Структурно-функциональные исследования рекомбинантной формиатдегидрогеназы из метилотрофных дрожжей и бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Зарубина, София Александровна

• Зарубина, София Александровна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Зарубина, София Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................5

I. ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................6

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................8

2.1. Общие сведения о формиатдегидрогеназе..........................................................8

2.2. Физиологическая роль формиатдегидрогеназ.....................................................9

2.3. Клонирование гена формиатдегидрогеназ........................................................11

2.4. Анализ структуры формиатдегидрогеназы.......................................................12

2.4.1. Анализ аминокислотной последовательности...............................................12

2.4.2. Пространственная структура...........................................................................14

2.5. Основные свойства формиатдегидрогеназ........................................................17

2.5.1. Каталитические свойства.................................................................................17

2.5.2. Температурная стабильность...........................................................................20

2.6. Изменение свойств ферментов методами белковой инженерии.....................21

2.6.1. Увеличение температурной стабильности.....................................................22

2.6.2. Увеличение химической стабильности...........................................................25

2.6.3. Изменение коферментной специфичности.....................................................28

2.7. Применение формиатдегидрогеназ в биотехнологии......................................32

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................36

3.1. Материалы............................................................................................................36

3.2. Методы исследования..........................................................................................37

3.2.1. Клонирование гена ОраББИ............................................................................37

3.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле..............................................................37

3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля..........................................38

3.2.4. Рестрикция фрагментов ДНК...........................................................................38

3.2.5. Лигирование......................................................................................................38

3.2.6. Трансформация клеток Е.еоН...........................................................................39

3.2.7. Выделение плазмидной ДНК...........................................................................40

3.2.8. Секвенирование ДНК.......................................................................................40

3.2.9. Экспрессия OpaFDH и ее мутантных форм в клетках Е.еоН........................41

3.2.10. Выделение и очистка ОраББИ......................................................................42

3.2.11. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях...............................43

3.2.12. Определение активности фермента...............................................................44

3.2.13. Определение констант Михаэлиса................................................................44

3.2.14. Определение каталитических констант методом Бредфорд.......................45

3.2.15. Определение констант ингибирования.........................................................45

3.2.16. Определение активности фермента при различных температурах............45

3.2.17. Определение констант скорости термоинактивации..................................45

3.2.18. Определение активационных параметров процесса термоинактивации фермента ...................................................................................................................... 46

3.2.19. Изучение термостабильности с помощью ДСК...........................................46

3.2.20. Изоэлектрофоркусирование...........................................................................47

3.2.21. Изучение химической стабильности.............................................................48

3.2.22. Моделирование трехмерной структуры ОраББИ........................................48

3.2.23. Получение кристаллов и определение трехмерной структуры..................49

3.2.24. Направленный мутагенез ОраББИ................................................................49

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............................................................51

4.1. Клонирование гена формиатдегидрогеназы из дрожжей Ogataea рагаро1ушогрка.....................................................................................................51

4.1.1. Поиск аминокислотных последовательностей, выравнивание и конструирование праймеров......................................................................................51

4.1.2. Создание генно-инженерной конструкции....................................................59

4.2. Экспрессия рекомбинантной ОраББИ...............................................................61

4.3. Выделение и очистка ОраББИ............................................................................62

4.4. Основные свойства рекомбинантной ОраББИ.................................................66

4.4.1. Кинетические параметры.................................................................................66

4.4.2. Зависимость активности ОраББИ от температуры.......................................67

4.4.3. Влияние рИ на константу Михаэлиса.............................................................69

4.4.4. Определение каталитической константы ОраББИ методом Бредфорд......71

4.4.5. Ингибирование ОраББИ неорганическими ионами......................................71

4.4.6. Изоэлектрофокусирование ОраББИ...............................................................74

4.5. Температурная стабильность ОраББИ..............................................................75

4.5.1. Стабильность ОраББИ при повышенных температурах..............................75

4.5.2. Определение активационных параметров процесса термоинактивации .... 79

4.5.3. Влияние pH и ионной силы на термоинактивацию ОраББИ.......................82

4.5.4 Изучение термостабильности OpaFDH с помощью ДСК..............................85

4.6. Моделирование и кристаллизация OpaFDH и определение структуры апо- и холо-форм..............................................................................................................87

4.7. Белковая инженерия OpaFDH и PseFDH...........................................................91

4.7.1. Увеличение температурной стабильности OpaFDH (мутагенез поверхностного остатка в полуконсервативной последовательности XPQP)......91

4.7.2. Увеличение химической стабильности OpaFDH.........................................100

4.7.3. Изменение коферментной специфичности OpaFDH и PseFDH.................110

V. ВЫВОДЫ...........................................................................................................122

VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................123

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

FDH - формиатдегидрогеназа

FDHs - формиатдегидрогеназы

OpaFDH - формиатдегидрогеназа из дрожжей Ogataea parapolymorpha

CboFDH - формиатдегидрогеназа из дрожжей Candida boidinii

SceFDH - формиатдегидрогеназа из дрожжей Saccharomyces cerevisiae

PseFDH - формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp.101

SauFDH - формиатдегидрогеназа из бактерий Staphylococcus aureus

BstFDH - формиатдегидрогеназа из бактерий Burkholderia stabilis

SoyFDH - формиатдегидрогеназа из растения сои Glycine max

AthFDH - формиатдегидрогеназа из растения Arabidopsis thaliana

NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид, окисленный

NADH - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленный

NADP+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, окисленный

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат, восстановленный

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РСА - рентгеноструктурный анализ

ЯМР -ядерный магнитный резонанс

ТАК - теория активированного комплекса

AS - сульфат аммония

dNTP - дезоксирибонуклеотид трифосфат

ATФ - аденозинтрифосфорная кислота

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин

Трис - трис(оксиметил)аминометан

ЭДТА - этилендиаминотетраацетат

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные исследования рекомбинантной формиатдегидрогеназы из метилотрофных дрожжей и бактерий»

I. ВВЕДЕНИЕ

Формиатдегидрогеназа (FDH) катализирует реакцию восстановления кофермента NAD(P)+ до NAD(P)H. Этот фермент найден как в прокариотических, так и эукариотических организмах (растениях, дрожжах и микроскопических грибах), где играет важную физиологическую роль в обеспечении клетки энергией [1,2].

С фундаментальной точки зрения FDH интересна как модельный фермент для изучения механизма переноса гидрид-иона в активном центре дегидрогеназ. В биотехнологическом процессе фермент используется, главным образом, при синтезе оптически активных соединений в качестве биокатализатора для регенерации кофермента NADH или NADPH. Преимуществами FDH являются: практически полная необратимость реакции за счет образования летучего соединения CO2, который не загрязняет целевой продукт, невысокая стоимость субстрата а также широкий pH оптимум работы фермента [1]. Известно, что самый крупномасштабный процесс хирального синтеза (синтез L-трет-лейцина, реализован фирмой Evonic (Degussa)) с применением очищенных ферментов проводится с использованием формиатдегидрогеназы из дрожжей Candida boidinii (CboFDH).

В нашей лаборатории в течение многих лет изучаются

формиатдегидрогеназы из различных источников. Было показано, что FDHs из

эукариот являются биокатализаторами с хорошим потенциалом для применения на

практике, поскольку они обладают низкими значениями константы Михаэлиса по

обоим субстратам. Так, в настоящее время широко используется CboFDH в

различных биотехнологических процессах, однако, рекомбинантный фермент

дикого типа имеет довольно высокие значения констант Михаэлиса по NAD+ и

формиат-иону по сравнению с другими эукариотическими FDHs, а также

невысокую стабильность по сравнению с бактериальными FDHs. В связи с этим

были проведены работы по белковой инженерии CboFDH, в результате которых

были улучшены свойства фермента [3,4]. Однако проблема высоких значений

констант Михаэлиса, так и не была решена. В настоящее время проводятся работы

по поиску ферментов с оптимальными свойствами из различных живых

организмов. Наше внимание привлекла NAD+^ависимая FDH из метилотрофных

6

термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha (OpaFDH), которая до настоящего момента не была подробно изучена. Поскольку источником является термотолерантный микроорганизм, можно было полагать, что фермент изначально будет обладать высокой температурной стабильностью. Геном O. parapolymorpha полностью отсеквенирован. В настоящее время этот организм является модельным. Первая попытка изучения OpaFDH была предпринята в 2014 году Yu S. и соавторами [5]. Ключевой особенностью этого гена являлось добавление участка, кодирующего 6 аминокислотных остатков гистидина на C-конце фермента. Известно, что данный подход значительно облегчает очистку препарата, однако, изменение последовательности С-конца гена, который участвует в формировании кофермент-связывающего участка активного центра, может существенно влиять на кинетические параметры фермента. Поэтому в настоящей работе была получена и подробно изучена рекомбинантная OpaFDH с немодифицированным C-концом.

