Структурно-функциональные исследования новых токсичных белков яда гадюки Vipera nikolskii тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Рамазанова, Анна Сергеевна

• Рамазанова, Анна Сергеевна
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Рамазанова, Анна Сергеевна

1. Введение

2. Семейства белков ядов змей

2.1. Фосфолипазы А

2.1.1. Фосфолипазы А2 и их классификация

2.1.2. Фосфолипазы А2 ядов змей

2.1.3. Роль ФЛА2 в поражающем действии яда

2.1.4. Классы нейротоксичных ФЛА

2.1.5. Нуклеотидные последовательности, кодирующие ФЛА

2.1.6. Структура генов ФЛА

2.1.7. Пространственная структура ФЛА

2.1.8. Ферментативная активность

2.1.9. Механизмы нейротоксического действия ФЛА

2.1.10. Белковые ингибиторы ФЛА

2.1.11. Перспективы исследования ФЛА

2.2. Тромбиноподобные ферменты из ядов змей

2.3. Ингибиторы сериновых протеиназ типа Кунитца

2.4. Структура и функции цистеин-богатых секреторных белков из ядов змей

2.4.1. Цистеин-богатые секреторные белки

2.4.2. CRISP ядов змей - блокаторы ионных каналов

2.4.3. Потенциальный сайт взаимодействия

2.5. Трехпетельные токсины

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Рамазанова, Анна Сергеевна

2.6 Заключение

В обзоре было рассмотрено несколько семейств токсинов змеиных ядов. Среди них представлены белки как обладающие ферментативной, активностью, так и не обладающие ею. В обзоре было также отмечено, что некоторые токсины (например, а-нейротоксины) широко используются в качестве инструментов исследований, другие пр вставляют интерес в качестве основы для создания новых лекарственных препаратов. Однако и те и другие имеют ряд недостатков (в частности, ограниченная селективность или высокая токсичность), что делает актуальной задачу поиска белков (токсинов) с новыми фармакологическими свойствам. Решению этой задачи и посвящена настоящая работа.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1. Реактивы и расходные материалы

В работе использовались реактивы следующих фирм: ацетонитрил (Криохром, Россия), водный* раствор аммиака, уксусная кислота ихидроксикарбонат аммония (Химмед, Россия), натрия ацетат, KCl, NaHC03 (Реахим, Россия), трифторуксусная кислота, 4-винилпиридин, гуанидин гидрохлорид, NaCl (Merck, Германия), Tris-HCl, PEG-6000 (Ferak, Германия), дитиотреитол, этидий бромид, Orange G (Serva), трипсин, пепсин, 2,5-дигидроксибензойная кислота (Sigma, США), Tersus-полимераза (Евроген, Россия), бакто-агар, бакто-тригггон, дрожжевой экстракт (Диа-М, Россия), изопропилтио-В-Г)-галактопиранозид (IPTG), X-Gal, ДНК-маркеры молекулярных масс, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), агароза (Fermentas, Литва), этанол, ампицилина натриевая соль (Ферейн, Россия), ß-меркаптоэтанол (Fluka), 1-пальмитоил-2-(10-пиренилдеканоил)-зп-глицеро-3-фосфорилхолин (Molecular Probes, Нидерланды), СаС12 (Acros, США).

Набор для выделения РНК "SV Total RNA Isolation System", обратная транскриптаза M-MLV, набор для клонирования продуктов ПЦР "pGEM-T Vector System I", набор для выделения и очистки продуктов ПЦР "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США).

Термостабилькая химически инактивированная ДНК-полимераза ChemTaq была предоставлена сотрудником лаборатории биотехнологии ИБХ РАН В.М. Крамаровым.

Клонирование плазмидной ДНК осуществляли в клетках E.coli штаммов XL-1 Blue (Stratagene) и DH-10B (Life Technologies). Праймеры для обратной транскрипции и ПЦР (табл. 1) были синтезированы и очищены сотрудником ИБХ РАН И.М. Альтшулером.

