорпионов присутствуют преимущественно полипептиды одного фолда (СБа/р) [11]. То же самое наблюдается и у других ядовитых животных, таких как моллюски-конусы, пауки, актинии. Тем не менее, все компоненты ядов белковой природы имеют на молекулярном уровне несколько общих особенностей [1]. Практически все они являются секретируемьтми полипептидами, содержащими, как правило, 1Ч-концевой сигнальный пептид. Для таких полипептидов характерно высокое содержание остатков цистеина, образующих дисульфидные связи, которые обеспечивают жесткость пространственной структуры и устойчивость к протеолитической деградации [2]. Стабильность полипептидных компонентов ядов в сочетании с их биологической активностью, селективностью и специфичностью действия позволяет рассматривать (и использовать) эти соединения в качестве уникальных инструментов в исследовании структуры и функции их молекулярных мишеней и моделей для разработки терапевтических препаратов [12].

На основании доступных данных о пространственной структуре и функциональной активности токсинов животных можно предположить наличие двух различных эволюционных механизмов, объясняющих их функциональное разнообразие [13]. Один из них - механизм дивергентной эволюции, широко распространенный среди ядовитых животных. Предполагается, что в рамках такого эволюционного механизма для развития нескольких различных функций используется древний консервативный мотив пространственной структуры (например, С8а/р-токсины скорпионов специфичны к разным ионным каналам) [14]. Другой механизм - направленная конвергентная эволюция токсинов у животных, принадлежащих к различным таксономическим группам, в результате которой полипептиды с разными молекулярными фолдами приобретают одинаковую функцию (как, например, нейротоксины актиний, скорпионов и змей, специфичные модуляторы К+-каналов) [15-17].

Принято считать, что соединения белковой природы, обнаруженные в ядах животных, являются результатом эволюционного отбора [2], в процессе которого гены «обычных» белков, участвующих, как правило, в ключевых регуляторных процессах, дуплицируются, и полученные при этом новые гены начинают селективно экспрессироваться в ядовитом аппарате животного. Во многих случаях происходит многократная дупликация (амплификация) генов, приводящая в сочетании с мутационным процессом к формированию мультигенных семейств и обширной функциональной дивергенции токсинов [18, 19]. Обычно кодируемые такими мультигенными семействами пептиды/полипептиды сохраняют молекулярную укладку (третичную структуру) полипептида, кодируемого анцестральным

геном, однако функционально важные а.о. вне кора белковой глобулы заменяются и/или модифицируются для приобретения новых видов активности [19-21]. Некоторые авторы отмечают, что данные процессы могут приводить как к нео-, поли- и субфункциализации, так и деградации генов до нефункциональных копий (например, в результате делеций или мутаций нередко происходит потеря всякой функциональной активности зрелых полипептидов) или даже псевдогенов [20].

Экспрессия «токсических» мультигенных семейств часто приводит к тому, что в яд попадают не одна-две гомологичные молекулы, а десятки и даже сотни токсинов со сходной структурой. Совокупность таких соединений в яде животного принято называть природной комбинаторной библиотекой биологически активных полипептидов [7].

2.3. Структурное и функциональное разнообразие биологически активных полипептидов ядов животных. Комбинаторные библиотеки

Комбинаторные библиотеки формируются множеством высокогомологичных компонентов, имеющих зачастую различную специфичность и функциональную активность. Такие библиотеки обнаружены в ядах змей, скорпионов, пауков, конусов и актиний [14, 19 22-27]. Отмечается, что, несмотря на структурные и функциональные различия компонентов, в полипептидных библиотеках реализуется лишь один тип молекулярной укладки [1, 18, 28-32].

2.3.1. Полипептиды со структурным мотивом цистеинового узла

В ядах многих пауков, скорпионов и моллюсков семейства Conidae обнаружены библиотеки, насчитывающие десятки полипептидов с фолдом, описываемым структурным мотивом цистинового узла или ICK [33-38]. Особенность данной молекулярной укладки состоит в том, что одна из дисульфидных связей пронизывает кольцо, сформированное двумя другими и атомами основной цепи, образуя своеобразный молекулярный узел (рис. 1).

Рисунок 1. - Трубчатая диаграмма пространственной структуры ICK-полипептида, со-конотоксина GVIA (PDB ID 1TTL) из Conus geographus [39]. С'-С6 - положения а.о. цистеина в молекуле полипептида. N-конец окрашен синим цветом, С-конец - красным. Желтым цветом показаны две дисульфидные связи, образующие молекулярное кольцо, которое пронизывает третья (показана зеленым). Визуализация выполнена с помощью программы DS Visualizer.

Полипептиды с такой молекулярной укладкой цепи называют также ноттинами (от англ. knot - узел). Подавляющее большинство ноттинов содержит 6 или 8 остатков цистеина, образующих 3 или 4 дисульфидных мостика, соответственно, стабилизирующих молекулу [7, 29]. Несмотря на то, что мотив ICK является общей структурной особенностью соединений данной группы, длина N- и С-концевых участков, а также некоторых петель между остатками цистеина может значительно варьировать даже для ноттинов яда, полученного от представителей одного вида. Согласно данным базы полипептидов ноттинового типа, в настоящее время известно более 2000 1СК-полипептидов (http://knottin.cbs.cnrs.fr/). Большинство представителей ноттиновых библиотек является нейротоксинами, специфически модулирующими К Na -, Ca - и С1 -каналы. Однако известны ноттины, выполняющие функции ингибиторов протеиназ, антимикробных, инсектицидных и антигельминтных агентов, гуморальных регуляторов [7, 29, 40].

2.3.2. Трехпетлевые токсины змей

Комбинаторные библиотеки так называемых трехпетлевых токсинов найдены в ядах змей семейств Elapidae и Hydrophidae [19, 20, 41—45]. Пространственная структура этих полипептидов характеризуется наличием трех ß-структурированных петель (I, II и III) и восьми консервативных остатков цистеина, образующих четыре дисульфидные связи, которые стабилизируют уникальный фолд (рис. 2). Такая молекулярная укладка напоминает ладонь с тремя пальцами, поэтому в англоязычной литературе соединения данного структурного типа принято называть «трехпальцевыми» токсинами (three-finger toxins, TFT или 3FTX).

По длине полипептидной цепи ТРТ делят на короткие (60-62 а.о.) и длинные (66-75 а.о.). Известны полипептиды данной группы, имеющие дополнительный дисульфидный мостик на петле I либо II и/или удлиненный ^концевой участок, например, к-бунгаротоксин (РЭВ ГО 1КВА [47]) и кандоксин (РЭВ ГО 1ГСК). Интересной особенностью некоторых трехпетлевых токсинов является их способность образовывать ковалентные и нековалентные

Рисунок 2. - Ленточная диаграмма пространственной структуры трехпетлевого токсина, эрабутоксина А (PDB ID 1QKD) из Laticauda semifasciata [46]. N-конец окрашен синим цветом, С-конец - красным. Желтым цветом показаны дисульфидные связи. I, II, III - нумерация петель согласно принятым обозначениям. Визуализация выполнена с помощью программы DS Visualizer.

гомо- и гетеродимеры [41, 44]. Несмотря на все перечисленные структурные различия полипептидов данного типа, критическим образом влияющие как на аффинность, так и на специфичность их связывания с молекулярными мишенями, в целом структурный мотив 3FTX значительно консервативнее мотива ICK.

Трехпетлевые токсины проявляют удивительно разнообразную биологическую активность. В настоящее время наиболее полно охарактеризованы 3FTX, являющиеся нейротоксинами, которые высокоспецифично взаимодействуют с мышечными (а-токсины) и нейрональными (к-токсины) никотиновыми, а также мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами. Известны также трехпетлевые токсины, выполняющие функцию ингибиторов ацетилхолинэстеразы, ингибиторов процессов клеточной адгезии, блокаторов кальциевых каналов L-типа, блокаторов ßi- и р2-адренорецепторов, а также пороформирующих кардиотоксинов и цитотоксинов, обладающих широким спектром биологической активности. Функции 3FTX, принадлежащих довольно большой и быстро растущей группе так называемых «токсинов-сирот» (orphan toxins), пока не установлены [20, 44].

2.3.3. Полипептиды с цистеин-стабилизированным a/ß-мотивом

Согласно современным данным, наиболее обширной и подробно охарактеризованной группой токсинов из яда скорпионов являются полипептиды с цистеин-стабилизированным a/ß-мотивом (CSa/ß). Эти токсины составляют более 60 % всех токсических пептидных компонентов, обнаруженных в ядах исследованных скорпионов семейств Buthidae, Scorpionidae, Liochelidae, Caraboctonidae и Chactidae [48].

Данный мотив представляет собой а-спираль, связанную дисульфидными мостиками с антипараллельным ß-листом [49]. Токсические полипептиды, несущие CSa/ß-мотив, имеют, подобно ICK-токсинам, весьма серьезные структурные различия в длине N- и С-концевых участков, а также петель, соединяющих фрагменты упорядоченной структуры. В связи с этим, токсины данной группы принято делить на короткие (менее 45 а.о. - рис. 3, А) и длинные (55 а.о. и более - рис. 3, Б) [50].

Рисунок 3. - Ленточные диаграммы пространственных структур короткого (А) и длинного (Б) CSa/ß-токсинов. А -чарибдотоксин (PDB ID 2CDR) из Leiurus quinquestriatus hebraeus [51]. Б - токсин ВМК Ml (PDB ID 1DJT) из Mesobuthus martensii. a-Спирали окрашены красным цветом, ß-стренды - голубым, участки неупорядоченной структуры - серым, I дисульфидные связи - желтым. Показаны N- и С-концы. Визуализация выполнена с помощью программы Chimera [52].

Данные структурные различия сказываются на функциях, выполняемых CSa/ß-токсинами в организме жертвы. Большинство представителей данного структурного типа соединений является мощными нейротоксинами, способными модулировать и блокировать ионные K+-, Na+-, СГ-каналы. Однако известны CSa/ß-полипептиды яда скорпионов, участвующие в липолизе и оказывающие антимикробное действие [50], подобное действию дефензинов растений и насекомых, имеющих также цистеин-стабилизированный a/ß-мотив [49, 53].