С точки зрения фундаментальной науки, интересным является изучение взаимосвязи между структурой и функцией фермента, что было реализовано в рамках данной работы благодаря методам рационального дизайна, направленного мутагенеза, а также с помощью определения его трехмерной структуры.

Целью диссертационной работы было изучение взаимосвязи структура-функция рекомбинантных формиатдегидрогеназ из метилотрофных дрожжей и бактерий.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: клонирование гена OpaFDH, его экспрессия в клетках E.coli и получение рекомбинантной OpaFDH высокой степени чистоты; изучение кинетических параметров, температурной и химической стабильности рекомбинантной OpaFDH; структурные исследования - получение кристаллов и решение трехмерной структуры апо- и холо-форм OpaFDH; белковая инженерия рекомбинантной OpaFDH с целью увеличения температурной и химической стабильности фермента; инженерия коферментной специфичности с NAD+ к NADP+ OpaFDH и формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp. 101 (PseFDH) методом рационального дизайна.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Общие сведения о формиатдегидрогеназе

NAD(P)+-зависимая формиатдегидрогеназа (ЕС 1.2.1.2, FDH) катализирует реакцию восстановлении кофермента NAD(P)+ до NAD(P)H [1]:

HCOO- + NAD(P)+ ^ NAD(P)H + СО2.

Исходя из структуры, FDHs можно разделить на две группы. К первой группе относятся ферменты, представляющие собой гомодимеры без простетических групп. Такие FDHs относятся к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-оксикислот [6]. На примере этого фермента был изучен механизм катализа с участием № иона, который осуществлялся путем его переноса с субстрата на никотинамидное кольцо кофермента, в активном центре дегидрогеназ [7]. Именно FDHs из первой группы рассмотрены в данной работе.

Формиатдегидрогеназы второй группы являются гетероолигомерами и содержат простетические группы (ионы Mo, W, молибдопротеин гуанин динуклеотид кофактор и Fe-S кластеры) [8-11]. Часто такие белки являются мембранными с большой молекулярной массой и сложной четвертичной структурой (PDB 1KQG) [12]. Такие FDHs найдены в анаэробных

микроорганизмах и археях. На данный момент ферменты из этой группы начинают использовать для фиксации CO2, поскольку они способны катализировать обратную реакцию [13-16].

FDH найдена как в прокариотических, так и эукариотических (дрожжах, микроскопических грибах и растениях) организмах, где играет важную физиологическую роль в обеспечении клетки энергией. Известно, что большинство природных FDHs специфичны к коферменту NAD+, и только в последнее время были найдены три бактериальных источника, FDHs из которых обладают юолее высокой специфичностью именно к NADP+ [17-19].

За длинную историю изучения формиатдегидрогеназы было показано, что среди всего разнообразия NAD+-специфичные FDHs из растений демонстрируют самые высокие значения каталитической эффективности (отношение £ca//Kм) по

NAБ+ и формиат-иону, бактериальные FБИs проявляют самую высокую температурную стабильность.

В биотехнологии этот фермент используется в качестве биокатализатора для регенерации кофермента NADH или NADPH при синтезе оптически активных соединений. Преимуществами FDH являются практически полная необратимость реакции за счет образования летучего соединения СО2, который не загрязняет целевой продукт, невысокая стоимость субстрата (формиат-иона), а также широкий рН оптимум работы фермента. Таким образом, формиатдегидрогеназа соответствует всем требованиям, предъявляемым к биокатализатору, осуществляющему реакцию регенерации кофермента.

2.2. Физиологическая роль формиатдегидрогеназ

ББИ катализирует восстановление кофермента NAБ(P)H. Данная молекула является универсальным источником энергии в живых системах, поэтому ББИ способна снабжать организм энергией за счет своей реакции в клетке. Особо стоит отметить метилотрофные бактерии и дрожжи, в которых FDH катализирует последнюю стадию процесса окисления метанола до углекислого газа, которая позволяет получить до трех молекул NADH (рис. 2.1). Стоит отметить, что бактерии способны проводить окисление СИ3ОИ до СО2 двумя путями: с помощью дегидрогеназного пути с участием ББИ, которая катализирует последнюю стадию, и с помощью рибулозомонофосфатного цикла - без использования ББИ [7]. Дрожжи в свою очередь используют только дегидрогеназный путь. Регуляция данного процесса осуществляется за счет изменения числа молекул NAБH внутри клетки. Их недостаток приводит к активации ББИ, которая окисляет формиат-ион до СО2, обеспечивая клетку энергией [22, 23].

Рис. 2.1. Путь метаболизма метанола в метилотрофных дрожжах [20].

В более сложных организмах, таких как высшие растения, изучение белкового состава митохондрий показало наличие ББИ [15]. В работах [17-19] было показано, что при неблагоприятных воздействиях, таких как засуха, резкие перепады температур, недостаточный доступ воздуха, экспрессия формиатдегидрогеназы резко возрастает. Вероятно, в условиях стресса растительной клетке необходимо больше молекул NADH, которые впоследствии идут на синтез АТФ [21]. В патогенных бактериях содержание этого фермента значительно повышается при переходе в биопленки, например, уровень мРНК ЗаиББИ в биопленках может занимать третье место [11]. Таким образом, для растений и патогенных организмов формиатдегидрогеназа является ферментом стресса — его уровень экспрессии значительно возрастает при неблагоприятных условиях [8-10].

2.3. Клонирование гена формиатдегидрогеназ

На настоящий момент проведено клонирование 25 генов формиатдегидрогеназы. В 1993 году был клонирован ген бактериальной метилотрофной FDH из Pseudomonas sp. 101 [21]. Позже были клонированы NAD+-специфичные FDHs из бактериальных (Methanobacterium formicicum [22], Moraxella sp.C-1 [23], Mycobacterium vaccae N10 [24], Paracoccus sp. 12-A [25], Ancylobacter aquaticus [26], Staphylococcus aureus, Bacillus sp.F1 [27], Thiobacillus sp. KNK65MA [28]), растительных (Glycine max (soya) [2], Arabidopsis thaliana [29], Lotus japonicus [30]), грибных (Ceriporiopsis subvermispora [31], Neurospora cracca [32]) и дрожжевых источников (Candida methylica [33], Candida boidinii [34], Saccharomyces cerevisiae [35], Pichiapastoris [36]).

В 2014 году китайскими исследователями был получен синтетический ген FDH из термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha [5]. Ключевой особенностью этого гена являлось добавление участка, кодирующего 6 аминокислотных остатков гистидина на C-конце фермента (далее His-OpaFDH). Известно, что данный подход значительно облегчает очистку препарата, однако, изменение последовательности С-конца гена, который участвует в формировании кофермент-связывающего участка активного центра, может существенно влиять на кинетические параметры фермента.

В 2016 году была клонирована растительная формиатдегилрогеназа из риса Vigna umbellate, стабильная при низких значениях pH [37]. В 2018 году были клонированы NAD+^ависимая Мо-содержащая FDH из Clostridium ljungdahlii [38] и термотолерантного хлопчатника Gossypium hirsutum L. [39].

Отдельно стоит отметить природные NADP+-специфичные формиатдегидрогеназы, которые были найдены лишь в последнее время. Так, были клонированы бактериальные FDHs из Burkholderia stabilis (BstFDH) [17], Granulicella mallensis MP5ACTX8 [40] и Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 [19] в 2010, 2015 и 2018 году, соответственно.