Табл. 4. Олигонуклеотиды, использованные в работе

Название Последовательность (5'—>3') Примечание

ТЗОСар AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T30)VN (N=A,C,G или Т; V=A,G или С) Праймер для обратной транскрипции

1 GGACCCCCTTCAACTCTGAGAC •s-етопраймер для ФЛА2 из V. nikolskii

2 GCATTCAGAATAATAGAGTAACAC antisense-upmuGp для ФЛА2 из V. nikolskii

3 TTCGGGGACATGATCTTACA ¿•еж-е-праймер для кислой ферментативно неактивной субъединицы

4 CTCCTCCGTGCAATGAGAGAT antisense-праймер для кислой ферментативно неактивной субъединицы

5 ACGATTTTCTGAAAGCAACA леш-е-праймер для CRISP из V. nikolskii и V.berus

6 GAAAGCAACAAAGAAG sense-щшшо^ для CRISP из К nikolskii и V.berus

7 GTTATCTTTACGTTTATTC •seme-праймер для CRISP из V. Nikolskii и V.berus

8 ATTTTGGTGAT(C,G)TTATTTTC ¿шШтуе-праймер для CRISP из V. nikolskii и V.berus

9 AG(C,G)TTTAAGTTTGGMACTGG яеияе-праймер для тромбин-подобных сериновых протеиназ из V. nikolskii

10 GGTTAGG(A, G) ATATAGAAGAGAT(C, G)T <з«/75бтое-праймер для тромбин-подобных сериновых протеиназ из V. nikolskii

11 GTCTTCTGGAGGTCTTCTTC •seme-праймер для ингибиторов сериновых протеиназ

12 GCAGAAKAGAAGGGATGAAG апШете-пршм&р для ингибиторов сериновых протеиназ

13 ATGAAAACTCTGCTGTTGATCCTGGGGGT ¿еше-праймср для трехпетельных токсинов из V. berus

14 GCCAATAGTCACTTTTAGAACTATTT-GTTGCAGTTGTCTG antisense-npalíuep для трехпетельных токсинов из V. berus

3.2. Методы

3.2.1. Получение яда змей

Содержание гадюк Vípera nikolskii и V. berus и отбор яда осуществлялись В.Г. Старковым. Гадюк держали в неволе при 25-26° С и кормили крысами и мышами. Яд получали ручным массажем желёз; полученный яд высушивали над хлоридом кальция и хранили при —20° С.

3.2.2. Фракционирование ядов

Катиопообменная ВЭЖХ. Высушенный яд разделяли на катионообменной колонке НЕМА ВЮ 1000 СМ (250x8 мм, Tessek, Чехия) в линейном градиенте концентрации аммонийно-ацетатного буфера (рН 7.5) от 5 до 700 мМ за 140 мин со скоростью потока 1мл/мин.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ. Фракции 4 и 5 (Рис. 1) далее разделяли на колонке Vydac С18 (10x250 мм) в присутствии 0.1% трифторуксусной кислоты в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в воде от 30 до 40% при скорости потока 2 мл/мин.

3.2.3.Анализ аминокислотных последовательностей

Пирндшэтгтирование белков. К 0.2-0.4 мг белка в 300 мл 0.2М Tris-НС1 буфера (рН 8.5), содержащего 6 М гидрохлорид гуанидина, добавляли 10 мкл раствора дитиотреитола (100 мг/мл) в том же буфере. После инкубации в течение 18 ч при комнатной температуре добавляли 3 мкл 4-винилпиридина и инкубировали 3 ч при комнатной температуре. Выделение пиридилэтилированных производных белка осуществляли с помощью обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac С18 (4.6x250мм) в присутствии 0.1% трифторуксусной кислоты в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в воде от 30 до 40% в течении 40 мин. Затем проводили лиофилизацию производных.

Тргтсиновый гидролиз белков. К раствору, содержащему 14.5 .нмоль пиридилэтилированного белка в 600 мкл 50 мМ Tris- НС1 (рН 8.5) буфера добавляли 10 мкл раствора свиного трипсина (1 мг/мл) в том же буфере. После инкубации смеси в течение 3 ч при 37°С полученные пептиды разделяли обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac С18 (4.6x250 мм) в градиенте концентрации ацетонитрила в воде от 2 до 42% за 80 мин в присутствии 0.1% трифторуксусной кислоты при скорости потока 1 мл/мин.