2.3.4. Перспективы использования полипептпдов ядов животных

Широкий спектр биологической активности, селективность и специфичность взаимодействия с молекулярными мишенями позволяет рассматривать полипептиды ядов различных организмов как перспективные модели для создания на их основе препаратов направленного действия, что привлекает к ним интерес фармацевтических компаний. Изобилие гомологичных компонентов, представленных целыми библиотеками, значительно упрощает процесс установления и оптимизации структуры фармакофора при разработке препаратов, действие которых направлено на конкретные молекулярные мишени.

Существует множество примеров успешного применения белковых компонентов ядов в качестве инструментов исследования механизмов функционирования биомолекулярных систем, изучения различных терапевтических мишеней, а также в качестве лекарственных средств. Так, например, a-бунгаротоксин из яда змеи Biingarus miilticinctiis уже в течение пятидесяти лет используют в качестве инструмента исследования ацетилхолиновых рецепторов [45]. Синтетический аналог со-конотоксина MVIIA из моллюска Conus magus, блокатор потенциалзависимых Са2+-каналов, используют под коммерческим названием «Приалт» (Зиконотид) в качестве анальгетика при терапии состояний хронической боли, церебральной ишемии и черепно-мозговой травмы [54]. В настоящее время проводятся работы по конструированию и испытанию терапевтических препаратов на основе CSa/ß-токсинов скорпионов, способных помочь в лечении астмы, сердечно-сосудистых заболеваний, СПИДа (чарибдотоксин, сциллатоксин), аутоиммунных заболеваний (мокатоксин-1), малярии (MeuTXKßl) [55, 56].

2.4. Полинсптиды Кунитц-типа

Полипептиды семейства Кунитца (Кунитц-типа) - широко распространенная группа соединений, обнаруженных в животных самого разнообразного систематического положения (ленточные и кольчатые черви, кишечнополостные, брюхоногие и головоногие моллюски, скорпионы, клещи, пауки, перепончатокрылые, амфибии, рептилии, млекопитающие) [57,

58]. Представители данного семейства характеризуются укладкой полипептидной цепи, идентичной фолду бычьего панкреатического ингибитора трипсина (БПТИ, апротинин). Структурный мотив полипептидов Кунитц-типа является одним из наиболее консервативных среди структурных мотивов компонентов белковой природы, продуцируемых ядовитыми организмами.

2.4.1. Структура

Для полипептидов структурного семейства Кунитц/БПТИ характерна длина цепи в 5070 а.о. и наличие шести остатков цистеина, образующих 3 дисульфидных мостика. Топология расположения дисульфидных связей (С'-С6, С2-С4, С3-С5) и длина петель между остатками цистеина (ХПС1Х8С2Х15С3Х7С4Х, 2С5ХзС6Хп)1 одинакова у подавляющего числа представителей этого семейства и является их уникальной структурной особенностью.

Наиболее полно охарактеризованный представитель данного семейства, БПТИ, способен в пикомолярных концентрациях ингибировать сериновые протеиназы, такие как трипсин, химотрипсин и калликреин [58]. Молекула БПТИ (6518 Да) состоит из 58 а.о. и стабилизирована тремя дисульфидными связями, обеспечивающими компактную и чрезвычайно стабильную третичную структуру (рис. 4).

Г

BPTI RPDFCLEPPOTGIPCKARII^YFYNAKAGL^

1 10 Р,Р, 20 3*0 40 50 58

М . -i ' ч i --.-,,

t

1

1

N-^f

Петля L1

Р-1

Р-2

I а I

Рисунок 4. А - Аминокислотная последовательность БПТИ (ишРго1 АЫ Р00974) со схемой расположения элементов вторичной структуры. Остатки Суэ выделены желтым цветом, топология дисульфидных связей показана жирными линиями. Черными рамками показаны петли Ы и Ь2, красной рамкой - остатки реактивного сайта ингибитора. Указана нумерация остатков полипептидной цепи и а.о. в Р] и Р)' положениях. Б - Ленточная диаграмма пространственной структуры БПТИ (РОВ ГО 2РТС [59]). Цветом выделены элементы вторичной структуры: красным - спирали, голубым - Р-стренды, зеленым — [3-изгибы, серым - участки неупорядоченной структуры. Коричневым цветом показаны дисульфидные связи. Указаны N1- и С-концы, стренды (31 и р2, Зю-спираль, а-спираль, остаток в Р] положении (Ьуз15). Визуализация выполнена с помощью программы Э8 ХЧвиаНгег.

В настоящее время появляется все больше сообщений о полипептидах, имеющих молекулярную укладку БПТИ, первичная структура которых не удовлетворяет приведенным формулам. Подробнее такие соединения описаны в разделе 2.4.3.

Основной особенностью Кунитц-фолда является изогнутый и скрученный вокруг своей оси на 180° р-лист, сформированный двумя антипараллельными Р-стрендами, pi (17-25 а.о.) и Р2 (29-36 а.о.) (рис. 4). С одной стороны он обрамлен р-изгибом (а.о. 25-29), а с другой -дисульфидным мостиком (Cysl4-Cys38). Участки полипептидной цепи 1-14 и 38-56 а.о. ковалентно связаны дисульфидной связью (Cys5-Cys55) и расположены таким образом, что остатки Argl и А1а58 приближены друг к другу. Еще один дисульфидный мостик стабилизирует область р-изгиба (Cys30-Cys51). N-концевой участок цепи представляет собой короткую Зю-спираль, а С-концевой - структурирован в более длинную и регулярную а-спираль (а.о. 48-56) [60].

Характер фолда и положение трех дисульфидных мостиков обеспечивают компактность и чрезвычайную стабильность молекулы, в которой возможность конформационных изменений ограничена лишь небольшими продольными перестройками участков главной цепи в областях 4—14 и 38—48 а.о. Такие изменения могут быть вызваны удлинением или укорочением N- и С-концевых спиралей и/или скручиванием р-листа [60].

2.4.2. Взаимодействие с ссриновымн протсиназами

Впервые высокоочищенный полипептид данного структурного семейства, БПТИ, был выделен Кунитцем и Нортропом в 1936 г. из бычьего панкреаса [61]. Полипептид проявляет чрезвычайно высокую ингибирующую активность в отношении трипсина и химотрипсина, а также является компетентным ингибитором плазмина, калликреина, тромбина и энтерокиназы [61-64]. Получение кристаллов апротинина (рис. 4) и его комплексов с трипсином (рис. 5) и химотрипсином и исследование их кристаллической структуры позволило не только установить молекулярную структуру и механизм комплексообразования, но и внести значительный вклад в понимание физических основ фермент-ингибиторных и белок-белковых взаимодействий [65-68].

Большинство обнаруженных почти за 80 лет полипептидов семейства Кунитца ингибирует сериновые протеиназы различной специфичности. Среди всех известных в настоящее время молекулярных мишеней полипептидов Кунитц-типа именно эти ферменты являются наиболее подробно исследованными, а механизм взаимодействия с ними -наиболее ясным. Установлено, что ингибиторы семейства Кунитца взаимодействуют с сериновыми протеиназами по стандартному субстратоподобному механизму и образуют устойчивые комплексы в стехиометрическом соотношении 1:1 (рис. 5) [58].

Рисунок 5. А — Схематичное изображение субстратоподобного механизма ингибирования сериновых протеиназ. Серым цветом показан фермент, красная область - остатки активного центра. Зеленым цветом показан ингибитор, синяя область - связывающая петля, желтая - боковая цепь остатка в Р] положении. - субцентр Б) активного центра фермента, Р1-РГ - пептидная связь между остатками в положениях Р| и Р/. Б — Ленточная диаграмма пространственной структуры комплекса БПТИ-трипсин (РОВ ГО 2РТС [59]). Трипсин показан серым цветом, БПТИ - зеленым, связывающая петля -синим, остатки активного центра трипсина - красным, остаток в положении Р1 - желтым. Визуализация выполнена с помощью программы ОБ Ч^виаПгег.

Стандартный (канонический) механизм ингибирования сериновых протеиназ полипептидами семейства Кунитца заключается в их нековалентном взаимодействии и образовании комплекса, подобного фермент-субстратному комплексу Михаэлиса. Ингибитор непосредственно блокирует активный сайт протеиназы, не претерпевая каких-либо конформационных изменений. Согласно данным рентгеноструктурного анализа [59], в комплексно связанном состоянии фермент и ингибитор формируют межмолекулярный антипараллельный Р-лист [58]. Кинетика связывания и сродство к ферменту значительно варьируют в ряду различных ингибиторов семейства Кунитца.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Табакмахер, Валентин Михайлович, 2014 год

7. Список литературы

1. Wong E.S., Belov К. Venom evolution through gene duplications // Gene. 2012. V. 496, N

1.P. 1-7.

2. Fry B.G., Roelants K., Champagne D.E., Scheib H., Tyndall J.D., King G.F., Nevalainen T.J., Norman J.A., Lewis R.J., Norton R.S., Renjifo C., Rodriguez de la Vega R.C. The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2009. V. 10. P. 483-511.

3. Reid H.A., Theakston R.D.G. The management of snake bite // Bull. World Health Organ. 1983. V. 61, N6. P. 885-895.

4. Gueron M., Ilia R., Sofer S. The cardiovascular system after scorpion envenomation. A review // Clin. Toxicol. 1992. V. 30, N 2. P. 245-258.

5. Isbister G.K., Fan H.W. Spider bite // Lancet. 2011. V. 378, N 9808. P. 2039-2047.

6. Sitprija V., Suteparak S. Animal toxins: an overview // Asian Biomed. 2008. V. 2, N 6. P. 451—457.

7. Василевский A.A., Козлов C.A., Гришин E.B. Молекулярное разнообразие яда пауков // Успехи биол. химии. 2009. Т. 49. С. 211-274.

8. Habermann Е. Bee and wasp venoms // Science. 1972. V. 177, N 46. P. 314-322.

9. Raghuraman H., Chattopadhyay A. Melittin: a membrane-active peptide with diverse functions // Biosci. Rep. 2007. V. 27, N 4-5. P. 189-223.

10. Mebs D. Toxicity in animals. Trends in evolution? // Toxicon. 2001. V. 39, N 1. P. 87-96.

11. Zhu S., Darbon H., Dyason K., Verdonck F., Tytgat J. Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides // FASEB J. 2003. V. 17, N 12. P. 1765-1767.