Таким образом, полученная база данных генов FDHs позволяет проводить систематические исследования ферментов из различных источников, проводить сравнительный анализ свойств, упорядочить полученные данные, проанализировать общие особенности последовательностей FDHs, адекватно

11

выбирать аминокислотные остатки для получения мутантных формиатдегидрогеназ с измененными свойствами, а также получать мутантные формы ферментов с помощью методов генетической инженерии.

2.4. Анализ структуры формиатдегидрогеназы

2.4.1. Анализ аминокислотной последовательности

На сегодняшний день последовательности генов FDH найдены более чем в 200 источниках, нуклеотидные последовательности которых находятся в базах данных GenBank ^В), EMBL, UniProt и KEGG.

На рисунке 2.2 приведено выравнивание аминокислотных последовательностей основных представителей FDHs из бактериальных, дрожжевых и растительных источников. Более подробный анализ будет приведен в разделе 4.1. Опираясь на выравнивание (рис. 2.2), можно отметить, что аминокислотные остатки важные для катализа и связывания субстратов строго консервативны. На рисунке 2.2 приведены остатки, участвующие в катализе, отмеченные знаком #, а именно Pro97, Phe98, Ш122, Asn146, (Ala/Gly)198, Gly200, Gly203, Arg284, Gln313 и His332 (здесь и далее нумерация приведена для PseFDH), а также остатки Cys255, который отвечает за связывание адениновой группы NAD+, и Asp308, карбоксильная группа которого образует водородную связь с амидной группой никотинамидной группы NAD+ [41]. Более того, для FDHs характерны две консервативные последовательности в районе кофермент-связывающего центра GXGXXG и PQP. Так, в случае дрожжевых источников степень гомологии FDH достигает не менее 50%, что свидетельствует о медленной скорости эволюции фермента. Таким образом, FDH является высококонсервативным ферментом.

PseFDH MycFDH

CboFDH SceFDH SoyFDH AthFDH

-------------------------------------------------makvlcvlyddpvdgypktyarddlpkidhypggqtlptp-kaidftp--gqllgsvsgelglrkylesnghtlwts

--------------------------------------------meeepvakcv-mvlypdpvjgyppkyardsipvinsypdgsslptp-skidftp—gellgcvsgalglrkffedgghelvvts

--------------------------------------------------mkivlvlydagkhaadeek-l-------------------------------ygctenklgianwlkdqghelitts

-----------------------------------------------mskgkvllvlyeggkhaeeqek-l-------------------------------lgcienelg irnfieeqgyelvtti

-MLNFTLKMSDPTLAQPHLVKVHTTLETWTTHNHNHRPSINASGEK---kkivgvfykgneya-----------------------------klnp---nfvgcvegalgirewle sqgh q yivtd

-------------MAMRQAAKATIRñCSSSSSSGYFARRQFNASSGD—säkivgvfykaneya-----------------------------tknp---nflgcvenalgirdwlesqghqyivtd

PseFDH MycFDH CboFDH SceFDH SoyFDH AthFDH

PseFDH MycFDH CboFDH SceFDH SoyFDH AthFDH

PseFDH MycFDH CboFDH SceFDH SoyFDH AthFDH

dkdgp-dsvferelvdadwisq dkdgp-dseferelpdadivisq dkege-tseldkhipdadiiitt dkdpeptstvdrelkdaeivitt dkegp-dselekhipdahviist dkegp-dcelekhipdlhvlist * • . . *.

; aV

I ig

w payltperiakaknlklal tag wpayit kerfakarnlklal tag

3SDHVDLQSAID—RNVTVAEVTYcSsISVAEHWMMILSLVRNYLPSHEWARK-3SDHVDLAEAQA—RGVTVAEE TWsSsiSVAEHTVMQilalvrnfvp shqwird-

: aHPAYI TKERLDKAKNLKLVWAGBGSDHIDLDYINQTGKKISVLE VTGSgWSVAEHWMTMLVLVRHFVPAHEQI IN J|FPAYISRNRIAEAPNLKLCVTAgBgSDHVDLEAANE—RKITVTE VTGsSwSVAEHVMAT ILVLIRNYNGGHQQAIN : IhPAYVTAERIKKAKNLELLLTAgBgSDHVDLKAAAA—Ar,T,TVAEVTfi.eS ™hPAYVTAERIKKAKNLKLLLTAG0GSDHIDLQAAAA-

##

AGLTVAEVTGSgVVSVAEDELMRILILMRNFLPGYHQAVN-AGLTVAEVTGSgWSVAEDELMRILILMRNFVPGYNQVVK-

-к -k

GGWNIAD CVS HAYDLEAMHVGTV GGWNI AD С VQRS YD VEGMDVGVIj HDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATll GEWDIAGVAKNEYDLE DKIIS TV GEWNVAGIAHRAYDLEGKTVGTV| GEWNVAGIAYRAYDLEGKTIGTV

■k . . * . * <fe

lavlrrla pf dvh - lh y tdrhrl pe s ve ke lnlt------------whatredmypvcdwtlncplhpetehmindetlklfkrgayivntä

ravle rmk pfgvh - l h y fdvhrl s pe yekqlgvt------------yhpdveslarsvdwsihspliaqthhmfnekllksmrrg3yivnta

YRVLERLL PFN PKE LIY YDYQALPKEAEEKVGAR------------RVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKE LLSKFKKGAWLVNTÄ

yrvlerlvafnpkkllyydyqelpaeainrlneasklfngrgdivqrvekledmvaqsdvvtincplhkdsrglfnkklishmkdgaylvnta

к l llqrlk pfncn-ll y ydrlrmnt d le keigak------------feedldamlpkcdvivinmplteqtrglfdknriakckkgwivnna

klllqrlkpfgch-llyhdrlqmapeleketgak------------fve dlnemlpkcdvivinmpltektrgmfnke ligklkkgvlivnnä

3GKLCDRDAVARALESGRLAGYAG lEETDHKAIVAALESGQLAGYAG

3gaicvaedvaaalesgqlrgygg 3gaicvaedvaeavksgklagygg sgaimdtqaiajacssghvagygg sga i me rqawdave sghiggysg

4:

HvWFP

• VWFP

■ VWFP

■ VWDK

• VWFP

» VWDP

•

ípapkdhp bppppdhp «papkdhp

Spapkdhp Spapkdhp

¡¡papkdhp

wrtmpy---------ngmtp

wrtmpn---------hamtp

wrdmrkky----gagnamt p

wrtmdnkd----hvgnamtv

wrympn---------hamtp

wrympn---------qamtp

: : : : : : :#

jlsgttltaqaryaagtreilecffegr-pirdeylivqggalagtgahsyskgnatggseeaakfkkav

isgsslsaqarycagtreiledwfagr-pirseyliveggkfagtgaksyaq--

¡ysgttldaqtryaegtknilesfftgkfdyrpqdiillngeyvtkaygkhdkk-

isgtslhaqkryaqgvknilnsyfskkfdyrpqdiivqngsyatrayg-qkk--

isgtгidaqlryaagvkdmldrhfkge-dfpeqnyivkegqlasqyr-¡¡jtsgttidaqlryaagtkdmleryfkge-dfptemyivkdgelapqyr-

Рис. 2.2. Сравнение аминокислотных последовательностей FDHs из различных источников. Названия бактериальных ферментов отмечены синим (PseFDH - Pseudomonas sp. 101, MycFDH - Mycobacterium vaccae N10), дрожжевых - фиолетовым (CboFDH -Candida boidinii, SceFDH - Saccharomyces cerevisiae) и растительных - зеленым цветом (SoyFDH - Glycine max (soya), AthFDH -Arabidopsis thaliana). Консервативные остатки отмечены жирным выделением и *, каталитически важные остатки выделены белым цветом на черном фоне и знаком #.

2.4.2. Пространственная структура

К настоящему времени в базе данных PDB накопилось большое количество решенных пространственных структур апо- и холо-форм FDHs из бактериальных (Pseudomonas sp. 101, Moraxella sp. С-1, Granulicella mallensis, Thiobacillus sp. KNK65MA), дрожжевых (Candida boidinii) и растительных (Arabidopsis thaliana) источников. В таблице 2.1 представлен список опубликованных трехмерных структур формиатдегидрогеназ в базе данных PDB.

Таблица 2.1.

Решенные структуры FDHs из различных источников.