Пепсиновый гидролиз белков. К раствору, содержащему 29 нмоль пиридилэтилированного белка в 800 мкл 0.5% трифторуксусной кислоты, добавляли 16 мкл раствора свиного пепсина (0.05мг/мл) в воде. После инкубации раствора в течение 2 часов при комнатной температуре полученные пептиды разделяли, как описано выше для трипсинов ого гидролиза.

Анализ аминокислотных последовательностей. N-концевые аминокислотные последовательности пиридилэтилированных белков и продуктов их гидролиза определяли путём деградации по методу Эдмана с использованием автоматического секвенатора 477А (Applied Biosystems, Foster City, CA, США)

3.2.4. Масс спектрометрия

Молекулярные массы выделенных соединений, их производных и пептидных фрагментов определяли на времяпролетном MALDI масс-спектрометре BRUKER REFLEX III (Bruker, Германия), оборудованном источниками ионов с матрично-стимулированной лазерной десорбцией и ионизацией (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization). При нанесении образца на мишень использовали метод высушенной капли, описанный в работе [183]. Образец на мишени облучали ультрафиолетовым лазером с длиной волны излучения 337 нм и максимальной мощностью энергии в импульсе 250 мкДж. Регистрировали положительно заряженные ионы для соединений с молекулярными массами до 20 кДа в режиме отражения, используя раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты (10мг/мл в 30% ацетонитриле/0.5% трифторуксусной кислоты) в качестве матрицы.

3.2.5. Выделение общей РЕПС

Для получения ядовитых желез змею обезглавливали и быстро извлекали ядовитые железы. Извлеченные железы немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в морозильнике при -70°С. Для выделения и очистки суммарной РЕК использовали набор реактивов "SV Total RNA Isolation System". Навеску массой 1 г растирали в ступке с жидким азотом. Приблизительно 30 мг гомогенизированных тканей смешивали со 175 мкл лизирующего буфера (рН 7.5), содержащего 4М гуанидин-тиоцианат и 1% (3-меркаптоэтанол. Добавляли 350 мкл буфера для разбавления лизата и прогревали на водяной бане при 70° С в течение 3 мин. Образец центрифугировали, после чего к супернатанту добавляли 200 мкл 95% этанола. Весь полученный раствор наносили на колонку, через которую затем последовательно пропускали раствор ДНК-азы I с 10 мМ МпС^ и отмывочный буфер. Очищенную суммарную РНК элюировали 100 мкл деионизированной воды, не обладающей нуклеазной активностью. РНК переосаждали 95% этанолом в присутствии подкисленного ацетата натрия (рН 4.5). Осадок растворяли в 100 мкл воды.

3.2.6. Обратная транскрипция и ОТ-ПЦР кДНК-матрица была получена следующим образом: 1 мкл раствора РНК смешивали с 2 мкл раствора праймера ТзоСар (Юпмоль/мкл) и 2 мкл воды и инкубировали при температуре 70°С в течение 2 мин, после чего добавляли смесь остальных компонентов, включая 4мкл 5х M-MLV буфера (250 мМ трис-HCl (рН 8,3); 375 мМ КС1; 30 мМ MgCl2), 2 мкл раствора dNTP (концентрация каждого нуклеотида 10 мМ), 1 мкл дитиотреитола (10 мМ), 1 мкл раствора обратной транскриптазы M-MLV (200 ед/мкл) 7 мкл воды. Реакция длилась 90 мин при 45-50°С. По окончании реакции объем смеси доводили водой до 100 мкл, затем инактивировали фермент нагреванием (5 мин при 80°С). Раствор кДНК хранили при температуре -20°С.