12. King G.F. Venoms as a platform for human drugs: translating toxins into therapeutics // Expert Opin. Biol. Ther. 2011. V. 11, N 11. P. 1469-1484.

13. Menez A. Functional architectures of animal toxins: a clue to drug design? // Toxicon. 1998. V. 36, N 11. P. 1557-1572.

14. Froy O., Sagiv Т., Poreh M., Urbach D., Zilberberg N., Gurevitz M. Dynamic diversification from a putative common ancestor of scorpion toxins affecting sodium, potassium, and chloride channels//J. Mol. Evol. 1999. V. 48, N2. P. 187-196.

15. Dauplais M., Lecoq A., Song J., Cotton J., Jamin N., Gilquin В., Roumestand C., Vita C., de Medeiros C.L.C., Rowan E.G., Harvey A.L., Menez A. On the convergent evolution of animal toxins // J. Biol. Chem. 1997. V. 272, N 7. P. 4302-4309.

16. Gilquin В., Racape J., Wrisch A., Visan V., Lecoq A., Grissmer S., Menez A., Gasparini S. Structure of the BgK-Kvl.l complex based on distance restraints identified by double mutant cycles //J. Biol. Chem. 2002. V. 277, N 40. P. 37406-37413.

17. Srinivasan K.N., Sivaraja V., Iluys I., Sasaki T., Cheng B., Kumar T.K.S., Sato K., Tytgat J., Yu C., San B.C.C., Ranganathan S., Bowie II.J., Kini R.M., Gopalakrishnakone P. K-Hefutoxinl, a novel toxin from the scorpion Heterometrus fulvipes with unique structure and function // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, N 33. P. 30040-30047.

18. Kordis D., Gubensek F. Adaptive evolution of animal toxin multigene families // Gene. 2000. V. 261, N l.P. 43-52.

19. Fry B.G. From genome to «venome»: molecular origin and evolution of the snake venom proteome inferred from phylogenetic analysis of toxin sequences and related body proteins // Genome Res. 2005. V. 15, N 3. P. 403-420.

20. Fry B.G., Wiister W., Kini R.M., Brusic V., Khan A., Venkataraman D., Rooney A.P. Molecular evolution and phylogeny of elapid snake venom three-finger toxins // J. Mol. Evol. 2003. V. 57, N 1. P. 110-129.

21. Possani L.D., Becerril B., Delepierre M., Tytgat J. Scorpion toxins specific for Na+-channels // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264, N 2. P. 287-300.

22. Olivera B.M., I-Iillyard D.R., Marsh M., Yoshikami D. Combinatorial peptide libraries in drug design: lessons from venomous cone snails // Trends Biotechnol. 1995. V. 13, N 10. P. 422426.

23. Escoubas P., Rash L. Tarantulas: eight-legged pharmacists and combinatorial chemists // Toxicon. 2004. V. 43, N 5. P. 555-574.

24. Sollod B.L., Wilson D., Zhaxybayeva O., Gogarten J.P., Drinkwater R., King G.F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries? // Peptides. 2005. V. 26, N 1. P. 131-139.

25. Escoubas P. Molecular diversification in spider venoms: a web of combinatorial peptide libraries // Mol. Divers. 2006. V. 10, N 4. P. 545-554.

26. Kozminsky-Atias A., Bar-Shalom A., Mishmar D., Zilberberg N. Assembling an arsenal, the scorpion way // BMC Evol. Biol. 2008. V. 8. P. 333-346.

27. Wang Y., Yap L.L., Chua K.L., Khoo H.E. A multigene family of Heteractis magnificalysins (HMgs) // Toxicon. 2008. V. 51, N 8. P. 1374-1382.

28. Duda T.F., Palumbi S.R. Molecular genetics of ecological diversification: duplication and rapid evolution of toxin genes of the venomous gastropod Conus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96, N 12. P. 6820-6823.

29. Duda T.F., Palumbi S.R. Evolutionary diversification of multigene families: allelic selection of toxins in predatory cone snails // Mol. Biol. Evol. 2000. V. 17, N 9. P. 1286-1293.

30. Zupunski V., Kordis D., Gubensek F. Adaptive evolution in the snake venom Kunitz/BPTI protein family // FEBS Lett. 2003. V. 547, N 1-3. P. 131-136.

31. Zhu S., Bosmans F., Tytgat J. Adaptive evolution of scorpion sodium channel toxins // J. Mol. Evol. 2004. V. 58, N 2. P. 145-153.

32. Ma Y., I-Ie Y., Zhao R., Wu Y., Li W., Cao Z. Extreme diversity of scorpion venom peptides and proteins revealed by transcriptomic analysis: implication for proteome evolution of scorpion venom arsenal //J. Proteomics. 2012. V. 75, N 5. P. 1563-1576.

33. Mouhat S., Jouirou B., Mosbah A., De Waard M., Sabatier J.M. Diversity of folds in animal toxins acting on ion channels // Biochem. J. 2004. V. 378, N 3. P. 717-726.

34. Jiang L., Peng L., Chen J., Zhang Y., Xiong X., Liang S. Molecular diversification based on analysis of expressed sequence tags from the venom glands of the Chinese bird spider Omithoctonus hmvena II Toxicon. 2008. V. 51, N 8. P. 1479-1489.

35. Tang X., Zhang Y., Hu W., Xu D., Tao II., Yang X., Li Y., Jiang L., Liang S. Molecular diversification of peptide toxins from the tarantula Haplopelma hainanum {Omithoctonus hainana) venom based on transcriptomic, peptidomic, and genomic analyses // J. Proteome Res. 2010. V. 9, N 5. P. 2550-2564.

36. Undheim E.A., Sunagar K., Ilerzig V., Kely L., Low D.H., Jackson T.N., Jones A., Kurniawan N., King G.F., Ali S.A., Antunes A., Ruder T., Fry B.G. A proteomics and transcriptomics investigation of the venom from the barychelid spider Trittame loki (brush-foot trapdoor) // Toxins. 2013. V. 5, N 12. P. 2488-2503.

37. Safavi-Hemami H., Hu II., Gorasia D.G., Bandyopadhyay P.K., Veith P.D., Young N.D., Reynolds E.C., Yandell M., Olivera B.M., Purcell A.W. Combined proteomic and transcriptomic interrogation of the venom gland of Conus geographus uncovers novel components and functional compartmentalization // Mol. Cell. Proteomics. 2014. V. 13, N 4. P. 938-953.

38. Corona M., Gurrola G.B., Merino E., Cassulini R.R., Valdez-Cruz N.A., García B., Ramírez-Domínguez M.E., Coronas F.I., Zamudio F.Z., Wanke E., Possani L.D. A large number of novel Ergtoxin-like genes and ERG K+-channels blocking peptides from scorpions of the genus Centruroides IIFEBS Lett. 2002. V. 532, N 1-2. P. 121-126.

39. Mould J., Yasuda T., Schroeder C.I., Beedle A.M., Doering C.J., Zamponi G.W., Adams D.J., Lewis R.J. The alpha2delta auxiliary subunit reduces affinity of omega-conotoxins for recombinant N-type (Cav2.2) calcium channels // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, N 33. P. 3470534714.

40. McDonough S.I. Gating modifier toxins of voltage-gated calcium channels // Toxicon. 2007. V. 49, N2. P. 202-212.

41. Tsetlin V. Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger' proteins // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264, N 2. P. 281-286.

42. Fry B.G., Wustcr W. Assembling an arsenal: origin and evolution of the snake venom proteome inferred from phylogenetic analysis of toxin sequences // Mol. Biol. Evol. 2004. V. 21, N 5. P. 870-883.

43. Fry B.G., Scheib II., van der Weerd L., Young B., McNaughtan J., Ramjan S.F., Vidal N., Poelmann R.E., Norman J.A. Evolution of an arsenal: structural and functional diversification of the venom system in the advanced snakes (Caenophidia) // Mol. Cell. Proteomics. 2008. V. 7, N 2. P. 215-246.

44. Kini R.M., Doley R. Structure, function and evolution of three-finger toxins: mini proteins with multiple targets // Toxicon. 2010. V. 56, N 6. P. 855-867.

45. Utkin Y.N. Three-finger toxins, a deadly weapon of elapid venom-milestones of discovery // Toxicon. 2013. V. 62, P. 50-55.

46. Nastopoulos V., Kanellopoulos P.N., Tsernoglou D. Structure of dimeric and monomeric erabutoxin a refined at 1.5 A resolution // Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1998. V. 54, N 5. P. 964-974.

47. Dewan J.C., Grant G.A., Sacchettini J.C. Crystal structure of kappa-bungarotoxin at 2.3-A resolution // Biochemistry. 1994. V. 33, N 44. P. 13147-13154.

48. Rodriguez de la Vega R.C., Possani L.D., Vidal N. Scorpion peptides // Handbook of Biologically Active Peptides / Kastin A.J. ed.: Amsterdam : Elsevier. 2013. Second ed. P. 423—429.

49. Thomma B.P., Cammue B.P., Thevissen K. Plant defensins // Planta. 2002. V. 216, N 2. P. 193-202.

50. Sunagar K., Undheim E.A.B., Chan A.II.C., Koludarov I., Muñoz-Gómez S.A., Antunes A., Fry B.G. Evolution stings: The origin and diversification of scorpion toxin peptide scaffold // Toxins. 2013. V. 5, N 12. P. 2456-2487.

51. Ganesan R., Jelakovic S., Campbell A.J., Li Z.Z., Asgian J.L., Powers J.C., Grütter M.G. Exploring the S4 and S1 prime subsite specificities in caspase-3 with aza-peptide epoxide inhibitors // Biochemistry. 2006. V. 45, N 30. P. 9059-9067.

52. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Greenblatt D.M., Meng E.C., Ferrin T.E. UCSF Chimera - a visualization system for exploratory research and analysis // J. Comput. Chem. 2004. V. 25, N 13. P. 1605-1612.

53. Bruix M., Jiménez M.A., Santoro J., González C., Colilla F.J., Méndez E., Rico M. Solution structure of gamma 1-H and gamma 1-P thionins from barley and wheat endosperm determined by 1H-NMR: a structural motif common to toxic arthropod proteins // Biochemistry. 1993. V. 32, N 2. P. 715-724.