Структура Разреш ение Код PDB

FDHs из бактерий

Тройной комплекс РОН-МАО+-азид (холо-форма) [42] 2,05 Ä 2NAD

Pseudomonas Открытая конформация (апо-форма) [42] 1,80 Ä 2NAC

sp. 101 Открытая конформация РОН-ЫАОН [43] 2,10 Ä 2G01

Двойной комплекс [РОН-НСОО"] (апо-форма) [43] 2,28 Ä 2GUG

Moraxella sp. С-1 Тройной комплекс РОН-ЫАО+-азид (холо-форма) [44,45] 1,95 Ä 2GSD

Апо-форма в закрытой конформации [44] 1,96 Ä 3FN4

Апо-форма РОН [40] 1,80 Ä 4XYG

Granulicella mallensis Тройной комплекс РОН^АОР+-азид (холо-форма) [40] 1,38 Ä 4XYB

Двойной комплекс с NAD+ (холо-форма) [40] 1,80 Ä 4XYE

Thiobacillus

sp. KNK65MA Двойной комплекс с КАО+ (холо-форма) [46] 2,14 Ä 3WR5

FDHs из дрожжей

Апо-форма мутантной FDH с заменой К47Е [47] 1,70 Ä 2FSS

Candida Апо-форма мутантной FDH с заменой K328V [47] 1,55 Ä 2J6I

boidinii Апо-форма FDH [48] 1,75 Ä 5 DNA

Тройной комплекс FDH-NAD+'азид (холо-форма) [48] 1,50 Ä 5DN9

FDHs из растений

Arabidopsis thaliana Тройной комплекс [FDH -NAD+-a3Hfl] [29] 2,00 Ä 3N7U

Апо-форма FDH [29] 1,70 Ä 3NAQ

Апо-форма FDH, кристаллизация в космосе [29] 1,30 Ä 3JTM

Для всех NAD+-зависимых FDHs характерно образование трехмерной структуры димера с кофермент- и субстрат-связывающими доменами. Двойной [FDH-NAD+] и тройной [FDH-NAD+-азид] комплексы являются структурными аналогами фермент-субстратного комплекса в переходном состоянии. Особенно стоит отметить, структуру тройного комплекса FDH из Thiobacillus sp. KNK65MA в комплексе с азид-ионом и коферментом NADP+ [46]. Вплоть до настоящего времени, это единственная экспериментально определенная структура FDH с NADP+.

На рисунке 2.4 представлены трехмерные структуры наиболее изученной FDH из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 (PseFDH). При переходе от апо-формы к холо-форме происходят структурные изменения PseFDH, что связано с тем, что холо-форма FDH в комплексе с коферментом NAD+ и азид-ионом представляет собой «закрытую» конформацию за счет компактизации белковой глобулы фермента и образования точечных взаимодействий. За счет изменения конформации PseFDH стало возможным определить концентрацию активного фермента в растворе с применением методики активных центров [49].

А Б

Рис. 2.4. Апо-форма (А) и холо-форма (Б) PseFDH [42]. Синим цветом указаны молекулы NAD+, желтым - молекулы азид-иона.

Также стоит отметить наличие длинной ^концевой петли, богатой остатками пролина, что приводит к проявлению жесткости в структуре PseFDH (см. рис. 2.2). Наличие именно такой петли обеспечивает высокую температурную стабильность бактериальных FDHs, что подтверждается увеличением констант скорости температурной инактивации фермента вследствие нарушения связывания пролиновой петли с остальной глобулой [50].

В работе [48] приведен подробный анализ апо- и холо-форм CboFDH, где показано, что при образовании тройного комплекса происходит переход в закрытую конформацию. Важно отметить, что долгое время не удавалось закристаллизовать апо-форму дрожжевой CboFDH без дополнительных мутаций, таких как K47E или K328V [47], что было связано с агрегацией фермента при его высокой концентрации. И только в 2017 году удалось закристаллизовать апо-форму фермента из Candida boidinii, не содержащего аминокислотных замен [48].

Активный центр FDH

Лимитирующей стадией реакции, катализируемой FDH, является перенос гидрид-иона от формиат-иона на С4-атом положительно заряженного никотинамидного кольца кофермента NAD+ [7]. В результате образуются молекулы CO2 и NADH. Трехмерная структура активного центра формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp. 101 представлена на рисунке 2.3 [51]. Аналогичная схема была предложена и для дрожжевых ферментов на основе молекулярного моделирования [34].

Рис. 2.3. Структура активного центра PseFDH [51]. Фиолетовым цветом показана молекула NAD+.

Согласно рисунку 2.3, в структуре PseFDH положительно заряженный остаток

Arg284, находящийся в активном центре, стабилизирует № при его переносе с

16

формиат-иона на NAD+ и дестабилизирует положительно заряженное никотинамидное кольцо кофермента [42]. Этот факт был подтвержден аминокислотной заменой Arg284 на остатки Ala или Gln, что привело к значительному ухудшению кинетических параметров фермента [52]. Гидрофобные аминокислотные остатки Val150-Ile202 и Pro97-Phe98 в районе кофермент-связывающего домена обеспечивают более благоприятное связывание нейтрально заряженных продуктов реакции NADH и CO2, чем заряженных NAD+ и формиат-иона, соответственно, а также способствуют их правильной конформации. Аминокислотные остатки, образующие ионную пару (Lys2 и Asp89) и межсубъединичное взаимодействие за счет остатков Arg163, Asn164, Trp177, Ala180, Asp188 обеспечивают стабильность белковой глобулы. Каталитически важные остатки (Phe98, Cys255, Gln313 и His332) обладают ограниченной подвижностью вследствие расположения в соседстве с остатками пролина, что хорошо видно в случае полуконсервативного мотива XP(A)QP - Pro312-Gln313-Pro314. В работе [53] на примере PseFDH было показано, что двойная замена Gln313Glu/His332Phe приводит к изменению pI фермента от 5,5 до 7,6, что говорит о том, что остаток His332 играет важную роль в процессе катализа.

2.5. Основные свойства формиатдегидрогеназ

2.5.1. Каталитические свойства

Бактериальные формиатдегидрогеназы, в частности SauFDH и PseFDH,

обладают более высокой удельной активностью по сравнению с растительными и

дрожжевыми FDHs [54]. С другой стороны, эукариотические FDHs имеют низкие

значения констант Михаэлиса по обоим субстратам, что говорит о хорошем

потенциале их применения на практике в качестве биокатализатора. Известно, что

растительная SoyFDH обладает одними из самых низких значений констант

Михаэлиса по NAD+ (13,3 мкМ) и по формиат-иону (1,5 мМ) по сравнению с FDHs из

других источников. Тем не менее, в настоящее время широко используется CboFDH в

различных биотехнологических процессах, однако, рекомбинантный фермент дикого

типа имеет довольно высокие значения констант Михаэлиса по NAD+ (37,0 мкМ) и

формиат-иону (5,9 мМ) по сравнению с другими эукариотическими FDHs, а также

17

невысокую стабильность по сравнению с бактериальными FDHs. В связи с этим были проведены работы по белковой инженерии CboFDH, в результате которых были улучшены свойства фермента [3,4]. Однако проблема высоких значений констант Михаэлиса, так и не была решена. В то же время главным недостатком растительных FDHs является их невысокая температурная стабильность [2]. В настоящее время достаточно актуальны работы, направленные на улучшение этого параметра методом направленного мутагенеза [2,55-57].

В таблице 2.2 приведены кинетические параметры FDHs из различных источников, описанных в литературе. Показано, что NAD+-специфичные FDHs из растений имеют самые высокие значения каталитической эффективности по NAD+ и формиат-иону, в то время как бактериальные FDHs имеют одни из самых высоких значений каталитической константы (в частности, для SauFDH kcat = 20 с-1) [58].

Также актуальным является получение NADP+-зависимых FDHs, поскольку в природе известно только три природных NADP+-специфичных FDHs из бактерий Burkholderia stabilis (BstFDH), Lactobacillus buchneri (LbuFDH) и Granulicella mallensis (GraFDH), в то время как существует большое количество биотехнологических процессов с участием NADPH-специфичных дегидрогеназ. Более того, цена на кофермент NADPH на порядок выше NADH, поэтому внедрение NADP+-зависимых ферментов довольно привлекательно для внедрения в практику. Подробнее об особенности их свойств будет сказано в разделе 4.7.3.