Для проведения ПЦР с целью получения последовательностей, кодирующих гетеродимерные фосфолипазы, были использованы праймеры 1 и 2. Для CRISP- 3,4,5 и 6, для тромбин-подобных сериновых протеиназ - 7,8, для трехпетельных токсинов - 9,10. ПЦР проводили в объеме 20 мкл, смешивая 2 мкл 10х буфера [670мМ трис-HCl (рН 8.8); 160 мкл (NH^SC^; 25мМ MgCl2], 3 мкл эквимолярной смеси dNTP (по 1,25 мкМ), по 1 мкл каждого из праймеров (10 пмоль/мкл), 2 мкл раствора кДНК, 0,5 мкл ДНК-полимеразы (5 ед/мкл) и требуемое количество воды.

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих гетеродимерные фосфолипазы, был следующим: 94°С — 1 мин, далее был выбран режим ступенчатого понижения температуры на стадии отжига ("step-down"): 94°С - 30 с, 65.53°С - 40 с, 68°С - 120с; 35 циклов.

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих CRISP, был следующим: 95 °С- 60с, далее 94 °С - 30с, 55.43 °С-40с, 68 °С -120с; 35 циклов.

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих тромбин-подобные сериновые протеиназы: 95 °С - 60с, далее 94 °С-30с, 55.43- 40с, 68°С-45с; 35 циклов, далее 94°С-30с, 43°С-40с, 68-10 мин.

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих ингибиторы сериновых протеиназ Типа Кунитца: 95°С - 60 с, отжиг праймеров при 55 °С в течение 40 сек, элонгация при 68 °С-2 мин

Температурный режим реакции для получения продуктов, кодирующих трехпетельные токсины: 95 °С - 60с, далее 94 °С-30с, 65.53-40с, 68 °С-20с; 35 циклов.

3.2.7. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР

Продукты ПЦР фракционировали в агарозном геле, элюировали стандартными способами (из легкоплавкой агарозы, электроэлюцией в 15%-PEG-6000) или с использованием набора "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" и клонировали по аденилированным З'-концам в векторе pGEM-T. Процедуры трансформации, скрининга, выделения и очистки плазмидной ДНК на данном и последующих этапах работы проводили согласно руководству [184]. Отбор клонов, содержащих требуемую вставку, осуществляли с помощью сине-белой селекции и ПЦР. Секвенирование ДНК проводилось в Центре коллективного пользования "Геном" ИМБ РАН с помощью набора реактивов ABI PRISM Big Dye Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems). Для повышения достоверности полученных данных каждый клонированный фрагмент секвенировался дважды в противоположных направлениях.

3.2.8. Определение ферментативной активности гетеродимерной ФЛА2

Ферментативную активность белков определяли по методике, описанной в работе [185] с использованием 1-пальмитоил-2-(10-пиренилдеканоил)-зп-глицеро-3-фосфорилхолином в качестве субстрата.

3.2.9. Определение антикоагулянтной активности гетеродимерной ФЛА2

Фосфолипазы А2 были растворены в 0.02 M изотоническом верональном буфере (pH 7.4), содержащим 1мМ СаС12 с конечной концентрацией 1мг/мл. Взятая кровь от здоровых доноров была смешана с цитратом и отцентрифугирована при 1200g 20 мин. Для измерений были использованы полученная обедненная тромбоцитами крови плазма л .набор реагентов из Tekhnologia-Standart (Барнаул, Россия). Каждый тест был выполнен параллельно в трех повторах, контрольный образец не содержал фосфолипазы.

Для определения тромбинового времени (ТСТ), брали ОД мл плазмы и 0.05 мл раствора белка и инкубировали при 37°С 2 мин. Затем к смеси добавляли 0.5 единиц (НИ) в 0.1 мл и регстрировали время до образования тромбинового сгустка.

Протромбиновое время (РТ) определяли двумя методами. Метод А: 0.1 мл плазмы и 0.05 мл раствора белка инкубировали как описано выше. После чего прибавиляли 0.2 мл кальций-тромбопластиновой смеси и регистрировали время свертывания. В методе В 0.2 мл тромбопластиново-кальциевой смеси инкубировали с белком 2 мин. Затем к смеси добавляли 0.1 мл плазмы и регистрировали время свертывания.