54. Miljanich G.P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain // Curr. Med. Chem. 2004. V. 11, N 23. P. 3029-3040.

55. Bergeron Z.L., Bingham J.P. Scorpion toxins specific for potassium (K+) channels: a historical overview of peptide bioengineering // Toxins. 2012. V. 4, N 11. P. 1082-1119.

56. Hmed B., Serria H.T., Mounir Z.K. Scorpion peptides: potential use for new drug development // J. Toxicol. 2013. V. 2013. Article ID 958797.

57. Caroline B.F.M., Schwartz E.F. Protease inhibitors from marine venomous animals and their counterparts in terrestrial venomous animals // Mar. Drugs. 2013. V. 11, N 6. P. 2069-2112.

58. Ranasinghe S., McManus D.P. Structure and function of invertebrate Kunitz serine protease inhibitors // Dev. Comp. Immunol. 2013. V. 39, N 3. P. 219-27.

59. Marquart M., Walter J., Deisenhofer J., Bode W., Huber R. The geometry of the reactive site and of the peptide groups in trypsin, trypsinogen and its complexes with inhibitors // Acta Crystallogr. 1983. V. 39. P. 480-490.

60. Pritchard L., Dufton M.J. Evolutionary trace analysis of the Kunitz/BPTI family of proteins: functional divergence may have been based on conformational adjustment // J. Mol. Biol. 1999. V. 285, N4. P. 1589-1607.

61. Kunitz M., Northrop J.H. Isolation from beef pancreas crystalline trypsinogen, trypsin, a trypsin inhibitors and an inhibitors trypsin compound // J. Gen. Physiol. 1936. V. 19, N 6. P. 991— 1001.

62. Ascenzi P., Bocedi A., Bolognesi M., Spallarossa A., Coletta M., De Cristofaro R., Menegatti E. The bovine basic pancreatic trypsin inhibitor (Kunitz inhibitor): a milestone protein // Curr. Protein Peptide Sci. 2003. V. 4,N 3. P. 231-251.

63. Sun Z., Lu W., Jiang A., Chen J., Tang F., Liu J.N. Expression, purification and characterization of aprotinin and a human analogue of aprotinin // Protein Expr. Purif. 2009. V. 65, N 2. P. 238-243.

64. Buczek O., Koscielska-Kasprzak K., Krowarsch D., Dadlez M., Otlewski J. Analysis of serine proteinase-inhibitor interaction by alanine shaving // Protein Sci. 2002. V. 11, N 4. P. 806819.

65. Huber R., Kukla D., Bode W., Schwager P., Bartels K., Deisenhofer J., Steigemann W. Structure of the complex formed by bovine trypsin and bovine pancreatic trypsin inhibitor. II. Crystallographic refinement at 1.9 A resolution // J. Mol. Biol. 1974. V. 89, N 1. P. 73-101.

66. Scheidig A.J., Hynes T.R., Pelletier L.A., Wells J.A., Kossiakoff A.A. Crystal structures of bovine chymotrypsin and trypsin complexed to the inhibitor domain of Alzhaimer's amyloid P-precursor (APPI) and basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI): Engineering of inhibitors with altered specificities // Protein Sci. 1997. V. 6, N 9. P. 1806-1824.

67. Otlewski J., Jaskolski M., Buczek О., Cierpicki Т., Czapinska H., Krowarsch D., Smalas A.O., Stachowiak D., Szpineta A., Dadlez M. Structure-function relationship of serine protease-protein inhibitor interaction // Acta Biochim. Pol. 2001. V. 48, N 2. P. 419^128.

68. Krowarsch D., Zakrzewska M., Smalas A.O., Otlewski J. Structure-function relationships in serine protease-bovine pancreatic trypsin inhibitor interaction // Protein Pept. Lett. 2005. V. 12, N 5. P. 403—407.

69. Zani M.L., Moreau T. Phage display as a powerful tool to engineer protease inhibitors // Biochimie. 2010. V. 92, N 11. P. 1689-1704.

70. Krowarsch D., Cierpicki Т., Jelen F., Otlewski J. Canonical protein inhibitors of serine proteases // Cell. Mol. Life. Sci. 2003. V. 60, N 11. P. 2427-2444.

71. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases // Eur. J. Biochem. 1992. V. 204, N 2. P. 433-451.

72. Read R.J., James M.N.G. Introduction to the protein inhibitors: X-ray crystallography // Protease Inhibitors / Barrett A.J., Salvesen G. eds. Amsterdam : Elsevier Sci. Publ. 1986. P. 301— 336.

73. Perona J.J., Craik C.S. Evolutionary divergence of substrate specificity within the chymotrypsin-like serine protease fold // J. Biol. Chem. 1997. V. 272, N 48. P. 29987-29990.

74. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V. 27, N 2. P. 157-162.

75. Krowarsch D., Dadlez M., Buczek O., Krokoszynska I., Smalas A.O., Otlewski J. Interscaffolding additivity: binding of PI variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor to four serine proteases // J. Mol. Biol. 1999. V. 289, N 1. P. 175-186.

76. Helland R., Otlewski J., Sundheim O., Dadlez M., Smalas A.O. The crystal structures of the complexes between bovine beta-trypsin and ten PI variants of BPTI // J. Mol. Biol. 1999. V. 287, N 5. P. 923-942.

77. Czapinska H., Otlewski J. Structural and energetic determinants of the SI-site specificity in serine proteases //Eur. J. Biochem. 1999. V. 260,N 3. P. 571-595.

78. Мосолов B.B. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза. М. : Наука, 1983.40 с.

79. Strydom D.J. Protease inhibitors as snake venom toxins // Nat. New Biol. 1973. V. 243, N 124. P. 88-89.

80. Schweitz H., Bruhn Т., Guillemare E., Moinier D., Lancelin J.M., Beress L., Lazdunski M. Kalicludines and kaliseptine. Two different classes of sea anemone toxins for voltage sensitive K+-channels //J. Biol. Chem. 1995. V. 270, N 42. P. 25121-25126.

81. Grzesiak A., Ilelland R., Smalás A.O., Krowarsch D., Dadlez M., Otlevvski J. Substitutions at the P(l) position in BPTI strongly affect the association energy with serine proteinases // J. Mol. Biol. 2000. V.301.N l.P. 205-217.

82. Chand H.S., Schmidt A.E., Bajaj S.P., Kisiel W. Structure-function analysis of the reactive site in the first Kunitz-type domain of human tissue factor pathway inhibitor-2 // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, N 17. P. 17500-17507.

83. Frazáo В., Vasconcelos V., Antunes A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview//Mar. Drugs. 2012. V. 10, N 8. P. 1812-1851.

84. Гладких И.Н. Изучение структуры и механизма действия ингибиторов сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus : дис. ... канд. хим. наук. Владивосток. 2008. 109 с.

85. Чаусова В.Е. Полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция, и причины многообразия изоформ : дис. ... канд. хим. наук. Владивосток. 2012. 128 с.

86. Андреев Я.А. Исследование природных модуляторов функциональной активности TRPV1 рецепторов : дис. ... канд. биол. наук. Москва. 2009. 109 с.

87. Rawlings N.D., Waller М., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors //Nucleic Acids Res. 2014. V. 42. P. D503-D509.

88. Hynes T.R., Randal M., Kennedy L.A., Eigenbrot C., Kossiakoff A.A. X-ray crystal structure of the protease inhibitor domain of Alzheimers amyloid beta-protein precursor // Biochem. 1990. V. 29, N43. P. 10018-10022.

89. Petersen L.C., Bjorn S.E., Norris F., Norris K., Sprecher C., Foster D.C. Expression, purification and characterization of a Kunitz-type protease inhibitor domain from human amyloid precursor protein homolog // FEBS Lett. 1994. V. 338, N 1. P. 53-57.

90. Xu Y., Carr P.D., Guss J.M., Ollis D.L. The crystal structure of bikunin from the interalpha-inhibitor complex: a serine protease inhibitor with two Kunitz domains // J. Mol. Biol. 1998. V. 276, N 5. P. 955-966.

91. Ilitendra S.C., Amy E.S., Paul В., Walter K. Structure-function analysis of the reactive site in the first Kunitz-type Domain of human tissue factor pathway inhibitor-2 // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, N 17. P. 17500-17507.

92. Hawdon J.M., Datu В., Crowell M. Molecular cloning of a novel multidomain Kunitz-type proteinase inhibitor from the hookworm Ancylostoma caninum // J Parasitol. 2003. V. 89, N 2. P. 402^107.

93. Skarzynski T. Crystal structure of alpha-dendrotoxin from the green mamba venom and its comparison with the structure of bovine pancreatic trypsin inhibitor // J. Mol. Biol. 1992. V. 224, N 3.P. 671-683.

94. Tytgat J., Vandenberghe I., Ulens C., van Beeumen J. New polypeptide components purified from mamba venom // FEBS Lett. 2001. V. 491, N 3. P. 217-221.

95. Stotz S.C., Spaetgens R.L., Zamponi G.W. Block of voltage-dependent calcium channel by the green mamba toxin calcicludine // J. Membr. Biol. 2000. V. 174, N 2. P. 157-165.

96. Doley R., Kini R.M. Protein complexes in snake venom // Cell. Mol. Life. Sci. 2009. V. 66, N 17. P. 2851-2871.

97. Kwong P.D., McDonald N.Q., Sigler P.B., Hendrickson W.A. Structure of beta 2-bungarotoxin: potassium channel binding by Kunitz modules and targeted phospholipase action // Structure. 1995. V. 3,N 10. P. 1109-1119.

98. Hokama Y., Iwanaga S., Tatsuki T., Suzuki T. Snake venom proteinase inhibitors. III. Isolation of five polypeptide inhibitors from the venoms of Hemachatus haemachatus (Ringhal's corbra) and Naja nivea (Cape cobra) and the complete amino acid sequences of two of them // J. Biochem. 1976. V. 79, N 3. P. 559-578.

99. Yuan C.H., He Q.Y., Peng K., Diao J.B., Jiang L.P., Tang X., Liang S.P. Discoveiy of a distinct superfamily of Kunitz-type toxin (KTT) from tarantulas // PLoS One. 2008. V. 3, N 10. P. e3414.