Таблица 2.2.

Кинетические свойства рекомбинантных БОШ из различных источников, нд - нет данных

Источник краткое название lr NAD+ Kcal , С"1 С"1 мкМ Л'м|1СО°, мМ ÄMnadp+, мМ (fc«NAD+/KMNAB+V Удельная активность, ед/мг Ссылка

а з Ceriporiopsis CsuFDHl НД НД 74 4,1 нд нд нд [31]

subvermispora CsuFDH2 нд нд 140 3,6 нд нд нд

5: Candida boidinii CboFDH 3,7 4*10"5 37 5,9 >38 >9,5 х Ю7 6,3 [34,48]

Л Candida methylica CmeFDH 1,4 нд 55 нд нд нд 2,1 [1]

Saccharomyces cerevisiae SceFDH 6,5 нд 36 5,5 нд >3 х 109 10 [59]

Pseudomonas sp. 101 PseFDH 7,3 нд 60 6,5 >400 2,4 х 103 10 [21]

Staphylococcus aureus SauFDH 20 нд 220 130 нд нд нд [58]

Ancylobacter aquaticus Strain KNK607M AaqFDH 7,3 нд 57 2,4 нд нд 10 [26]

Para coccus sp. 12-A ParFDH 6,1 нд 54 5,6 нд нд 8,3 [25]

5! Bacillus sp. F1 BacFDH 6,67 1,07 90 19,6 (NAD+), 39,1 (NADP+) 3,5 2,4 х I02 нд [27]

1 s Burkholderia stabilis 15516 BstFDH 1,66 4,75 1400 55,5 0,16 0,04 2,0 [17]

a Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 LbuFDH 1,8 3,5 1700 нд 0,12 27 нд [19]

Granulicella mallensis MP5ACTX8 GraFDH 5,8 4,0 6500 80,0 0,85 5 нд [18]

Thiobacillus sp. KNK65MK TbaFDH 5,5 нд 4,8 1,6 нд нд 7,5 [28]

Moraxella sp. CI MorFDH 7,3 нд 80 7,7 нд нд 10 [60]

Mycobacterium vaccae N 10 MycFDH 7,3 нд 89 6,0 нд нд 10 [24]

s Lotus japonicus LjaFDH 1,2 0,005 26 6,1 29,5 >2,5 х 105 нд [30]

^ С Arabidopsis thaliana AthFDH нд нд 20 2,8 10 2 х 104 6,5 [29]

« Si. Glycine max SoyFDH 2,9 нд 13 1,6 1 1,1 х 103 4,0 [2,61]

2.5.2. Температурная стабильность

Механизмы инактивации FDHs из бактерий и дрожжей достаточно хорошо изучены [3]. Выше 50^ температурная инактивация FDHs объясняется температурной денатурацией, при этом величина константы скорости реакции не зависит от концентрации фермента, и описывается кинетикой реакции первого порядка [1]. Аналогично термоинактивация протекает и у растительных FDH [2]. Однако, при низких температурах 4-37^ для PseFDH инактивация связана не с разворачиванием глобулы, а с окислением SH-групп остатков цистеина, в особенности остатка Cys255 [41,62]. Окисление сульфо-группы приводит к необратимой денатурации фермента. В случае дрожжевой FDH кинетика процесса потери активности в том же диапазоне температур (4-37°^ описывается экспоненциальной зависимостью, это обусловлено разворачиванием белковой глобулы [63].

FDHs из бактерий являются самыми устойчивыми к тепловой денатурации, что связано с наличием на их Оконце петли, образованной остатками пролина, обеспечивающей жесткость полипептидной цепи. Самыми термостабильными FDHs дикого типа являются PseFDH и SauFDH (время полуинактивации при 64°С и 63 °С составляет 20 минут, соответственно), что значительно превосходит другие формиатдегидрогеназы [64]. Тем не менее, c помощью карт Рамачандрана для PseFDH был выявлен остаток Tyr144, замена которого на Gly привела к дальнейшему увеличению температурной стабильности [65].

Таким образом, для большинства FDHs процесс термоинактивации является необратимым, однако, исключением является FDH из пекарских дрожжей $>.сегеу1$1ае. В работе [66] подробно описан механизм инактивации SceFDH, отличающийся от других FDHs: при температуре ниже 42 ^ инактивация SceFDH обратима, и только при более высоких температурах фермент инактивируется окончательно.

В работе [60] было показано, что при добавлении к FDH кофермента NAD+, а также азид-иона, может происходить значительное увеличение температурной стабильности за счет компактизации белковой глобулы и образованию дополнительных точечных взаимодействий при переходе к закрытой конформации, что было показано в экспериментах ДСК. Более того, в работе [67]

20

были получены липосомальные системы CboFDH вместе с кофакторами NAD+ или NADH, проявляющие большую температурную стабильность, чем в их отсутствии.

Подробное изучение температурной стабильности дрожжевой CboFDH в зависимости от pH буферного раствора и ионной силы проведено в работе [68]. Среди растительных FDH наиболее стабильной является фермент модельного растения Arabidopsis ШаНана [29,69]. Последний обзор, посвященный изучению температурной стабильности формиатдегидрогеназ, был представлен в работе [70].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зарубина, София Александровна, 2018 год

VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Tishkov V.I., Popov V.O. Catalytic mechanism and application of formate dehydrogenase. Biochem., 2004, v.69, №11, p.1252-1267

2. Alekseeva A.A., Savin S.S., Tishkov V.I. NAD+-dependent Formate Dehydrogenase from Plants. Acta Naturae, 2011, v.3, №11, p.38-54

3. Tishkov V.I., Popov V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomol. Eng., 2006, v.23, №2-3, p.89-110

4. Slusarczyk H. et al. Stabilization of NAD-dependent formate dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues. Eur. J. Biochem., 2000, v.267, №5, p.1280-1289

5. Yu S. et al. Promising properties of a formate dehydrogenase from a methanol-assimilating yeast Ogataea parapolymorpha DL-1 in His-tagged form. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014, v.98, №4, p.1621-1630

6. Vinals C., Depiereux E., Feytmans E. Prediction of structurally conserved regions of D-specific hydroxy acid dehydrogenases by multiple alignment with formate dehydrogenase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, v.192, №1, p.182-188

7. Tishkov V.I., Galkin A.G., Egorov A.M. Kinetic isotope effect and the presteady-state kinetics of the reaction catalyzed by the bacterial formate dehydrogenase. Biochimie, 1989, v.71, №4, p.551-557

8. Maia L.B., Moura J.J.G., Moura I. Molybdenum and tungsten-dependent formate dehydrogenases. J. Biol. Inorg. Chem., 2015, v.20, №2, p.287-309

9. Maia L.B. et al. Reduction of Carbon Dioxide by a Molybdenum-Containing Formate Dehydrogenase: A Kinetic and Mechanistic Study. J. Am. Chem. Soc., 2016, v.138, №28, p.8834-8846

10. Niks D. et al. Spectroscopic and kinetic properties of the molybdenum-containing, NAD+-dependent formate dehydrogenase from Ralstonia eutropha. J. Biol. Chem., 2016, v.291, №3, p.1162-1174

11. Dong G., Ryde U. Reaction mechanism of formate dehydrogenase studied by computational methods. JBIC J. Biol. Inorg. Chem., Springer Berlin Heidelberg, 2018, v.1, №0123456789, p.1-12

12. Jormakka M., Byrne B., Iwata S. Formate dehydrogenase - A versatile enzyme in changing environments. Curr. Opin. Struct. Biol., 2003, v.13, №4, p.418-423

13. Poehlein A. et al. An ancient pathway combining carbon dioxide fixation with the generation and utilization of a sodium ion gradient for ATP synthesis. PLoS One, 2012, v.7, №3, p.e33439

14. Hartmann T., Schwanhold N., Leimk S. Assembly and catalysis of molybdenum or tungsten-containing formate dehydrogenases from bacteria. BBA - Proteins Proteomics, Elsevier B.V., 2014, v.1854, №9, p.1090-1100