Для определения активного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) 0.1 мл плазмы, 0.05 мл раствора белка и 0.1 мл каолин-кефалинового реагента ("Tekhnologiya-Standart") инкубировали 3 мин при 37°С. Затем к смеси добавляли 0.1 мл 25 мМ СаСЬ и регистрировали время образования сгустка.

Активированное время рекальцификации (ART) определяли так же как АРТТ, но в качестве реагента добавлялся только каолин. Для определения ART использовали обогащенную тромбоцитами плазму, полученную после центрифугирования крови с добавлением цитрата в течение 5 мин. при 240 g. Результаты всех тестов свертывания плазмы были выражены как минимальные эффективные концентрации, то есть минимальные конечные концентрации бежа в инкубационной смеси, которые вызывали увеличение времени свертывания во всех трех определениях для периода, превышающего ошибку метода, которая составляла 1с для ТСТ и РТ, Зс для АРТТ и 5с для ART. Для определения минимально эффективной концентрации было использовано 10-, 100- и 1000-кратное разведение белка.

3.2.10 Анти-тромбоцитарная активность гетеродимерной ФЛА2

Анти-тромбоцитарная активность была измерена как описано в методе [186] с использованием богатой тромбоцитами плазмы. Кратко, 0.5 мл плазмы и 0.1 мл раствора белка (0.2 мг/мл изотонического NaCI, 0.04 мг/мл HDP-2) инкубировали 1 мин при 37°С. Затем к смеси добавляли 0.05 мл раствора АДФ (конечная концентрация 2.5 мкМ) и определяли изменения проводимости каждые 5 мин. В качестве котроля использовался изотонический раствор NaCl.

3.2.11. Характеристка цистеин-богатых беков (CRISP) из гадюки обыкновенной

Сырой яд гадюки обыкновенной (170мг) растворяли в 2 мл 0,1М аммоний-ацетатного буфера (рН 6.2) и наносили на колонку с сефадексом G-50 (две колонки 2.5x90 мм, соединенных последовательно). Полученные фракции высушивали лиофилизацией. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия проводили по методике (Smith 1994) в восстанавливающих условиях в 12% геле. Толщина геля - 1,5 мм. Белки окрашивали кумасси бриллиантовым голубым. Часть (около 1.5x1.0 мм) окрашенной полосы белка вырезали из геля и обрабатывали трипсином (Шевченко и др. 2006). Продукты анализировали методом MALDI масс спектрометрии (MS). MALDI MS и MS/MS анализ проводили на масс спектрометре Ultraflex II MALDI-ToF-ToF (Bruker Daltonik, Germany), оборудованном Nd лазером. Молекулярные ионы МН4" измерялись в рефлекторной моде; точность измерения массы составляла 0.01%. Для проведения измерения аликвоту раствора (0.5 мкл) образца смешивали с равным объемом раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich, Milwaukee, WI) (10мг/мл в 30% ацетонитриле и 0.5% трифторуксусной кислоте) и оставляли сушиться при комнатной температуре. Каждый масс-спектр получал в сумме 500 лазерных ударов. Спектры фрагментных ионов генерировали индуцированной лазером диссоциацией, ускоренной низкоэнергетической ударной диссоциацией с использованием гелия в качестве вспомогательного газа. Соответствующие полученные массы пептидов токсина и пептидных фрагментов интерпретировали с применением програмного обеспечения GPMAW 4.04 (Lighthouse data, Denmark), используя критерий точности 0.01-0.02%.

3.2.12.Филогенетический анализ CRISP из гадюки Никольского и гадюки обыкновенной

Филогенетический анализ выполнен с использованием транслированной аминокислотной последовательности зрелого белка. Последовательности CRISP были подобраны с помощью программы BLAST (bttp://www.expasv.org/tools/blast). Выбранные последовательности выравнивали используя программу CLUSTAL-X. Наборы данных анализировали, используя распределение по Байесу, с помощью программы Mr. Bayes, версия 3.1.2. Анализ был выполнен, как описано в работе [187]. Визуальное древо было получено, используя программу TreeView, версия 1.6.6.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Выделение гетеродимерных ФЛА2 и анализ их аминокислотной последовательности