100. Jiang L., Chen J., Peng L., Zhang Y., Xiong X., Liang S. Genomic organization and cloning of novel genes encoding toxin-like peptides of three superfamilies from the spider Orinithoctonus huwena II Peptides. 2008. V. 29, N 10. P. 1679-1684.

101. Wan H., Lee K.S., Kim B.Y., Yuan M., Zhan S., You H., Li J., Jin B.R. A spider (Araneus ventricosus) chymotrypsin inhibitor that acts as an elastase inhibitor and a microbial serine protease inhibitor// Comp. Biochem. Physiol. B-Biochem. Mol. Biol. 2013. V. 165,N 1. P. 36-41.

102. Schwartz E.F., Diego-Garcia E., Rodriguez de la Vega R.C., Possani L.D. Transcriptome analysis of the venom gland of the Mexican scorpion Hadrurus gertschi (Arachnida: Scorpiones) // BMC Genomics. 2007. V. 8. P. 119.

103. Zhao R., Ma Y., He Y., Di Z., Wu Y.L., Cao Z.J., Li W.X. Comparative venom gland transcriptome analysis of the scorpion Lychas mucronatus reveals intraspecific toxic gene diversity and new venomous components // BMC Genomics. 2010. V. 11. P. 452—452.

104. Chen Z.Y., Hu Y.T., Yang W.S., He Y.W., Feng J., Wang B., Zhao R.M., Ding J.P., Cao Z.J., Li W.X., Wu Y.L. Hgl, novel peptide inhibitor specific for Kvl.3 channels from first scorpion Kunitz-type potassium channel toxin family //J. Biol. Chem. 2012. V. 287, N 17. P. 13813-13821.

105. Chen Z., Luo F., Feng J., Yang W., Zeng D., Zhao R., Cao Z., Liu M., Li W., Jiang L., Wu Y. Genomic and structural characterization of Kunitz-type peptide LmKTT-la highlights diversity and evolution of scorpion potassium channel toxins // PLoS One. 2013. V. 8, N 4. Article ID e60201.

106. Bayrhuber M., Yijayan V., Ferber M., Graf R., Korukottu J., Imperial J., Garrett J.E., Olivera B.M., Terlau Ii., Zweckstetter M., Becker S. Conkunitzin-Sl is the first member of a new Kunitz-type neurotoxin family. Structural and functional characterization // J. Biol. Chem. 2005. V. 280, N25. P. 23766-23770.

107. Imperial J.S., Silverton N., Olivera B.M., Bandyopadhyay P.K., Sporning A., Ferber M., Terlau PI. Using chemistry to reconstruct evolution: On the origins of fish-hunting in venomous cone snails // Proc. Amer. Philos. Soc. 2007. V. 151, N 2. P. 185-200.

108. Hu H., Bandyopadhyay P.K., Olivera B.M., Yandell M. Characterization of the Conns bulletins genome and its venom-duct transcriptome // BMC Genomics. 2011. V. 12. P. 60.

109. Elliger C.A., Richmond T.A., Lebaric Z.N., Pierce N.T., Sweedler J.V., Gilly W.F. Diversity of conotoxin types from Conns californicus reflects a diversity of prey types and a novel evolutionary history // Toxicon. 2011. V. 57, N 2. P. 311-322.

110. Conlon J.M., Kim J.B. A protease inhibitor of the Kunitz family from skin secretions of the tomato frog, Dyscophus guineti (Microhylidae) // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 279, N 3. P. 961-964.

111. Wang H., Wang L., Zhou M., Yang M., Ma C., Chen T., Zhang Y., Zeller M., Hornshaw M., Shaw C. Functional peptidomics of amphibian skin secretion: A novel Kunitz-type chymotrypsin inhibitor from the African hyperoliid frog, Kassina senegalensis II Biochimie. 2012. V. 94, N 3. P. 891-899.

112. You D., Hong J., Rong M., Yu H., Liang S., Ma Y., Yang II., Wu J., Lin D., Lai R. The first gene-encoded amphibian neurotoxin // J. Biol. Chem. 2009. V. 284, N 33. P. 22079-22086.

113. Hisada M., Satake II., Masuda K., Aoyama M., Murata K., Shinada T., Iwashita T., Ohfune Y., Nakajima T. Molecular components and toxicity of the venom of the solitary wasp, Anoplius samariensis II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 330, N 4. P. 1048-1054.

114. Parkinson N.M., Conyers C., Keen J., MacNicoll A., Smith I., Audsley N., Weaver R. Towards a comprehensive view of the primary structure of venom proteins from the parasitoid wasp Pimpla hypochondriaca II Insect Biochem. Mol. Biol. 2004. V. 34, N 6. P. 565-571.

115. Yang X., Wang Y., Lu Z., Zhai L., Jiang J., Liu J., Yu H. A novel serine protease inhibitor from the venom of Vespa bicolor Fabricius II Comp. Biochem. Physiol. B-Biochem. Mol. Biol. 2009. V. 153, N l.P. 116-120.

116. Choo Y.M., Lee K.S., Yoon H.J., Qiu Y., Wan H., Sohn M.R., Sohn H.D., Jin B.R. Antifibrinolytie role of a bee venom serine protease inhibitor that acts as a plasmin inhibitor // PLoS One. 2012. V. 7. P. e32269.

117. Qiu Y., Lee K.S., Choo Y.M., Kong D., Yoon H.J., Jin B.R. Molecular cloning and antifibrinolytie activity of a serine protease inhibitor from bumblebee (Bombus terrestris) venom // Toxicon. 2013. V. 63. P. 1-6.

118. Turk Т., Kem W.R. The phylum Cnidaria and investigations of its toxins and venoms until 1990 // Toxicon. 2009. V. 54, N 8. P. 1031-1037.

119. Ishida M., Minagawa S., Miyauchi K., Shimakura K., Nagashima Y., Shiomi K. Amino acid sequences of Kunitz-type protease inhibitors from the sea anemone Actinia equina II Fish. Sci. 1997. V. 63, N5. P. 794-798.

120. Minagawa S., Sugiyama M., Ishida M., Nagashima Y., Shiomi K. Kunitz-type protease inhibitors from acrorhagi of three species of sea anemones // Сотр. Biochem. Physiol. B-Biochem. Mol. Biol. 2008. V. 150, N 2. P. 240-245.

121. Wunderer G., Machleidt W., Fritz H. The broad-specificity proteinase inhibitor 5 II from the sea anemone Anemonia sulcata II Methods Enzymol. 1981. V. 80. P. 816-820.

122. Peigneur S., Billen В., Derua R., Waelkens E., Debaveye S., Beress L., Tytgat J. A bifunctional sea anemone peptide with Kunitz type protease and potassium channel inhibiting properties//Biochem. Pharmacol. 2011. V. 82, N 1. P. 81-90.

123. Minagawa S., Ishida M., Shimakura K., Nagashima Y., Shiomi K. Isolation and amino acid sequences of two Kunitz-type protease inhibitors from the sea anemone Anthopleura aff. xanthogrammica II Сотр. Biochem. Physiol. B-Biochem. Mol. Biol. 1997. V. 118, N 2. P. 381386.

124. Minagawa S., Ishida M., Shimakura K., Nagashima Y., Shiomi K. Amino acid sequence and biological activities of another Kunitz-type protease inhibitor from the sea anemone Anthopleura aff. xanthogrammica II Fish. Sci. 1998. V. 64, N 1. P. 157-161.

125. Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Маркова Л.Ф., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность ингибитора трипсина IV из Radianthus macrodactylus II Биоорган, химия. 1985. Т. 11, № 3. С. 293-301.

126. Сокотун И.Н., Ильина А.П., Монастырная М.М., Лейченко Е.В., Еськов А.А., Анастгак С.Д., Козловская Э.П. Ингибиторы протеиназ тропической актинии Radianthus macrodactylus: выделение и характеристика//Биохимия. 2007. Т. 72, вып. 3. С. 368-374.

127. Сокотун И.Н., Лейченко Е.В., Вакорина Т.И., Еськов А.А., Ильина А.П., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Ингибитор сериновых протеиназ из актинии Radianthus

macrodactyliis: выделение и физико-химические свойства // Биоорган, химия. 2007. Т. 33, № 4. С. 1-8.

128. Gladkikh I., Monastyrnaya М., Leychenko Е., Zelepuga Е., Chausova V., Isaeva М., Anastyuk S., Andreev Y., Peigneur S., Tytgat J., Kozlovkaya E. Atypical reactive center Kunitztype inhibitor from the sea anemone Ileteractis crispa II Mar. Drugs. 2012. V. 10, N 7. P. 15451565.

129. Andreev Y.A., Kozlov S.A., Koshelev S.G., Ivanova E.A., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P., Grishin E.V. Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of vanilloid receptor 1 (TRPV1) // J. Biol. Chem. 2008. V. 283, N 35. P. 23914-23921.

130. Козлов С.А., Андреев Я.А., Мурашев A.H., Скобцов Д.И., Дьяченко И.А., Гришин Е.В. Новые полипептидные компоненты с анальгетической активностью из морской анемоны Heteractis crispa И Биоорган, химия. 2009. Т. 35, № 6. С. 789-798.

131. Ilonma Т., Kawahata S., Ishida М., Nagai II., Nagashima Y., Shiomi К. Novel peptide toxins from the sea anemone Stichodactyla haddoni II Peptides. 2008. V. 29, N 4. P. 536-544.

132. Antuch W., Berndt K.D., Chavez M.A., Delfín J., Wüthrich К. The NMR solution structure of a Kunitz-type proteinase inhibitor from the sea anemone Stichodactyla helianthus И Eur. J. Biochem. 1993. V. 212, N 3. P. 675-684.

133. Delfín J., Martinez I., Antuch W., Morera V., Gonzalez Y., Rodriguez R., Márquez M., Saroyan A., Larionova N., Diaz J., Padrón G., Chavez M. Purification, characterization and immobilization of proteinase inhibitors from Stichodactyla helianthus II Toxicon. 1996. V. 34, N 11-12. P. 1367-1376.