15. Yu X. et al. Efficient reduction of CO2 by the Mo-containing formate dehydrogenase from Cupriavidus necator. J Biol Chem, 2017, v.292, p.1-19

123

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

Noji T. et al. CO2 Photoreduction by Formate Dehydrogenase and a Ru-Complex in a Nanoporous Glass Reactor. Appl. Mater. Interfaces, 2017, v.9, p.3260-3265

Hatrongjit R., Packdibamrung K. A novel NADP+-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis 15516: Screening, purification and characterization. Enzyme Microb. Technol., Elsevier Inc., 2010, v.46, №7, p.557-561

Fogal S. et al. Structural basis for double cofactor specificity in a new formate dehydrogenase from the acidobacterium Granulicella mallensis MP5ACTX8. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2015, v.99, №22, p.9541-9554

Alpdag S. et al. Discovery of an acidic , thermostable and highly NADP+ dependent formate dehydrogenase from Lactobacillus buchneri NRRL B-30929. Biotechnol Lett, 2018, v.40, №7, p.1135-1147

Hartner F.S., Glieder A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microb. Cell Fact., 2006, v.5, p.1-21

Tishkov, V.I., Galkin, A.G., and Yegorov A.M. NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium Pseudomonas sp 101 - cloning, expression and study of gene structure. Proc. USSR Acad. Sci., 1991, v.317, №3, p.745-748

Shuber A.P. et al. Cloning , Expression , and Nucleotide Sequence of the Formate Dehydrogenase Genes from Methanobacterium formicicum ". J. Biol. Chem., 1986, №2, p.12942-12947

Asano Y., Sekigawa T., Inukai H., Nakazawa A. Purification and Properties of Formate Dehydrogenase from Moraxella sp. Strain C-1. J. Bacteriol., 1988, v.170, №7, p.3189-3193

Galkin A. et al. Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, v.44, №3-4, p.479-483

Taylor P. et al. Cloning , Nucleotide Sequencing, and Expression in Escherichia coli of the Gene for Formate Dehydrogenase of Paracoccus sp . 12-A , a Formate-assimilating Bacterium. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, v.66, №2, p.271-276

Anba H.N., Akaoka Y.T., Asegawa J.H. Purification and Characterization of Formate Dehydrogenase from Ancylobacter aquaticus Strain KNK607M, and Cloning of the Gene. Biosci Biotechnol Biochem, 2003, v.67, №4, p.720-728

Ding H.T. et al. Characterization of a thermally stable and organic solvent-adaptative NAD+-dependent formate dehydrogenase from Bacillus sp. F1. J. Appl. Microbiol., 2011, v.111, №5, p.1075-1085

Choe H. et al. Efficient CO2-reducing activity of NAD-dependent formate dehydrogenase from Thiobacillus sp. KNK65MA for formate production from CO 2 gas. PLoS One, 2014, v.9, №7, p.e103111

Tishkov V.I., Kuranova I.P. Recombinant Formate Dehydrogenase from Arabidopsis thaliana: Preparation , Crystal Growth in Microgravity , and Preliminary X Ray Diffraction Study. Crystallogr. Reports, 2010, v.55, №5, p.806-807

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

Andreadeli A. et al. Cloning and characterization of Lotus japonicus formate dehydrogenase: A possible correlation with hypoxia. Biochim. Biophys. Acta, Elsevier B.V., 2009, v.1794, №6, p.976-984

Watanabe T. et al. Cloning of a cDNA encoding a NAD-dependent formate dehydrogenase involved in oxalic acid metabolism from the white-rot fungus Ceriporiopsis subvermispora and its gene expression analysis. FEMS Microbiol. Lett., 2008, v.279, №1, p.64-70

Chow C.M., Bhandary U.L. Developmental Regulation of the Gene for Formate Dehydrogenase in Neurospora crassa. J. Bacteriol., 1993, v.175, №12, p.3703-3709

Ozgun G.P. et al. Site Saturation Mutagenesis Applications on Candida methylica Formate Dehydrogenase. Scientifica (Cairo)., 2016, v.2016, p.1-7

Labrou N.E., Rigden D.J. Active-site characterization of Candida boidinii formate dehydrogenase. Biochem J., 2001, v.354, №2, p.455-463

Jomantiene R., Januska A., Lebediene E. Cloning and analysis of a Candida maltosa gene which confers resistance to formaldehyde in Saccharomyces cerevisiae. Gene, 1992, v.122, p.207-211

Hou C.T. et al. NAD-Linked Formate Dehydrogenase from Methanol-Grown Pichia pastoris NRRL-Y-7556. Arch. Biochem. Biophys., 1982, v.216, №1, p.296-305

Lou H.Q. et al. A Formate Dehydrogenase Confers Tolerance to Aluminium and Low pH. Plant Physiol., 2016, v.171, №May, p.294-305

£akar M.M. et al. Discovery of a new metal and NAD+-dependent formate dehydrogenase from Clostridium ljungdahlii. Prep. Biochem. Biotechnol., 2018, v.6068, p.10826068.2018.1446150

Kurt-Gur G., Ordu E. Characterization of a novel thermotolerant NAD+-dependent formate dehydrogenase from hot climate plant cotton (Gossypium hirsutum L.). 3 Biotech, Springer Berlin Heidelberg, 2018, v.8, №3, p.175

Fogal S. et al. Structural basis for double cofactor specificity in a new formate dehydrogenase from the acidobacterium Granulicella mallensis MP5ACTX8. Appl Microbiol Biotechnol, 2015

Popov V.O, Lamzin V.S. NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem J., 1994, v.301, p.625-643

Lamzin V., Dauter Z., Popov V., Harutyunyan E. W.K. High resolution structure of holo and apo formate dehydrogenase. J. Mol. Biol., 1994, v.236, p.759-785

Filippova E. V et al. Crystal Structures of Complexes of NAD+-Dependent Formate Dehydrogenase from Methylotrophic Bacterium Pseudomonas sp . 101 with Formate. Crystallogr. Reports, 2006, v.51, №4, p.627-628

Shabalin I.G. et al. Structures of the apo and holo forms of formate dehydrogenase from the bacterium Moraxella sp. C-1: towards understanding the mechanism of the closure of the interdomain cleft research papers. Acta Crystallogr. Sect. D, International Union of Crystallography, 2009, v.65, p.1315—1325

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

Shabalin I.G. et al. Atomic Resolution Crystal Structure of NAD+-Dependent Formate Dehydrogenase from. Acta Naturae, 2009, v.3, p.89-93

Choe H. et al. Structural insights into the efficient CO2 -reducing activity of an NAD-dependent formate dehydrogenase from Thiobacillus sp . KNK65MA research papers. Acta Crystallogr. Sect. D, 2015, p.313-323

Schirwitz K., Schmidt A., Lamzin V.S. High-resolution structures of formate dehydrogenase from Candida boidinii. Protein Sci., 2007, v.16, p.1146-1156

Guo Q. et al. Structural and kinetic studies of formate dehydrogenase from Candida boidinii. Biochem J., 2016, v.55, №19, p.2760-2771

Romanova E.G. et al. Determination of the Concentration of Active Sites and the Catalytic Rate Constant of Recombinant Formate Dehydrogenase from Glycine max. Moscow Univ. Chem. Bull., 2010, v.65, №3, p.127-128

Fedorchuk V. V et al. Effect of Interactions Between Amino Acid Residues 43 and 61 on Thermal Stability of Bacterial Formate Dehydrogenases. Biochem., 2002, v.67, №10, p.1145-1151

Bandaria J.N. et al. Fast Enzyme Dynamics at the Active Site of Formate Dehydrogenase. JACS, 2008, v.130, p.22-23

Esipova N.G. et al. Site-directed mutagenesis of the essential arginine of the formate dehydrogenase active centre. Biochim. Biophys. Acta, 2002, v.1594, p.136-149

Tishkov V.I. et al. Site-directed mutagenesis of the formate dehydrogenase active centre: role of the His332-Gln313 pair in enzyme catalysis. FEBS Lett., 1996, v.390, p.104-108

Tishkov V.I. et al. Role of a Structurally Equivalent Phenylalanine Residue in Catalysis and Thermal Stability of Formate Dehydrogenases from Different Sources. Biochem., 2015, v.80, №13, p.1690-1700