Для выделения белков сырой яд гадюки Никольского разделяли катионо обменной хроматографией на колонке НЕМА BIO 1000 СМ (Рис.ИА). Фракции 4 и 5 обладали фосфолипазной А2 активностью и были названы HPD-1 (от английского названия HeteroDimeric Phospholipase - 1, гетеродимерная фосфолипаза -1) и HPD-2, соответственно. Выходы HPD-1 и HPD-2 составляли соответственно 7.5% и 14.5%. В целом, эти два белка составляли более чем 20% веса от высушенного яда. На следующем этапе после фракционирования методом обращено-фазовой хроматографии (Рис.ПБ) HDP-1 и HDP-2 были разделены каждая на две основные фракции. Определение липолитической активности показало, что более гидрофобные белки (HDP-1P и HDP-2P), элюирующиеся в более высокой концентрации ацетонитрила обладали ферментативной активностью. Более гидрофильные белки (HDP-1I и HDP-2I) являлись ферментативно неактивными и всегда элюировались как пик с предплечьем, которое не отделялось от главного пика. Массы белков HDP-1P и HDP-2P по данным MALDI масс спектроскопии составил 13798±1 и 13827±1 Да, соответственно. Молекулярные массы ферментативно неактивных компонентов (HDP-1I и HDP-2I) совпали (очень сильный сигнал составил 13624±1Да и небольшой сигнал 13662±1Да.). Поэтому в дальнейшем будем называть эту кислую субъединицу ФЛА2 - HDP-In. В каждом из выделенных белков восстанавливали дисульфидные связи, алкилировали образующиеся сульфгидрильные группы 4-винилпиридином и анализировали N-концевую аминокислотную последовательность методом автоматической деградации по Эдману. Данные показывают (Рис.14), что N-концевые последовательности компонентов ФЛА2 из гадюки Никольского (HDP-1P и HDP-2P) гомологичны основным субъединицам гетеродимерных фосфолипаз А2: васпину В из V. aspis и вайпоксину В из V.ammodites. В тоже время, NА

Рис 11. Выделение гетеродимерных ФЛА2 из яда гадюки Никольского. Разделение сырого яда методом катионообменной ВЭЖХ (А) с последующим фракционированием НОР-1 и ШЭР-2 методом обращенно-фазной ВЭЖХ (Б). концевая последовательность ферментативно неактивной компоненты НОР-1п является гомологичной кислым субъединицам этих гетеродимерных ФЛА2. На основании этих данных мы считаем, что белки НЕ)Р-1 и НВР-2 соответствуют двум разным гетеродимерным фосфолипазам.

Для подтверждения димерной природы ЬГОР-1 и НОР-2 мы применяли гель фильтрацию на колонке с Бирегдех 75 (Рис. 12).

СА ЕГО

10

20 30

ГП1П

40 I

50

Рис. 12. Гель фильтрация НОР-2 на колонке Бирегёех 75 ЬЖ (10x300мм). Скорость потока 0.5 мл/мин. Элюционный буфер: 50мМ Тт-НС! (рН 6.5), содержащий 0.1 М ИаСЬ Стрелками показаны позиции рибонуклеазы А (М-Т, -13.7 кДа) и карбонил ангидразы (СА, -ЗОкДа).

Как видно из рисунка НОР-2 элюировался с колонки раньше чем рибонуклеаза А, белок с молекулярной массой приблизительно 13.7 кДа, но при этом после карбонил ангидразы, имеющей молекулярную массу около 30 кДА. (Рис. 12). Похожие результаты были получены для НОР-1. (Данные не показаны). Эти данные согласуются с димерной структурой НОР-1 и НОР-2, которые имеют молекулярные массы ~27.5 кДа.

Для получения более детальных данных о последовательностях пиридилэтилированные белки обрабатывали трипсином. Полученные триптические пептиды разделяли с помощью обращено-фазовой НРЬС и анализировали методами МАЫЛ Мв и деградации по Эдману. Перекрывающиеся пептиды, полученные в результате гидролиза пиридилэтилированных производных белков пепсином, анализировали подобным образом. Полученные данные суммированы в таблицах 5 и 6, а также и на рис. 15.