134. Díaz J., Morera V., Delfín J., Huerta V., Lima G., Rodríguez de la Vega M., Garcia В., Padrón G., Assfalg-Machleidt I., Machleidt W., Chávez M. Purification and partial characterization of a novel proteinase inhibitor from the sea anemone Stichodactyla helianthus II Toxicon. 1998. V. 36, N9. P. 1275-1276.

135. García-Fernández R., Pons Т., Perbandt M., Valiente P.A., Talavera A., González-González Y., Rehders D., Chávez M.A., Betzel C., Redecke L. Structural insights into serine protease inhibition by a marine invertebrate BPTI Kunitz-type inhibitor // J. Struct. Biol. 2012. V. 180, N 2. P. 271-279.

136. Ilonma Т., Shiomi K. Peptide toxins in sea anemones: structural and functional aspects // Mar. Biotechnol. 2006. V. 8, N 1. P. 1-10.

137. Isaeva M.P., Chausova V.E., Zelepuga E.A., Guzev K.V., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P. A new multigene superfamily of Kunitz-type protease inhibitors from sea anemone Heteractis crispa II Peptides. 2012. V. 34, N 1. P. 88-97.

138. Kozlov S., Grishin E. The mining of toxin-like polypeptides from EST database by single residue distribution analysis // BMC Genomics. 2011. V. 12. P. 88.

139. Mebs D., Gebauer E. Isolation of proteinase inhibitory, toxic and hemolytic polypeptides from the sea anemone Stoichactis sp. И Toxicon. 1980. V. 18, N 1. P. 97-106.

140. Hedstrom L. Serine protease mechanism and specificity // Chem. Rev. 2002. V. 102, N 12. P. 4501-4524.

141. Blow D.M. Structure and mechanism of chymotrypsin // Accounts Chem. Res. 1976. V. 9, N 4. P. 145-152.

142. Варфоломеев С.Д., Пожитков А.Е. Активные центры гидролаз: основные типы структур и механизм катализа // Вестн. МГУ. Сер. Химия. 2000. Т. 41, № 43. С. 147-156.

143. Di CeraE. Serine proteases // IUBMB Life. 2009. V. 61, N 5. P. 510-515.

144. Page M.J., Di Cera E. Serine peptidases: classification, structure and function // Cell. Mol. Life Sci. 2008. V. 65, N 7-8. P. 1220-1236.

145. Neurath H., Walsh K.A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73, N 11. P. 3825-3832.

146. Davie E.W., Fujikawa K., Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation//Biochemistry. 1991. V. 30, N 43. P. 10363-10370.

147. Vaday G.G., Lider O. Extracellular matrix moieties, cytokines, and enzymes: dynamic effects on immune cell behavior and inflammation // J. Leukoc. Biol. 2000. V. 67, N 2. P. 149-159.

148. Fanconi G., Uehlinger E., Knauer C. Das Coeliakiesyndrom bei angeborener zystischer Pankreasfibromatose und bronchiektasien // Wiener Med. Wochensch. 1936. V. 86. P. 753-756.

149. Hopkins R.L. Nutritional management of children with cystic fibrosis // Pediatric nutrition / Suskind R.M., Lewinter-Suskind L. eds. : New York : Raven Press. 1993. P. 375-382.

150. Lasson A. Acute pancreatitis in man. A clinical and biochemical study of pathophysiology and treatment// Scand. J. Gastroenterol. 1984. V. 19,N 99. P. 1-57.

151. Markland F.S. Snake venom fibrinogenolytic and fibrinolytic enzymes: an updated inventory // Thromb. I-Iaemost. 1998. V. 79, N 3. P. 668-674.

152. Macfarlane S.R., Seatter M.J., Kanke Т., Hunter G.D., Plevin R. Proteinase-activated receptors // Pharmacol. Rev. 2001. V. 53, N 2. P. 245-282.

153. Selwyn A.P. Prothrombotic and antithrombotic pathway in acute coronary syndromes // Am. J. Cardiol. 2003. V. 91, N 12A. P. 3H-11II.

154. Budayova-Spano M., Lacroix M., Thielens N.M., Arlaud G.J., Fontecilla-Camps J.C., Gaboriaud C. The crystal structure of the zymogen catalytic domain of complement protease Clr reveals that a disruptive mechanical stress is required to trigger activation of the CI complex // EMBO J. 2002. V. 21, N 3. P. 231-239.

155. McGeer P.L., McGeer E.G. The inflammatory response system of brain: implications for therapy of Alzheimer and other neurodegenerative diseases // Brain Res. Rev. 1995. V. 21, N 2. P. 195-218.

156. Arumugam T.V., Shiels I.A., Woodruff T.M., Granger D.N., Taylor S.M. The role of the complement system in ischemia-reperfusion injury // Shock. 2004. V. 21, N 5. P. 401—409.

157. Korkmaz В., Moreau Т., Gauthier F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: physicochemical properties, activity and physiopathological functions // Biochimie. 2008. V. 90, N 2. P. 227-42.

158. Cai S.H., Dole V.S., Bergmeier W., Scafidi J., Feng H.P., Wagner D.D., Davis A.E. A direct role for CI inhibitor in regulation of leukocyte adhesion // J. Immunol. 2005. V. 174, N 10. P. 6462-6466.

159. Гришин E.B., Цетлин В.И. Молекулярные механизмы регуляции рецепторов нейронов // Вестн. РАН. 2010. Т. 80. № 5. С. 433^140.

160. Narahashi Т. Tetrodotoxin: a brief history // Proc. Jpn. Acad. Ser. B-Phys. Biol. Sci. 2008. V. 84, N5. P. 147-154.

161. Olivera B.M., Miljanich G.P., Ramachandran J., Adams M.E. Calcium channel diversity and neurotransmitter release: the omega-conotoxins and omega-agatoxins // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 823-867.

162. Узденский А.Б. Ионные каналы в биологических мембранах : учеб. пособие. Ростов-на- Дону : Южный федер. ун-т, 2008. 44 с.

163. Neuroscience. Eds: Purves D. et al. Sunderland : Sinauer Associates. 2012. 759 p.

164. Venkatachalam K., Montell C. TRP channels // Annu Rev Biochem. 2007. V. 76. P. 387417.

165. Messerli S.M., Greenberg R.M. Cnidarian toxins acting on voltage-gated ion channels // Mar. Drugs. 2006. V. 4,N 3. P. 70-81.

166. Кодиров C.A., Журавлев B.JI., Сафонова T.A., Курилова Л.С., Крутецкая З.И. Суперсемейство потенциалзависимых К+-каналов: структура, функции и патология // Цитология. 2010. Т. 52, № 9. С. 697-714.

167. Basic and clinical pharmacology / Katzung B.G., Masters S.B., Trevor A.J. eds. : New York. 2009. 1416 p.

168. Димитриев Д.А., Сапёрова E.B. Электрофизиология кардиомиоцита : учеб. пособие. Чебоксары : Чуваш, гос. пед. ун-т, 2009. 102 с.

169. Papazian D.M., Bezanilla F. How does an ion channel sense voltage? //News Physiol. Sci. 1997. V. 12. P. 203-210.

170. Durell S.R., Hao Y., Guy H.R. Structural models of the transmembrane region of voltage-gated and other K+ channels in open, closed, and inactivated conformations // J. Struct. Biol. 1998. V. 121, N2. P. 263-284.

171. Keynes R.D., Elinder F. The screw-helical voltage gating of ion channels // Proc. Biol. Sci. 1999. V. 266, N 1421. P. 843-852.

172. Jiang Y., Lee A., Chen J., Ruta V., Cadene M., Chait B.T., MacKinnon R. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel // Nature. 2003. V. 423, N 6935. P. 33-41.

173. Cheng Y.M., Claydon T.W. Voltage-dependent gating of HERG potassium channels // Front. Pharmacol. 2012. V. 3. P. 83.

174. Moiseenkova-Bell V.Y., Wensel T.G. Hot on the trail of TRP channel structure // J. Gen. Physiol. 2009. V. 133, N 3. P. 239-244.

175. Gaudet R. TRP channels entering the structural era // J. Physiol. 2008. V. 586, N 15. P. 3565-3575.

176. Veronesi B., Oortgiesen M. The TRPV1 receptor: target of toxicants and therapeutics // Toxicol. Sci. 2006. V.89, N 1. P. 1-3.

177. Salazar H., Jara-Oseguera A., Hernández-García E., Llórente I., Arias-Olguín I.I., Soriano-García M., Islas L.D., Rosenbaum T. Structural determinants of gating in the TRPV1 channel //Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. V.16, N 7. P. 704-710.

178. Mezey E., Toth Z.E., Cortright D.N., Azrubi M.K., Krause J.E., Elde R. Distribution of mRNA for vanilloid receptor subtype 1 (VR1), and VRl-like immunoreactivity, in the central nervous system of the rat and human // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97, N 7. P. 36553660.

179. Caterina M.J., Leffler A., Malmberg A.B., Martin W.J., Trafton J., Petersen-Zeitz K.R., Koltzenburg M., Basbaum A.I., Julius D. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor // Science. 2000. V. 288, N 4564. P. 306-313.

180. Alawi K., Keeble J. The paradoxical role of the transient receptor potential vanilloid 1 receptor in inflammation // Pharmacol. Ther. 2010. V. 125, N 2. P. 181-195.

181. Fernández-Ballester G., Ferrer-Montiel A. Molecular modeling of the full-length human TRPV1 channel in closed and desensitized states // J. Membr. Biol. 2008. V. 223, N 3. P. 161-172.

182. Tominaga M., Tominaga T. Structure and function of TRPV1 // Pflugers Arch. 2005. V. 451, N 1. P. 143-150.

183. Jung J., Lee S.Y., Hwang S.W., Cho H., Shin J., Kang Y.S., et al. Agonist recognition sites in the cytosolic tails of vanilloid receptor 1 // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, N 46. P. 44448^14454.

184. Nakagawa H., Iliura A. Capsaicin, transient receptor potential (TRP) protein subfamilies and the particular relationship between capsaicin receptors and small primary sensory neurons // Anat. Sci. Int. 2006. V. 81, N 3. P. 135-155.

185. García-Sanz N., Fernández-Carvajal A., Morenilla-Palao C., Planells-Cases R., Fajardo-Sánchez E., Fernández-Ballester G., et al. Identification of a tetramerization domain in the C terminus of the vanilloid receptor // J. Neurosci. 2004. V. 24, N 23. P. 5307-5314.