Alekseeva A.A., Savin S.S., Kleimenov S.Y. Stabilization of Plant Formate Dehydrogenase by Rational Design. Biochem., 2012, v.77, №10, p.1199-1209

Alekseeva A. A., Kargov I.S., Kleimenov S.Yu., Savin S.S., Tishkov V.I. Additivity of the Stabilization Effect of Single Amino Acid Substitutions in Triple Mutants of Recombinant Formate Dehydrogenase from the Soybean. Acta Naturae, 2015, v.7, №26, p.55-64

Alekseeva A.A. et al. Engineering catalytic properties and thermal stability of plant formate dehydrogenase by single-point mutations. PEDS, 2012, v.25, №11, p.781-788

Каргов И.С. Структурно-функциональная характеристина и белковая инженерия бактериальной и растительной формиатдегидрогеназ. Диссертация кандидата химических наук, 2017. Москва, ФИЦ Биотехнологии РАН

Serov, A.E., Popova, A.S., Fedorchuk, V.V., and Tishkov V.I. Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae. Biochem., 2002, v.367, №3, p.841-847

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

Садыхов Э.Г. Получение, термостабильность и структурные исследования формиатдегидрогеназ из различных источников. Диссиссертация кандидата химических наук, 2007. Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова.

Алексеева (Пометун) А.А. Рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои Glycine max: белковая инженерия и структурные исследования. Диссертация кандидата химических наук, 2011

Savin S.S., Tishkov V.I. Assessment of Formate Dehydrogenase Stress Stability In vivo using Inactivation by Hydrogen Peroxide. Acta Naturae, 2010, v.2, №1, p.97-102

Labrou N.E., Rigden D.J., Clonis Y.D. Characterization of the NAD+ binding site of Candida boidinii formate dehydrogenase by affinity labelling and site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem, 2000, v.267, p.6657-6664

Sadykhov E.G. et al. A comparative study of the thermal stability of formate dehydrogenases from microorganisms and plants. Appl. Biochem. Microbiol., 2006, v.42, №3, p.236-240

Serov A.E. et al. Use of Ramachandran Plot for Increasing Thermal Stability of Bacterial Formate Dehydrogenase. Biochem., 2005, v.70, №7, p.804-808

Серов А.Е. Взаимосвязь структуры и свойств рекомбинантных формиатдегидрогеназ из пекарских дрожжей и метилотрофных бактерий. Диссертация кандидата химических наук, 2002. Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова.

Yoshimoto M. et al. Enzyme and Microbial Technology Stabilization of formate dehydrogenase from Candida boidinii through liposome-assisted complexation with cofactors. Enzyme Microb. Technol., Elsevier Inc., 2010, v.46, №7, p.588-593

Tishkov V.I. et al. Influence of Ion Strength and pH on Thermal Stability of Yeast Formate Dehydrogenase. Acta Naturae, 2010, v.2, №5, p.82-87

Olson B. et al. Formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana: Characterization and possible targeting to the chloroplast. Plant Sci., 2000, v.159, №2, p.205-212

Pometun A.A. et al. Comparison of the Thermal Stability of New Formate Dehydrogenases by Differential Scanning Calorimetry. Moscow Univ. Chem. Bull., 2018, v.73, №2, p.79-83

Cadwell R.C., Joyce G.F. Mutagenic PCR. Man. Suppl., 1994, v.3, p.136-141

Li Y. et al. Biotechnology for Biofuels Directed evolution of a ß - mannanase from Rhizomucor miehei to improve catalytic activity in acidic and thermophilic conditions. Biotechnol. Biofuels, BioMed Central, 2017, v.10, №143, p.1-12

Li W. et al. Directed evolution to improve the catalytic efficiency of urate oxidase from Bacillus subtilis. PLoS One, 2017, v.12, №5, p.1-18

Tishkov V.I. et al. Rational Design of Practically Important Enzymes. Moscow Univ. Chem. Bull., 2018, v.73, №1, p.1-6

Binay B. et al. Highly stable and reusable immobilized formate dehydrogenases : Promising biocatalysts for in situ regeneration of NADH. Beilstein J. Org Chem, 2016, v.12, p.271-277

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

Bolivar J., Wilson L. M.C. Evaluation of different immobilization strategies to prepare an indystrial biocatalyst of formate dehydrogenase from Candida biodinii.

Enzyme Microb. Technol., 2007, p.540-546

Gao X. et al. Enhancement of the activity of enzyme immobilized on polydopamine-coated iron oxide nanoparticles by rational orientation of formate dehydrogenase. J. Biotechnol., Elsevier B.V., 2014, v.188, p.36-41

Homaei A.A. et al. Enzyme immobilization: an update. J Chem Biol, 2013, v.6, p.185-205

Rueda N. et al. Chemical Modification in the Design of Immobilized Enzyme Biocatalysts: Drawbacks and Opportunities. Chem Rec, 2016, v.16, p.1436-1455

Hernandez-Garcia, S Garcia-Carmona I.M. Improving the production, activity and stability of CLEAs with diepoxides. Biocatal. Bioreact. Des., 2017, v.33, p.1425-1429

Matte C.R., Bussamara R. Immobilization of Thermomyces lanuginosus Lipase by Different Techniques on Immobead 150 Support : Characterization and Applications. Appl Biochem Biotechnol, 2014, p.1-14

Wang H. et al. Covalent organic framework-coated magnetic graphene as a novel support for trypsin immobilization. Anal. Bioanal. Chem., 2017, v.409, №8, p.2179-2187

Sun J. et al. Stability and activity of immobilized trypsin on carboxymethyl chitosan-functionalized magnetic nanoparticles cross-linked with carbodiimide and glutaraldehyde. J. Chromatogr. B, 2017, v.1054, p.57-63

Lienert F., Lohmuller J., Garg A. S.P. Syntheric bilogy in mammalian cell: Next generation research tools and therapeutics. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, v.15, №2, p.95-107

Rojkova A.M. et al. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, №1, p.183-188

Alekseeva A.A. et al. The Role of Ala198 in the Stability and Coenzyme Specificity of Bacterial Formate Dehydrogenases. Acta Naturae, 2015, v.7, №24, p.60-69

Kargov I.S. et al. Improvement of the soy formate dehydrogenase properties by rational design. PEDS, 2015, v.28, №6, p.171-178

Poole L.B. The Basics of Thiols and Cysteines in Redox Biology and Chemistry.

Free Radic Biol Med, 2016, p.148-157

Tishkov V.I. et al. Catalytic properties and stability of a pseudomonas sp.101 formate dehydrogenase mutants containing Cys-255-Ser and Cys-255-met replacements. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, v.192, №2, p.976-981

Zheng J. et al. Elimination of a free cysteine by creation of a disulfide bond increases the activity and stability of Candida boidinii formate dehydrogenase. Appl. Environ. Microbiol., 2017, v.83, №2, p.1-12

91. Hoelsch K. et al. Engineering of formate dehydrogenase: synergistic effect of mutations affecting cofactor specificity and chemical stability. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, v.97, p.2473-2481

92. Yamamoto H. et al. Robust NADH-regenerator: Improved a-haloketone-resistant formate dehydrogenase. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005, v.67, №1, p.33-39

93. Felber S. Optimierung der NAD- NAD - abhängigen Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii für den Einsatz in der Biokatalyse, 2001, 176 p.

94. Seelbach K. et al. A Novel , Efficient Regenerating Method of NADPH Using a New Formate Dehydrogenase. Tetrhedron Lett, 1996, v.37, №9, p.1377-1380

95. Andreadeli A. et al. Structure-guided alteration of coenzyme specificity of formate dehydrogenase by saturation mutagenesis to enable efficient utilization of NADP+. FEBS J., 2008, v.275, №15, p.3859-3869

96. Wu W., Zhu D., Hua L. Site-saturation mutagenesis of formate dehydrogenase from Candida bodinii creating effective NADP+-dependent FDH enzymes. J. Mol. Catal. B Enzym., 2009, v.61, p.157-161

97. Rozzell J.D., Hua L., Mayhew M. N.S. Mutants of enzymes and methods for their use. US Patent Application Publication 2004, US2004/0115691, 2004

98. Gul-Karaguler N. et al. A single mutation in the NAD-specific formate dehydrogenase from Candida methylica allows the enzyme to use NADP. Biotechnol Lett, 2001, v.23, p.283-284

99. Serov A., Popova A., Fedorchuk V., Tishkov V. Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae. Biochem J., 2002, v.367, p.841-847

100. Klyushnichenko V., Tishkov V., Kula M. Rapid SDS-GEL capillary electrophoresis for the analysis of recombinant NADP+-dependent formate dehydrogenase during expression in Escherichia coli cells and its purification. J. Biotechnol., 1997, v.58, p.187-195

101. Atroshenko D.L. et al. Preparation and Characterization of Multipoint Yeast D-Amino Acid Oxidase Mutants with Improved Stability and Activity. Moscow Univ. Chem. Bull., 2017, v.72, №5, p.218-223

102. Johannes T.W., Woodyer R.D., Zhao H. Efficient Regeneration of NADPH Using an Engineered Phosphite Dehydrogenase. Biotechnol. Bioeng., 2006, v.96, №1, p.18-26

103. Liu W., Wang P. Cofactor regeneration for sustainable enzymatic biosynthesis. Biotech Adv, 2007, v.25, p.369-384

104. Relyea H.A., Van Der Donk W.A. Mechanism and applications of phosphite dehydrogenase. Bioorg. Chem., 2005, v.33, №3, p.171-189

105. Rissom S., Gmbh F.J. Synthesis of chiral E-lactones in a two-enzyme system of cyclohexanone mono-oxygenase and formate dehydrogenase with integrated bubble-free aeration t. Tetrahedron: Asymmetry, 1997, v.8, №15, p.2523-2526

106. Schulz F. et al. Towards practical biocatalytic Baeyer-Villiger reactions : applying a thermostable enzyme in the gram-scale synthesis of optically-active lactones in a

129

two-liquid-phase system. Beilstein J. Org Chem, 2005, v.9, p.1-9

107. Kragl U. et al. Enzyme engineering aspects of biocatalysis: Cofactor regeneration as example. Biotechnol. Bioeng., 1996, v.52, №2, p.309-319

108. Hummel W., Kuzu M., Geueke B. An efficient and selective enzymatic oxidation system for the synthesis of enantiomerically pure D-tert-leucine. Org. Lett., 2003, v.5, №20, p.3649-3650

109. Jiang W. et al. Identification of catalysis , substrate , and coenzyme binding sites and improvement catalytic efficiency of formate dehydrogenase from Candida boidinii. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2016, v.19, p.8425-8437

110. Jiang W., Xu C., Jiang S. Establishing a Mathematical Equations and Improving the Production of L-tert-Leucine by Uniform Design and Regression Analysis. Appl Biochem Biotechnol, Applied Biochemistry and Biotechnology, 2017, v.181, p.1454-1464

111. Fröhlich P., Albert K., Bertau M. Formate dehydrogenase - a biocatalyst with novel applications in organic chemistry. Org. Biomol. Chem., 2011, v.9, №22, p.7941

112. Li J.-X. et al. Enhanced production of optical (S)-acetoin by a recombinant Escherichia coli whole-cell biocatalyst with NADH regeneration. RSC Adv., 2018, v.8, №53, p.30512-30519

113. Jiang W., Fang B.S. Construction and evaluation of a novel bifunctional phenylalanine - formate dehydrogenase fusion protein for bienzyme system with cofactor regeneration. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., Springer Berlin Heidelberg, 2016, v.43, №5, p.577-584

114. Bekhouche M., Doumeche B., Blum L.J. Chemical modifications by ionic liquid-inspired cations improve the activity and the stability of formate dehydrogenase in [MMIm][Me2PO4]. J. Mol. Catal. B Enzym., 2010, v.65, p.73-78

115. Ketterer L., Keusgen M. Amperometric sensor for cyanide utilizing cyanidase and formate dehydrogenase. Anal. Chim. Acta, 2010, v.673, №1, p.54-59

116. Triebig G., Schaller K.H. A simple and reliable enzymatic assay for the determination of formic acid in urine. Clin. Chim. Acta, 1980, v.108, №3, p.355-360

117. Chen W., Georgiou G. Cell-Surface Display of Heterologous Proteins : From High-Throughput Screening to Environmental Applications. Biotechnol. Bioeng., 2002, v.79, №5, p.496-503

118. Liu A., Feng R., Liang B. Enzyme and Microbial Technology Microbial surface displaying formate dehydrogenase and its application in optical detection of formate. Enzyme Microb. Technol., Elsevier Inc., 2016, v.91, p.59-65

119. Xia L. et al. Biosensors and Bioelectronics Direct energy conversion from xylose using xylose dehydrogenase surface displayed bacteria based enzymatic biofuel cell. Biosens. Bioelectron., Elsevier, 2013, v.44, p.160-163

120. Feng R. et al. Enzyme and Microbial Technology Rational design of xylose dehydrogenase for improved thermostability and its application in development of efficient enzymatic biofuel cell. Enzyme Microb. Technol., Elsevier Inc., 2016,

v.84, p.78-85

121. Luo S. et al. 13 C Pathway Analysis for the Role of Formate in Electricity Generation by Shewanella Oneidensis MR-1 Using Lactate in Microbial Fuel Cells. Nat. Publ. Gr., Nature Publishing Group, 2016, v.6, №20941, p.1-8

122. Ji A.C. et al. Single-enzyme biofuel cell. Angew. Chemie, 2017, v.56, №33, p.9762-9766

123. Takacs M. et al. Secretion of functional formate dehydrogenase in Pichia pastoris. PEDS, 2017, v.30, №5, p.381-386

124. Turner N.J., Turunen O. Chaetomium thermophilum formate dehydrogenase has high activity in the reduction of hydrogen carbonate (HCO3-) to formate. PEDS, 2018, v.30, №1, p.47-55

125. Kim J.H. et al. Sunlight-assisted, biocatalytic formate synthesis from CO2 and water using silicon-based photoelectrochemical cells. Chem. Commun., Royal Society of Chemistry, 2016, p.4-7

126. Abdellaouia S. et al. Hybrid Molecular/Enzymetic Catalytic Cascade for Complete Electro-oxidation of Glycerol Using a Promiscuous NAD-dependent Fromate Dehydrogenase from Candida boidinii. Chem Commun, 2017, v.53, №39, p.5368-5371

127. Zhu K. et al. The surface display of haemolysin from Vibrio harveyi on yeast cells and their potential applications as live vaccine in marine fish. Vaccine, 2006, v.24, p.6046-6052

128. Poole R.K. This is a repository copy of CO-releasing Metal Carbonyl Compounds as Antimicrobial Agents in the Post-antibiotic Era. J. Biol. Chem., 2015, v.290, №31, p.18999-19007

129. Рожкова А.М. овышение термостабильности бактериальной формиатдегидрогеназы гидрофобизацией белковой глобулы. Диссертация кандидата химических наук, 1999. Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова.

130. Садыхов Э.Г. et al. NAD+-зависимые формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana и сои: экспрессия в клетках E.coli и кинетические свойства рекомбинантных ферментов. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия, 2006, v.47, p.31-34

131. Mesentsev, A.V., Lamzin, V.S., Tishkov V.I. Effect of pH on kinetic parameters of NAD+-dependent formate dehydrogenase. Biochem J., 1997, v.321, №2, p.475-480

132. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem., 1976, v.72, p.248-254

133. Алексеева А.А. et al. Изменение величины изоэлектрической точки формиатдегидрогеназы методом рационального дизайна. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия, 2014, v.55, №2, p.98-105

134. Федорчук В.В. Повышение термостабильности бактериальной формиатдегидрогеназы методом направленного мутагенеза. Диссертация

кандидата химических наук, 2000. Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова.

135. Pometun A.A. et al. Comparison of Thermal Stability of New Formate Dehydrogenases by Differential Scanning Calorimetry. Moscow Univ. Chem. Bull., 2018, v.73, №2, p.80-81

136. Ihara M. et al. Light Driven CO 2 Fixation by Using Cyanobacterial Photosystem I and NADPH-Dependent Formate Dehydrogenase, 2013, v.8, №8, p.1-8