186. Caterina M.J., Schumacher M.A., Tominaga M., Rosen T.A., Levine J.D., Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway // Nature. 1997. V. 389, N 6653. P. 816-824.

187. Liao M., Cao E., Julius D., Cheng Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy //Nature. 2013. V. 504, N 7478. P. 107-112.

188. Koplas P.A., Rosenberg R.L., Oxford G.S. The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons // J. Neurosci. 1997. V. 17, N 10. P. 35253537.

189. Rosenbaum T., Gordon-Shaag A., Munari M., Gordon S.E. Ca2+/calmodulin modulates TRPVI activation by capsaicin // J. Gen. Physiol. 2004. V. 123, N 1. P. 53-62.

190. Numazaki M., Tominaga T., Takeuchi K., Murayama N., Toyooka H., Tominaga M. Structural determinant of TRPV1 desensitization interacts with calmodulin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100, N 13. P. 8002-8006.

191. Prescott E.D., Julius D. A modular PIP2 binding site as a determinant of capsaicin receptor sensitivity // Science. 2003. V. 300, N 5623. P. 1284-1288.

192. Bhave G., Zhu W., Wang H., Brasier D.J., Oxford G.S., Gereau R.W. cAMP-dependentprotein kinase regulates desensitization of the capsaicin receptor (VR1) by direct phosphorylation //Neuron. 2002. V. 35,N4. P. 721-731.

193. Mohapatra D.P., Nau C. Desensitization of capsaicin-activated currents in the vanilloid receptor TRPV1 is decreased by the cyclic AMP-dependent protein kinase pathway // J. Biol. Chem. 2003. V. 278, N 50. P. 50080-50090.

194. Jordt S.E., Julius D. Molecular basis for species-specific sensitivity to "hot" chili peppers // Cell. 2002. V. 108, N 3. P. 421^30.

195. Gawa N.R., Klionsky L., Qu Y., Shi L., Tamir R., Edenson S., Zhang T.J., Viswanadhan V.N., Toth A., Pearce L.V., Vanderah T.W., Porreca F., Blumberg P.M., Lile J., Sun Y., Wild K., Louis J.C., Treanor J.J. Molecular determinants of vanilloid sensitivity in TRPV1 // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, N 19. P. 20283-20295.

196. Chou M.Z., Mtui Т., Gao Y.D., Kohler M., Middleton R.E. Rcsiniferatoxin binds to the capsaicin receptor (TRPV1) near the extracellular side of the S4 transmembrane domain // Biochemistry. 2004. V. 43, N 9. P. 2501-2511.

197. Jordt S.E., Tominaga M., Julius D. Acid potentiation of the capsaicin receptor determined by a key extracellular site // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97, N 14. P. 8134-8139.

198. Yao J., Liu В., Qin F. Modular thermal sensors in temperature-gated transient receptor potential (TRP) channels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108, N 27. P. 11109-11114.

199. Brauchi S., Orta G., Mascayano C., Salazar M., Raddatz N., Urbina H., Rosenmann E., Gonzalez-Nilo F., Latorre R. Dissection of the components for PIP2 activation and thermosensation in TRP channels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104, N 24. P. 10246-10251.

200. Szallasi A., Cortright D.N., Blum C.A., Eid S.R. The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept //Nat. Rev. Drug Discov. 2007. V. 6, N 5. P. 357-372.

201. Wong G.Y., Gawa N.R. Therapeutic potential of vanilloid receptor TRPV1 agonists and antagonists as analgesics: recent advances and setbacks // Brain Res. Rev. 2009. V. 60, N 1. P. 267277.

202. Lazar J., Gharat L., Khairathkar-Joshi N., Blumberg P.M., Szallasi A. Screening TRPV1 antagonists for the treatment of pain: lessons learned over a decade // Expert. Opin. Drug Discov. 2009. V. 4, N2. P. 159-180.

203. Immke D.C., Gawa N.R. The TRPV1 receptor and nociception // Semin. Cell Dev. Biol. 2006. V. 17, N5. P. 582-591.

204. Gunthorpe M.J., Chizh B.A. Clinical development of TRPV1 antagonists: targeting a pivotal point in the pain pathway // Drug Discov. Today. 2009. V. 14, N 1-2. P. 56-67.

205. Пат. 2368621, Российская Федерация, МПК С07К14/435. Полипептид актинии, обладающий анальгетическим действием / Козлов С.А., Андреев Я.А., Кошелев С.Г., Иванова Е.А., Лейченко Е.В., Козловская Э.П., Гришин Е.В. ; заявитель и патентообладатель Учреждение РАН Ин-т биоорган, химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. -№ 2008112846/13 ; заявл. 04.04.08 ; опубл. 27.09.09, Бюл. № 27. 15 с.

206. Пат. А, Российская Федерация, МПК С07К14/435. Способ получения полипептида, обладающего анальгетическим действием / Монастырная М.М., Чаусова В.Е., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Козловская Э.П. ; заявитель и патентообладатель Учреждение РАН Тихоокеан. ин-т биоорган, химии ДВО РАН. - № 2009144398 ; заявл. 30.11.09 ; опубл. 10.04.11, Бюл. № 10. 9 с.

207. Mebs D., Liebrich М., Reul A., Samejima Y. Hemolysins and proteinase inhibitors from sea anemones of the Gulf of Aqaba // Toxicon. 1983. V. 21, N 2. P. 257-264.

208. Зыкова Т.А. Исследование первичной структуры биологически активных пептидов актинии Radianthus macrodaclylns : дис. ... канд. хим. наук. Владивосток. 1987. 130 с.

209. Зыкова Т.А., Монастырная М.М., Апаликова О.В., Щвец Т.В., Козловская Э.П. Низкомолекулярные цитолизины и ингибиторы трипсина из актинии Radianthus macrodac-tylus. Выделение и частичная характеристика // Биоорган, химия. 1998. Т. 24, № 7. С. 509-516.

210. Монастырная М.М., Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Выделение и характеристика высокомолекулярных цитолизинов морской актинии Radianthus macrodactylus II Биоорган, химия. 1998. Т. 25, № 10. С. 733-741.

211. Arnold К., Bordoli L., Корр J., Schwede Т. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling // Bioinformatics. 2006. V. 22, N 2. P. 195201.

212. Bordoli L., Kiefer F., Arnold K., Benkert P., Battey J., Schwede T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace //Nat. Protoc. 2009. V. 4, N 1. P. 1-13.

213. Webb В., Sali A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER // Curr. Protoc. Bioinformatics. 2014. Suppl. 47. P. 5.6.1-5.6.32.

214. Guex N., Peitsch M.C., Schwede T. Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer: a historical perspective // Electrophoresis. 2009. V. 30, suppl. l.P. S162-S173.

215. Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S., Thornton J.M. PROCIIECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures // J. Appl. Crystallogr. 1993. V. 26. P. 283291.

216. García-Fernández R., Pons Т., Meyer A., Perbandt M., González-González Y., Gil D., de los Angeles Chávez M., Betzel C., Redecke L. Structure of the recombinant BPTI/Kunitz-type inhibitor rShPI-1 A from the marine invertebrate Stichodactyla helianthus // Acta Crystallogr. F-Struct. Biol. Cryst. Commun. 2012. V. 68, N 11. P. 1289-1293.

217. Richter S., Wenzel A., Stein M., Gabdoulline R. R., Wade R.C. webPIPSA: a web server for the comparison of protein interaction properties //Nucleic Acid Res. 2008. V. 36. P. 276-280.

218. Зелепуга E.A., Табакмахер B.M., Чаусова B.E., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. Взаимодействие полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1: in silico исследование // Биоорган, химия. 2012. Т. 38, №2. С. 185-198.

219. Wade R.C., Gabdoulline R.R., De Rienzo F. Protein interaction property similarity analysis // Int. J. Quantum Chem. 2001. V. 83, N 3-4. P. 122-127.

220. Kozakov D., Brenke R., Comeau S.R., Vajda S. PIPER: An FFT-based protein docking program with pairwise potentials // Proteins. 2006. V. 65, N 2. P. 392—406.

221. Comeau S.R., Gatchell D.W., Vajda S., Camacho C.J. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes // Bioinformatics. 2004. V. 20, N 1. P. 45-50.

222. Comeau S.R., Gatchell D.W., Vajda S., Camacho C.J. ClusPro: a fully automated algorithm for protein-protein docking // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 96-99.

223. Kozakov D., Beglov D., Bohnuud Т., Mottarella S.E., Xia В., Hall D.R., Vajda S. How good is automated protein docking?//Proteins. 2013. V. 81, N 12. P. 2159-2166.

224. Vajda S., Sippl M., Novotny J. Empirical potentials and functions for protein folding and binding // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. V. 7, N 2. P. 222-228.

225. Larsen T.A., Olson A.J., Goodsell D.S. Morphology of protein-protein interfaces // Structure. 1998. V. 6, N 4. P. 421-427.

226. Carugo O., Argos P. Protein-protein crystal-packing contacts // Protein Sci. 1997. V. 6, N 10. P. 2261-2263.

227. Janin J. Specific versus non-specific contacts in protein crystals //Nat. Struct. Biol. 1997. V. 4,N 10. P. 973-974.

228. Reynolds C., Damerell D., Jones S. ProtorP: a protein-protein interaction analysis server // Bioinformatics. 2009. V 25, N 3. P. 413-414.

229. Janin J., Bahadur R.P., Chakrabarti P. Protein-protein interaction and quaternary structure // Q. Rev. Biophys. 2008. V. 41, N 2. P. 133-180.

230. Табакмахер В. M., Гладких И. Н., Монастыриая М. М., Зелепуга Е. А. Теоретические пространственные модели молекулярного комплекса полипептида IICGS-2,23 из актинии Iieteractis crispa с трипсином // «Актуальные проблемы биологии, химии, физики»: материалы междунар. заочн. науч.-практ. конф. (27 дек. 2011 г.). Новосибирск : Изд. «ЭКОР-книга». 2011. С. 107-114.

231. Kastritis P. L., Bonvin А. М. Are scoring functionsin protein-protein docking ready to predict interactomes? Clues from a novel binding affinity benchmark // J. Proteome Res. 2010. V. 9, N5. P. 2216-2225.

232. Henrich S., Richter S., Wade R.C. On the use of PIPSA to guide target-selective drug design // ChemMedChem. 2008. V. 3, N 3. P. 413-417.

233. Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem. J. 2004. V. 378, N 3. P. 705-716.

234. Bode W., Huger R. Structural basis of the endoproteinase-protein inhibitor interaction // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1477, N 1-2. P. 241-252.

235. Roussel A., Mathieu M., Dobbs A., et. al. Complexation of two proteic insect inhibitors to the active site of chymotrypsin suggests decoupled roles for binding and selectivity // J. Biol. Chem. 2001. V. 276, N.42. P. 38893-38898.

236. Farady C.J., Craik C.S. Mechanisms of macromolecular protease inhibitors // ChemBioChem. 2010. V. 11,N 17. P. 2341-2346.

237. Аверьянов A.B. Роль нейтрофильной эластазы в патогенезе хронической обструктивной болезни легких // Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 4. С. 3-8.

238. Shapiro S.D. Proteinases in chronic obstructive pulmonary disease // Biochem. Soc. Trans. 2004. V. 30, N2. P. 98-102.

239. Koizumi M., Fujino A., Fukushima K., Kamimura Т., Takimoto-Kamimura M. Complex of human neutrophil elastase with 1/2SLPI // J. Synchrot. Radiat. 2008. V. 15, N 3. P. 308-311.

240. Zani M.L., vin Baranger K., Guyot N., Dallet-Choisy S., Moreau T. Protease inhibitors derived from elafin and SLPI and engineered to have ehanced specificity towards neutrophil serine proteases // Protein Sci. 2009. V. 18, N 3. P. 579-594.

241. Jones S., Thornton J.M. Principles of protein-protein interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93, N 1. P. 13-20.

242. Xu D., Tsai C.J., Nissinov R. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces // Protein Eng. 1997. V. 10, N 1. P. 999-1012.

243. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson II.J., Nissinov R. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of hydrophobic effect//Protein Sci. 1997. V. 6, N 1. P. 53-64.

244. Tsai C.J., Nissinov R. Hydrophobic folding units at protein-protein interfaces: Implications to protein folding and to protein-protein association // Protein Sci. 1997. V. 6, N 7. P. 1426-1437.

245. Braden B.C., Poljak R.J. Structure and energetics of anti-lysozyme antibodies // Proteinprotein recognition / Kleanthous C. ed. : New York : Oxford Univ. Press. 2000. P. 126-161.

246. Gong S., Yoon G., Insoo J., Bolser D., Dafas P., Schroeder M., Choi H., Cho Y., Han K., Lee S., Choi II., Oh D., Lappe M., Holm L., Kim S., Bhak J. PSIbase: the Database of the protein structural interactome MAP // Bioinformatics. 2005. V. 21, N 10. P. 2541-2543.

247. Winter C., Henschel A., Kim W.K., Schroeder M. SCOPPI: a structural classification of protein-protein interfaces //Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 310-314.

248. Deval E., Noel J., Lay N., Alloui A., Diochot S., Friend V., Jodar M., Lazdunski M., Lingueglia E. ASIC3, a sensor of acidic and primary inflammatory pain // EMBO J. 2008. V. 27, N 22. P. 3047-3055.

249. Lazar J., Braun D.C., Toth A., Wang Y., Pearce L.V., Pavlyukovets V.A., Blumberg P.M., Garfield S.IL, Wincovitch S., Choi H.K., Lee J. Kinetics of penetration influence the apparent potency of vanilloids on TRPV1 //Mol. Pharmacol. 2006. V. 69, N 4. P. 1166-1173.

250. Duhovny D., Nussinov R., Wolfson H.J. Efficient unbound docking of rigid molecules : Algorithms in bioinformatics : second international workshop, Rome, Italy, Sept. 17-21, 2002 // Proceedings. 2002 . P. 185-200.

251. Schneidman-Duhovny D., Inbar Y., Nussinov R., Wolfson H.J. PatchDock and SymmDock: servers for rigid and symmetric docking //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 363-367.

252. Andrusier N., Nussinov R., Wolfson II.J. FireDock: Fast interaction refinement in molecular docking // Proteins. 2007. V. 69, N 1. P. 139-159.

253. Mashiach E., Schneidman-Duhovny D., Andrusier N., Nussinov R., Wolfson II.J. FireDock: a web server for fast interaction refinement in molecular docking //Nucleic Acids Res. 2008. V. 36.

P. 229-232.

254. Зелепуга E.A., Пономарева Р.Б., Коликов B.M., Паутов В.Д., Шевелева Т.В., Медведев M.JL, Третьяк Т.М., Терпеловская О.Н. Конъюгаты панкреатической рибонуклеазы с безлигандным сывороточным альбумином человека // Биомед. химия. 2003. Т. 49, № 6. С. 588-596.

255. Терпеловская О.Н., Зелепуга Е.А., Пономарева Р.Б., Третьяк Т.М. Проникновение панкреатической РНКазы через гематоэнцефалический барьер в паренхиму головного мозга // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39, № 5. С. 41-43.

256. Lange A., Giller К., Ilornig S., Martin-Eauclaire M.F., Pongs О., Becker S., Baldus M. Toxin-induced conformational changes in a potassium channel revealed by solid-state NMR // Nature. 2006. V. 440, N 7086. P. 959-962.

257. Ellis C., Smith A. Highlighting the pitfalls and possibilities of drug research // Nat. Rev. Drug. Discov. 2004. V. 3, N 3. P. 238-278.

258. Rosenbaum Т., Simon S.A. TRPV1 receptors and signal transduction // TRP ion channel function in sensory transduction and cellular signaling cascades / Eds: Heller S., Liedtke W. B. Boca Raton : CRC Press. 2007. P. 69-84.

259. Zelepuga E., Tabakmakher V., Monastyrnaya M. et al. In silico investigation of interaction between human neutrophil elastase and sea anemone Heteractis crispa Kunitz polypeptide // Proceedings of the 5th International conference on bioinformatics and biomedical engineering (ICBBE 2011), Wuhan, China, May 10-12, 2011. Wuhan. 2011. P. 1-4.

260. Tabakmakher V., Zelepuga E., Monastyrnaya M., Kozlovskaya E. How does Heteractis crispa Kunitz polypeptides suppress inflammation? // 9th 1ST Asia Pacific meeting on Animal, Plant and Microbial Toxins, Vladivostok, Russia, Sept. 4-8, 2011: abstrs. Vladivostok. 2011. P. 24.

261. Монастырная M.M., Лейченко E.B., Гладких И.Н., Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Синцова О.В., Калина Р.С., Кветкина А.Н., Козловская Э.П. Полипептиды актиний, их взаимодействие с биологическими мишенями // Вестн. ДВО РАН. 2014. № 1. С. 103-119.

262. Табакмахер В.М., Зслепуга Е.А., Гладких И.Н., Синцова О.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Анальгстические полипептиды Кунитц-типа актинии Heteracíis crispa: прогнозирование и получение новых представителей методами генной инженерии // Всероссийская молодежная конференция «Взгляд в будущее», Владивосток, 7—14 нояб. 2013 г. : сб. работ. Владивосток. 2013. С. 52-65.

263. Иванов A.C., Згода А.И., Арчаков В.Г. Технологии белковой интерактомики // Биоорган, химия. 2011. Т. 37, № 1. С. 8-21.

264. Kane J.F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli II Curr. Opin. Biotechnol. 1995 V. 6, N 5. P. 494-500.

265. Табакмахер B.M., Синцова O.B. Создание генетической экспрессионной конструкции для получения нового полипептида Кунитц-типа актинии Heteracíis crispa II Вестн. ДВО РАН. 2014. №5. С. 139-142.

266. Табакмахер В.М., Синцова О.В., Терентьева A.A. Получение новых биологически активных полипептидов структурного семейства Кунитца методами генной инженерии // XV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток 5-15 сентября 2014 г.: сб. тр. Владивосток : ДВО РАН. 2014. С. 45.

267. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М. : Мир, 1982. Т. 2. С. 500-508.

268. Сокотун И.Н., Гнеденко О.В., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Мольнар A.A., Иванов A.C. Исследование взаимодействия ингибитора трипсина из актинии Radianthus macrodactylus с различными протеиназами // Биомед. химия. 2006. Т. 52, №. 6. С. 595-600.

269. Андреев Я.А., Козлов С.А., Козловская Э.П., Гришин Е.В. Анальгетическое действие пептидного ингибитора TRPV1 рецептора в моделях тепловой стимуляции боли // Докл. АН. 2009. Т. 424, № 5. С. 688-691.

270. Andreev Y.A., Kozlov S.A., Korolkova Y.V., Dyachenko I.A., Bondarenko D.A., Skobtsov

D.I., Murashev A.N., Kotova P.D., Rogachevskaja O.A., Kabanova N.V., Kolesnikov S.S., Grishin

E.V. Polypeptide modulators of TRPV1 produce analgesia without hyperthermia // Mar. Drugs. 2013. V. 11, N 12. P. 5100-5115.

271. Терентьева A.A., Синцова О.В., Схабюк В.П., Табакмахер В.М. Исследование анальгетической активности рекомбинантных полипептидов Кунитц-типа актинии Heteracíis crispa II XV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток 5-15 сент. 2014 г. : сб. тр. Владивосток : ДВО РАН. 2014. С. 49.

272. Lowry O.H., Rosebrrough N.J., Fearr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. V. 193, N 1. P. 265-275.

273. Kassell B. Bovine trypsin-kallikrein inhibitor (Kunitz inhibitor, basic pancreatic trypsin inhibitor, polyvalent inhibitor from bovin organs) // Methods Enzymol. / L. Lorand. ed. New York, San Francisco, London : Acad. Press, 1970. V. 19. P. 844-852.

274. Li H., Robertson A.D., Jensen J.H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values // Proteins. 2005. V. 61, N 4. P. 704-721.

275. Bas D.C., Rogers D.M., Jensen J.H. Very fast prediction and rationalization of pKa values for protein-ligand complexes // Proteins. 2008 V. 73, N 3. P. 765-783.

276. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227, N 5259. P. 680-685.